Aceites Esenciales con propiedades antimicrobianas

RESUMEN El presente estudio trata sobre la extraccin y

evaluacin del perfil biolgico antimicrobiano in vitro de aceites esenciales de especies vegetales aromticas. Los aceites fueron obtenidos mediante destilacin por arrastre de vapor de agua de diferentes rganos: partes areas (hojas y tallos) y dermis de ctricos (cscara). El crecimiento del hongo saprfito Neurospora crassa fue inhibido por el aceite de Citrus limetta (Lima) a concentraciones de 0, 5 mg/ml. El aceite de Rosmarinus oficinalis (Romero), a una concentracin de 1 mg/ml, inhibi el crecimiento de la bacteria Staphylococcus aureus. Mientras que los aceites de Petroselium sativum (Perejil), Satureja boliviana (Khoa), Schnus molle (Molle), Citrus aurantium (Naranja), Citrus paradisii (Toronja) y Citrus nobilis (Mandarina), inhibieron el crecimiento tanto de hongos a 0, 5 mg/ml, como bacterias a 1 mg/ml Entre estas ltimas esencias, las del Perejil y Molle a 3.7 mg/ml y la Khoa a 7.5 mg/ ml inhibieron el crecimiento de Sigella flexneri.
1. INTRODUCCION Bolivia presenta una diversidad de zonas geogrficas con climas variados, favoreciendo de esta manera que exista una gran riqueza de flora con propiedades medicinales an no estudiadas en su totalidad. Con este trabajo pretendemos contribuir a las investigaciones cientficas sobre aceites esenciales de plantas aromticas comunes en nuestro pas. Los aceites esenciales son los constituyentes odorferos o esencias de una planta, son productos voltiles, aromticos, constituidos por una mezcla compleja de varias sustancias,' 2.2 generadas por lo general mediante la ruta biosinttica del cido mevalnico.4,5,6 El trmino aceite probablemente se origina del hecho que, el aroma de una planta existe en forma lquida inmiscible en agua, en glndulas o entre clulas. Los aceites esenciales se hallan en las flores, sumidades floridas, hojas, frutos y semillas de los vegetales a veces, aunque no muy frecuentemente, en los tallos y races. Su distribucin es amplia en el reino vegetal.3,4,5 Los aceites esenciales son utilizados en la industria cosmtica, farmacutica, alimenticia y entre otros usos, son materia prima pivotal en la aromaterpia atribuyndoseles acciones antibacterianas; antifngicas; antivirales, etc.7 Cabe destacar que es tambin importante el procedimiento que se emplea para la obtencin de las esencias de los vegetales, es as que existen varias tcnicas, entre
Vol. VII - Diciembre de 1999

Universidad Mayor de San Andrs Facultad de Ciencias Farmacuticas y Bioqumicas

Instituto de Investigaciones Frmaco Bioqumicas-IIFB

Area Temtica de Qumica Farmacutica

A quien debe dirgrse la correspondencia ifb@hotmail.com

FLORES, VELASCO, FIGUEROA, GIMENEZ.

las ms utilizadas estn el mtodo por arrastre de vapor de agua, la extraccin por fluidos en estado supercrtico, la expresin en fro y otros mtodos especficos que se utilizaran de acuerdo al uso final que tendrn los aceites esenciales. 8' 9 METODOLOGA OBTENCION DE LOS ACEITES ESENCIALES POR ARRASTRE DE VAPOR
Los aceites esenciales fueron obtenidos por el mtodo de arrastre de vapor de agua, utilizando un extractor de aluminio de capacidad de 12 litros, para procesar aprox. 1 kilo de material vegetal. Consta del reservorio de agua (3Lt) un trpode (18cm) y una rejilla milimtrica metlica sobre la cual se deposita la muestra vegetal pesada (0.5 a 1.0Kg). El extractor cerrado hermticamente esta conectado aun condensador de serpentn, que desemboca en una bureta graduada. Cuando el volumen de aceite destilado se mantiene constante, se considera punto final de la extraccin. El aceite extrado es secado con Na2SO4 anhidro y conservado a -20 C en tubos tapa rosca. 70'17,72

ATCC 12022, Escherichia coli ATCC 8739.a una poblacin de 106 ufc/ml. La caja fue incubada 372C durante 24 hrs antes de leer el crecimiento o inhibicin.14
Concentracin Mnima Inhibitoria (CIM): Se realiz la tcnica de microdilucin utilizando el medio caldo Mueller Hinton (MHB-DIFCO), en el que se realizaron las diluciones de los aceites en estudio a partir de 30mg/ml, adicionando una poblacin bacteriana a 3 x 106 ufc/ml de cada microorganismo, colocando en la microplaca controles de crecimiento bacteriano; control de esterilidad y control de solvente. Una vez montada toda la microplaca, se incubo a 372C por 16-18 hrs;, despues de este periodo las placas se examinaron visualmente. 14

El punto final (Concentracin Mnima Inhibitoria) se considera la menor concentracin de compuesto frente a la cual el microorganismo ensayado no presenta desarrollo visible. El criterio de desarrollo es una turbidez definida como se presenta en el control de crecimiento; y la CIM se observa cuando no hay turbidez, como el control de esterilidad. Concentracin Mnima Bactericida (CMB): La CMI mide la capacidad del agente antimicrobiano para inhibir la multiplicacin del microorganismo. En consecuencia los microorganismos presentes en el inculo pueden ser "slo inhibidos" por el compuesto antibacteriano, estos reinician su crecimiento si se elimina la accin del compuesto, en este caso se dice que es Bacteriosttico . En caso de ser Bactericida los microorganismos no podrn volver a multiplicarse aunque sean separados del compuesto antibacteriano. Estas pruebas se basan en la anterior tcnica de microdilucin. Se realiza diluciones de la suspensin bacteriana inicial de 1x106 ufc/ml, para determinar el nmero real de unidades formadoras de colonias del inculo. Despus de realizar la lectura de la CIM, se sembraron 100 ul de todos los pocillos que no tuvieron desarrollo (no turbios) en cajas Petri con agar Nutritivo,se incubaron las cajas, a 372C por 16-18 hrs.14 Despus del tiempo de incubacin, realizar el recuento de colonias desarrolladas y se compara con el inculo inicial (105ufc/ml). Dado que las substancias bactericidas no siempre esterilizan totalmente una poblacin bacteriana, la mnima concentracin del agente antibacteriano que permita sobrevivir a menos de 0,1% del inculo original se denomina CONCENTRACION BACTERICIDA MINIMA O CONCENTRACION LETAL MINIMA.15

PRUEBAS BIOLOGICAS Todo el material de vidrio, medios de cultivo, y agua destilada fueron esterilizados en autoclave (Al American, Mod-No 25X) a 120 C, por 15 min a 1.5 atm. Los medios de cultivo utilizados fueron Agar Saboraud, Caldo Saboraud, Agar Muller Himton, Caldo Soya Tripticasa. Como control en las pruebas antifngicas, se utiliz Ketoconazol (2.5 ug/ml) y en las pruebas antibacterianas, Gentamicina(10ug/ml). Evaluacin antifngica contra Neurospora crassa 1M70, ATCC 9279: En una microplaca de 24 pozos se colocaron los aceites (a 1.0, 0.5 y 0.2mg/ml) mezclados con el medio inoculado con esporas (106) de N. Crasssa. La microplaca fue incubada a 289C en estufa por 24hr antes de realizar la lectura del crecimiento o inhibicin. 13 Evaluacin antifngica contra Candida albicans ATCC 10231 En una microplaca de 24 pozos se colocaron los aceites (a 1.0, 0.5 y 0.2mg/ml) mezclados con el medio, una vez solidificado, se siembr C. albicans.(106 ufc/ml) La microplaca fue incubada a 372C en estufa por 24hr antes de realizar la lectura del crecimiento o inhibicin. Evaluacin antibacteriana contra Bacterias: El grado de inhibicin de crecimiento mediante fue determinado mediante la tcnica de Mitcher, utilizando caja Petri y mezclando el aceite (1 mg/ml) con el medio de cultivo (MHA) sobre el cual se sembraron las bacterias en estudio: Staphylococcus aureus ATCC 6538 Shigella flexneri

AMBROLITIC CAPSULAS 30 MG

JARABE 15 MG

C Chiesi Wassermann 1

Ambroxol Espaa Monosustancia de doble dimensin enso ' M uco l ltlva - T ac t Iva * Fabricado bajo licencia por: Laboratorios Alfa Ltda.
Vol. VII- Diciembre de 1999

ACEITES ESENCIALES CON PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS

RESULTADOS Qumicos La Tabla No 1, detalla el nombre cientfico, nombre comn y porcentaje de rendimiento del aceite esencial destilado de cada una de las 9 plantas estudiadas. Este grfico, representa el rendimiento relativo de los aceite obtenidos durante nuestros estudios. Puede observarse que la especie de mayor rendimiento es el Molle, dentro de las especies de los ctricos, la Naranja produce ms aceite que la Toronja, la Mandarina, y la Lima, mientras que la esencia de perejil es la menos abundante. TABLA No 1.- NOMBRE CIENTIFICO , NOMBRE COMUN Y RENDIMIENTO DE LAS ESPECIES VEGETALES.
Nombre cientfico Petroselium sativum Citrus limetta Citrus paradisii Citrus nobilis Citrus aurantium Cymbopgon citratus Satureja boliviana Rosmarinus oficinalis Schinus molla Nombre comn Perejil Lima Toronja Mandarina Naranja Paja Cedrn Khoa Romero Molle Rendimiento 0.09% 0.10% 0.20% 0.27% 0.33% 0.40% 0.45% 0.55% 0.72%

Biolgicos Todos los aceites esenciales fueron evaluados mediante pruebas in vitro contra bacterias Gram (+) y Gram (-), as como contra mohos y levaduras para definir su actividad antbacteriana y antifngica. Los resultados de las pruebas antibacterianas se detallan en la Tabla No. 2 y los resultados de las pruebas antifngicas se presentan en la Tabla No. 4. TABLA No 2.- RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ACEITES ESENCIALES A 1 MG/ML Nombre cientfico Petroselium sativum Citrus limetta Citrus paradisii Citrus nobilis Citrus aurantium Cymbopgon citratus Satureja boliviana Rosmarinus oficinalis Schinus molle 1 (-) (-) (+) (+) (+) (+) (-) (+) (+) 2 (+) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (+) 3 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

1 Staphylococcus aureus: 2 Shigella flexneri: 3 Escherichia coli

(V/P)*100
0.80% 070%

GRAFICO No 1

0.60%-1--0-50 %-----0.40%-1--0.30 % 0.20%

El Pelroseoum salivum ^'Olms limalla 110 lrus paradisii El Olmo nobilis Olma aurantium ^mlwpgan cilratus -Solurele boliviana Rosmarinus oficinalis 1 Scbinus molla

0.00%-I, Rendimiento Especies vegetales

CREMA

LTDA Av. Ecuador 2387 esq. Waldo Ballivin (Sopocachi) Telfonos: 410215 - 411762 Fax: 411762 Casilla 1998 La Paz - Bolivia
Vol. VII Diciembre de 1999 ,,:.

GRAMON BOLIVIA

FLORES, VELASCO, FIGUEROA, GIMENEZ.

TABLA No 3.- RESULTADOS DE CIM Y CBM DE LOS ACEITES ESENCIALES

Nombre cientfico Petroselium sativum Satureja boliviana Schinus molle CIM 15 mg/mI CMB 15 mg/ml
1 Staphylococcus aureus 2 Shigella flexneri

2 CIM 3,7 mg/ml CMB 3,7 mg/ml CIM 7,5 mg/ml CMB 30 mg/ml CIB 3,7 mg/ml CMB 15 mg/ml

TABLA NO 4.- RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD ANTIFNGICA DE LOS ACEITES. Neurospora crassa Nombre cientfico Petroselium sativum Citrus limetta Citrus paradisii Citrus nobilis Citrus aurantium Cymbopgon citratus Satureja boliviana Rosmarinus oficinalis Schinus molle 1,0 mg/mI () + (+) (+} (+) (+) (+) (} {+) O {) {) () (+) () (+) O O () () () () {} () {) () () () () (} 0,5 mg/mI (+) 0,25 mg/ml () C. albicans 1,0 mg/mI ()

BIBLIOGRAFA 1.- FERNAROLI, Giovanni."Sostance Aromatiche Natturali", Ed. Ulrico Hoepli; Milan 1963
2.- HARRISON, Jack."Curso de Farmacognosia", Universidad San Marcos; Lima, 1984

9.- DE OLIVEIRA J.V. "Recientes Pesquisas en Extraccin Supercrtica No DEQUFSC", Memorias del Primer Encuntro sobre Extraccin Supercrticas de Productos Naturales, UNICAMP-CAMPINAS, Brasil, 1994. 10.- FIGUEROA, Nelson. "Evaluacin Antibacteriana, Antifngica, Insecticida y Caracterizacin Qumica de los Aceites Esenciales Extrados de Especies Vegetales Aromticas, con Valor Comercial", Tesis BioqumicoFarmacutico, UMSA. 1996. 11.- RETAMAR, Juan. "Curso Sobre Aceites Esenciales" Primera Parte, FCPN-UMSA, 1993. 12.- MOLLI, Jos. "Curso Sobre Aceites Esenciales" Segunda Parte, FCPN-UMSA, 1993. 13.- FLORES, Esther. "Manual de Pruebas Antifngicas para Productos Naturales" IIFB-UMSA, 1998.
14.- VELASCO, Patricia. "Manual de Pruebas Antifngicas para Productos Naturales" IIFB-UMSA, 1998. 15.- KONEMAN W. Elmer. "Diagnstico Microbiolgico" 3ra. Ed. Panamericana, 1992.

3.- BANDONI,Arnoldo, MIZRAHI Isaac, "Taller Normalizacin de Esencias", Programa Agroqumico CORDECO-UMSS; Cochabamba, 1993. 4.- VARRO E, Tyler et al "Farmacognosy", 9Th Edition, Lea Febiger; Philadelphia, (1989). 5.- LOCK DE UGAZ, Olga."Investigacin Fitoqumica", Ed. PUCP; Lima, 1995. 6.- TREASE ANDEVANS "Pharmacongosy" 2'' Edition WB Saunders, Londosn 1998. 7.- www.Frontiercoop.com/aromatherapy. 8: LANCAS F., VILLEGAS J., QUEIROZ M, MARCHIE., "Proyecto Construccin Supercriticas de Productos Naturales, UNICAMP-CAMPINAS, Brasil, 1994.

GRANULADOS FOSCAL TABLETAS

El recalcificante de 1 ra. eleccin

LABORATORIOS ALFA Ltda.

ELTRIANGULO DE LA CALIDAD

Vol. VII- Diciembre de 1999