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TEST TOPOGRAFICO DEL TETRAZOLIO (TTT) 4,1.

REACTIVOS El 2,3,5 tryphenil cloruro de tetrazolio, sal utilizada en esta prueba, se vende en forma de polvo en envases de 10 y 100 gramos. Las marcas comerciales disponibles en el mercado pueden diferir en el tamao de los cristales de la sal y la fotosensibilidad de la solucin. La sal debe disolverse preferentemente en solucin tampn o agua destilada (tambin puede ser utilizada para prepararlo). La solucin tampn se obtiene a partir de los siguientes frmacos: - fosfato diacido de potasio, fosfato mono cido de sodio. Las Normas Internacionales de Anlisis de Semillas (ISTA, 2003), en el captulo 6, "Bioqumica pruebas de viabilidad: Test Topogrfico de tetrazolio" describe en detalle cmo la solucin tampn es preparado en los siguientes trminos:

Solucin No. 1: Se pesa y se disuelven 9.078 g de la fosfato diacido de potasio (K H2PO4) en agua hasta que haya 1.000 ml de la solucin (Fig. 24 A). Solucin No. 2: Pesar y disolver 9.472 g de fosfato mono cido de sodio (Na2HPO4) o 11.876 g de fosfato mono cido bihidratado de sodio (Na2HPO4 X 2H2O) en agua hasta que haya 1.000 ml de solucin. La solucin de trabajo es obtenida por la mezcla: 2 partes de solucin No. 1 Con 3 partes de solucin No. 2.

Controlar que el pH de la solucin final es entre 6,5 y 7,5 ; hacer ajustes si es necesario.

Muestra 1: Preparacin de las soluciones. Para obtener las soluciones de trabajo se deben seguir estos pasos:

1- Pesar con precisin los gramos indicados para cada componente de reactivos en forma slida de la solucin tampn (Fig. 24 A). 2- Disolver cada droga por separado en 1000 ml de agua. Para asegurarse de la correcta disolucin del slido, se recomienda el uso de un agitador magntico (Fig. 24 B). 3- Almacenar cada una de las soluciones en botellas mbar en lugar fresco. 4- Mezclar 400 ml de solucin No. 1 Y 600 ml de solucin No. 2 Para obtener 1 litro de solucin tampn (Fig. 25). 5- Una vez que la solucin tampn se ha preparado, controlar el pH y reajustarlo 6,5 -7,5 si es necesario (Fig. 26). 6- En este litro de solucin tampn, disolver 1 g de cloruro de 2,3,5 tryphenil tetrazolio de sal para obtener una solucin definitiva al 0,1 % (Fig. 27).

7- La solucin se debe guardar en un lugar fresco en un frasco color ambarino para evitar la descomposicin de la luz. La solucin de tetrazolio adecuadamente preparados y almacenados pueden durar meses siempre que no exista contaminacin orgnica en la botella. Muestra 2: Preparacin de tetrazolio Solucin madre en 1% 1- Repita los pasos 1 a 5 . 2- Disolver 10 g de cloruro de 2,3,5 tryphenil tetrazolio de sal para obtener una solucin final en un 1 %. 3- Para preparar la solucin 0,1 %, siga estos pasos: 3,1 . Colocar 100 ml de la solucin madre en otro color ambarino botella y etiqueta de 0,1 %. 3,2 . Obtener 1.000 ml de volumen total aadiendo 360 ml de solucin No. 1 Y 540 ml de solucin No. 2.

4,2 . FASES DE TRABAJO Con el fin de lograr una uniformidad de las prcticas que pueden garantizar la fiabilidad y la repetibilidad de los resultados, las Pruebas Topogrficas de tetrazolio requiere una serie de procedimientos secuenciales: abcdeSeleccin de una muestra de trabajo Acondicionado de semilla Preparacin de tincin incubacin Evaluacin

a- seleccin una muestra de trabajo seleccionar una muestra representativa de las semillas enviadas al laboratorio (Fig. 28). Equipo especfico llamado Homogeneizadores/Divisores de diferentes tipos de muestras debe ser usada para este propsito (Fig. 29). Una vez que la muestra original ha sido homogeneizadas y reducida a una cantidad apropiada, proceder a separar las repeticiones, que pueden ser 4 de 100 semillas (ISTA) o menos. En este caso 2 repeticiones de 100, 4 de 50 o 2 de 50 semillas de la fraccin de semillas puras pueden realizarse (Manual de semilla pura definiciones, ISTA, 2008). En todos los casos las tablas estadsticas de la tolerancia debe ser utilizada con el fin de comprobar si las diferencias observadas en las repeticiones son aceptables (Ellis et al., 1985; Meyer & Steiner, 1989; ISTA Edimburgo, 1997; ISTA, 2003). Para asegurarse de que el lote sea representativo, las semillas deben ser elegidos al azar, ya sea mediante el uso de semillas que los contadores no selecciona por el tamao, forma, peso o aspecto, o

manualmente por recoger pequeas cantidades de semillas hasta que el nmero establecido ha sido alcanzado.

b- Acondicionamiento de las semillas

El tejido es lentamente hidratado cuando las semillas son embebidas en agua facilitando la activacin de los procesos de respiracin celular, la eliminacin del tegumento, tetrazolio de penetracin y una coloracin ms homogneo. Las semillas de cada repeticin, perfectamente identificadas, deben estar acondicionadas por un perodo de remojo en agua para asegurar una hidratacin lenta y uniforme. Con este fin, se usan tiras de toallas de papel saturadas de agua. Luego, se coloca las semillas, distribuidas en forma pareja y separadas, a lo largo de dos toallas de papel hmedo, cubrir con otra toalla de papel hmeda y enrollar la toalla (Fig. 31). Los rollos de papel deben colocarse en posicin horizontal para asegurar que todas las semillas estn bien empapadas, a continuacin se introduce en bolsas de plstico para evitar la prdida de humedad y almacenados por un perodo de 18 horas en un lugar fresco para evitar la germinacin. A altas temperaturas, almacenar los rollos de papel en la plataforma inferior de un refrigerador. El ISTAHandbook recomienda que este acondicionamiento previo ser hecho a 20 oC y la AOSA manual con una temperatura entre 20-25 oC (AOSA, 2000; ISTA Hojas de Trabajo, 2003). Despus de 18 horas, si una hidratacin uniforme de todas las semillas de cada repeticin no es observada, puede recurrir a una hidratacin complementaria hasta por una hora extra (Fig. 32). La calidad de las toallas de papel empleado es muy importante porque un exceso o dficit de humedad disponible para cada semilla puede redundar en una falta de uniformidad en la hidratacin, as como fisuras o fracturas en algunas de las estructuras seminales. Este ltimo puede conducir a errores de interpretacin y tambin causa una demora en el procedimiento si tener que recurrir a un perodo ms largo de remojo complementario. Por lo general, con una buena calidad las toallas de papel, con dos hojas por debajo de las semillas y otro sobre de ellas son suficientes. Cada repeticin de una muestra de la semilla debe estar perfectamente identificada con una etiqueta, preferiblemente por escrito a lpiz o tinta indeleble y se coloca en cada rollo de papel. Mientras que este es un mtodo rpido y los resultados estn disponibles en 24 horas, a veces el resultado es solicitado anteriormente. En este caso, investigadores de EMBRAPA (Empresa Brasilera Pesquisa Agropecuaria) sugieren un mtodo rpido de acondicionamiento utilizando los rollos de papel como se describi anteriormente y colocarlos en una estufa a 41 C por 6 Horas (Fig. 33) (Costa et al., 1998). El analista debe contar con considerable experiencia en la evaluacin e interpretacin de los resultados porque algunas discrepancias podran aparecer en comparacin con el mtodo tradicional. Para un perodo de hidratacin ms rpida tambin podr emplearse en remojo las semillas secas directamente en el agua (Fig. 34). Este procedimiento no es especialmente recomendado porque las

semillas (de soja) son muy susceptibles a la rpida hidratacin y se producen a menudo fisuras o fracturas perpendiculares al eje mayor de la semilla en la zona proximal y distal de la unin del eje embrionario y los cotiledones (Fig. 35). Este fenmeno se conoce como cracking (fisuras). Es la consecuencia de la fisura espontnea de los tejidos debido a la traccin fuerzas generadas por los tejidos y diferentes niveles de humedad. El analista debe tener suficiente experiencia para discernir adecuadamente este fenmeno y asignar correctamente los niveles de la viabilidad y el vigor del lote. Es importante sealar que el tejido de zonas que rodean las fisuras o fracturas producidas por fisuras no presentan los signos de deterioro que caracterizan daos mecnicos. En este tipo de daos, y como consecuencia del tiempo transcurrido desde su aparicin en el momento de analizar las semillas, las fisuras o fracturas generalmente van acompaadas por sus tiras color rojo de tejidos circundantes, lo que indica deterioro, o blanco, lo que indica la presencia de tejido muerto. En el caso de fisuras, los tejidos que rodean las reas daadas mostrar el color y la turgencia tejido sano mnimos.

c- Preparacin de la Tincin Los tegumentos seminales de las semillas de soya son muy permeables y no hay necesidad de cualquier corte adicional para facilitar la penetracin de la solucin de tetrazolio en el interior de los tejidos. Si las semillas han sido adecuadamente hidratadas, estn listos para la siguiente etapa del proceso.

d- Incubacin Las semillas hidratadas se quitan de los rollos de papel junto con las etiquetas de identificacin que se corresponden con cada repeticin y se sumergen en la solucin de tetrazolio. El lote de semillas debe ser perfectamente cubiertas con la solucin de tetrazolio, evitando as el exceso de lquido porque las semillas ya estn bien hidratadas. Se recomienda el cierre firme de la tapa del recipiente de vidrio o plstico para evitar fugas por evaporacin durante la incubacin (Fig. 36). La fase de incubacin se lleva a cabo con la ayuda de una incubadora o un bao termosttico a 35 oC de 2.5 a 3 horas en la oscuridad (Fig. 37) (Craviotto et al., 1991). Despus de ese perodo de tiempo, las semillas se quitan de la solucin de tetrazolio, se lavan cuidadosamente con abundante agua del grifo y sumergido en el agua hasta evaluacin (Fig. 38). Las semillas deben ser evaluadas inmediatamente despus del perodo de incubacin, pero si no es posible, pueden ser preservadas en los contenedores de agua en el refrigerador durante un da ms. Es importante sealar que no es muy prctico postergar la evaluacin varios das debido a que la solucin colorante puede estar expuesta a la contaminacin y alteraciones, haciendo su interpretacin ms difcil.

e- Evaluacin Es indispensable un analista que cumpla con los siguientes requisitos para la ejecucin de esta tcnica: - Deben estar capacitados en el mtodo - debe tener conocimientos bsicos de estructura anatmica de semillas - debe ser un vivo y atento observador - debe ser paciente - Deben estar dispuestos a llevar a cabo los procedimientos de ensayo concienzudamente durante todo el proceso de evaluacin
Durante todo el proceso de evaluacin las semillas deben permanecer sumergidas en agua para evitar la

deshidratacin, que puede causar alteraciones en la interpretacin.

I-4,3 . HERRAMIENTAS NECESARIAS El uso de un ampliador (4 a 6 veces) de luz blanca es altamente recomendable para visualizar cmodamente los diversos sntomas que pueden aparecer en las semillas (Fig.39). El proceso de evaluacin requiere un anlisis detallado de los tejidos externos e internos de las semillas. Para ello es importante el uso de alguna herramienta que puede cortar porciones finas y precisas de las diferentes estructuras. La herramienta apropiada para esta tarea es una hoja de afeitar. En su trabajo diario, el analista puede utilizar otros instrumentos para cada semilla y cortarlas con el fin de observar mejor los sntomas. En este sentido, es importante mencionar que instrumentos de odontologa, tales como pinzas y sondas exploradores de diferentes tamaos y formas, son de gran ayuda para realizar con precisin el anlisis de la viabilidad de cualquier especie (Fig. 40). Es conveniente usar guantes de goma para manipulacin de las muestras que son sospechosos de no estar totalmente limpio.

5. PROCESOS SISTEMTICOS El analista debe llevar a cabo una serie de operaciones manualmente con el fin de completar un diagnstico definitivo de la condicin fisiolgica de cada semilla: 12345Extraccin del tegumento Observacin de homogeneidad de coloracin Comprobacin de turgencia de tejido Identificacin de la naturaleza de los daos Visualizacin de la ubicacin de daos

6- Comprobacin de extensin y profundidad de daos

5,1 . EXTRACCION DEL TEGUMENTO La operacin de remocin del tegumento debe llevarse a cabo con cuidado a fin de evitar daos en estructuras del embrin. El analista debe colocar las semillas entre sus dedos en posicin horizontal con el eje hipoctiloradcula hacia arriba (Fig. 41A y b). Luego, sujetar la semilla entre los dedos pulgar e ndice, el analista presionar con los mismos dedos de una mano en los cotiledones frente a la zona donde se une con el eje embrionario. Esta presin puede ocasionar el tegumento dividir por la mitad y los dos porciones deben ser eliminados con un movimiento circular convergentes para evitar causar el desprendimiento de la radcula (Fig. 42). En semillas hermticas y de la alta calidad, el tegumento est fuertemente adherido a la superficie de los cotiledones y el hilio, haciendo ms difcil su extraccin. En este caso, el analista puede recurrir a un corte cuidadoso en el hilio con una herramienta o una cuchilla para facilitar la eliminacin del tegumento (Fig. 43). Si bien el tegumento de semilla de soya es transparente y la intensidad de la tincin puede observarse a travs de l, se recomienda retirar del tegumento a diagnosticar mejor posible pequeos daos , as como para verificar la presencia de daos internos de diversos orgenes. Las variedades de semillas de soya que presentan tegumentos oscuros son ms permeables y, por consiguiente, la penetracin de la solucin de tetrazolio es ms difcil. El procedimiento recomendado en este caso es la eliminacin o escarificacin del tegumento para facilitar el proceso de tincin. 5,2 .OBSERVACION DE HOMOGENEIDAD DE COLORACIN. Una vez que el tegumento ha sido eliminado, el analista debe observar cuidadosamente la totalidad de la superficie de la semilla, prestando especial atencin al grado de homogeneidad de la tincin. El analista debe estar en condiciones de apreciar la posible existencia de zonas de diferente intensidad de color causada por la actividad respiratoria de los tejidos. Estas diferencias en actividad respiratoria pueden ser debido a las lesiones, a diferentes contenidos de humedad, y en el caso del pice de la radcula, a una mayor actividad meristemtica. Manteniendo estos conceptos en mente, el analista debe interpretar, en primer lugar, la "vitalidad general" de la semilla. Con este fin, el analista profesional debe observar los planos frontal, dorsal y lateral de las semillas (Fig. 44). En segundo lugar, el analista debe observar el interior de las semillas por una incisin con una hoja de afeitar. Se introduce entre ambos cotiledones, en la regin dorsal, y el eje hipoctilo- radicular es cortado usando la superficie interior de los cotiledones de gua (Fig. 45 Y 46). De esta manera, el eje embrionario est dividido en dos y sus estructuras internas se observan con claridad: la corteza y

cilindro central. La corteza rodea el cilindro central como una cubierta y cuando se trata de cortar en una direccin lateral, pueden verse dos porciones corticales: la superior y lo inferior (Fig. 47 Y 48). Normalmente, la Plmula y la yema terminal, como componentes del eje embrionario, quedan pegadas a uno slo de los cotiledones. El analista debe ser capaz de observar el nivel de penetracin del tetrazolio en el permetro interno de los cotiledones. Al mismo tiempo, se puede comprobar la penetracin en el eje hipoctilo- radicular. En semillas de alta calidad, la hermeticidad de estas estructuras causa una muy escasa penetracin de la solucin que se puede observar a travs de una delgada franja coloreada de aproximadamente 0,5 mm de ancho en prcticamente todo el permetro del cotiledn (Fig. 49). Sin embargo, incluso en semillas de alta calidad, la corteza externa del eje hipoctilo- radicular puede ser teidas y en ese caso, la tincin nunca debe superar la intensidad adquiridos por los cotiledones externamente (Fig. 49). Por otro lado, la falta de hermeticidad en semillas de inferior calidad favorece una mayor penetracin de la solucin de tetrazolio y las reas coloreadas en el permetro aumentan considerablemente y cubren toda la superficie interior de los cotiledones (Fig.50).

5,3 .COMPRABACION DE TURGENCIA DE TEJIDOS. El analista puede comprobar la turgencia de los tejidos por dos medios: visual y tctil. En el primer caso, se puede observar el grado de brillo del tejido, ya sea con manchas, o no. El analista debe recordar que los tejidos muy vigorosos pueden todava presentar un color blanco brillante. Por otro lado, los tejidos deteriorados suelen presentar un matiz blanco, si han sido teidos o no. Luego, deben ser evaluados la firmeza o flacidez de los tejidos en la semilla. Esta evaluacin se hace con una hoja de afeitar o cualquier otro instrumento como un explorador dental o la sonda, ejerciendo una ligera presin y observar la plasticidad con la que el tejido responde (Fig. 51 A 55). En las semillas de excelente calidad los tejidos son turgentes y responden con firmeza a la presin (Fig. 52 A 54). Por el contrario, cuando los tejidos son deteriorados, el instrumento generalmente penetra fcilmente (Fig. 55). 5,4 .IDENTIFICACION DE LA NATURALEZA DE LOS DAOS La prueba es capaz de detectar diferentes tipos de daos cuya identificacin slo es posible mediante el reconocimiento de ciertos patrones. Estos patrones de dao muestran los sntomas a travs del cual el agente causal manifestar repetidamente su accin sobre las semillas de manera fsica. Los efectos fsicos causados por estos agentes se mantienen sobre la estructura de la semilla durante el resto de su vida, de tal manera que su presencia es permanente, y pueden ser calculados el momento y la frecuencia de ocurrencia, y la magnitud del dao. Los daos que puede ser cuantificado por esta prueba son:

- Mecnicos - ambiental y prcticas despus de la cosecha - debido a insectos, -fracturas, -malformaciones genticas 5,5 .VISUALIZACION DE LA UBICACIN DE LOS DAOS. El analista debe observar detenidamente cada semilla, analizar su superficie exterior y el interior de los cotiledones y el eje embrionario con el fin de asignar un valor de viabilidad segn la ubicacin de los daos y lesiones. Una semilla ser clasificada con un nivel menor viabilidad segn el nmero de piezas o estructuras esenciales afectados por los diversos tipos de daos . La ubicacin de los daos sobre la semilla tiene mayor o menor importancia segn cun cerca est de zonas consideradas como puntos crticos en la formacin de la futura plntula (Fig. 56). El rea donde el eje embrionario se une a los cotiledones, llamada zona proximal, es el lugar fsico de todos los nutrientes acumulada por los cotiledones circulan durante el crecimiento de los pices de la radcula y plmula durante el proceso de germinacin. El punto de insercin de los cotiledones con el eje embrionario se encuentra en esta zona (Fig. 57). En el lado opuesto del rea de unin, que se denomina zona distal, los daos son menos importantes, puesto que estn ms lejos, en la seccin intermedia del cotiledn. 5,6 .COMPROBACION DE EXTENSIN Y LA PROFUNDIDAD DE DAOS La importancia de cada tipo de dao est relacionada con la extensin de la zona afectada y, al mismo tiempo de cmo estn comprometida los tejidos. Si las estructuras afectadas estn gravemente alteradas en su desarrollo normal, este fenmeno se transmite a la futura plntula. Grandes extensiones necrosadas producida por insectos, medio ambiente o daos mecnicos causan un grave debilitamiento del estado fisiolgico de las estructuras circundantes y puede incluso reducir la energa necesaria para el proceso de germinacin. Todos los daos en las estructuras seminales deben evaluarse segn su profundidad debido a que muchos que parecen muy pequeos en la superficie de los tejidos pueden ser mucho ms grandes internamente. Este efecto, similar a otros en la naturaleza, se asemeja a un fenmeno "iceberg" y es muy comn en las semillas (de soya). Para comprobar la profundidad de los daos, el analista debe cortar rebanadas delgadas de cada una de las estructuras de semillas que muestran algn dao con las herramientas adecuadas (Fig. 58 A 63). Fuente: Topographic Tetrazolium Test for Soybean. Craviotto, R. M., INTA EEA Oliveros.