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FUNDAO CENTRO DE CINCIAS E EDUCAO A DISTNCIA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE EDUCAO SUPERIOR A DISTNCIA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO UERJ/CEDERJ

LICENCIATURA EM CINCIAS BIOLGICAS

BIOLOGIA MOLECULAR

RELATRIO DE ATIVIDADE PRTICA: EXTRAO DE DNA

ALUNO: RAFAEL SERAFIM PINTO

MATRCULA: 20091202001

PLO REGIONAL DE NOVA FRIBURGO Nova Friburgo Rio de Janeiro, abril de 2012.

RELATRIO DE AULA PRTICA 1: EXTRAO DE DNA GENMICO


1. INTRODUO:

O DNA (cido desoxinucleotdeo) uma molcula orgnica que contem a "informao" que instrui o desenvolvimento e funcionamento de todos os organismos vivos. O procedimento de extrao de DNA j foi um processo bem complicado de ser feito em laboratrio. Hoje, muito fcil de se fazer at mesmo em casa. Cada nucleotdeo que constitui o DNA formado pela ligao de um fosfato (PO4) a uma pentose, a desoxirribose (carboidrato de cinco carbonos) e uma base nitrogenada, que pode ser uma Adenosina, Timina, Citosina ou Guanina. A base nitrogenada est sempre ligada ao carbono 1 da desoxirribose e o grupamento fosfato encontra-se ligado ao carbono 5 da mesma. As molculas de DNA so geralmente formadas por duas cadeias polimricas em hlices unidas por pontes de hidrognio formadas entre uma base prica (Adenina ou Guanina) de uma das cadeias e uma base pirimdica (Timina ou Citosina) da outra. A ligao sempre se d entre Adenina e Timina, ou Citosina e Guanina. Ambos, RNA e DNA so polmeros lineares de nucleotdeos, tais cidos nuclicos se diferem em alguns aspectos bsicos: o DNA formado pelo cido desoxirribonucleico e o RNA pelo cido ribonucleico; no DNA so encontradas as bases A, G, C e T, j no RNA so encontradas as bases A, G, C e U; o DNA formado por duas fitas antiparalelas, que se ligam entre si por ligaes do tipo pontes de hidrognio formando uma estrutura helicoidal (dupla hlice), o RNA formado por fita simples; a molcula do DNA mais estvel que a molcula do RNA; existem vrios tipos de RNA, entre eles, seguem os principais: RNA mensageiro, RNA transportador e RNA ribossomal; o DNA s est localizado no ncleo, e o RNA est localizado no ncleo e no citoplasma; a funo do DNA o armazenamento da informao gentica do indivduo, e a funo do RNA a transferncia da informao gentica do ncleo para o citoplasma e a decodificao dessas informaes dentro da clula. Devidos as caractersticas distintas entre as molculas de DNA e RNA, nos protocolos de extrao de RNA e DNA muitas diferenas podem ser observadas.

Isso se deve as diferenas encontradas tanto na estrutura quanto nos processos de sntese e degradao dessas molculas. As enzimas Nucleases (DNAses e RNAses) so as responsveis por degradar as molculas de DNA e RNA. As enzimas RNAses e DNAses so especficas e atuam clivando as ligaes fosfodister. Como essa nucleases so abundantes e esto presentes em todo o ambiente, uma das preocupaes recorrentes ao se executar um procedimento de extrao de cidos nuclicos eliminar RNASes e DNAses presentes na vidraria e solues utilizadas para o processo e dessa forma evitar que o DNA ou RNA sofram a ao dessas enzimas e sejam degradas. O principal aspecto que diferencia os procedimentos de extrao de DNA e RNA, que os protocolos para extrao de RNA so mais exigentes quanto a eliminao da RNAses. Isso se deve ao fato das molculas de RNA se encontrarem conforme mencionado acima em fita simples, e assim so mais instveis e mais facilmente degradadas. As tcnicas de manipulao do DNA, que atualmente vem sendo utilizadas com grande intensidade tm influenciado direta ou indiretamente a sociedade, atravs da cura e diagnstico precoce de doenas, dos testes de paternidade, atravs das aplicaes na medicina forense, na preservao de espcies ameaadas, na agricultura e na busca pela cura de diversas doenas. Por isso, a importncia de se conhecer e aprender Biologia Molecular.

2.

OBJETIVOS:

Os objetivos dessa aula prticas so: executar um protocolo de extrao de DNA genmico; aprender com detalhes a metodologia de extrao; obsevar os cuidados exigidos pelo procedimento; conhecer a estrutura celular, composio das organelas celulares; entender a funo dos reagentes em um protocolo de extrao do DNA; visualizar a molcula de DNA.

3.

MATERIAIS:

Foram utilizados os seguintes materiais: 2 Beckers 1 Funil; 2 Colheres de Ch; Pano Perfex. 2 Colheres de Detergente de cozinha; Colher de Ch de Sal de cozinha (NaCl); lcool; Tecido vegetal (banana ou caqui); Caneta; Lpis; Caneta; Folha branca A4 para anotao;

4.

METODOLOGIA:

Os alunos foram separados em duplas, cada dupla escolheu entre duas frutas para realizar a sua prtica: caqui e banana. Cada dupla recebeu um kit com: 2 beckers, 1 colher de ch, 1 funil e um pedao de perfex. Sobre a mesa estava disposio o detergente de cozinha, sal de cozinha e lcool. A minha dupla escolheu trabalhar com a banana. Assim, descascou-se a banana e cortou-se a banana em pequenos fragmentos e colocou-se no Becker. Com auxlio da colher de ch os pedaos da banana foram bastante macerados. No outro Becker foram misturados duas colheres bem cheias de detergente com colher de ch de sal de cozinha, completando-se a mistura com gua at completar a medida do Becker de 50 ml. Misturou-se com auxlio da colher de ch at homogeneizar a mistura. A essa mistura iremos chamar de soluo de extrao. O prximo passo foi transferir essa soluo de extrao para o Becker, no qual se encontrava a banana macerada. Novamente com auxlio da colher misturamos a soluo de extrao com a banana macerada formando uma espcie de suco. Misturamos bem a fim de homogeneizar a mistura. O pano Perfex foi utilizado para filtrar a soluo. Dobramos o Perfex de uma maneira que forma-se um filtro e o colocamos no funil para que pudssemos filtrar a mistura formada pelo suco e pela soluo de extrao. O Becker que no estvamos utilizando havia sido lavado para que a filtrao pudesse ser feita utilizando esse recipiente. Aguardamos pacientemente que todo o suco fosse filtrado, obtendo-se um filtrado de aspecto homogneo. A quantidade de filtrado obtido foi de 45 ml, essa verificao importante para a prxima fase do protocolo. Acrescentou-se 45 ml de lcool a soluo, j que a concentrao de filtrado obtido foi de 45 ml. Ou seja, acrescentamos a quantidade de lcool at chegar medida que representa o dobro da quantidade do filtrado. Com pequenos movimentos circulares com o Becker homogeneizamos a mistura. Esperou-se algum tempo e procurou-se observar a formao de duas fases: uma superior alcolica e outra inferior aquosa. Como na figura abaixo:

O que acontece...

Depois de misturarmos essas fases, observamos no topo uma massa esbranquiada com aspecto gelatinoso, pois o DNA insolvel em lcool. Isso pode ser observado na figura abaixo:

Conhecendo a funo dos reagentes nesse protocolo


Detergente

detergente

ajuda

dissolver

bicamada lipdica que compe a membrana plasmtica e as membranas das organelas. Sal O sal ajuda a manter as protenas dissolvidas no lquido extrado, impedindo que elas precipitem com o DNA. O sal de cozinha (NaCl) em soluo se dissocia em Na+ e Cl-, que vo interagir com os fosfatos das molculas de DNA, neutralizando-as e estabilizandoas, contudo torna-as menos solveis em gua. Isso vai evitar a fora de repulso (pois os cidos nucleicos so molculas longas e altamente carregadas, e ser gerado, assim, uma grande fora de repulso entre essas molculas). Assim numerosas molculas de DNA podem coexistir nessa soluo sem que uma repila a outra devido s cargas.

lcool

O DNA insolvel em etanol (lcool etlico). Quando as molculas so solveis em um dado solvente, elas se dispersam neste solvente e no so, portanto, visveis a olho nu. Por outro lado, quando as molculas so insolveis em um dado solvente, elas se agrupam, tornando-se visveis. Como o DNA insolvel em lcool, quando adicionamos o lcool, a gua que foi utilizada como solvente e o lcool reagem e o DNA se torna visvel no sobrenadante

5.

RESULTADOS e DISCUSSO:

Cumpriram-se as trs etapas do protocolo para extrao de DNA de clulas de banana e o resultado obtido foi formao de um emaranhado branco de filamentos mais prximo superfcie do Becker, como mostrado na figura acima. O primeiro passo desse protocolo de extrao do DNA foi liberao do DNA do interior dos ncleos celulares atravs de processos fsicos e qumicos. Como sabemos os vegetais so eucariotos, e, portanto, possuem um ncleo no qual o material gentico encontra-se compartimentalizado. Atravs da macerao houve a quebra mecnica das clulas. As clulas vegetais possuem uma parede vegetal que formada principalmente por celulose e, por isso, tambm conhecida como membrana celulsica. Ela uma parede semi-rgida, e portanto, o processo de rompimento das clulas um pouco dificultado, sendo o processo de macerao um importante passo para o rompimento das clulas. Aps realizar a macerao e assim o rompimento mecnico das clulas, a lise, o DNA e o material celular ainda estavam insolveis, por isso foi necessrio utilizao da soluo de extrao. Essa soluo continha um detergente, sal e gua. Aps a macerao do tecido vegetal, a soluo de extrao foi adicionada ao material macerado, misturando-se at obter uma papa mole. Aps esse processo, a maioria das interaes entre as macromolculas, as estruturas enoveladas formadas por DNA e protenas foram desfeitas, deixando o DNA linearizado. Para saber por que aconteceu isso preciso saber a utilidade prtica de cada um dos reagentes utilizados no experimento. O detergente utilizado com a finalidade de desconstruir as molculas de lipdeos que constituem as membranas celulares e, desta forma, o contedo das clulas da banana, incluindo as protenas e o DNA, liberado. Ou seja, os lipdeos formam complexos com o detergente e precipitam. O sal ajuda a manter as protenas dissolvidas no lquido extrado, evitando que as mesmas precipitem junto com o DNA. As molculas de DNA possuem carga negativa devido presena do grupo fosfato na posio 5, logo, as molculas individuais de DNA tendem a se repelir. O sal tambm atua fornecendo ons de carga positiva que neutralizam a carga negativa das molculas de DNA, permitindo que estas se condensem quando em contato com uma soluo alcolica. O lcool, por sua vez, atua na separao do DNA, que menos denso, dos demais

componentes celulares. Como a gua e lcool se diluem, o DNA separado da mistura, porque insolvel em lcool, formando um emaranhado de molculas de DNA na superfcie da soluo no Becker. Ou seja, o lcool foi utilizado para eliminar a camada de solvatao, separando as molculas da soluo. O que se observou a olho nu foram milhares de fitas de DNA juntas que formavam grumos, j que a utilizao do sal permite que as fitas de DNA que em sua periferia possuem carga negativa possam interagir. O procedimento experimental seguido relativamente simples e permite a visualizao clara do emaranhado de filamentos de DNA que se forma. Entretanto, a estrutura de dupla-hlice s pode ser visualizada de modo indireto e atravs de aparelhos sofisticados.

6.

CONCLUSO:

Essa prtica permitiu a visualizao do DNA, atravs de substncias usadas, agentes fsicos e qumicos, permitindo que no final da prtica consegussemos ver o DNA da banana, atravs da lise da membrana, a precipitao do sal de cozinha e o isolamento do DNA. O material produzido atravs do experimento permitiu uma viso diferenciada deste contedo (cromossomos e DNA), tornando-o mais atraente e simples, alm de ser plenamente realizvel nas escolas com os alunos do Ensino Fundamental e Mdio. A utilizao de recursos do dia a dia, portanto, alm de demonstrar como a cincia faz parte da nossa vida, desperta uma maior conscincia da importncia da compreenso dos seus processos. Existem diversos mtodos de extrao de DNA e pudemos realizar um desses mtodos de forma simples e satisfatria com materiais que podem ser encontrados em qualquer cozinha. E para ns futuros professores essas prticas so de extrema importncia, j que em muitas escolas no h laboratrios e prticas como essas enriquecem muito o processo de ensino-aprendizagem.

7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

GARCIA, A. B.; MACEDO, J. M. Biologia Molecular. Mdulos 1. v. 1, Rio de Janeiro: Fundao CECIERJ, 2010;

FERREIRA, B., BRANCO, A. T. Estudo dos cidos nucleicos. 2005.

Aupex

Joinvile.

Aulas

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Biologia.

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http://aupexjoinville.blogspot.com.br/2011/03/aulas-praticas-de-biologia.html Acesso em: 03/04/2012 s 22h31min.

Extrao

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http://dnamonitor.blogspot.com.br/2010/11/extracao-do-dna-da-banana.html Acesso em: 04/04/2012 s 16h50min.

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Disponvel Acesso

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http://www.mundoeducacao.com.br/biologia/parede-celular.htm 03/04/2012 s 20h25min.

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http://www.bioinfo.ufpb.br/difusao/pdf/extracaodednademorango.pdf. Acesso em: 03/04/2012 s 21h30min.

Imagens:

SILVA, H. H. M. PRTICA 1- EXTRAO DE DNA. Disponvel em: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABboAAL/extracao-dna-banana em: 04/04/2012 s 15h14min. Acesso

http://www.molecularstation.com/molecular-biologyimages/data/502/DNA_Overview.png - Acesso em: 04/04/2012 s 15h48min.

http://www.ufmt.br/bionet/principal.htm Acesso em: 04/04/2012 s 16h08min.

http://www.sgc.utoronto.ca/SGC-WebPages/StructureDescription/2AV4.php Acesso em: 04/04/2012 s 16h14min.