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Fundamentos de Extração de DNA e RNA MSc. Ana Liedke Importância Uso de DNA para estudos de natureza variada: • diagnóstico (sensível e específico); • medicina (estudo do câncer; identificação doenças); • processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais); • genoma • investigações de perícia, paternidade... Uso de RNA para estudos de natureza variada: • Transcrição Reversa do RNA (cDNA); • Análises de expressão gênica • Northern, RT-PCR, construção de bibliotecas de cDNA Organismos bactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais Organismos bactérias, fungos, vírus, tecidos vegetais e tecidos animais A extração e a purificação de ácidos nucléicos é uma etapa fundamental para se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em cadeia da polimerase (PCR). Tipos de DNA Eucariontes (núcleo individualizado) • DNA nuclear; • DNA mitocondrial; • DNA cloroplasto; Tipos de DNA Eucariontes (núcleo individualizado) • DNA nuclear; • DNA mitocondrial; • DNA cloroplasto; Tipos de DNA Procariontes (sem núcleo) • DNA circular; • DNA plasmidial; Fator adicional: parede celular Extração de DNA/RNA Extração de DNA/RNA Passos principais: • lise das membranas plasmáticas e nucleares; • degradação proteínas; • purificação do DNA/RNA. Para cada tipo de amostra, vários protocolos podem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade. Extração de DNA/RNA Passos principais: • lise das membranas plasmáticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica. detergentes Extração de DNA/RNA Passos principais: • lise das membranas plasmáticas e nucleares; solubilizadas por agentes que rompam associações hidrofóbicas e destruam a bicamada lipídica. detergentes micelas Extração de DNA/RNA Passos principais: • lise + degradação proteínas; detergentes Proteinase k Extração de DNA/RNA Passos principais: • lise + degradação proteínas; A Proteinase K foi descoberta em 1974, no fungo Tritirachium album; É capaz de digerir a queratina (Keratin), daí o nome “Proteinase K”. detergentes Rapidamente inativa as nucleases, que degradam o DNA e RNA Proteinase k Extração de DNA/RNA Passos principais: • lise + degradação proteínas; Digestão em banho-maria com temperatura próxima a 50°C detergentes Proteinase k O tempo de incubação pode variar. Importante é que a amostra se apresente totalmente digerida Extração de DNA/RNA Fenol: desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove as partes orgânicas Aviso: O fenol é um produto altamente tóxico, irritante para a pele e mucosas Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1): eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos. IAA reduz espuma, deixa parte orgânica mais densa. Clorofórmio: retira resíduos de fenol Extração de DNA/RNA Passos principais: • purificação do DNA/RNA (eliminação de resíduos orgânicos) Uso de álcool para a precipitação formação do Pellet A molécula de DNA não é solúvel em álcool e, desta maneira, tende a formar um aglomerado de moléculas quando em meio alcoólico. Notas - Extração de RNA • A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.); • DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminação com RNAses das soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes; • Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas... • Extração usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de células e tecidos; • DNAse; • O RNA total é livre de contaminações por DNA ou proteínas. Quantificação DNA/RNA Espectrofotômetro • • Qualidade da extração Determinação da quantidade de DNA/RNA extraído nucleotídeos podem ser detectados por espectrofotometria a um comprimento de onda de 260 nm 280 nm para estimar a contaminação com proteínas 260 e 280 nm razão 260/280 = 1,7 e 1,9 amostra de DNA com pureza adequada Um valor inferior indica contaminação com proteínas e um valor superior indica contaminação com RNA. Conservação da amostra • Amostras de tecidos (p.ex. animais) devem ser colocadas em álcool absoluto imediatamente após a coleta, e trocado após 24h. • Amostras de partes vegetais devem ser lavadas e secadas com sílica. • Para todas amostras congeladas em estoque, é preferível o fracionamento em pequenas alíquotas para que o material não sofra descongelamentos sucessivos, que poderiam contribuir para a oxidação do tecido e para a degradação do DNA. • O manuseio dessas amostras deve ser feito preferencialmente com o uso de luvas, para que uma parte dos ácidos nucléicos não sejam degradados Material Necessário Para executar os protocolos de extração de DNA, é necessário que o laboratório tenha os equipamentos básicos, o material plástico e todas as soluções utilizadas nos procedimentos. O material mínimo necessário é o seguinte: a) Centrífuga com rotor para vários tipos de tubos b) Capelas de exaustão. c) Banho-maria com termostato ou com termômetro para aferição da temperatura. d) Microtubos de polipropileno. e) Micropipetas automáticas para volumes diversos (com ponteiras). Fundamentos de Eletroforese Agarose (AGE) e Poliacrilamida (PAGE) MSc. Ana Liedke Eletroforese • É um método simples e muito eficiente para separar, para identificar e para purificar fragmentos de DNA, RNA e de proteínas. • Ela consiste na separação de moléculas ionizadas de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular. • Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo). A migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de potencial é chamada de eletroforese. Eletroforese Existem dois modelos básicos de eletroforese: Gel de agarose AGE + Eletroforese Existem dois modelos básicos de eletroforese: Gel de agarose Gel de poliacrilamida - + AGE + PAGE Eletroforese Existem dois modelos básicos de eletroforese: Gel de agarose Gel de poliacrilamida - + AGE + PAGE Fonte Eletroforese Pólo - Pólo + Equipamento - Agarose • Ágar-ágar (ágar ou agarose) • É um hidrocolóide componente da parede celular, extraído de diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta; • insolúvel em água fria • dissolve em água quente (absorve uma quantidade de água de cerca de vinte vezes o seu próprio peso) formando um gel nãoabsorvível, não-fermentável e com importante característica de ser atóxico. • Concentrações de 0,5 – 2,5% Diluídos no tampão TBE ou TAE. (Tris-borato-EDTA ou Tris-acetato-EDTA) Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose •Tamanho do DNA Diferentes tamanhos de moléculas, diferentes taxas de migração no gel de agarose •Concentração da agarose •Conformação do DNA Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose •Tamanho do DNA •Concentração da agarose •Conformação do DNA Fatores que afetam a migração de fragmentos de DNA em géis de agarose •Tamanho do DNA •Concentração da agarose •Conformação do DNA em ≠ formas ou conformação do DNA, a migração ≠ velocidades DNA superenrolado DNA linear mais lento mais rápida Equipamento - Agarose Despeja na forma com o pente Agarose tampão aquece Cuba com Tampão TBE ou TAE Equipamento DNA + marcador migração aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço) adicionar cor às amostras Permite acompanhar a corrida (Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol) (+) marcador de tamanho molecular (Low mass, High e Ultra High...) DNA com fragmentos de tamanho conhecido Equipamento DNA + marcador migração (Glicerol, Ficol, Blue Juice, Azul de bromofenol) aumentar a densidade da amostra (faz afundar no poço) adicionar cor às amostras Permite acompanhar a corrida (+) marcador de tamanho molecular (Low mass, High e Ultra High...) Depois de migrar o suficiente..... Coloração com brometo de Etídio (EtBr) (0,0001%). Transiluminador (caixa de luz UV) Brometo de Etídio AVISO: Danoso se for engolido ou absorvido pela pele. Prejudicial se for inalado. Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório. Intercala entre as fitas de ácidos nucléicos Fluorescente na luz ultravioleta Equipamento - Poliacrilamida Utilizado tanto para Proteínas quanto para DNA/RNA Composto por Acrilamida e Bis-Acrilamida AVISO: Perigoso!!! Danoso se for engolido,inalado ou absorvido pela pele. Causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central. Concentrações diferentes – quanto mais acrilamida, menores os poros Proteínas: a carga e a forma devem ser excluídas, com adição de SDS (dodecilssulfato de sódio) que possui carga negativa – converte proteínas em estrutura linear Equipamento - Poliacrilamida Coloração com: Brometo de Etídio (EtBr), prata (sensibilidade maior: menos amostra no gel e análise de amostra diluída) SYBR Green (menos mutagênico) Coomassie Blue se liga inespecificamente a praticamente todas as proteínas. É menos sensível que corar com a prata mas efetivo também, além de ser fácil de corar Fotodocumentação Transluminador Caixa acoplada máquina fotográfica Computador AGE Fácil preparo, não-tóxico. X PAGE É mais difícil de ser preparado e muito tóxico quando em pó ou em solução. tem maior capacidade de resolução e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base). podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. também usados para separação de proteínas menor capacidade de resolução, porém apresenta maior extensão de separação. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp)