ANALISA PROTEIN DENGAN METODE KJELDAHL

Tahap destruksi Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya.

Tahap destilasi Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP.

Tahap titrasi Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP. Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah: HCl 0,1 N + NaOH 0,1 N Kelebihan Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut: %N = ml NaOH blanko ml NaOH sampel N. NaOH 14,008 100% Gram bahan x 1000 Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda. Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut: %N = ml NaOH blanko ml NaOH sampel N. HCl 14,008 100% Gram bahan x 1000 NaCl + H2O

Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan. Kadar protein (%) = % N x faktor konversi Nilai faktor konversi berbeda tergantung sampel: Apabila faktor konversi tidak diketahui, faktor 6,25 dapat digunakan . Faktor ini diperoleh dari fakta rata-rata nitrogen dalam protein adalah 16 %. Kadar Protein (%) = N x 100/16 = N x 6,25

Analisa Protein Pada Kedelai

1. Proses Destruksi

Ditimbang 1 g bahan yang telah dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl, namun karena kandungan protein tinggi pada kedelai maka digunakan bahan kurang dari 1 g Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat. dipanaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan diteruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan menjadi jernih. ditambahkan pemanasan kurang lebih 30 menit, dimatikan pemanasan dan dibiarkan sampai dingin. Selanjutnya ditambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya ditambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan dalam lemari es.

2. Proses Destilasi Diipasang labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Dipanaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian dipanaskan dengan cepat sampai mendidih. Destilat ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan indicator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N. Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml.

3. Proses Titrasi Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N. Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko. Ada pun penentuan kadar protein kasar : Protein Kasar = (y-z) X titar NaOH X 0,014 X 6,25 X 100% Berat Sampel (x) g

Analisa Protein dengan Metode Bradford

Material yang digunakan

Pereaksi (Reagent) Pereaksi yang digunakan dibuat dengan melarutkan 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml ethanol 95%. Larutan ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml asam fosfat 85% dan diencerkan sampai volume 1 L dengan aquadest. Pereaksi ini harus difilter dengan kertas saring Whatman no. 1 dan disimpan dalam botol amber (gelap) di suhu ruang. Pereaksi ini stabil hingga beberapa minggu, namun jika terbentuk endapan ketika penyimpanan, maka harus difilter lagi saat hendak digunakan. Standar Protein Bovine -globulin dengan konsentrasi 1 mg/ml (atau 100 g/ml untuk microassay) digunakan sebagai larutan stok (disimpan beku pada suhu -20oC). Konsentrasi protein larutan standard harus diukur sebelum digunakan dengan mengukur absorbansinya pada 280 nm. Absorbansi larutan Bovine -globulin 1mg/ml pada cuvet 1 cm adalah 1.35. Jika yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) atau Ovalbumin, maka absorbansinya masing-masing adalah 0.66 dan 0.75. Alat Gelas dan Plastik Alat gelas dan plastik yang digunakan harus benar-benar bersih dan bebas detergen. Jangan menggunakan cuvet silika (Quartz) untuk pengukuran spektrofotometer karena zat pewarna dapat terikat pada bahan ini.

Standard Assay

Pipet 100 l sample yang mengandung kira-kira 10 100 g protein. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui, maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1, 1:10, 1:100, 1:1000, dst). Siapkan secara duplo. Untuk kurva kalibrasi, buatlah seri larutan standard 100, 200, 400, 600, 800 dan 1000 g/ml. Lalu pipet masing-masing 100 l ke dalam tabung. Siapkan blanko dengan aquadest 100 l. Tambahkan 5 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung sample dan standard, campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan. Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit. Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelombang 595 nm.

Catatan:

Standard 100 g akan memberikan absorbansi sekitar 0.4. Kurva standard-nya tidak linear, dan presisi absorbansinya bervariasi bergantung pada lamanya inkubasi. Jadi kurva kalibrasi harus dibuat untuk setiap assay.

Microassay

Pipet 100 l sample yang mengandung kira-kira 1 10 g protein ke dalam tabung Eppendorf 1.5 ml. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui, maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1, 1:10, 1:100, 1:1000, dst). Siapkan secara duplo. Untuk kurva kalibrasi, buatlah seri larutan standard 10, 20, 40, 60, 80 dan 100 g/ml. Lalu pipet masing-masing 100 l ke dalam tabung. Siapkan blanko dengan aquadest 100 l. Tambahkan 1 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung, campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan. Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit. Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelsombang 595 nm. Nilai absorbansi untuk sampel yang mengandung 10 g -globulin adalah 0.45.