CONTROL DE CALIDAD DE PRUEBAS CUALITATIVAS

Por: Natalia Mara Guevara Arismendy .

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Para garantizar la calidad de un resultado de laboratorio clnico, es imprescindible contar con mtodos validados y verificar su desempeo en las condiciones especficas del laboratorio a travs del tiempo. Los mtodos pueden ser cualitativos o cuantitativos, ambos proveen informacin acerca de la composicin de la muestra, pero slo los cuantitativos ofrecen informacin acerca de la concentracin del analito en estudio. Algunos de los analitos que hacen parte del diagnstico hematolgico, se determinan a travs de mtodos cualitativos, por lo que en este documento de finalidad acadmica, se presentan rn algunos lineamientos acerca del aseguramiento de la calidad de pruebas cualitativas ya validadas.

CARACTERSTICAS DE LAS PRUEBAS CUALITATIVAS Las pruebas cualitativas permiten definir la presencia o ausencia de un analito en una muestra y en muchas ocasiones puede servir como una prueba tamiz, de forma que se determine la concentracin de dicho analito por medio de una prueba cuantitativa. Desde el punto de vista metrolgico, dado que la deteccin cualitativa de los analitos se basa en la determinacin de una o ms cualidades para poder determinar la presencia de un analito, independiente de que la determinacin sea sean realizadas por medio de un instrumento o por un observador, estas pruebas determinan propiedades cualitativas. En este sentido, a partir de muchas de las pruebas cualitativas se obtiene un resultado Positivo/Negativo, Ausente/Presente. Por ejemplo, en las ELISA se parte de la lectura de densidad ptica para la deteccin de una reaccin antgeno anticuerpo y debe determinarse a partir de qu valor de densidad ptica, la prueba se define como positiva o negativa (Valor cut off). Entre los sistemas de deteccin de las pruebas cualitativas se encuentran las sensoriales y las instrumentales. En las pruebas de deteccin sensorial, se utilizan sistemas de deteccin que permitan evidenciar la reaccin del reactivo con el analito, por ejemplo, colorantes, y la intensidad del color puede relacionarse con la concentracin del analito, como en las ELISA. En el caso de las pruebas de deteccin instrumental, por lo general se determina por absorbancia, nefelometra u otros
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Microbiloga y Bioanalista, estudiante MSc en Microbiologa y Bioanlisis con nfasis en Hematologa. Servicio Social Obligatorio en Hematologa.

mtodos por medio de los cuales se define si el analito se encuentra por encima o por debajo del valor de corte; los mtodos con sistemas de deteccin instrumentales pueden ofrecer valores del analito, no obstante considerarse propiedades cualitativas.

VERIFICACIN DE LOS MTODOS CUALITATIVOS En el rea de la salud, toda prueba de laboratorio es susceptible de tomarse como evidencia para la toma de decisiones mdicas y de manejo teraputico de los pacientes, por lo que deben entregarse resultados con la mayor calidad posible y por ello cada prueba debe verificarse de acuerdo con los requerimientos que debe cumplir el mtodo antes de su instauracin dentro del portafolio de servicios de cualquier institucin prestadora de servicios de salud. La validacin se define como aportacin de evidencia objetiva de que un elemento satisface los requisitos especificados2. En este sentido, al definir cul es el analito de inters, deben definirse los requerimientos analticos y con base en estos determinar cul es el mtodo que probablemente sirva para tal fin. Posteriormente, se procede a la verificacin y en caso que cumpla estos requisitos, puede aplicarse en la prctica clnica. Para seleccionar el mtodo que probablemente se adece a los requerimientos analticos, debe seleccionarse un mtodo oficial, que est tanto validado como certificado. Adicionalmente, debe verificarse todo el procedimiento, no slo la medicin en el equipo. La verificacin de un mtodo cualitativo incluye los siguientes parmetros: Sensibilidad: Hace referencia a la capacidad de un mtodo para detectar como positivas las muestras que lo son. De este parmetro se puede derivar la tasa de sensibilidad, calculada a partir del nmero de resultados positivos dividida por el nmero de muestras realmente positivas. Especificidad: Capacidad de un mtodo para detectar como negativas las muestras que lo son. De forma similar a la sensibilidad, puede calcularse la tasa de especificidad. Falsos negativos: Probabilidad de que una muestra que es positiva, se clasifique como negativa con el mtodo que se est evaluando. Falsos positivos: Probabilidad de que una muestra que es negativa, sea clasificada como positiva mediante dicho mtodo. Regin de incertidumbre: Se expresa como una regin con probabilidades de obtener falsas respuestas, ya sean falsos positivos o falsos negativos. En esta regin
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JCGM 200:2008. Vocabulario Internacional de Metrologa Conceptos fundamentales y generales, y trminos asociados. 2008.

pueden obtenerse resultados inconclusos y las concentraciones que lo comprenden estn determinadas por el error del valor cut-off. Lmite de deteccin: Mnima concentracin del analito a la cual el mtodo es capaz de detectar una muestra como positiva. Interferencias: Deben analizarse por la empresa que dise la prueba diagnstica. Robustez: Se refiere al desempeo del mtodo al variar las condiciones ambientales, operacionales y otras. Se considera como opcional para la validacin de mtodos cualitativos. Si bien el valor cut-off no es uno de los parmetros que se incluye para la verificacin, ste constituye un valor de decisin de especial importancia, ya que es la concentracin a la cual el mtodo diferencia una muestra como positiva o negativa con alguna probabilidad de error, generalmente del 5%, y por lo tanto, estar ligado a parmetros de validacin como falsos positivos, falsos negativos y regin de incertidumbre, como previamente se expres. La meta final del proceso la constituye la exactitud, la cual indica el nivel de confiabilidad de una prueba y es estrechamente proporcional a la incertidumbre del mtodo. En la verificacin de un mtodo debe determinarse su exactitud estableciendo un estimado de la incertidumbre del mismo. Para ello, debe contarse con un criterio de la incertidumbre permitida. Igualmente deben calcularse tanto el sesgo como la desviacin estndar indicativos de la veracidad y precisin del mtodo de inters, respectivamente. Materiales de referencia certificados y mtodos primarios Para la verificacin de un mtodo tanto cualitativo como cuantitativo, debe tenerse un material de referencia certificado, el cual no est disponible para varias de las pruebas cualitativas. En caso que est disponible un material de referencia certificado, ste debe contener el analito en cantidades cercanas al lmite de especificacin, de forma que pueda evaluarse si el mtodo en proceso de validacin determina correctamente una muestra como positiva o negativa. Para aquellos mtodos que no cuentan con un material de referencia certificado, pueden emplearse controles de referencia internos (controles), los cuales son muestras que han sido bien caracterizadas con el mtodo disponible en los laboratorios y los proveen los fabricantes del kit o de la prueba y su positividad o negatividad tambin se define con un valor cut-off. Estos controles pueden ser de varios tipos: a) Negativos, sin el analito de inters; b) Positivos, con cantidad conocida del analito; c) Cut-off, con el analito en el valor cut-off y d) Intermedios, como aquellos positivos bajos, en los cuales la muestra da positiva a pesar de que el analito se encuentre en bajas concentraciones.

Durante la verificacin de un mtodo de laboratorio, sus resultados deben compararse con un procedimiento de medida primario, y si este no est disponible o no ha sido definido, debe hacerse contra un procedimiento de medida de referencia o contra un procedimiento de medida recomendado, stos en escala descendiente de importancia o jerarqua metrolgica; sin embargo, muchas de las pruebas cualitativas no poseen un procedimiento de medida primario e incluso no lo poseen de referencia o recomendado. Es por ello, que la ausencia de un procedimiento de medida primario o de referencia, afecta la trazabilidad del mtodo que se est evaluando y aunque algunos de las pruebas cualitativas posean procedimientos de medida de referencia, definidas por una autoridad oficial, no siempre stas hacen parte de la cadena de trazabilidad. Dado que estos son inconvenientes inherentes a las pruebas y al desarrollo histrico y tecnolgico de las mismas, cuando se est verificando un mtodo cualitativo con dichos inconvenientes, pueden tomarse algunas medidas que si bien no son las ideales, pueden ayudar a contrarrestar las deficiencias relacionadas con la ausencia de los procedimientos de medida primario, tales como tener en cuenta los procedimientos de medida de referencia para seleccionar equipos de laboratorio, y por ejemplo, algunos autores tambin recomiendan la evaluacin interlaboratorio del mtodo de inters. En la tabla 1, se citan algunas de las principales pruebas de hematologa con su procedimiento de medida primario (en caso que est definido), con el procedimiento de medida referencia o con el procedimiento de medida recomendado y con el material de referencia certificado, en caso que lo haya3. Entre las pruebas a las cuales no se les identificaron dichos procedimientos o material de referencia certificado en esta revisin de la literatura, se el recuento diferencial de leucocitos, Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado, Tiempo de Trombina, Factor V de la coagulacin, Hemoglobina S, entre otros.

Fuentes X, et al. CDEX del laboratorio clnico. Indicaciones e interpretacin de los exmenes de laboratorio. Madrid: Elsevier. 2003

Tabla 1: procedimientos de medida primario, de referencia o recomendado y material de referencia certificado disponibles para las principales pruebas hematolgicas y de hemostasia.
Prueba Antitrombina --Procedimiento de medida primario Procedimiento de medida referencia ----Procedimiento de medida recomendado Materiales de referencia certificados Antithrombin concentrate 2nd IS 95/250 (NBSC/WHO) Antithrombin, plasma, Human 2nd IS 93/768 (NIBSC/WHO) Blood coagulation Factors, Plasma, human 8th British Standard 98/734 (NIBSC). Thromboplastin (human combined) 1st IRP 67/40 (WHO). Thromboplastub (bovine combined) 1st IRP 68/434 (WHO) Thromboplastin (rabbit plain) 1st IRP 70/178 (WHO) Thromboplastub (human plain) 2nd IRP BCT/253 (WHO) Thromboplastin (bovine combined) 2nd IRP OBT/79 CRM 148 (WHO). Thromboplastin (rabbit plain) 2nd IRB RBT/79 CRM 149 (WHO). Thromboplastin (human plain) 3rd IRP X/95 (WHO). Thromboplastin (rabbit plain) 3rd IRP RBT/90 (WHO). Nieuwenhuizen W. A Reference Material for Harmonisation of D-Dimer Assays. Thromb Haemost. 1997; 77: 103-33. ---

Coagulacin del plasma inducida por el factor tisular (tiempo de protrombina)

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Dmero D

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Eritrocito (incluye recuento, hematocrito y volumen

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Reference method for the enumeration of erythrocytes and leucocytes. Clin Lab Haematol. 1994; 16: 131-8.

International Committee for Standarization in Haematology. Recommended methods for red cell enzyme analysis. Br J Haematol. 1997;

Prueba corpuscular medio)

Procedimiento de medida primario

Procedimiento de medida referencia

Eritrosedimentacin

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Factor VIII de la coagulacin

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International Committee for Standardization in Haematology. Recommendation for measurement of erythrocyte sedimentation rate of human blood. Am J Clin Pathol. 1977; 68: 505-507 ---

Procedimiento de medida recomendado 35. 331-340 World Health Organisation. Recommended methods for the determination of packed cell volumen by centrifugation. Who Document LAB/89.1, 1989. Biochim Clin. 1990; 14: 405-10 ---

Materiales de referencia certificados

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Factor IX de la coagulacin

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Blood coagulation Factor VIII and von Willebrand factor in plasma, human 4th IS 97/586 (NIBSC/WHO). Blood coagulation Factor VIII: C concentrate, human 6th IS 97/616 (NIBSC/WHO). Blood coagulation Factor VIII concentrate, human 11th British Standard 95/608 (NIBSC). Blood coagulation Factor VIII plasma, human 20th British Standard 95/518 (NIBSC). Blood Coagulation Factor II, VII, IX, X, Plasma, Human. 2nd IS 94/746 (NIBSC/WHO). Blood Coagulation Factor II, VII, IX, X, Plasma, Human 3rd IS 99/826 (NIBSC/WHO). Blood Coagulation Factor IX Concentrate 3rd IS 96/854 (NIBSC/WHO) Blood Coagulation Factors, Concentrate, human 4th British Standard 96/794 (NIBSC).

Prueba

Procedimiento de medida primario

Procedimiento de medida referencia

Procedimiento de medida recomendado

Materiales de referencia certificados Blood Coagulation Factor IXa concentrate, human, recombinant 1st IS 97/562 (NIBSC/WHO). Blood coagulation Factor VIII and von Willebrand factor in plasma, human 4th IS 97/586 (NIBSC/WHO). Von Willebrand Factor, concentrate 1st IS 00/514 (NIBSC/WHO). Fibrinogen concentrate, human 1st IS 98/614 (NIBSC/WHO). Fibrinogen, plasma 2nd IS 98/612 (NIBSC/WHO). Haemoglobin A2 Lysate, Raised 1st IRR 89/666 (NIBSC/WHO). Haemoglobin F Lysate, Raised 1st IRR 85/616 (NIBSC/WHO).

Factor von Willebrand

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Firbingeno

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Hemoglobin A2 Hemoglobin F Leucocitos (Recuento total) Protena C

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----Reference method for the enumeration of erythrocytes and leucocytes. Clin Lab Haematol. 1994; 16: 131-8 ---

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Protena S Reticulocitos

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Protein C, plasma 1st IS 86/622 (NIBSC/WHO). Blood coagulation Factors, Plasma, human 8th Brithish Standard 98/734 (NIBSC). Protein S, plasma, human 1st IS93/590 (NIBSC/WHO).

o Evaluacin del desempeo de mtodos cualitativos: Tablas de contingencia Para evaluar el desempeo de los mtodos cualitativos, se emplean con mayor frecuencia las tablas de contingencia, aunque tambin pueden emplearse test de hiptesis estadstica, curvas caractersticas de desempeo, entre otras. La seleccin por alguna de estas se basa principalmente en el tipo de resultado que se obtiene de un sistema de medicin instrumental, entre otras caractersticas. Entre las principales se encuentran las tablas de contingencia, las cuales se caracterizan por su fcil aplicacin y simple diseo, adems, permiten el clculo de probabilidades estadsticas. Entre las ms simples, se encuentran aquellas de dos categoras o tablas 2x2, las cuales permiten comparar resultados bicategricos del procedimiento de medida primario, de referencia o recomendado con el mtodo que se est validando. A continuacin se presenta un esquema simple:
Tabla #2: Ejemplo tabla de contingencia 2x2 para mtodos cualitativos en validacin Procedimiento de medida primario, de referencia o recomendado Total Mayor que Menor que Mtodo en validacin Positivo Negativo Total VP FN VP+FN FP VN FP+VN VP+FP FN+VN VP+VN+FP+FN

VP, Verdadero Positivo; FP, Falso Positivo; FN, Falso Negativo; VN, Verdadero Negativo

A partir de la aplicacin de dicha herramienta en mtodos cualitativos, se obtienen dos parmetros de desempeo imprescindibles para la validacin: falsos positivos y falsos negativos. As mismo, se obtiene la informacin necesaria para calcular los valores predictivos positivos y negativos de la prueba en evaluacin. Adicionalmente, las tablas de contingencia tambin pueden emplearse en otros componentes de la calidad, como la evaluacin de profesionales en la ejecucin de una prueba de laboratorio. Por ejemplo, si se desea realizar un estudio para comparar los resultados en la lectura de recuentos diferenciales de leucocitos entre varios bacterilogos del mismo laboratorio, pueden disearse tablas de contingencia que permitan comparar los resultados, tomando como referencia a un experto en el rea, el cual debe ser externo a la institucin que est implementando dicha evaluacin a su personal. Si la intencionalidad de las tablas de contingencia son la evaluacin de profesionales de laboratorio, debe tenerse en cuenta que stos debe contar con entrenamiento bsico, deben tener en cuenta el procedimiento de medida de referencia, deben aplicar el mismo protocolo y debe tenerse en cuenta la calidad de materiales crticos empleados durante todo el procesamiento de la muestra. Para mayor

informacin al respecto de esta aplicacin, se recomienda la revisin del documento H20 A2, segunda versin del CLSI (por su significado en ingls Clinical and Laboratory Standardd Institute), en la cual se hace referencia al Conteo diferencial de leucocitos y evaluacin de mtodos estndar, como tambin a los resultados aceptables en el recuento diferencial de leucocitos por el mtodo manual, el cual se considera como mtodo de referencia cuando se va a evaluar este parmetro del hemograma en un equipo de hematologa que se encuentra en proceso de validacin. Es as, como las tablas de contingencia se posicionan como un elemento verstil para su aplicacin en procesos de calidad, constituyendo una parte del proceso de validacin de un mtodo cualitativo, que, como se describi brevemente, comprende varios parmetros y procedimientos. o ndice Kappa Permite evaluar la concordancia entre mtodos para medir el mismo analito. Adems, su frmula incluye una correccin que excluye la concordancia que se debe al azar, por ello, la cuantificacin del ndice kappa parte del supuesto de que existe independencia entre los dos mtodos de clasificacin, por lo se supone que la probabilidad de que dichos mtodos coincidan clasificando la misma muestra como positiva, es el producto de ambas probabilidades y dicho precepto tambin se aplica al clasificar una muestra como negativa. Por lo tanto, la probabilidad de acuerdo de ambos mtodos para positivos y negativos constituye el nivel de concordancia. Para su clculo, se dispone de software y calculadoras estadsticas que permiten la determinacin matemtica de este ndice a partir del anlisis cruzado de tablas; los valores que se obtienen se encuentran entre 0 y 1, siendo 0 la ausencia de concordancia y 1 la mxima concordancia posible. Dependiendo del valor kappa que se obtiene, se determina la concordancia en varias categoras, como se expresa en la tabla a continuacin:
Tabla #3: Valoracin del ndice Kappa: Valor del ndice Kappa <0.2 0.21-0.40 0.41-0.60 0.61-0.80 >0.80 Fuerza de la concordancia Pobre Dbil Moderada Buena Muy buena

Este ndice puede calcularse no slo para mtodos con resultados dicotmicos, sino tambin para aquellos con resultados politmicos. Adems, puede aplicarse para evaluar la concordancia entre dos o ms observadores en la ejecucin de mtodos cualitativos con sistema de deteccin sensorial; sin embargo, no puede aplicarse en mtodos donde las categoras de respuesta son ordinales, ya que no permite

estimar la gravedad de una mala clasificacin entre mtodos o lectores si el resultado lo ubican en una categora diferente, por lo que deben evaluarse los mtodos a travs de otras medidas de concordancia o emplear el ndice kappa para evaluar individualmente la concordancia entre la misma categora. CONCLUSIN En resumen, previo a la aplicacin de una prueba de concordancia, debieron tenerse en cuenta diferentes aspectos para la verificacin del mtodo, entre ellos el procedimiento de medida primario, de referencia o recomendado, los materiales de referencia certificados, las caractersticas intrnsecas del mtodo que se quiere verificar y el sistema de deteccin que emplea. Posteriormente, se evalan parmetros como falsos positivos y negativos, sensibilidad, especificidad, valor cut off, robustez, lmite de deteccin, incertidumbre, entre otros, por lo que la verificacin de mtodos cualitativos puede llegar a ser incluso ms compleja que la de mtodos cuantitativos y se requiere del compromiso de todo el profesional de laboratorio implicado en dicho fin.

BIBLIOGRAFA Aguilera E, Lucena R, Crdenas S, Valcrcel M, Trullos E, Ruisnchez I. Robustness in qualitative analysis: a practical approach. Trends in Anal. Chem. 2006; 25: 621-627 Fuentes X, et al. CDEX del laboratorio clnico. Indicaciones e interpretacin de los exmenes de laboratorio. Madrid: Elsevier. 2003. JCGM 200:2008. Vocabulario Internacional de Metrologa Conceptos fundamentales y generales, y trminos asociados. 2008. Lpez de Ullibarri GI, Pita S. Unidad de Epidemiologa Clnica y Bioestadstica. Complexo Hospitalario-Universitario Juan Canalejo.) Cad Aten Primaria 1999; 6: 169171. Molinero, LM. Medidas de concordancia para variables cualitativas. Asociacin de la Sociedad Espaola de Hipertensin. Liga Espaola para la Lucha contra la Hipertensin Arterial. 2001. Trullols E. Validation of Qualitative Analytical Methods. Thesis to obtain the degree of Doctor from the Universitat Rovira i Virgili. Tarragona, 2006 Trullols E, Ruisnchez I, Rius FX. Validation of qualitative analytical methods. Trends in Anal. Chem. 2004; 23: 137145 Trullols E, Ruisnchez I, Rius FX, Huguet J. Validation of qualitative methods of analysis that use control samples. Trends in Anal. Chem. 2005; 24: 516-524.