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Produo de Enzimas

Maria Alice Zarur Coelho Priscilla Filomena Fonseca Amaral Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos

Produo de Enzimas
Introduo
Comercialmente, uma enzima pode ser um preparado que, alm da protena enzimtica, contm quantidades variveis de matria contaminante proteica e no-proteica e preservantes; As clulas constituem-se, at hoje, o nico meio para obteno de biocatalisadores, visto que ainda no possvel destacar-se sua fabricao por sntese qumica. As enzimas podem ser provenientes de: tecidos de organismos diferenciados (clulas animais e vegetais) microrganismos.

Produo de Enzimas
Introduo
- Produo: fermentao; produo agro-pecuria ou cultivo in-vitro; - Recuperao: separao, extrao e concentrao; - Purificao: varia de acordo com o tipo de catalisador enzimtico; - Formulao: normalizao do produto enzimtico.

(---) enzima extracelular, (___) enzima intracelular.

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Produo de Enzimas de Tecidos
Ainda se produz um nmero importante de enzimas de tecidos animais e vegetais; Ex.: renina usada na elaborao de queijos, proteases vegetais usadas em anti-inflamatrios, amilases para a preparao de mostos de cerveja.

As enzimas de origem vegetal so produzidas em grande parte como subprodutos da atividade agrcola; Ex.: papana, extrada do latx do papaya, bromelina, obtida do talo da pinha. Situao anloga: enzimas de origem animal que se obtm como subprodutos dos matadouros (renina).

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Produo de Enzimas de Tecidos
As enzimas de tecidos requerem um processo de ruptura celular para a sua recuperao. A extrao uma operao simples e de baixa incidncia no custo de produo. As clulas vegetais: providas de uma
rgida parede celular de natureza celulsica, so muito sensveis aos esforos de corte, podendo ser eficientemente extradas em moinhos convencionais.

As clulas animais: desprovidas de parede celular podem ser facilmente rompidas (corte ou choque osmtico)

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Produo de Enzimas de Tecidos
Produo em grande escala de enzimas em cultivos artificiais de tecidos: pouco factvel complexidade do sistema alto custo dos meios de cultivo Produo de enzimas sofisticadas de alto custo: ok competio com a produo por fermentao usando microrganismos geneticamente modificados.

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal Tecidos animais so secos e triturados (moinhos ou homogeneizadores) Extradas com soluo aquosa ou tampo Resduos removidos por filtrao (uso de terra diatomcea) ou centrifugao

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal Pancreatina apresenta atividade amiloltica, proteoltica e lipoltica Pncreas de porco Antigamente: realar sabor de queijos Atualmente: Auxiliar digestivo
Pncreas frescos ou congelados so triturados com tecido duodenal Tripsina presente no duodeno inicia a ativao das enzimas Massa seca em secadores a vcuo, e desengordurada atravs de extrao com ter de petrleo Flocos so secos em secadores a vcuo, para remoo do solvente, e modos, obtendo-se um p fino e peneirado

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal Renina
Usada na elaborao de queijos

Extrao do quarto estmago de bezerro alimentado somente com leite Lavagem e corte em tiras do estmago Extrao do coalho com uma soluo de cloreto de sdio (12-20%) Filtra-se e purifica-se a soluo por precipitao salina Acidificao

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal Pepsina Origem: Mucosa do estmago de porco Auxiliar digestivo
Mucosa fatiada e misturada com cido clordrico ou fosfrico (pH 2,0) por 16 h a temperatura ambiente Eleva-se a temperatura para 40-45C por 1 h (pepsinognio convertido em pepsina) Tecido no digerido filtrado, e seco no secador a vcuo a 40C. Pepsina de alta pureza obtida atravs da concentrao a vcuo do filtrado, resfriamento a 5-8C e adio de etanol para atingir a concentrao de 60% Filtrao e secagem a baixa temperatura

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal Catalase Obtida a partir de fgado e sangue de boi ou porco Pode atuar como peroxidase, degradando lcoois, nitritos e fenis
Fgados so macerados e submetidos a agitao em soluo aquosa de 25% com acetona a 25oC Concentrao da acetona aumentada a 35%, a massa obtida filtrada e os slidos descartados Mais acetona adicionada (50%), precipitando a catalase, recuperada atravs de filtrao ou centrifugao Precipitado pode ser seco ou ainda extrado em soluo aquosa agitada por 1 h, removendo o material insolvel Catalase lquida submetida filtrao estril e comercializada, com ou sem estabilizante (glicerol)

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Vegetal Papana Enzima proteoltica Origem: latex do fruto verde do mamo Clarificao da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo Extrada como suco prensado deste componente e posteriormente purificada A adio de gua e cloreto de sdio perfazem um preparado chamado de papana bruta

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Vegetal Bromelina Enzima proteoltica Origem: talo e fruto do abacaxi Clarificao da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo Obtida do caule do abacaxi aps moagem, prensagem, filtrao e precipitao (silfato de amnio, metanol isopropanol ou acetona) do suco deste talo.

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Produo de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Vegetal Malte Proteases, lipases e hemicelulases, oxiredutases e amilases (alfaamilases: no gro durante a germinao; beta-amilase presente no gro antes da germinao) Origem: malte de cevada Aps germinao feita secagem: paralisao da atividade biolgica do gro e reduzir teor de umidade

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Produo de Enzimas Microbianas
Engenharia de Bioprocessos: propagao de clulas microbianas Aplicao comercial: bactrias, fungos filamentosos e leveduras; Produo de enzimas extracelulares industriais: Bacillus e Aspergillus (8085% do mercado de enzimas extracelulares)

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Produo de Enzimas Microbianas
Enzimas extracelulares: aquelas que passam pela membrana celular

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Produo de Enzimas Microbianas
Enzimas extracelulares: aquelas que passam pela membrana celular

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Produo de Enzimas Microbianas
Sntese e excreo de protena extracelulares em bactrias

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Produo de Enzimas Microbianas
Sntese e excreo de protena extracelulares em eucariotos

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Produo de Enzimas Microbianas
Sntese e excreo de protena extracelulares em eucariotos

Enzimas segregadas so modificadas extensamente durante sua passagem pelo retculo endoplasmtico e pelo aparato de Golgi

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Produo de Enzimas Microbianas
Sntese e excreo de protena extracelulares Enzima segregada: possa difundir livremente atravs da parede celular e, no caso de fungos e batrias Gram positivas, chegar ao meio externo. Algumas enzimas permanecem associadas a estruturas da membrana ou da parede celular. Nas bactrias Gram negativas a secreo de enzimas mais complexa, devido a presena de uma membrana externa
nica enzima relevante produzida por uma bactria Gram negativa a pululanase de Klebsiella pulmoniae.
(a) Bactrias Gram positivas; (b) Bactrias Gram negativas; (c) Fungos

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Produo de Enzimas Microbianas
Etapa Upstream

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Produo de Enzimas Microbianas
Cintica de Produo de Metablitos As enzimas como agentes metablicos tero o carter de metablitos primrios ou secundrios dependendo da sua funo metablica Maioria das enzimas comerciais: enzimas degradativas (catabolismo) e tm as caractersticas dos metablitos primrios. Isto no absoluto! Modelo de Ludecking & Piret para a cintica de produo de metablitos por fermentao:

dP dt

dX dt

X
No-associada ao crescimento Associada ao crescimento

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Produo de Enzimas Microbianas
Cintica de Produo de Metablitos Modelo de Ludecking & Piret para a cintica de produo de metablitos por fermentao:

dP dt
Metablitos primrios: Metablitos secundrios,

dX dt

Situaes intermedirias so freqentes na prtica. Ex.: -amilase de Bacillus subtilis, glucoamilase de Aspergillus niger e lactase de Escherichia coli

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Produo de Enzimas Microbianas
Cintica de Produo de Metablitos Uma enzima no necessariamente sintetizada durante parte do ciclo de crescimento

Meio de composio adequada

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Produo de Enzimas Microbianas
Aspectos de controle gentico da produo enzimtica Induo Enzimas constitutivas: - Proporo minoritria com relao ao total; - Enzimas que esto implicadas com os aspectos centrais do metabolismo. - Produzidas continuamente independente da presena de substrato. Enzimas induzidas: - Proporo maioritria com relao ao total; - Vo sendo sintetizadas em propores baixas, mas significativas, at que um substrato ou um produto derivado de sua degradao induza um grande aumento na sntese enzimtica.

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Produo de Enzimas Microbianas
Aspectos de controle gentico da produo enzimtica Represso - Represso pelo substrato Na presena de uma fonte de carbono rapidamente assimilvel como a Dglicose, a sntese de muitas enzimas se encontra reprimida. - Represso por um catablito um fenmeno que se d comumente nos microrganismos e que afeta a muitas enzima constitutivas e induzidas - Represso pela presena de compostos que contenham enxofre, nitrognio e outros. Ex.: sntese da proteinase extracelular de Bacillus subtilis reprimida pela presena no meio de cultivo de certos compostos que contenham nitrognio, como o glutamato e o aspartato.

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Produo de Enzimas Microbianas
Meios de cultivo Meio sinttico x Matrias-primas naturais Fonte de carbono: carboidrato que ingresse nas vias metablicas centrais, geralmente na forma de glicose Fonte de Nitrognio: usualmente sal de amnio Enxofre, fsforo e magnsio: sais inorgnicos (sulfatos e fosfatos) Elementos-traos (K+, Ca2+, Na+, Fe2+, Mg2+, Zn2+ e Co2+): funes metablicas indispensveis; sais inorgnicos. Alguns podem adquirir especial relevncia (cofatores da enzima) Ex.: Ca2+ no caso da amilase; Co2+ no caso da glicose-isomerase. Hidrognio e Oxignio

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Produo de Enzimas Microbianas
Meios de cultivo Vitaminas, fatores de crescimento, aminocidos Compostos que favoream a excreo (surfactantes), no caso de enzimas extracelulares Os mecanismos de controle que operam sobre a sntese enzimtica (induo e represso catablica) devem ser considerados na formulao do meio.

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Produo de Enzimas Microbianas
Escolha do microrganismo Produtor da enzima de interesse em grande quantidade; Estvel; No-patognico; Fcil manipulao.

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Produo de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo Superfcie Submerso - Batelada - Batelada alimentada - Contnuo

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Produo de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo Superfcie - Dificuldades de controle operacional; - Severos problemas de contaminao - Vantagens importantes em relao a transferncia de oxignio e recuperao do produto. - A principal tecnologia de fermentao superficial a fermentao em estado slido. empregada para produzir, em escala comercial, celulases, amilases fngicas, pectinases, proteases fngicas e lipases. Microrganismo: fungos filamentosos do gnero Aspergillus. -amilase bacteriana mediante fermentao em estado slido com farelo de arroz como substrato suporte.

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Produo de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA - O sistema mais empregado na produo de enzimas. (importncia do conhecimento da cintica) - Algumas enzimas so marcadamente instveis depois da sua etapa de produo. - Efeito das variveis operacionais mais relevantes: pH e temperatura compromisso entre os valores timos para produo e crescimento; Ex.: Produo de celulase de Trichoderma reesei em meio de cultivo celulsico onde o pH timo de crescimento 4.8, enquanto que o timo de produo 3.5. Soluo: valores intermedirios ou efetuar alteraes programadas de pH e temperatura

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Produo de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA

Cintica de produo de celulases de Trichoderma reesei em batelada, mostrando a instabilidade da frao endoglucanase.

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Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA - O sistema mais empregado na produo de enzimas. (importncia do conhecimento da cintica) - Algumas enzimas so marcadamente instveis depois da sua etapa de produo. - Efeito das variveis operacionais mais relevantes: pH e temperatura compromisso entre os valores timos para produo e crescimento; Ex.: Produo de celulase de Trichoderma reesei em meio de cultivo celulsico onde o pH timo de crescimento 4.8, enquanto que o timo de produo 3.5. Soluo: valores intermedirios ou efetuar alteraes programadas de pH e temperatura

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Produo de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo Submerso: BATELADA ALIMENTADA - Batelada seguida de alimentao de forma contnua ou intermitente at alcanar o volume final de operao dentro do reator; - Vantagens: Controlar a velocidade especfica de crescimento do microrganismo. Produo de metablitos secundrios, metablitos sujeitos inibio por alta concentrao de substrato e metablitos sujeitos a represso catablica por substratos altamente metabolizveis; Esta situao aplicvel a maioria das enzimas de interesse comercial.

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Produo de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo Submerso: CONTNUO -O cultivo, se operado em estado estacionrio, dever se manter em estado fisiolgico definido que, a princpio, pode ser aquele de mxima produtividade em relao ao metablito que se deseja produzir. - Pode-se manipular a velocidade de crescimento atravs da taxa de alimentao. - Aplicao industrial na produo de enzimas e outros metablitos reduzida. Maior complexidade do equipamento e sua operao, Baixa concentrao do produto obtido Maiores perigos de contaminao e de desenvolvimento de mutantes devido aos grandes perodos de operao.

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Produo de Enzimas Microbianas
Produo de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados Atualmente: Todas as enzimas produzidas comercialmente provm de microrganismos que so um produto de programas de melhoramento gentico Perspectivas: produzir enzimas com microrganismos manipulados por tcnicas modernas de recombinao gentica. Tcnica: Clonagem gentica, clonagem molecular ou DNA recombinante. Obteno por sntese qumica, por biossntese ou por purificao de uma fonte natural, um fragmento de DNA que codifique a sntese de uma determinada enzima e introduzir este fragmento atravs de um vetor na clula hospedeira onde o cdigo gentico vai se reproduzir e se expressar.

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Produo de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados

Clonagem do DNA utilizando vetores de fago Clonagem do DNA em um plasmdeo vetor

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Produo de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados As enzimas so produtos genticos primrios, o que torna muito atrativa sua produo por esta via. Atravs dela pode-se conseguir: - Produzir enzimas de organismos superiores em sistemas microbianos; - Transferir a capacidade produtiva de uma cepa mais adequada do ponto de vista sanitrio ou econmico; - Melhorar o nvel de produo e a pureza da enzima produzida. Problemtica: estabilidade gentica do microrganismo; Na prtica: a reverso a estados sub-produtivos ou no-produtivos; Destaca-se o enorme potencial desta tcnica: xitos mais significativos na produo de enzimas com microrganismos clonados.

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Produo de Enzimas Microbianas
Produo de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados Ex.: renina: protease de origem animal com alta demanda - Substituio por renina microbiana (de Mucor miehii): parcial. -Produo por tecnologia de DNA recombinante: Celltex, Genex, Genencor e Codon: produo de renina com cepas de Escherichia coli (sem excreo); Genecor: produo de renina animal extracelular com cepas Aspergillus nidulans. Outros centros: produo de renina excretvel com cepas de Saccharomyces e Kluyveromyces. Gist-Brocades: renina animal produzida por cepas clonadas de Kluyveromyces marxianus.

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Produo de Enzimas Sintticas
Introduo Uma enzima, apesar de conter muitos aminocidos, utiliza somente uma pequena poro destes no processo cataltico. Ex.: tripsina contm 254 resduos de aminocidos: trs aminocidos so implicados no mecanismo de protelise. Os demais aminocidos: importantes para formar o stio de unio ao substrato.

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Produo de Enzimas Sintticas
Mtodos Basear a estrutura em protenas ou peptdeos - Modificar uma enzima ou protena existente - Construir uma estrutura peptdica totalmente nova Ex.: mioglobina: protena transportadora de oxignio Modificada para produzir uma enzima do tipo oxidase: - Une-se um catalisador de transferncia de rutnio [Ru(NH3)5]3+ a cada um dos trs resduos de histidina na mioglobina - Enzima bio-inorgnica, semi-sinttica: capaz de reduzir o oxignio enquanto que oxida vrios compostos tais como o ascorbato. - Construir uma nova enzima ainda invivel: no possvel predizer a estrutura tridimensional

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Produo de Enzimas Sintticas
Mtodos Desenvolvimento dos stios de unio para molculas orgnicas simples: construir anlogos no proticos de enzimas -Sistemas mais estudados: dextrinas de Schardinger: oligosacardeos cclicos com resduos de D-glicose unidos por ligaes - 1,4 e que formam slidos cristalinos. ciclomaltohexose ( -ciclodextrina): 6 resduos de glicose ciclomaltoheptose ( -ciclodextrina): 7 resduos de glicose ciclomaltooctose ( -ciclodextrina): 8 resduos de glicose

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Produo de Enzimas Sintticas
Mtodos dextrinas de Schardinger:

Estrutura da ciclomaltohexose ( -ciclodextrina)

Orientao dos resduos: formao de uma estrutura cilndrica - Interior relativamente hidrofbico - Grupos hidroxila estendendo-se a partir das bordas da molcula - Proporcionam um stio hidrofbico - Com o acoplamento covalente dos grupos reativos apropriados: possibilidade de produzir um anlogo enzimtico.

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Produo de Enzimas Sintticas
Mtodos Desenvolvimento dos stios de unio para molculas orgnicas simples: construir anlogos no proteicos de enzimas - Resultados -ciclodextrina com 0-[-4(5)-mercaptometil 2 il] benzoato covalentemente unido borda da molcula: imitando centro ativo da quimotripsina. Enzima sinttica: mximo de atividade em pH 10 ( -benzima) capaz de catalisar a hidrlise de certos steres to rpido quanto a quimotripsina. cintica de Michaelis-Menten mais estvel ao calor e ao alcali que seu equivalente natural.

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