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UNIVERSIDADE PARANAENSE UNIPAR MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA AGRICULTURA DISCIPLINA DE GENTICA GERAL E DE POPULAES MESTRANDOS: DOUGLAS ANTONIO DIAS

AS E TIAGO VIDIGAL PROFESSORA: CLAUDICIA RISSO PASCOTTO

VIAS DE REPARO DO DNA

A integridade do DNA est sob constante ameaa de radiao, mutgenos qumicos e mudanas que surgem espontaneamente. A despeito do ataque de agentes danosos, a taxa de mutao permanece baixa, graas eficincia com a qual o DNA reparado. Menos de uma em um milho de sees do DNA estimada como se tornando uma mutao; todas as outras so corrigidas. Existe um nmero complexo de vias para o reparo do DNA, mas vrias afirmativas gerais podem ser feitas sobre o reparo do DNA. Primeira, a maioria dos mecanismos de reparo do DNA requerem dois filamentos de nucleotdeos do DNA, porque a maioria substitui nucleotdeos inteiros, e um filamento molde necessrio para especificar a sequncia de bases. Uma segunda caracterstica geral do reparo do DNA a redundncia: muitos tipos de danos ao DNA podem ser corrigidos por mais de uma via de reparo. A redundncia comprova a extrema importncia do reparo do DNA para a sobrevida da clula:garante que quase todos os erros sejam corrigidos. Se um erro escapa de um sistema de reparo, ele provavelmente ser reparado pelo outro sistema. Consideraremos quatro mecanismos gerais de reparo do DNA: reparo de pareamento errado, reparo direto, reparo por exciso de bases e reparo por exciso de nucleotdeos.

REPARO DE PAREAMENTO ERRADO

A replicao extremamente precisa: cada cpia nova do DNA tem menos de um erro por bilho de nucleotdeos. Entretanto, no processo de replicao, as bases de pareamento errado so incorporadas ao novo DNA com uma frequncia de 10-4 a 10-5; logo, a maioria dos erros que surgem inicialmente so corrigidos e nunca se tornam mutaes permanentes. Algumas dessas correes so feitas na reviso pelas DNA polimerases. Muitos nucleotdeos inseridos incorretamente que escapam da deteco pela reviso so corrigidos pelo reparo de pareamento errado. As bases de pareamento errado distorcem a estrutura tridimensional do DNA, estas modificaes so reconhecidas pelas enzima de reparo de pareamento errado. O sistema de reparo de pareamento errado tambm corrige pequenas alas no pareadas no DNA, como as causadas por deslizamento de filamento na replicao. Repeties de trinucleotdeos podem formar estruturas secundrias no filamento no pareado, as quais escapam da deteco pelo sistema de reparo de pareamento errado. Aps reconhecer o erro de incorporao, as enzimas de reparo de pareamento errado eliminam o trecho distorcido do filamento recm-sintetizado e preenchem o espao com novos nucleotdeos, usando o filamento original de DNA como molde. O sistema de reparo de pareamento errado distingue os filamento novo e antigo do DNA, assim, apenas a parte contendo o erro removida. As protenas que fazem o reparo de pareamento errado em E. coli diferenciam entre os filamentos velho e o novo pela presena de grupos metila em sequncias especiais do filamento velho. Aps a replicao, os nucleotdeos adenina na sequncia GATC so metilados. O processo de metilao retardado, e, assim, imediatamente aps a replicao, o filamento velho metilado e o filamento novo no. O complexo de reparo de pareamento errado coloca uma sequncia no metilada GATC em ntima proximidade a bases de pareamento errado. Ele corta o filamento no metilado no stio GATC,

e degrada o filamento entre o corte e as bases de pareamento errado. A DNA polimerase e a DNA ligase preenchem o espao no filamento no metilado com nucleotdeos corretamente pareados. O reparo de pareamento errado nas clulas eucariticas similar ao de E. coli mas no se sabe como os filamentos antigo e novo so reconhecidos nas clulas eucariticas. Em alguns eucariontes, como leveduras e moscasdas-frutas, no h metilao detectvel do DNA, e ainda assim ocorre o reparo de pareamento errado.

REPARO DIRETO

O reparo direto no substitui os nucleotdeos alterados, mas os devolve a suas estruturas corretas. Um dos sistemas de reparo mais bem compreendidos de reparo direto a fotorreativao de dmeros induzidos por UV. Tanto E. coli quanto algumas clulas eucariticas possuem uma enzima, chamada fotoliase, capaz de utilizar a energia captada da luz para quebrar ligaes covalentes que unem as pirimidinas em um dmero. O reparo direto tambm corrige O6- metil- guanina, um produto alquilante que faz par com adenina, produzindo transverses G.*C T*A. Uma enzima chamada de O6 metilguanosina DNA metil transferase remove o grupo metila de O6- metil- guanina, restaurando a base guanina.

REPARO POR EXCISO DE BASES

No reparo por exciso de bases, uma base modificada primeiro removida, e ento o nucleotdeo inteiro substitudo. A exciso de bases modificadas catalisada por um conjunto de enzimas chamadas de DNA glicosilases, cada uma das quais reconhece e remove uma base modificada e especfica por clivagem da ligao que une essa base com o carbono 1 do acar desoxirribose. A uracil glicosilase, por exemplo, reconhece e remove uracil produzida pela desaminao de citosina. Outra glicosilasse reconhece hipoxantina, 3 metiladenina, 7 metilguanina e outras bases modificadas. Aps a base ter sido removida, uma enzima chamada AP (apurnica ou apirimidnica) corta a ligao fosfodister e outras enzimas removem o acar desoxirribose. A DNA polimerase ento adiciona novos nucleotdeos ao ncleo 3 OH exposto, substituindo um trecho de nucleotdeos do filamento danificado. O corte na ligao fosfodister fechado pela DNA ligase, e a sequncia original intacta restaurada. As bactrias usam a DNA polimerase I para substituir nucleotdeos excisados, mas os eucariontes usam a DNA polimerase , que no tem capacidade de reviso e tende a cometer erros. Em mdia a DNA polimerase comete um erro a cada 4000 nucleotdeos inseridos. Cerca de 20.000 a 40.000 modificaes de bases por dia so reparadas por exciso de base, e assim a DNA polimerase pode introduzir 10 mutaes por dia no genoma humano. Estas mutaes podem ser corrigidas pela habilidade de reviso das endonucleases AP: quando a DNA polimerase insere um nucleotdeo com a base errada no DNA, a DNA ligase no pode fechar o corte na ligao fosfodister, porque os grupos 3-OH e 5-P e nucleotdeos adjacentes no esto na orientao correta e a ligase no pode lig-los. Nesse caso a endonuclease I AP detecta o paremanento errado e usa sua atividade de endonuclease 3 5 para excisar a base incorretamente pareada. A DNA polimerase usa sua atividade de polimerase para introduzir o nucleotdeo ausente. Deste modo, a fidelidade da remoo de bases mantida.

REPARO POR EXCISO DE NUCLEOTDEOS

No reparo por exciso de nucleotdeos so removidas leses volumosas de DNA (como dmeros de pirimidina) que distorcem a dupla hlice. O reparo de nucleotdeos bem verstil e pode reparar muitos tipos diferentes de danos ao DNA. Ele encontrado em clulas de todos os organismos, de bactrias a humanos e est entre os mais importantes de todos os mecanismos de reparo. O processo de exciso de nucleotdeos complexo; em humanos um grande nmero de genes toma parte. Primeiro, um complexo de enzimas escaneiam o DNA, procurando distores de sua configurao tridimensional. Quando detectada uma distoro, enzimas adicionais separam os dois filamentos de nucleotdeos na regio danificada, e as protenas de ligao unifilamentar estabilizam os filamentos separados. Em seguida, o a ligao fosfodister do filamento danificado clivado em ambos os lados do dano. Parte do filamento danificado removida e o espao preenchido pela DNA polimerase e ligado pela DNA ligase.

OUTROS TIPOS DE REPARO DE DNA

Alguns tipos de danos ao DNA, afetam ambos os filamentos da molcula e, portanto, criam um desafio mais grave maquinaria de reparo de DNA. A radiao ionizante, frequentemente quebra ambas as fitas do DNA. O reparo de quebras bifilamentares geralmente por recombinao homloga. Outro tipo de dano que afeta ambos os filamentos uma ligao cruzada interfilamentar, que surge quando os dois filamentos de um dplice so conectados por ligaes covalentes. As ligaes cruzadas interfilamentares so extremamente txicas param a replicao. Vrias drogas comumente usadas em quimioterapia, incluindo a cisplatina, mitomicina C, psoralen e nitrognio

mostarda, causam ligaes cruzadas interfilamentares. O nitrognio mostarda, que se relaciona estruturalmente ao gs mostarda usado por Charlotte Auerbach para induzir mutaes em Drosophila, foi o primeiro agente qumico a ser usado em quimioterapia. Pouco se sabe sobre como as ligaes cruzadas interfilamentares so reparadas. Um modelo prope que as quebras bifilamentares so feitas em cada lado da ligao cruzada e so subsequentemente bifilamentares. reparadas pelas vias que reparam as quebras

A VIA BSICA DE REPARO DO DNA

A maioria dos mtodos de reparo do DNA depende da presena de dois filamentos, porque os nucleotdeos so substitudos no reparo de pareamento errado, reparo por exciso de bases e reparo por exciso de nucleotdeos, mas no so substitudos por mecanismos de reparo direto. Os mecanismos de reparo que incluem a remoo de nucleotdeos usam uma via comum de quatro etapas:
1. Deteco: o trecho danificado do DNA reconhecido. 2. Exciso: as endonucleases de reparo do DNA cortam o arcabouo de

fosfodister em um ou em ambos os lados do DNA danificado, e um ou mais nucleotdeos so removidos.


3. Polimerizao: a DNA polimerase adiciona nucleotdeos ao grupo 3-

OH exposto usando o outro filamento como molde e substituindo os nucleotdeos danificados (e, frequentemente, alguns no danificados.
4. Ligao: a DNA ligase fecha os cortes no arcabouo acar-fosfato.

Na exciso de bases e reparo de pareamento errado, feito um nico corte a ligao fosfodister no lado do dano: no reparo por exciso

de nucleotdeos, so feitos cortes em ambos os lados da leso do DNA. No reparo por exciso de bases, a DNA polimerase desloca os nucleotdeos antigos medida que adiciona novos nucleotdeos ponta 3 do corte; no reparo de pareamento errado, os nucleotdeos antigos so degradados, e, no reparo por exciso de nucleotdeos, os nucleotdeos so deslocados pelas enzimas helicase. Todos os trs mecanismos usam a DNA polimerase e ligase para preencher o espao produzido pela exciso e remoo dos nucleotdeos danificados.

DOENAS GENTICAS E REPARO POR DNA DANIFICADO

Vrias doenas humanas so ligadas a defeitos no reparo do DNA. Essas doenas geralmente esto associadas a altas incidncias de cnceres especficos, porque os defeitos no reparo do DNA levam a aumentos de taxas de mutao. Entre as doenas mais bem estudadas no reparo do DNA humano est o xeroderma pigmentoso, rara condio autossmica recessiva que inclui pigmentao anormal da pele e sensibilidade aguda luz do sol. As pessoas com essa doena tambm tem uma fonte predisposio ao cncer de pele, como um aumento variando de 1000 a 2000 vezes o encontrado nas pessoas no afetadas. A luz do sol inclui um forte componente UV; logo, a exposio luz do sol produz dmeros de pirimidina no DNA das clulas da pele. Embora as clulas humanas no tenham fotoliase (que repara dmeros de pirimidina nas bactrias) a maioria dos dmeros de pirimidina em humanos pode ser corrigida pelo reparo de exciso de nucleotdeos. Entretanto, as clulas da maioria das pessoas com xeroderma pigmentoso so defectivas no reparo por exciso de nucleotdeos, e

muitos de seus dmeros de pirimidina no so corrigidos, levando ao cncer. O xeroderma pigmentoso pode resultar de defeitos em vrios genes diferentes. Algumas pessoas com xeroderma pigmentoso tem mutaes em um gene que codifica a protena que reconhece e se liga ao DNA danificado; outras tm mutaes em um gene que codifica helicase. Outras, ainda, tem defeitos nos genes que tem um papel em cortar o filamento danificado nos lados 5 ou 3 do dmero de pirimidina. Algumas pessoas tem uma forma levemente diferente da doena (variante de xeroderma pigmentoso) devido a mutaes no gene codificante da polimerase a DNA polimerase que ultrapassa os , dmeros de pirimidina inserindo AA. Duas outras doenas genticas devidas a defeitos no reparo por exciso de nucleotdeos so a sndrome de Cockayne e a tricotiodistrofia (tambm conhecida como sndrome dos cabeos quebradios). As pessoas que tm uma dessas doenas no apresentam aumento do risco de cncer, mas sim mltiplos problemas de desenvolvimento e neurolgicos. Ambas as doenas resultam de mutaes em alguns dos mesmos genes que causam xeroderma pigmentoso. Vrios genes que tomam parte no reparo por exciso de nucleotdeos produzem protenas que tambm tem papel na recombinao e na iniciao da transcrio. Essas outras funes podem levar aos sintomas desenvolvimentais vistos na sndrome de Cockayne e na tricotiodistrofia. Outra doena gentica causada por reparo defeituoso de DNA uma forma hereditria de cncer de clon chamada de cncer de clon no polipose hereditria (HNPCC). Esse um dos cnceres hereditrios mais comuns, contribuindo com cerca de 15% dos cnceres de clon. Os achados de pesquisas indicam que o HNPCC surge de mutaes nas protenas que fazem o reparo de pareamento errado.

REFERNCIAS

PIERCE, Benjamin A. Gentica: um enfoque conceitual. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011. 774 p.