CULTIVOS INDUSTRIALES DE MICROORGANISMOS. (FERMENTACIONES) 1.

INTRODUCCIN La Biotecnologa consiste en utilizar bacterias, levaduras, hongos, algas y clulas animales o vegetales en cultivos cuyo metabolismo est orientado a la produccin de determinadas sustancias. As con la aplicacin integrada de los conocimientos y las tcnicas de la bioqumica, la microbiologa, la gentica y la ingeniera qumica surge la bioindustria capaz de producir, a partir de recursos renovables y disponibles en abundancia, gran cantidad de compuestos esenciales para la vida y para mejorar la condicin del hombre. Una parte importante de los productos de esta industria son obtenidos por tcnicas de fermentacin de microorganismos (mo) considerando a estos como aquellas formas de vida cuyos individuos son de una magnitud tal que es preciso el uso del microscopio para su observacin. Son de inters industrial bacterias, levaduras y hongos de cuyos cultivos pueden obtenerse cidos orgnicos, alcoholes, antibiticos , por citar algunos ejemplos, siendo en algunas ocasiones el producto su propia masa (biomasa) o algn extracto de la misma. Actualmente se trabaja en la obtencin de fertilizantes y plaguicidas a partir de mo que pueden sustituir gradualmente a los de origen qumico constituyendo un aporte a la conservacin del medio ambiente, pues es conocido que estas sustancias van ocasionando lentamente el deterioro de los suelos con efectos igualmente nocivos en los alimentos. Hay tambin mo causantes de enfermedades (patgenos) que pueden ser inescrupolasamente utilizados como armas de guerra biolgica o con un fin ms noble en el control de vectores de enfermedades. Ante la diversidad de usos que se dan a los mo, es conveniente que el futuro ingeniero Industrial tenga una visin general de este tipo de producciones. 2. FERMENTACIN Puede definirse como el proceso metablico que transforma los hidratos de carbono (carbohidratos) en alcoholes, cidos orgnicos, aldehdos o cetonas con la formacin de dixido de carbono. Esta denominacin est dada sobre la base de las alteraciones que en presencia de levaduras ocurren en los jugos azucarados de frutas que se transforman en otros compuestos ms estables denominados vinos. Hoy da el trmino fermentacin se hace extensivo a los cultivos de microorganismos en general. Por ejemplo se dice que el antibitico conocido por penicilina se obtiene de la fermentacin de un tipo especfico de hongo conocido por Penicillium notatum. Podemos tambin definir la fermentacin como la oxidacin incompleta de carbohidratos, aminocidos y sustancias similares por la accin de los mo. La participacin de los mo puede requerir O2 (fermentacin aerbica). La fermentacin aerbica puede llevar la descomposicin de los carbohidratos u otra sustancia fermentable hasta la oxidacin completa o sea hasta obtener dixido de carbono y agua. C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O HR = - 2817 J Glucosa Ahora bien en la fermentacin anaerobia el mo realiza la oxidacin incompleta de las sustancias orgnicas a expensas de su habilidad para tomar el oxgeno de estas.

En la fermentacin anaerobia el mo no es capaz de liberar toda la energa que puede obtenerse de u proceso respiratorio donde la oxidacin es completa. C6H12O6 2 CH3CHOH COOH HR= - 94, 05 J cido lctico C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 HR= - 91,96 J Etanol C6H12O6 3 CH3COOH HR= - 62,75 J cido actico Debemos tener en cuenta que el mo utiliza parte de la energa en su reproduccin (asimilacin de nutrientes) y el resto se libera en forma de calor, es decir que el proceso de fermentacin (desasimilacin) es exotrmico aspecto de gran importancia en su explotacin industrial.
2.1 CLASIFICACIN DE LAS FERMENTACIONES.

Es preciso definir que llamamos sustrato limitante (S) al componente del medio de cultivo que controla la velocidad de crecimiento del mo y por lo general lo constituye la fuente de carbono. Gaden clasifica las fermentaciones atendiendo a la relacin entre el consumo de S y la formacin de productos. Tipo I Relacin directa entre el consumo de S y la formacin de producto P
g .- gramos L .- litros t .- tiempo

Tipo II Consumo de sustrato no asociado a la formacin de producto.

Otra clasificacin mas bien prctica tiene en cuenta la forma de conducirse el proceso industrial y as tenemos: Cultivo a templa (batch)- Se colocan en el fermentador todos los componentes del medio de cultivo desde el inicio del proceso Ej: fermentacin anaerbica de Sacharomyces cerevisiae en la obtencin de etanol. Cultivo continuo- Se introduce al fermentador de forma continua el medio de cultivo en la cantidad jus ta para satisfacer la necesidad del cultivo y simultneamente se extrae ese mismo volumen de medio fermentado. Ej: cultivo de Candida utilis para obtencin de biomasa. Cultivo con alimentacin incrementada- Se realiza sin extraccin de medio fermentado requiriendo cada vez mayor entrada de medio de cultivo por la acumulacin de mo en el fermentador hasta el final del proceso. Ej: fermentacin aerbica de Saccharomyces cerevisiae (cepa panadera). 3. MICROORGANISMOS Los microorganismos son seres vivos que pertenecen al reino de los protistas (del griego Protos que significa primitivos) y los ubican entre los reinos vegetal y animal. La clula o clulas de que consta un microorganismo estn compuestas por los mismos elementos bsicos de las clulas vegetales, o sea: pared celular, citoplasma y ncleo. Ahora bien todos los protistas no son iguales y pueden considerarse dos grupos: Procariones y Eucariones que tienen en cuenta la complejidad de las clulas fundamentalmente la existencia de un ncleo bien definido en los ltimos que incluyen a levaduras y hongos.

La pared o membrana celular es una pelcula delgada e incolora que en las bacterias est formada por hemicelulosa y protenas; en las levaduras adems aparecen pequeas cantidades de quitina y en los hongos filamentosos tambin. Dentro de la pared celular se encuentra la membrana citoplasmtica que es semipermeable y deja pasar agua y soluciones con sustancias de molculas pequeas. El citoplasma ocupa la mayor parte del interior de la clula y es un lquido viscoso formado de agua y albuminoides. En clulas viejas se forman unas cavidades rodeadas de una membrana semipermeable llamadas vacuolas. El ncleo celular es un corpsculo esfrico o alargado que siempre est rodeado por citoplasma. El ncleo est formado por agua y sustancias proteicas y tiene una importancia para la vida de las clulas participando muy fundamentalmente en la reproduccin celular y la transmisin de los factores hereditarios. Bacteria mo unicelulares que generalmente se reproducen por biparticin que se aprecia como un estrechamiento que escinde la clula en dos sin apreciarse cul dio origen a cul. Levaduras mo casi siempre unicelulares que se reproducen por gemacin, es decir surge una pequea protuberancia que se desarrolla hasta que se separa de la clula madre. Hongos mo filamentosos formados por largas clulas en forma de hilos muchas veces ramificados. Tales clulas se llaman hifas y el tejido formado micelios. Presentan dos formas de reproducirse bien diferenciadas: la vegetativa donde un fragmento se separa del individuo y se desarrolla independiente; la otra forma de reproduccin es la formacin de esporas que pueden soportar condiciones desfavorables durante largos perodos de tiempo hasta que se presenten condiciones propicias y germinan desarrollando al nuevo individuo. Las levaduras y las bacterias son unicelulares aunque a veces forman cadenas de varias clulas. Las clulas generalmente son ovaladas. Tanto en los hongos, levaduras y bacterias la fuente de carbono debe ser de naturaleza orgnica, sin embargo el nitrgeno utilizado por las levaduras puede ser de origen inorgnico. Esta caracterstica de las levaduras es de gran importancia pues al ser el nitrgeno constituyente indispensable en la formacin de protenas, su biomasa es una va de obtener alimento para animales superiores capaces de asimilar solo el nitrgeno orgnico. Adems de carbono y nitrgeno los mo necesitan fsforo en ese mismo orden cuantitativo en la relacin 100-5-1. En menores cantidades requieren potasio, azufre, magnesio y otros elementos que dependern del tipo especfico de mo. De gran importancia en la alimentacin de los mo son los probiticos que pudiramos asociar su funcin a las vitaminas y de hecho muchos de ellos son sustancias que pertenecen al complejo vitamnico B. Otro elemento fundamental es el oxgeno y cuya fuente establece una diferencia de la va metablica que utiliza el mo. Por ej: la levadura Saccharomyces cerevisiae en presencia de O2 (fermentacin aerobia) sobre un sustrato de sacarosa da como producto biomasa y si se conduce en ausencia de O2 se obtienen como productos etanol y dixido de carbono.
3.1 CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS.

La utilizacin industrial de un proceso microbiolgico conlleva la necesidad de disear los equipos para el proceso y en primer lugar el recipiente donde se desarrolla y que llamamos reactor, tanque de fermentacin o simplemente fermentador. El estudio cintico de los reactores nos permite conocer el volumen y flujo de operacin y es por ello que se hace necesario contar con modelos matemticos que describan el

crecimiento y/o formacin de productos en un cultivo del que conocemos su curva de crecimiento. Leyenda: x .- concentracin de mo t .- tiempo a-b .- adaptacin al medio (fase lag) b-c .- aceleracin del crecimiento c-d .- crecimiento acelerado (fase log) d-e .- desaceleracin del crecimiento e-f .- crecimiento estacionario f-g .- aceleracin de la muerte

En la fase de adaptacin ocurren cambios que an no se manifiestan como crecimiento, mientras en la fase log se alcanza la mayor velocidad de crecimiento. El concepto de velocidad representa el cambio de cierto parmetro (x) por unidad de tiempo (t). Estamos familiarizados con la velocidad media X/ t de un mvil que no es ms que el cambio de posicin por unidad de tiempo. Ej: km/h. Si el intervalo de tiempo es infinitamente pequeo obtendramos la velocidad instantnea dx/dt . La velocidad de crecimiento ser entonces el cambio de concentracin de mo (x) por unidad de tiempo. En un cultivo de mo si dividimos la velocidad instantnea entre la concentracin de mo en ese instante de tiempo obtenemos la velocidad especfica de crecimiento () = 1/x dx/dt Integrando la expresin: dt = dx/x dt = dx/x

y para la fase log donde es constante: = (t2 t1) = ln x2 ln x1 = (ln x2 ln x1)/ (t2 t1) o = (ln x2/x1)/ t Tiempo de duplicacin .- se define como el tiempo en que se duplica la biomasa o sea: x2/x1 = 2 = ln 2/t t = ln 2/ Tiempo de generacin .- se define como el tiempo en que se duplica el nmero de mo y para los casos como las levaduras Tiempo de generacin tiempo de duplicacin En levaduras y bacterias el efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de crecimiento puede verse por el modelo de Monod: = max S/( Ks + S) donde: max .- velocidad mxima de crecimiento especfico del mo ante el sustrato limitante. (S) S .- concentracin del sustrato limitante. Ks .- constante de saturacin (que se interpreta como inversamente proporcional a la afinidad del mo por el sustrato limitante). Es fcil entender de la expresin de Monod que al irse agotando el sustrato disminuye la velocidad de crecimiento tendiendo a = 0 cuando S tiende a cero. Pero lo cierto es que puede hacerse cero sin que se agote el sustrato limitante y esto se puede deber a la formacin de productos del metabolismo que a cierta concentracin inhiben el crecimiento del cultivo. Un ejemplo de esto lo tenemos en la fermentacin alcohlica (cultivo de Saccharomyces cerevisiae en sustrato de sacarosa) donde se puede observar que se detiene esta sin agotarse el sustrato debido a que el propio etanol, a cierta concentracin, acta como inhibidor del crecimiento En estos casos no puede aplicarse el modelo de Monod y han aparecido otros que tienen en cuenta la aparicin de inhibidores como el que sigue: = max S/ (Ks + S + KsI/Ki ) donde I muestra la influencia del inhibidor. Para los mo citados existe una relacin inversa entre la velocidad especfica y el tamao de los individuos; para la levadura saccharomyces 0,4 h-1, para una bacteria Escherichia coli que puede ser cinco veces ms pequea, su 0,9 h-1. Los hongos, mo de mayor tamao, tienen velocidades de crecimiento mucho ms pequeas. Al igual que un agricultor guarda las simientes, en la industria fermentativa se requiere contar con cepas constituidas por cultivos puros de especies de mo de valor comercial en cuanto a estabilidad, productividad y velocidad de crecimiento donde la ingeniera gentica presta actualmente un importante servicio a los microbilogos que dedican su atencin a los mtodos de conservacin de cepas. 4. ESTERILIZACIN La industria microbiolgica exige gran asepsia as todos los componentes del proceso en contacto con el cultivo deben estar libre de otros mo que llamaremos contaminante, y esto

se logra mediante la esterilizacin que pretende la muerte de todas las formas vegetativas o esporulantes. Un procedimiento muy utilizado es el calentamiento con vapor de agua saturado a 121C que le corresponde una sobrepresin de 1 atm (101,3 kPa). En fermentaciones aerbicas el suministro de aire debe ser constante y su esterilizacin puede realizarse por filtracin a travs de un material que retenga las partculas que sirven de hospedero a los mo. Otros mtodos de esterilizacin son el uso de ozono, radiaciones ultravioletas, la exposicin a materiales radioactivos en dependencia de las posibilidades que ofrece el proceso. Tambin con calor seco a temperaturas de170C puede lograrse la esterilidad pero requiere perodos de exposicin largos que lo hacen industrialmente poco prctico. 5. CONTROLES AL FERMENTADOR El diseo de la fermentacin concibe determinados valores de temperatura, pH, oxigenacin, por citar los parmetros ms comunes a controlar. Ya se ha mencionado que de la degradacin del sustrato se obtiene la energa vital constituyendo las fermentaciones procesos exotrmicos que tienden a elevar la temperatura y ese calor en exceso debe ser eliminado utilizando sistemas de enfriamiento que constituyen otro importante gasto econmico. An cuando en la formulacin del medio de cultivo se haya logrado un pH adecuado la propia fermentacin al modificar el sustrato origina cambios de pH que usualmente son reguladas automticamente por adiciones de H2SO4 o NaOH o agregando al medio sustancias con capacidad buffer desde el mismo inicio del proceso. Como sabemos el O2 es una sustancia apolar y por tanto muy poco soluble en agua pura (2,5. 10-4 mol/L a 20C) y an menos soluble a temperaturas mayores por lo que el simple burbujeo de aire no logra la velocidad de transferencia necesaria de O2 a la fase acuosa y se hace preciso agitar fuertemente el medio con considerable consumo de energa y formacin de espuma que en s no es perjudicial solo que puede ser arrastrada con el aire de salida por lo que deben existir sistemas rompeespumas que por lo general no bastan, siendo necesaria la adicin de sustancias que varan la tensin superficial y disminuyen la espumosidad del medio. Razones econmicas y fisiolgicas del cultivo aconsejan utilizar al mnimo estas sustancias.
6. RESIDUALES DE LA INDUSTRIA

Se debe ser muy cuidadoso con los residuales de estas industrias que en ocasiones deben ser esterilizados antes de someterlos al procedimiento de depuracin que permita verterlos a cualquier curso de agua. La depuracin ser tal que la demanda biolgica de oxgeno sea reducida a los niveles que establezcan las normas vigentes. Al ser desechado un residual que contenga materias biodegradables, estas facilitan el consumo del oxgeno disuelto en las aguas de los ros, lagunas, mares y limita la vida de los organismos que necesitan ste, iniciando un complejo proceso con resultados muy negativos a la proteccin del medio ambiente. Los procedimientos de depuracin pueden ser qumicos o biolgicos, o sea que aparecen de nuevo los mo en ayuda del hombre y la conservacin de la naturaleza. 7. LOS MICROORGANISMOS Y LA NATURALEZA. A pesar de la gran utilidad que prestan a la humanidad los productos obtenidos de la actividad industrial fermentativa son aun superiores los beneficios que reportan los mo en

la formacin y conservacin de un medio ambiente adecuado tomando parte en los grandes ciclos que en la naturaleza posibilitan la vida. Usted puede ver el proceso el siguiente.