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REPLICAO Replicao SEMICONSERVATIVA: as bases do filamento de DNA exposto so capazes de parear com nucleotdeos da soluo.

Cada base pareia com sua base complementar apenas. Os tipos so: conservativa, semiconservativa e dispersiva. A vantagem da semi evitar propagao de erros e aumentar velocidade de replicao. DNApol3 avana abrindo a fita>RNApol primase sintetiza o primer de RNA sobre a fita simples de DNA> DNApol3 reconhece o primer e inicia a sntese da cpia>DNApol1 desfaz primer, colocando DNA no lugar> DNAligase junta as pontas 3 do DNA preenchedor do espao do primer 5 do fragmento de Okasaki seguinte catalisando ligao fosfodister REPLISSOMO um complexo que envolve o sistema de replicao, semelhante em eucariotos e procariotos, mas no primeiro eles ainda podem des/remontar o nucleossomo (complexo protena-DNA). HELICASE faz parte e abre as fitas quebrando as lig de H entre bases. Enzimas distributivas se dissociam do DNA com facilidade (RNAprimase), as processivas tem continuidade. A CINTA DESLIZANTE que permite a ligao da DNApol no possui atividade cataltica, protena. TELMEROS so as fileiras de DNA no codificantes na ponta da fita, as telomerases impedem a perda de material gentico na ponta a cada replicao adicionando uma fitinha de RNA na ponta da cpia que ser trocada por DNA. Telmeros curtos esto relacionados a envelhecimento precoce. OBS: RNA pode fazer pareamento no cannico (no normal), nada a ver com os telmeros. TRANSCRIO Procariotos: transcrio e traduo simultneas. Eucariotos: trans no ncleo e trad no citoplasma, envolve remoo dos introns, capeamento no 5 e cauda poli-A no 3. RIBOZIMA: RNA que pode catalisar reaes biolgicas, um RNA funcional. So exemplos o transportador e o ribossmico (molculas dos principais componentes do ribossomo, so grandes maquinas macromoleculares que guiam a cadeia de montagem dos aas pelo mRNA e tRNA). RNA nuclear: s nos eucariotos. Unem-se a subunidades proticas para formar o SPLICEOSSOMO (complexo nucleoproteico que remove os introns do mRNA eucaritico). RNA funcional pode participar de sntese de protenas, processamentos, regulao da EXPRESSO GNICA(etapas pelas quais um gene influencia um fentipo) e defesa do genoma. Crescimento do RNA de 5>3(nucleotdeos add na 3), logo o filamento completo 3>5. RNA instvel pq OH pode atacar ligao fosfodiester degradando-o. PROCARIOTOS possuem o promotor (sequncia especfica de DNA para iniciar transcrio do RNA)> subunidades ligam-se ao promotor> RNApolimerase reconhece o fator sigma (responsvel pelo reconhecimento do local da transcrio) e inicia a transcrio>h um sinal de parada>o RNA pode ser liberado pela formao de um grampo por interaes CG>enzima se solta do DNA. (o complexo que faz a trans holoenzima) EUCARIOTOS: baixa densidade de genes por molcula de DNA torna mais complexo. RNApol (I, II e III) sintetizam RNA diferentes. Fatores gerais de transcrio precisam se ligar ao promotor antes e depois da RNApol2. RNA precisa sofrer processamento para sair do ncleo (pr-mRNA), feito pela RNApol2, por isso ela mais complexa que a procaritica. DNA eucaritico est organizado em cromatina, que pode dificultar acesso da RNApol, esse mecanismo funciona como uma regulao da expresso gnica. O complexo pra trans se forma pela ligao ao TATAboxe, uma cauda de ptna fosforilada por fatores de trans enfraquecendo a ligao da RNApol com outras ptnas do

complexo, permitindo a elongao. O RNA simultaneamente capeado para proteger da degradao (alm de ser necessrio traduo), ao final add a cauda poli(A). SPLICING(recomposio): remoo dos introns durante a transcrio do RNA e unio dos exons. A recomposio alternativa de exons permite codificar informao para mais de uma protena. TRADUO Incio: maioria dos procariotos e todos os eucariotos iniciam com uma metionina inserida por um tRNA iniciador. PROCARIOTOS: Sequncia de Shine-Dalgarno no RNAm posiciona o ribossomo para iniciar a traduo na subunidade menor do ribossomo. Protenas chamadas fatores de iniciao garantem a dissociao das duas subunidades e a entrada do tRNA iniciador no stio do meio (P). A associao das duas subunidades seguida da liberao dos fatores. A adio de bases iniciar no primeiro AUG (metionina) depois da sequncia, esse o cdon de incio. EUCARIOTOS: fatores de inicao eucariticos se associam a ponta capeada 5 e subunidade menor do ribossomo formando um complexo, o complexo se move de 5>3 desenrolando regies com pareamento at achar AUG, alinhando com o tRNA iniciador e ento a subunidade maior se liga e os fatores so liberados antes da fase de alongamento. Acontece o alongamento e o trmino, que consiste na identificao do cdon de parada por fatores de liberao (protenas), e no tRNA! EVENTOS PS-TRADUCIONAIS Dobramento da protena nascente para sua forma nativa. O ambiente aquoso da clula no permite o dobramento necessrio, que feito pelas CHAPERONAS (cmara de dobramento que possui microambiente eletricamente neutro que permite o dobramento). Molculas podem se ligar covalentemente s cadeias laterais dos aas, eventos mais importantes so fosforilao e ubiquitinao. FOSFORILAO: CINASES ligam grupo fosfato(carga negativa-muda conformao protica) aos OH da ser, tre e tir. Fosfatases removem. Eucariotos possuem muitos genes codificantes de cinase para prevenir no caso de mutao. UBIQUITINAO: marca a ptna para degradao pelo PROTEASSOMO. Ubiquitina encontrada s nos eucariontes. Os alvos so ptnas de curta durao (reguladoras do ciclo celular) ou ptnas danificadas. Direcionamento de ptnas: em eucariontes as ptnas possuem sequencia sinal na ponta amino-terminal (15 a 20 aas). PEPTIDASE cliva a seq sinal quando a ptna entra no canal da membrana do REG, por exemplo. Ptnas do ncleo tem sequncias de localizao nuclear (NSL) que no clivada para, no caso de uma mitose ela, por conter o sinal, pode se realocar no ncleo da clula filha. OUTROS REGULAO PROCARIOTOS Clulas precisam reconhecer condies ambientais nos quais ela deve ativar ou reprimir a expresso de genes relevantes. Todo gene possui um promotor onde se liga a RNApol. Ativadores esto antes e repressores esto depois do promotor e decidem se a transcrio ativada pelo promotor ocorre. Em procariontes stios de ligao para repressor so os operadores. A enzima que se liga ao DNA deve ter um stio de domnio de ligao ao DNA e um stio alostrico, onde se ligam efetores alostricos(pequenas molculas-ex:lactose) que ao interagirem com a ptna alteram sua forma para ativa ou inativa.

OPERON LAC: a regulao da produo do RNAm ordena a sntese das 3 ptnas. O Operon organizado em |promotor|operador|Z|Y|A|. H um repressor lac que se liga ao DNA, a lactose se liga ao repressor, mudando ele alostericamente. Ele tem um sio adicional de controle que o torna inativo na presena de glicose, mesmo com lactose. Um efetor alostrico, AMPc, se liga ao ativador CAP para permitir induo do operon lac. Alta concentrao de glicose afeta os nveis de AMPc, que necessrio para formar o complexo CAP-AMPc, que permite a RNApol se ligar ao promotor. REGULAO EUCARIOTOS Regulao mais complexa exigindo mais tipos de interaes com regies reguladoras adjacentes ao DNA. O DNA compactado em NUCLEOSSOMO, formando a cromatina. RNApol2 sintetiza RNA e coordena o seu processamento. Unio de ptnas de ligao ao DNA especficas de sequncias a regies fora dos promotores do gene de interesse caracterstica da regulao transcricional eucaritica. Ptnas regulatrias se ligam em regies anteriores ao promotor, podendo possuir um environmental sensing, stio de interao com outras ptnas regulatrias e stio de interao com o DNA. Regulao positiva a presena do ativador induz a transc, na negativa a presena do repressor impede. Os sinais de regulao para ativar/desativar podem ser de fosforilao, adio de uma subunidade, ligao com substncia do meio e liberao da membrana. Um modo de estudar a expresso de genes considerar o stio de ativao e o de ligao ao DNA do ativador como dois pontos diferentes e alterar o segundo para a condio laboratorial, isso permite stios de ligao de DNA de outros organismos. MUTAO Substituio de bases: transio quando a outra base de mesma categoria, purina por purina (A-G) ou pirimidina por pirimidina (T-C). Transverso o oposto. Mutaes silenciosas: mudam o cdon de um AA por outro desse mesmo aa. Sentido trocado: troca pelo cdon de outro aa. Sem sentido: muda para um cdon de parada. Mutao em regies no codificantes podem comprometer stios de ligao ao DNA para ptnas, mudando padro de expresso ou alterando resposta a estmulo do ambiente. Provocam pouca ou nenhum mudana fenotpica. Pareamento pode ocorrer com base no correspondente quando se tm tautmeros. Causando mutao em parte da prole. Mutao que causa alterao fenotpica, mas que ocorre fora de regio codificante pode estar relacionada a desativao do gene pela mutao, que o silencia(apaga). DEPURINAO: erro na replicao do DNA forma stios sem a presena purinas(G ou A). Interrupo da ligao glicosdica entre a base e a desoxirribose. TAUTMEROS: as bases existem em vrias formas, algumas delas no usuais que podem fazer pareamentos incomuns (T-C e G-A) DESAMINAO: Muda grupamento amina (NH2) por OH, pode ocorrer pareamento no usual. MUTAGNESE: podem substituir(pareando errado), alterar ou danificar(causando no reconhecimento) uma base. DNA pode ser danificado por fonte interna (replicao, oxignio reativo) ou externa (UV, radiao ionizante, mutgenos) REPARO DE DNA Reverso direta de DNA danificado: FOTORREATIVAO: exige luz para uma enzima dividir os dmeros de pirimidina. Reparo por EXCISO DE BASES: podem ser dependentes da homologia (filamento complementar), incluindo remoo de uma ou mais bases. DNAGLICOSIDASE corta ligaes base-acar gerando stios apurnicos/apirimidnicos (AP), conjunto de enzimas

corta o filamento e remove o trexo do acar-fosfato vizinho para a DNApol preencher o espao com DNA complementar a outra fita e a ligase fecha. METILAO DO DNA: grupos metil (CH3) so adicionados a determinados locais do DNA para impedir que ele seja destrudo por enzimas de restrio. Reparo POR EXCISO DE NUCLEOTDEOS: desfaz bloqueios de replicao e transcrio (defeito nesse reparo causa xeroderma pig e cockaine), os sintomas diferentes se devem a via de identificao dos defeitos, uma est na identificao de forquilhas paradas e outra na traduo parada por diferentes enzimas. Pacientes so sensveis a UV por mutao em ptna chave de reparo. Ordem de importncia: conferncia pela DNApol>exciso de base> de nuclotdeos PS-REPLICAO: reconhecimento e reparo de bases mal pareadas e pequenas alas causadas por deleo e insero. MutS reconhece mal pareamento e distorce a dupla hlice atraindo outras protenas Mut. O erro no pareamento ocorre na fita recm sintetizada(que ainda no foi metilada- s procariontes), ento essa que ser corrigida. Se uma forquilha travar uma enzima bypass pode inserir erros no curso da sntese, passando esse trecho e deixando-o para ser corrigido por outro mecanismo, como o de reparo por mau pareamento. QUEBRA BIFILAMENTAR: por O2 reativo ou radiao ionozante. JUNO DE PONTAS NO HOMLOGAS: apara e religa as pontas livres de volta, feito quando no h uma cromtide-irm para servir de molde. HOMLOGO: usa cromtides irms disponveis na mitose para garantir o reparo correto. Pontas so aparadas por ENDONUCLEASES, deixando uma ponta exposta que far o processo de invaso de filamento, formando uma ala na CROMTIDE-IRM permitindo a sntese do DNA complementar ao molde, completando a fita danificada. Esse tipo de replicao se d conservativamente. CNCER: rpida taxa de diviso, pode invadir novos territrios celulares, possuem alta taxa metablica, forma anormal e em geral no entram em apoptose. ISOLAMENTO E MANIPULAO DE UM GENE Regies polirrepetitivas so as que apresentam maior variao entre seres de uma mesma espcie CLONAGEM: escolha e preparao: todo DNA>purificar DNA e fazer a digesto dele. Trecho do DNA: purificar o DNA>amplificar o gene>digerir OU purificar o RNAm>transcriptase reversa>amplificar o gene>digerir TRANSCRIO REVERSA: definir molde de RNAm>usar primer de DNA poli(T) para garantir que vai ligar Ca cauda poli(A) do RNAm>se a transcriptase souber fazer uma volta ao final do RNAm ela usa essa volta como primer para fazer a fita complementar fita de DNA que ela acabou de sintetizar (fornecer moeda energtica ATP, CTP.. e manter tampo) AMPLIFICAO(PCR): mistura de fora inica e T para separar as fitas, primers senso e anti-senso (com stio de restrio para anelar no vetor) de DNA(que limitam o tamanho das fitas cpias - conferir pelo tamanho do amplicon), tampo e moeda. Ciclo de T abre as fitas> DNApol sintetiza a complementar>ciclo T abre de novo e etc. Teste de verificao feito por eletroforese, esperando-se uma nica banda, oq significa que as cpias possuem mesmo tamanho. DIGESTO: ENDONUCLEASES(enzima de restrio) que clivam em stios especficos geralmente no presente no material gentico do organismo. Usa-se as endo para digerir os plasmdeos e o gene, de modo que eles possam parear. Duas endo evitam pareamento invertido pq tiram pedao do vetor de modo q as pontas no pareiam e o gene s pode entrar em um sentido evitando inverso do frame de leitura.

ANLISE: ELETROFORESE em gel de agarose ou poliacrilamida, visualizao usando molcula fluorescente que liga ao DNA. Aplica no gel e insere DDP. SOUTHERN BLOT para DNA: eletroforese em gel e transferncia para membrana. NORTHERN BLOT para RNAm- identifica sequncia especfica, digere o DNA todo, coloca pra correr por eletroforese, transfere do gel frgil para uma membrana, adiciona componente raioativo que interage com o seu fragmento, destacando ele na corrida. FINGERPRINT DE DNA: identificao de sequncias especficas no DNA, como h mais stios de restrio h mais bandas, resultado da exposio por eletroforese em chapas fotogrficas. Eficaz se comparado com uma larga quantidade de amostras pq reduz a probabilidade de erro, no recomendado para teste de paternidade pq propensa a erros. ETAPAS SEGUINTES CLONAGEM: escolher caracterstica fenotpica que vem no vetor (reisitncia a droga, fluorescncia) >digerir vetor e DNA> fazer ligao lembrar das endo diferentes forma vetor recombinante> selecionar organismo que receber o vetor(transformao e seleo)> add clcio cultura para diminuir atividade da membrana da bactria e permitir insero do vetor BIBLIOTECA GENMICA: isolar DNA do organismo que contm o gene>digerir DNA e vetor com a mesma enzima de restrio>pontas coesivas do gene e do plasmdio vo se ligar>fazer transformao(inserir vetor na bactria)>cada clula vai conter um segmento diferente de DNA do organismo>separar as clulas em placa de Agar para que culturas cresam separadamente, tendo assim uma bliblioteca.