FACTORES QUE AFECTAN LA ACCIN ENZIMTICA DE LA CATALASA VARIABLES THAT AFECTS THE ENZYMATIC ACTION OF CATALASE Jos G.

Saldarriaga1 Universidad Nacional de Colombia; Departamento de Ciencias; Carrera 45No 26-85 RESUMEN Los seres vivos adquieren y mantienen su vida gracias a diferentes procesos fsicos y qumicos; la totalidad de estas reacciones qumicas es denominada metabolismo. Los seres vivos son altamente efectivos en los procesos metablicos debido a que estn catalizados, por una serie de macromolculas de naturaleza proteicas denominadas enzimas, aumentando la velocidad de reaccin y permitiendo que los procesos se lleven a cabo en milsimas de segundo. Dentro de las diferentes enzimas se encuentra la catalasa, capaz de degradar el perxido de hidrogeno en agua y oxigeno; la accin cataltica de la enzima y a su vez la velocidad de la reaccin se ve afectada por una serie de factores como la temperatura, concentracin y pH. El fin de este trabajo es analizar brevemente como afectan la velocidad de la reaccin. Palabras clave: Enzima, catalasa, velocidad de reaccin, orden de reaccin, pH. Key words: Enzyme, catalase, reaction rate, reaction order, pH. ABSTRACT: Una de las principales caractersticas de las formas de vida es que se constituyen por macromolculas capaces de replicarse a s mismas y adicionalmente sintetizar, a nivel celular, una serie de compuestos que ayudan a realizar los procesos necesarios para mantener la homeostasis; para conservar el equilibrio son necesarias diversas reacciones qumicas que se encuentran catalizadas, en general, por compuestos denominados enzimas. Las enzimas son macromolculas de naturaleza proteica, por lo que se conforman por aminocidos, unidos entre s por un enlace peptdico (Fig. No. 1). Cada aminocido posee un carbono central, el cual tiene cuatro valencias ocupadas por; un grupo amino (NH2), un hidrgeno, un grupo carboxilo (COOH) y una cadena lateral (R, que vara en su constitucin segn el aminocido, en total se encuentran 20 diferentes). INTRODUCCIN:

Fig. No. 1 Enlace peptdico.2

A partir de la secuencia de aminocidos en una enzima, se presentan interacciones tipo puente de hidrogeno, electroestticas, hidroflicas o hidrofbicas a partir de las cadenas laterales, que definen su estructura.
2

Jgsaldarriagar@unal edu.co

[http://b-log-ia20.blogspot.com/2009/11/lasproteinas-i-los-aminoacidos.html]

Las cadenas polipeptdicas se pliegan sobre s mismas, formando un surco conocido como sitio activo, en el cual solo estn involucrados solo unos pocos aminocidos que interactan de manera especfica con sus sustratos (o reactivos). Resulta indispensable una determinada conformacin qumica y estructural en las enzimas para su correcto funcionamiento. Gracias a la complementariedad de la enzima (tanto en su forma como en su carga), se forma una asociacin pasajera con las molculas a reaccionar, acercndolas, debilitando los enlaces existentes y promoviendo la formacin de nuevos. En ciertos casos se requiere la presencia de coenzimas, grupos no proteicos que aceptan o donan electrones o grupos qumicos, consumindose durante la reaccin. O la presencia de cofactores molculas orgnicas no proteicas- o iones metlicos como el magnesio (Mg2+), cobre (Cu2+), potasio (K+), manganeso (Mn2+), hierro (Fe2+), entre otros; se encuentran en la enzima estabilizando su estructura o conformando el sitio activo. En ambos casos todo el conjunto se conoce con el nombre de haloenzima. En general los catalizadores no afectan las caractersticas como tal de la reaccin; su rendimiento, equilibrio qumico, entalpa de reaccin, entropa y adicionalmente la cantidad de catalizador se mantiene constantes. El hecho ms relevante sigue siendo que aumentan la velocidad de la reaccin miles o decenas de miles de veces. Orden y velocidad de una reaccin: La rama de la qumica que estudia todo lo relacionado con la velocidad de una reaccin es denominada cintica. Toda reaccin qumica posee una velocidad que se determina segn la variacin de la

concentracin de reactivos o productos, durante un periodo de tiempo determinado. Los experimentos realizados tomando la variacin de la concentracin de los reactivos en un tiempo, determinan que la velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de los reactivos. A C+D

De tal forma que se obtiene una ecuacin de este estilo: Ecuacin 13: [ ] En donde V es la velocidad de la reaccin, [ ] la concentracin del reactivo y k una constante que depende de la reaccin, la temperatura y se determina nicamente de forma experimental. A pesar de estar directamente relacionada la velocidad de la reaccin con la concentracin, no se puede definir a partir de la estequiometria del proceso. Se ha observado que la velocidad de reaccin puede estar determinada por la concentracin de [A] elevada a la cero, primera, segunda o tercera potencia; siendo respectivamente una reaccin de orden cero, primer, segundo o tercer orden. La ecuacin corregida se presenta a continuacin: Ecuacin 2: V=k[A]x Donde x puede tomar valores de nmeros enteros positivos de cero a tres. Es posible determinar el orden de la reaccin por diferentes mtodos, pero en este caso en
3

Conocida como: expresin de reaccin o ley de reaccin

particular, se puede evaluar nicamente por el mtodo grfico.

Mtodo grfico: En el estudio del orden de las reacciones se han desarrollado tres formulas, para los primeros tres rdenes de reaccin, todas ellas describen una lnea recta, cuya pendiente es igual a la constante de la reaccin. Para determinar si la reaccin es de orden cero, se debe realizar la grfica de concentracin versus tiempo. Para determinar que es de este orden se debe obtener una forma como la que se presenta: Orden cero

Fig. No. 3 Logaritmo natural de la concentracin Vs. Tiempo.

En las reacciones de segundo orden se evala en la expresin Ecuacin 4:

[ ]

=k t

[ ]

Obtenindose una grfica como la siguiente: Orden dos

Fig. No. Concentracin a la menos uno Vs Tiempo.4

METODOLOGA:
Fig. Concentracin Vs. Tiempo. No. 2

Extraccin de catalasa: Se macero aproximadamente 30 g (gramos) de papa (previamente pelada y lavada), se diluyo la pulpa en 100mL (mililitros) de agua destilada, posteriormente se filtro y se dejo reposar. Obtencin de oxgeno sobre agua: Se empleo un montaje de recoleccin de gases (Fig. No. 5). Se calent 300 mL de agua a una temperatura de 37C (Celsius) y se sumergi parcialmente en esta el baln
4

Para determinar si una reaccin es de primer grado se puede obtener evaluando en la expresin: Ecuacin 3: ln[A] = -k*t+ln[A]. Donde [A] es una concentracin determinada y [A]0 la concentracin inicial, k la constante de la reaccin y t, el tiempo en la reaccin. Obtenindose una grafica como la siguiente: Orden uno

[http://www1.uprh.edu/inieves/macrotema/CINET ICA_macrotema.htm]

aforado que contena 10 mL del extracto enzimtico, cinco minutos despus se adicionan 2 mL de perxido de hidrogeno (H2O2) al 4%(v/v). Se midi el tiempo en que se tardaba en recolectar 1 mL de gas de forma sucesiva en la probeta. Variaciones: 1. Adicin de 2 mL de hidrxido de sodio (NaOH) 2M (molar). 2. Se realizo el procedimiento original adicionando un total de 4 mL de de H2O2 al 4 %. 3. Finalmente se realiz una cuarta prctica en la cual el baln se encontraba en un bao de hielo (a una temperatura aproximada a 2 C). RESULTADOS Y ANLISIS

perxido, reaccionan para segunda molcula de agua. Reacciones:

formar

una

[1] H2O2 + Fe(III)-E H2O + O=Fe(IV)E(.+) [2] H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) H2O + Fe(III)E + O25 La reaccin catalizada se realiza en un ambiente aislado para separar el oxigeno (O2) del resto de los productos. El gas es conducido por una manguera hasta una fase lquida y gracias a su baja densidad alcanza la probeta. Realizando un recorrido como el que se muestra en la imagen.

Un claro ejemplo de una haloenzima es la catalasa que posee un grupo hemo. Esta enzima se encuentra presente en gran cantidad de organismos y tiene como funcin descomponer el perxido de hidrgeno producto metablico- en agua y oxgeno molecular. El grupo hemo (FeIII) de la catalasa es oxidado por un oxigeno del perxido de hidrgeno, al degradarse la molcula queda libre un hidrogeno (H+) y un grupo hidroxilo (HO-) que se mezclan para formar agua. Por otra parte la catalasa forma un intermediario con el oxgeno. La reaccin finaliza luego de que una segunda molcula de perxido interacta con el intermediario. Un oxigeno del H2O2 se disocia de la molcula y ataca al oxigeno ligado al metal, por lo que se produce oxigeno molecular (O2) y la enzima regresa a su estado inicial, los residuos del segundo

Fig. No. 5 Montaje recoleccin de gases sobre agua. 6

Al final de la practica el oxigeno se presenta en estado gaseoso, en la parte superior de la probeta se encuentra confinado, mientras que en la parte inferior est en solucin con el agua. La prctica fue llevada a cabo por un grupo estudiantil de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogot, el cual realizo un triplicado para cada una de las prcticas, determinando el volumen de gas producido
5 6

H. D. Ardila, I. Cubillos, M.F. Molina, L. C. Moreno, H. Lozano, L. Palomeque, C.Y. Soto, C.A. Trujillo, A. Umaa. Tcnicas bsicas en laboratorio qumica. Departamento de Qumica Faculta de Ciencias. Documento de trabajo seccin de qumica general I de 2010. Pg. 70

en cierto tiempo, a partir del promedio de los datos consignados. Se realizo tres veces cada practica debido a que los datos obtenidos en el laboratorio se encuentran sujetos a diferentes tipos de errores, ya sea por la habilidad de los experimentadores o por las condiciones bajo las que se realizo la prctica tales como la temperatura, la masa y el volumen de los reactivos y muestras utilizados. Por tal razn resulta necesario realizar un triplicado de cada una de las prcticas, mas no fue posible por cuestiones de tiempo. Los valores iniciales del volumen en las grficas no fueron tomados en cuenta debido a que no est definido el logaritmo natural de cero, al igual que uno sobre cero; para las tres grficas se utilizaron los mismos datos, para evaluar correctamente y en igualdad de condiciones. A partir de las grficas hechas se espera determinar el orden de la reaccin, aunque no se emplean directamente los datos de la cantidad de productos obtenidos en un tiempo determinado. Se hace uso del volumen que ocupa el gas, que resulta ser directamente proporcional a la concentracin. Al utilizar la cantidad de reactivos se analiza el aumento de estos; esto significa que las rectas tienen un comportamiento opuesto al esperado, el signo de la pendiente es el contrario. Se emplea este mtodo debido a que no es posible determinar la concentracin de los reactivos durante la reaccin. Para poder determinar con certeza el orden de la reaccin, para cada prctica se hicieron las tres grficas correspondientes a los posibles rdenes de reaccin. Aquella grfica en la que el ndice de correlacin (R2) es ms cercano a uno, en esta se determinara su orden de reaccin. Esto es posible debido a que R2 compara los valores estimados y

reales, en un rango de cero (0) a uno (1). En el caso en que es uno, no hay diferencia entre los predichos con los valores evaluados; si es cero, la ecuacin determinada, ser muy poco til para predecir un valor.7 El hecho que el oxigeno sea soluble en agua afecta ligeramente los resultados, debido a que a mayor volumen, hay una mayor cantidad de gas en solucin. Esto en la grfica se ve reflejado en los ltimos valores tomados, que tienen valores bajos; por lo anterior la pendiente tambin se ve afectada. 37 C: GRAFICA I: Orden 0

15 13 11 9 7 5 30

Volumen (mL)
Volum en (mL) 80 Tiempo (s) 130 y = 0.0745x + 4.2495 R = 0.9879

GRAFICA II: Orden 1

Volumen (mL)

ln[Volumen (mL)]
2.7 ln[Volumen (mL)] 2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 30 80 ln[Vol umen (mL)] Linear (ln[Vol umen (mL)]) 130 y = 0.0076x + 1.6959 Tiempo (s) R = 0.9695

GRAFICA III: Orden 2

Aumento de la concentracin: GRAFICA IV: Orden 0

1/Volum en (mL) 30 Volumen (ml) 25 20 15 10 5 15 40 65 Tiempo (s) Linear (Volumen (ml)) 90 y = 0.3195x + 2.1844 R = 0.9852

1/Volumen (mL)
0.15 1/Volumen (mL) 0.13 0.11 0.09 0.07 0.05 30 80 Tiempo (s) 130 y = -0.0008x + 0.1655 R = 0.9351 Linear (1/Volum en (mL))

Volumen (ml)
Volumen (ml)

GRAFICA V: Orden 1

Los valores de R2 que confirman que los valores obtenidos a partir de la ecuacin son fiables, se encuentran por encima de 0,9900. Aun al obtener resultados por debajo de lo deseado, es posible determinar el orden de la reaccin puesto que hay una diferencia significativa entre las tres grficas; permitiendo afirmar que el orden de la reaccin es cero, mientras que el valor de la constante (k) sea aproximadamente 0,0745/segundo (s). La practica como tal resulto de baja reproductibilidad, puesto que resulta imposible mantener una temperatura constante para cada intento, por lo que no es posible aseverar que realmente la reaccin se llevo a cabo a una temperatura de 37C.

Ln[Volumen (mL)]
4 3.5 3 2.5 2 1.5 15 40 65 Tiempo (s) Ln[Volumen (mL)] Ln[Volume n (mL)] Linear (Ln[Volum en (mL)])

90 y = 0.0207x + 1.8086 R = 0.9195

GRAFICA VI: Orden 2

1/Volumen (mL)
0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 15 40 65 90 Tiempo (s) 1/Volumen (mL) 1/Volumen (mL) Linear (1/Volumen (mL)) y = -0.0015x + 0.1359 R = 0.8031

El orden de la reaccin a partir de los R2 resulta ser de orden cero y el valor de la constante (k) - 0,3195/s. El aumento en la concentracin de los reactivos conlleva a que se presente un nmero mayor de molculas capaces reaccionar; al incrementar la frecuencia de colisiones y encontrarse ms cerca de las enzimas, se genera una mayor probabilidad de obtener productos en un menor tiempo. Disminucin de la temperatura: La temperatura se encuentra estrechamente relacionada con la energa cintica de las partculas. Al tener una menor cantidad de energa cintica, las molculas se mueven menos y como consecuencia se obtiene una frecuencia de choque menor.

obvio como la accin de la enzima es afectada directamente por el medio. La enzima normalmente se encuentra estable, aun cuando interacta con su medio conserva su estructura; al variar el pH del medio hasta 12, surgen nuevas interacciones entre este y la enzima, que finalmente significan un cambio en la carga de la enzima o el sustrato. O bien la desnaturalizacin de la enzima: las cadenas proteicas puede que se desenrollen, se compacten o disocien, cambiando su estructura y disminuyendo su accin. Como resultado la velocidad de la reaccin toma valores muy pequeos o inclusive llegando al punto de una reaccin no catalizada. Variables y el tiempo: Se presento finalmente una ltima variable, la agitacin del recipiente que contena a la enzima y los reactivos. Este proceso permita el contacto y la interaccin de las molculas a reaccionar con el catalizador, puesto que aumentaba la energa cintica y permita que el gas saliera rpidamente de la solucin. Al aumentar la concentracin de los reactivos, se presenta un punto en el que no es posible aumentar la velocidad de la reaccin, debido a que el catalizador empleado que trabaja a toda marcha se restringir a una cantidad de reactivo por cierto periodo de tiempo. Cuando disminuye la temperatura lo suficiente las molculas no son capaces de moverse. Al no haber movimiento de los reactivos o de las enzimas, la cantidad de molculas con la suficiente energa son muy pocas o ninguna. Este efecto se mantendr siempre y cuando se mantenga baja la temperatura. Las enzimas actan correctamente en un determinado margen de pH, luego de esto se

Fig. No. 6 Efecto de la temperatura en la energa de activacin.8

Al no estar catalizada la reaccin y estar a baja temperatura, pocas molculas tienen la energa suficiente para reaccionar; por otra parte para obtener productos en el montaje, se requiere una produccin de gas elevada, ya que el gas debe supere la presin ejercida por el vapor de agua y la columna de agua. Cambio de pH: La variacin de la concentracin de hidrogeniones resulta ser una de las variables ms interesantes a estudiar, pues se hace
8

desnaturalizan, pierden su forma y capacidad para catalizar. De forma similar tienen un rango de accin a ciertas temperaturas, al sobrepasar el lmite, la energa empleada o de las partculas en el medio supera las fuerzas presentes en las interacciones intermoleculares en la estructura proteica. En ambos casos el aumento de variable se interpreta como la desnaturalizacin del catalizador. Existe la posibilidad de que la enzima vuelva a obtener su capacidad cataltica, esto depende nicamente en la cantidad de tiempo a la que este expuesta a altas variaciones de pH o una elevada temperatura. El efecto que realizan estos factores no es inmediato, es un proceso gradual que si es frenado a tiempo puede ser revertido; la enzima puede reestructurarse a s misma a partir de las interacciones entre las cadenas laterales de los aminocidos.
1

Curtis H., Barnes N.S., Biologa. 6 edicion. Editorial Mdica Panamericana. 2000. Pp. 191-196. Murray, Granner, Mayes Rodwell. Bioqumica de Harper. 12 edicin. Editorial. El Manual Moderno, S.A. de C.V. Mxico. 1992. Pp. 90-96 -H. D. Ardila, I. Cubillos, M.F. Molina, L. C. Moreno, H. Lozano, L. Palomeque, C.Y. Soto, C.A. Trujillo, A. Umaa. Tcnicas bsicas en laboratorio qumica. Departamento de Qumica Faculta de Ciencias. Documento de trabajo seccin de qumica general I de 2010. Pp. 68-71.

____________________________________ BIBLIOGRAFA: Brown, T. L., Lemay H.E., Burdge J.R., Qumica la Ciencia Central. 9 edicin. Pearson Prentice Hall. 2004. Cap. 14.