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MICROSCOPIA

1.

INTRODUCCIN.

El microscopio es un instrumento ampliamente utilizado para obtener una imagen aumentada de objetos o muestras pequeas. Actualmente su uso se encuentra difundido en diversos aspectos de la enseanza, la investigacin, y la industria, siendo un instrumento indispensable en el estudio de la citologa animal y vegetal, la histologa, la microbiologa y muchas otras ciencias. A pesar que la invencin del microscopio es atribuida a Hans y Zacaras Jansen (1590), no se sabe con exactitud si otras personas contribuyeron a su invencin. Su posterior

perfeccionamiento y sofisticacin ha permitido al hombre de ciencia profundizar su bsqueda, para dilucidar la compleja estructura de la materia viva y de cada uno de sus componentes. Actualmente, los microscopios tienden a convertirse en multiinstrumentos que permiten entregar, adems de la informacin morfolgica y estructural, informaciones cuantitativas, microanlisis qumico, y con frecuencia estn conectados a unidades computacionales. Sin embargo, el microscopio ptico convencional sigue siendo irremplazable y es el instrumento ms importante en los centros cientficos y de enseanza donde se desee conocer de la estructura y morfofisiologa de clulas y tejidos. Por lo tanto, se hace imprescindible tener un conocimiento bsico del microscopio ptico en sus aspectos fundamentales de estructura, componentes, funcionamiento, as mismo de las consideraciones mnimas de cuidado y mantencin de l. Adems, dado que en esencia el

microscopio se basa en las propiedades de las lentes y de la luz para formar imgenes del objeto observado, se hace absolutamente necesario conocer las nociones generales sobre la luz y las lentes.

1.1

La Luz.

La luz blanca, de naturaleza corpuscular y ondulatoria, comprende una mezcla de radiaciones electromagnticas de longitud de onda () entre 380 a 780 nm, que estimula las clulas de la retina del ojo provocando sensaciones visuales. La luz se propaga en lnea recta a una velocidad aproximada de 300.000 Km/seg y al atravesar un prisma se descompone en sus componentes monocromticos, cada uno de los cuales es una radiacin de diferente longitud de onda, como se expresa en el anexo adjunto: COLOR Violeta Azul Verde Amarillo Naranja rojo MICRONES (m) 0,436 0,483 0,540 0,577 0,627 0,698 NANOMETRO (nm) 436 483 540 577 627 698 ANGSTROMS (A) 4.360 4.830 5.400 5.770 6.270 6.980

1.2 Propiedades de los rayos luminosos.

Dada la caracterstica ondulatoria de los rayos luminosos, es posible distinguir las siguientes propiedades de ellos: Longitud de onda (): Distancia entre dos puntos equivalentes o correspondientes entre dos ondas. Es decir, entre dos montes o entre dos valles vecinos.

longitud de onda

1.2.1

Amplitud de una onda (A): Distancia mxima que alcanza un valle o una meseta de una onda, desde su eje central durante un periodo de vibracin.

1.2.2

Frecuencia (f): Nmero de vibraciones u oscilaciones por unidad de tiempo. A mayor frecuencia menor longitud de onda y mayor energa. A menor frecuencia mayor longitud de onda y menor energa.

1.2.3

Periodo (T): Es el tiempo en que cada partcula efecta una oscilacin completa, desde a a b en la figura.

Fenmenos de la luz.

Los fenmenos ms simples relativos a la propagacin de la luz y que son utilizados en el microscopio son la reflexin y la refraccin:

1.2.4

Reflexin: Fenmeno fsico en que un haz de rayos de luz paralelos inciden sobre una superficie plana bien pulida, y los rayos rebotan y se devuelven paralelos con el mismo ngulo con que incidieron.

Considrese que toda superficie donde los rayos se reflejan constituye un espejo, Ej. Las aguas tranquilas de un lago, un vidrio o una lmina de metal pulido. Adicionalmente,

cuando el haz de rayos paralelos inciden sobre una superficie rugosa, despus del choque los rayos no siguen siendo paralelos; la luz se ha difundido.

Leyes de la Reflexin:

a) Los rayos incidentes (RI), la normal (N) y los rayos reflejados (RR), deben estar en un mismo plano perpendicular al espejo llamado plano de reflexin (PR).

RI

RR PR PR

b) El ngulo de incidencia () es igual al ngulo de reflexin (). c) La razn entre el seno del ngulo y el seno del ngulo es constante.
Refraccin: Es el fenmeno fsico en que un haz de rayos de luz, al atravesar oblicuamente la superficie de separacin de dos medios transparentes, se desva de su direccin primitiva. Los rayos luminosos, al pasar de un medio menos denso a otro ms denso, se desvan acercndose a la normal; los rayos luminosos al pasar de un medio ms denso a otro menos denso se desvan alejndose de la normal. Los rayos luminosos que inciden en un cuerpo de diferente densidad, siguiendo la trayectoria de la normal no cambian su direccin, es decir no son refractados.

N
1 = 1,00

2=1,33
Sen = Sen

= ndice de refraccin. Relacin entre la velocidad de la luz en el aire (1) y la velocidad de la luz en el agua (2). Estos fenmenos fsicos que ocurren al pasar los rayos a travs de las lentes del microscopio, son los responsables de la formacin de imgenes. Consecuentemente, una lente es un medio.

La lente.

Es un cuerpo trasparente, formada por un material pticamente homogneo, limitado por lo menos por una superficie esfrica. Las lentes ms comunes son convergentes (positivas) o divergentes (negativas), pero las utilizadas por el microscopio son del tipo convergentes y generalmente biconvexas. Para la formacin de imgenes, es necesario, previamente, considerar algunos elementos de la ptica geomtrica:

Eje principal F

co

1.4.1 Eje Principal (EP): Es la recta determinada por la unin de los centros de las superficies esfricas que forman las caras de la lente. 1.4.2 Centro ptico (CO): Es el centro geomtrico de la lente; los rayos que pasan por l, no se desvan. 1.4.3 Foco Objeto: Punto situado en el eje principal desde el cual divergen (salen), rayos luminosos, que al pasar por la lente salen paralelos al eje principal. Este punto est situado del lado del objeto. 1.4.4 Foco Imagen: Punto situado en el eje principal, donde convergen (cruzan), los rayos luminosos que atravesaron la lente. 1.4.5 Distancia Focal (DF): Distancia entre el Foco de la lente y su centro ptico.

1.5

Formacin de Imgenes: La imagen del objeto se forma donde dos o ms rayos provenientes del objeto se cruzan, luego de atravesar la lente. Para esto se consideran tres tipos de rayos:

a) Un rayo paralelo al eje principal que atraviesa la lente, se refracta y pasa por el foco imagen.
Lente

Eje principal Objeto Foco objeto Foco imagen

b) Un rayo que pasa por el centro ptico, atraviesa la lente sin desviarse.
Lente Foco objeto Objeto Foco imagen

Eje principal

c) Un rayo que pasa por el foco objeto, atraviesa la lente y emerge de ella paralelo al eje principal.
Foco objeto Lente Foco imagen

Eje principal

Objeto

Dependiendo de la distancia entre el objeto y el centro ptico, las imgenes formadas son:

1.5.1 Imagen Real. Se caracteriza porque se puede recoger y hacer visible en pantallas colocadas detrs de la lente. Se construye con los rayos reales que convergen detrs de la lente.

Fo objeto lente imagen

1.5.2 Imagen Virtual. Los rayos son divergentes entre s, por lo tanto nunca convergen y no formarn imagen real. Si ambos rayos se prolongan en el otro sentido se cruzarn originando una imagen virtual.

Fo objeto lente imagen

1.5.3 Imagen del Microscopio.

La imagen otorgada por el microscopio corresponde a la combinacin de la imagen formada por los dos sistemas de aumento del microscopio compuesto. El objeto se sita fuera de la distancia focal del objetivo y se forma una imagen real, aumentada e invertida en relacin al objeto. Esta imagen primaria se forma en la distancia focal de la lente ocular y pasa a ser el objeto de ella. Esta lente forma una imagen virtual, aumentada y derecha respecto a la imagen primaria. Esta imagen virtual constituye el objeto del ojo y se forma la

imagen final en la retina del observador. Por lo tanto, la imagen que percibe el observador es virtual, invertida y de mayor tamao comparndola con el objeto.

Esquema de la formacin de la imagen en el microscopio.

Eje ptico

F1 CO

F2

CO

Objeto Objetivo Imagen real Ocular

Imagen virtual

1.6

Propiedades de las lentes.

En la fabricacin de los microscopios se usan las lentes convergentes que proporcionan finalmente una imagen aumentada del objeto, principio bsico y fundamental del microscopio. Sin embargo, es necesario que las lentes posean otras propiedades o poderes que contribuyan a mejorar la nitidez de la imagen y en consecuencia la calidad del microscopio.

1.6.1 Poder de aumento: Es la capacidad del microscopio para generar una imagen aumentada
del objeto y corresponde a la razn existente entre el tamao de la imagen y el tamao del objeto. Como el microscopio tiene dos sistemas de lentes, objetivos y oculares, capaces cada uno de agrandar la imagen, el aumento total corresponde al producto del aumento de ambos sistemas:

AUMENTO TOTAL = AUMENTO OBJETIVO X AUMENTO OCULAR

El clculo se facilita ya que cada lente lleva impreso su aumento de la siguiente manera: 4x, 10x, 40x, 100x. AUMENTO LENTE 4X 10X 40X 100X DISTANCIA FOCAL 40mm 16mm 4mm 1.8mm DISTANCIA UTIL 18mm 5mm 0.3mm 0.1mm

Como se ha detallado en la tabla, cada lente tiene una distancia focal propia la que a su vez determina la distancia til de la lente (distancia entre el preparado y la lente frontal del objetivo).

1.6.2 Poder de definicin: Es la capacidad del instrumento que permite visualizar una imagen ntida y de contornos bien definidos. Este poder es mayor en las lentes de mayor

aumento y adems se incrementa en la medida que se corrijan las aberraciones esfricas y cromticas.

1.6.3

Poder de penetracin: Es la capacidad del microscopio que permite observar simultneamente varios planos de una muestra u objeto con una posicin de enfoque. El poder de penetracin disminuye a medida que incrementa el poder de aumento de las lentes.

1.6.4

Poder de resolucin: Es la capacidad del microscopio para formar imgenes separadas y definidas de 2 estructuras o puntos que estn muy prximos entre si. El poder de

resolucin depende de la longitud de onda del haz luminoso () y de la apertura numrica (AN), de las lentes. R = AN x 0,61

La apertura numrica corresponde al ngulo que forma el eje ptico con los rayos ms perifricos que puede captar la lente y que son utilizados para la formacin de la imagen.

La mayor o menor cantidad de rayos luminosos que llegan al lente varan segn el ndice de refraccin del medio en que ellos se propagan.

Abbe propuso la siguiente formula para calcular AN:

AN = sen x n

Por tanto:

sen x n x 0,61

1.6.5 Limite de resolucin: Corresponde a la distancia mnima que debe existir entre 2 puntos para que se produzcan imgenes separadas. Si la distancia es menor que el lmite de resolucin, se formar una sola imagen y los puntos se confunden. El lmite de resolucin (r), vara en forma inversa respecto al poder de resolucin y se determina de acuerdo a la siguiente formula:

r = . 0,61 AN

1.7

Defectos o aberraciones pticas.

La aberracin es un defecto de una lente en que la imagen formada no es una correspondencia exacta del objeto. Al construir un microscopio se realizan correcciones de las imperfecciones pticas que afectan la imagen a observar. Las correcciones se logran mediante sistemas de lentes o de prismas que, acoplndose entre s, eliminan los defectos pticos. Se pueden distinguir seis tipos de aberraciones: el astigmatismo, la coma, la distorsin, la

curvatura de campo y las ms comunes en el microscopio las aberraciones esfricas y cromticas. Adems, influyen otros factores que afectan los sistemas pticos, como el poder de resolucin de la lente, prdida de luminosidad y los anillos de Newton.

1.7.1

Aberracin esfrica: Todos los rayos de luz paralelos al eje principal de la lente, al pasar a travs de ella y ser refractados, deberan concentrarse o cortarse en un mismo
Eje principal

punto del eje de la lente, llamado FOCO. Sin embargo, los rayos luminosos marginales refractados en los bordes de las lentes convergentes tienen mayor refraccin que los rayos ms prximos al eje, por lo que se cortan ms cerca de la lente. Se forman as, distintos focos provenientes del mismo objeto, resultando una zona focal y una imagen borrosa.

Correccin de la aberracin esfrica: Se puede reducir por medio del diafragma, que al cerrarlo parcialmente elimina los rayos marginales, dejando pasar solamente los rayos centrales y que corresponden a la parte central de la lente que sufre menos aberracin esfrica. Tambin se elimina usando un par de lentes, una convergente y otra divergente pegadas, formando una lente combinada. La cara cncava de la lente divergente neutraliza la aberracin positiva de la lente biconvexa. Esta combinacin de lentes se denomina aplanticas.

1.7.1 Aberracin cromtica: Los rayos luminosos de distinta longitud de onda son refractados de manera diferente y se dispersan cortando el eje principal en distintos puntos formando un

espectro de diversos colores. Los rayos violetas de menor longitud de onda tienen su foco ms cerca de la lente que los rayos rojos de mayor longitud de onda; los rayos de los colores

restantes tienen sus focos situados en puntos intermedios. As la lente tendr una distancia focal para cada color y la imagen aparecer de varios colores.
Luz blanca

Eje principal azul rojo

Luz blanca

Correccin de la aberracin cromtica:

Se corrige formando una lente compuesta con una

lente convergente (+) y otra divergente (-). La lente positiva es de crown-glass y la negativa de flint-glass. La lente as combinada se dice que es acromtica.

1.8 TIPOS DE MICROSCOPIOS.

La estructura celular ha sido estudiada a travs de diversos tipos de microscopios, siendo sus distintos lmites de resolucin los que han permitido el estudio de diversos niveles de organizacin celular. 1.8.1 El microscopio fotnico o de luz visible: Es el de uso ms comn, permite observar an sin tcnicas especiales, es decir en estado fresco a la clula en su conjunto (forma, tamao, movilidad, etc), el ncleo, algunos organoides e inclusiones. 1.8.2 El microscopio contraste de fase: Permite el reconocimiento, sin la utilizacin de colorantes o de otros reactivos, de muchas estructuras no visualizadas en el microscopio comn, debido a que las pequeas diferencias de densidad que presentan las estructuras celulares al estado fresco y que no son visibles al ojo humano, se convierten en diferencias de amplitud fcilmente perceptibles. 1.8.3 El microscopio de interferencia: De concepcin similar al anterior, pone de manifiesto variaciones de fase an menores y como consecuencia permite deducir la concentracin de materias orgnicas de las estructuras observadas y calcular el peso de su masa seca. 1.8.4 El microscopio de fondo oscuro o ultramicroscopio: Permite la visualizacin de: estructuras de menor tamao que aquellas que pueden ser vistas con el microscopio comn, tales como mitocondrias, envoltura nuclear, ncleo y distintas vacuolas, como elementos brillantes que se destacan en el fondo oscuro del citoplasma de clulas vivientes. 1.8.5 El microscopio de polarizacin: Emplea la luz polarizada como energa para establecer la mono o birrefringencia de las estructuras observadas con lo que se deduce la fina disposicin de sus componentes. Permite obtener informacin sobre el ordenamiento molecular de estructuras cristalinas o fibrilares.

1.8.6 El microscopio de fluorescencia: Existen ciertas substancias que al ser iluminadas por luz de determinadas longitudes de onda absorben energa y emiten luz de diferente color

que la usada para excitarlas. Esto se conoce como fluorescencia. Ficoeritrina que fluoresce a 580 nm (color rojo) y fluorescena que fluoresce a 528 nm (color verde), son dos fluorforos de uso corriente, que se colocan en las clulas y permiten visualizar la presencia y concentracin de determinada molcula o estructura celular. La citoinmunofluorescencia es una importante aplicacin de esta tcnica. 1.8.7 El microscopio electrnico: Utiliza como fuente de energa un haz de electrones de

longitud de onda 100.000 veces inferior a la de la luz, por lo que logra aumentos de 100.000 a 300.000 veces con un lmite de resolucin de hasta 5 . Actualmente se utilizan dos tipos: a) Microscopio Electrnico de

Transmisin (MET):

Permite ver en una

pantalla fluorescente o bien impresionar en una placa fotogrfica la imagen de cortes ultrafinos, provenientes de un material incluido en plstico y obtenido en el ultramicrtomo mediante cuchillas de

vidrio o diamante.

El espesor de los

cortes, no mayores de 0,1 micrn, permiten el paso de los electrones, los cuales slo son producidos en un sistema de alto vaco, lo que hace imposible la observacin de clulas o tejidos vivos. En la figura se compara la microscopia de luz con la MET.

b)

Microscopio

Electrnico

de

Barrido

(MEB):

Proporciona una imagen tridimensional de la superficie del objeto. El material biolgico fijado y deshidratado se recubre de una delgada capa de oro mediante un proceso de sublimacin. Esta pelcula metlica es puesta en el microscopio y sobre ella chocan los electrones en un movimiento de barrido, provocando emisin de electrones secundarios los que son recogidos por un sistema digital que los procesa, formando las imgenes correspondientes.

1.8.8 El microscopio confocal: Permite que slo observemos el plano que est situado en el punto de foco del sistema ptico eliminando, de forma ptica a travs de un diafragma o "pinhole", la luz proveniente de los planos que estn fuera de foco. Este principio fue descrito por Minsky en los aos 50, pero es a partir de los 80 cuando se empieza a extender su uso.

Un objeto tridimensional tiene varios planos focales. La luz de todos los planos es refractada por la lente, pero solo la que est en foco (haz azul) pasa a travs del diafragma o pinhole formando definida sin de las estructuras de la luz situadas procedente en del una imagen ntida y el resto plano del focal objeto.

interferencia

Para estudiar un objeto en microscopa confocal se toman imgenes procedentes de distintos planos focales, las que se denominan seccin ptica, porque equivalen a las imgenes obtenidas al seccionar la muestra con un micrtomo. Con sistemas informticos adecuados se reconstruye la imagen tridimensional del objeto, a partir de las distintas secciones pticas.

1.9

ESTRUCTURA DEL MICROSCOPIO FOTONICO.

En el microscopio fotnico se distinguen mltiples partes esenciales que en base a sus funciones pueden agruparse en: Sistema mecnico, Sistema de iluminacin y Sistema ptico.

1.9.1 Sistema mecnico: Es el sistema que proporciona el sostn a apoyo a todos los componentes del microscopio y consta de las siguientes partes: a) b) Pie: Sostiene el microscopio, es de amplia base y su forma vara segn el modelo. Columna: Es la parte articulada al pie, sostiene al tubo del microscopio y contiene los mecanismos de movimientos del mismo. c) Platina: Plataforma horizontal, fija o mvil, perpendicular a la columna y al eje ptico del microscopio. Posee un orificio central que deja pasar los rayos luminosos y sostiene al carro Vernier, el cual provisto de una pinza, permite sostener y desplazar el preparado. d) Tubo o can: Es un cilindro hueco que lleva en su extremo inferior el revlver y en el superior la o las lentes oculares. e) Revlver: Pieza giratoria que lleva atornillados los objetivos de diferentes aumentos en forma secuencial, de menor a mayor. f) Subplatina: Sustenta la lente condensador, el diafragma y en algunos modelos el anillo porta-filtro y filtro. g) Tornillos de precisin y desplazamiento: Elementos que permiten deslizar las lentes del microscopio para asegurar la observacin ntida de un objeto, cuya funcin especifica se describe a continuacin: Tornillo macromtrico: Sirve para variar rpidamente la distancia entre la lente objetivo y la platina. Tornillo micromtrico: Permite modificar muy lentamente la separacin entre lente objetivo y la platina, facilitando la obtencin de una imagen perfecta y ntida. Ambos tornillos, macro y micromtrico, pueden estar separados o bien contenidos en uno solo y en este caso el movimiento libre corresponde al macromtrico y aquel que vence una resistencia perceptible al del micromtrico. Tornillo de subplatina: Acerca o aleja verticalmente la subplatina a la platina.

1.9.2 Sistema de Iluminacin: Encargado de entregar, seleccionar y regular la calidad, cantidad e intensidad de la luz que llega a la muestra. Las partes que lo componen son: a) Fuente de luz: Puede ser natural, aunque en la actualidad la ms frecuente es la luz artificial blanca, proveniente del filamento incandescente, contenido en una ampolla de vidrio, que transforma la energa elctrica en luminosa. b) Filtro de luz: Vidrio coloreado que deja pasar la radiacin de onda que se desea usar absorbiendo las restantes. El ms usado en el filtro azul celeste. c) Diafragma iris: Por su intermedio se regula la cantidad de luz que llega al preparado ya que su dimetro es regulable, al deslizar las lminas que lo componen, por medio de una palanca horizontal. d) Condensador: Es un sistema de lentes localizado en la subplatina y que permite concentrar los rayos luminosos en la muestra. El ms usado es el condensador de Abb y est compuesto por una lente inferior convexa y una superior plana convexa.

1.9.3 Sistema ptico: Formado por dos conjuntos de lentes convergentes, proporciona una imagen aumentada del tamao del objeto. a) Lente Ocular: Las ms usadas tienen un aumento de 6x, 8x, 10x, 12x, 15x. En cantidad de una o dos se encuentra ubicadas en la parte superior del tubo, prxima al ojo del observador. Estn destinadas a recoger la imagen dada por el objetivo para lo cual est formada por dos lentes plano convexo y un diafragma entre ellos. La lente inferior de campo o colector recibe y refracta la imagen proporcionada por el objeto, formando a su vez una imagen en el campo del diafragma. La lente superior u ocular recoge la imagen en el campo del diafragma y forma la imagen definitiva del microscopio. b) Lentes objetivos: Son de aumento variable: 4x, 10x, 25x, 40x y 100x, y se hallan localizadas secuencialmente en un dispositivo giratorio, revlver, en la parte inferior del tubo. Son los llamados objetivos parafocales, ya que al girarlos quedan,

automticamente, dentro de la distancia til y basta hacer un pequeo ajuste del micromtrico para lograr el enfoque preciso.

Por la manera de utilizarse se distinguen los siguientes tipos de lentes objetivos:

Objetivos a seco: Son aquellos en que entre el preparado y la lente objetivo se interpone el aire.

Objetivos a inmersin: Aquellos en que entre el objetivo y el preparado se ubica un lquido trasparente que posee un ndice de refraccin superior al del aire (n = 1), y se aproxima al del vidrio (n = 1.52). El ms utilizado es el aceite de cedro (n= 1.515), y se usa con el objetivo 100x. Las lentes, frecuentemente, llevan impresas las especificaciones pticas bsicas como: poder de aumento, apertura numrica, longitud (mm), total del tubo de microscopio y espesor (mm), del cubre-objeto.

ESPECIFICACIONES OPTICAS DE LAS LENTES

AUMENTO LONGITUD TUBO

40/0.65 160/0.17

APERTURA NUMRICA ESPESOR CUBREOBJETO

40 0.65 0.17

AUMENTO APERTURA NUMRICA ESPESOR CUBRE OBJETO

Microscopio fotnico binocular Olympus, modelo CH40.

2.

OBJETIVOS

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7

Describir las propiedades y caractersticas de la luz. Interpretar los fenmenos de la luz. Conocer algunas propiedades y poderes de las lentes. Aplicar los conocimientos sobre la luz y las lentes, para la construccin de imgenes. Describir los tipos de microscopio y sus ventajas. Sealar y describir los sistemas que conforman la estructura del microscopio. Aplicar los conocimientos de estructura y cuidados del microscopio para su correcto manejo y utilizacin.

2.8

Evaluar el correcto empleo del microscopio.

3.

CUESTIONARIO

3.1 3.2 3.3

Cul es concepto actual de la naturaleza de la luz? Cules son los componentes monocromticos de la luz? Defina las propiedades de los rayos luminosos, tomando en cuenta su caracterstica ondulatoria.

3.4 3.5 3.6 3.7 3.8

Describa los fenmenos ms simples relativos a la propagacin de la luz. Qu es y de qu manera se corrige la aberracin esfrica y la cromtica? Qu es una lente? Qu lentes son las utilizadas por el microscopio ptico? Indique y defina cada uno de los elementos de la ptica geomtrica utilizados para la formacin de imgenes.

3.9 3.10

Defina una imagen real y demuestre su formacin. Por qu se forma una imagen virtual?

3.11

Realice el esquema de la formacin de la imagen captada por el observador en el microscopio ptico.

3.12 3.13 3.14

Defina los poderes del microscopio, en base a las propiedades de las lentes. Qu es el microscopio ptico? Enumere que sistemas componen el microscopio e identifique sus partes en el esquema adjunto (1.9.4).

3.15 3.16 3.17 3.18

Describa brevemente cada una de las partes que constituyen cada sistema. Compare los objetivos a seco y los a inmersin. Describa la forma de proceder para enfocar una preparacin con el objetivo 100x. Indique como se debe guardar el microscopio.

4.

ACTIVIDADES

4.1

Evale los conocimientos obtenidos sobre luz, formacin de imgenes y propiedades de las lentes. Construya geomtricamente imgenes de un objeto colocado a distintas distancias focales. Compare las imgenes reales y virtuales obtenidas.

4.2

Indique cada una de las partes que componen el microscopio ptico, segn los sistemas sealados. Utilice el microscopio correctamente, segn las instrucciones entregadas y en la secuencia sealada (anexo N1). Coloque una preparacin con un centmetro cuadrado de papel milimetrado, en el cual est escrito el N 6. Enfoque como corresponde con objetivo menor, con 10x y 40x. Esquematice con cada objetivo segn las indicaciones de Anexo N2

Nombre preparacin: Propsito: Tincin:

Aumento total: Descripcin:


Calcule el dimetro real del campo, observando y contando el N de lneas que caben en el campo convirtiendo luego su valor en mm, y luego en micrones (m).

AUMENTO OBJETIVO

DIAMETRO CAMPO MILIMETROS (mm)

DIAMETRO CAMPO MICRONES (m)

4.3

Con el objetivo de menor aumento enfoque una zona del preparado en que se observe el entrecruzamiento de hilos verdes y blancos. Con este aumento comprobar que ambos hilos se ven ntidos. Cambie a objetivo de 10x ubicando siempre la zona de entrecruzamiento de ambos hilos. Enfoque la preparacin. Observe diferencias con respecto a la imagen anterior. Cambie a objetivo de 40x. Enfoque. Aparecen ambos hilos enfocados simultneamente? Por qu?. Cambie a objetivo de inmersin. Siga la metdica descrita. Busque el foco del hilo verde y luego gire lentamente el micromtrico hasta encontrar en foco el hilo blanco. Para

determinar el plano en que est el hilo con respecto al verde, debe considerar la direccin del giro del tornillo macro/micromtrico. Cul hilo se encuentra arriba? Cul de los objetivos tiene mayor profundidad de foco?

4.4

Utilice el microscopio observando con cada uno de los objetivos la muestra entregada. Esquematice con objetivo 40x y segn las indicaciones de anexo N2. Calcule el tamao aproximado de las clulas presentes en el preparado. Observe el preparado con objetivo 100x, usando aceite de inmersin, de acuerdo al anexo N1

Nombre preparacin: Propsito: Tincin: Aumento total: Descripcin:

5.

CONCLUSIONES

Segn los conocimientos adquiridos, tanto tericos como prcticos, a qu conclusiones usted ha llegado?

ANEXO N1

RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO OPTICO

Limpiar el microscopio, con preferencia el sistema de aumento y el de iluminacin, con pao suave y sin pelusas.

Verificar que el cable elctrico y el enchufe est en buenas condiciones. Conectar el enchufe a la red elctrica. Girar el conmutador o interruptor de la lmpara hasta lograr la iluminacin ptima. Colocar el objetivo de menor aumento en el eje ptico del microscopio. Se detecta por un sonido clic del revlver.

Subir la platina y subplatina al tope mximo superior. Colocar el lente frontal del condensador, si fuera deslizable en el eje ptico. Colocar el filtro si fuera necesario. Abrir completamente el diafragma. Regular la separacin de las lentes oculares de acuerdo a la separacin de sus ojos. Observar por los oculares y ajustar la separacin de ellos hasta que el campo de iluminacin observado, sea uno solo homogneo y circular.

Limpiar muy bien la preparacin entregada, preferentemente la zona donde se halla la muestra.

Colocar el preparado en la platina con el cubreobjeto hacia arriba. Para proceder con mayor facilidad haga lo siguiente; con la mano izquierda abra la pinza resorte del carro Vernier y con la derecha encaje el preparado en la escuadra del carro, luego con suavidad suelte la pinza para que establezca contacto con el borde del preparado y lo aprisione al carro.

Desplazar el preparado con los tornillos de desplazamiento del carro hasta que la muestra quede en el centro del orificio de la platina y reciba directamente los rayos luminosos provenientes desde el condensador.

Observar por los oculares y usando el tornillo macromtrico proceda a bajar lentamente la platina hasta obtener una imagen, aproximadamente, ntida y enseguida muy ntida accionando el tornillo micromtrico. Si no la obtiene, nuevamente desplace la platina al tope mximo superior y repita el paso anterior.

Compensar las diferencias pticas entre los ojos con el anillo diptico y constate que al guiar alternadamente los ojos no se perciben diferencias de focalizacin..

Recorrer el preparado en toda su extensin y constate que la imagen se mueve en sentido contrario al desplazamiento de la muestra.

Seleccionar una zona de la muestra que desee observar a mayor aumento (objetivo 10x), y djela en el centro del campo de iluminacin.

Sin desplazar ni accionar el tornillo macromtrico y micromtrico girar el revolver y reemplazar el objetivo menor por el objetivo 10x (posicin clic).

Mirar por los oculares y verificar que la imagen es borrosa, luego precise la nitidez de ella accionando el tornillo micromtrico. Si no lo consigue regrese al objetivo 4x, suba la platina al tope mximo y comience de nuevo.

Para observar con objetivo

40x, seleccione previamente una zona con el objetivo 10x,

enfoque, luego gire el revlver y coloque el lente 40x. A continuacin proceda de la manera que ya fue sealada en los 2 ltimos puntos anteriores. Por ltimo, para observar con el objetivo 100x, lente de inmersin, realice lo siguiente: Seleccionar con el objetivo 40x un punto de la muestra, enfoque claramente, y djela en el centro del campo de observacin. Luego gire el revlver y djelo a mitad del desplazamiento hacia el objetivo 100x. A continuacin, ponga una gota de aceite de cedro sobre la muestra y recuerde que no debe accionar los tornillos macro y micromtrico ni mover la muestra. Termine el desplazamiento del objetivo 100x hasta que quede en posicin de enfoque. Observar y precisar la nitidez de la imagen borrosa con ayuda del tornillo micromtrico. Al finalizar la observacin apague, rote el revolver y sustituya el objetivo 100x por el 4x, saque el preparado y lmpielo con un pao suave humedecido con xilol y compruebe que ha quedado sin aceite.

Despus que haya finalizado sus observaciones, apague inmediatamente la lmpara, saque el preparado, limpie las lentes, el sistema de iluminacin y dems componentes del microscopio. Desconecte el cordn a la red elctrica, ponga el microscopio en el centro del mesn.

Compruebe que el objetivo menor est en posicin de enfoque, que la platina y la subplatina se hayan en tope superior y que el carro esta centrado. Por ltimo, cubra el microscopio con la funda de proteccin.

ANEXO N 2 FORMA DE REALIZAR UN ESQUEMA

Enfoque y observe la preparacin entregada o la preparada, segn las indicaciones que usted ya conoce. Ubicar y observar la muestra enfocando con aumento objetivo 4x, luego 10x.

Si para la comprensin de la observacin, debe esquematizar con aumento 10x, realice un crculo de 8 cm. de dimetro o utilice el que ya viene hecho y esquematice. Este representa el campo del microscopio. Normalmente se esquematizar con aumento 40x y en algunas oportunidades con 100x.

En cualquiera de las situaciones anteriores, proceda teniendo en cuenta lo siguiente:

a) El esquema debe ser proporcionado en el campo. b) Usted debe cuidar que, con ese objetivo, mida los micrones que corresponda. c) Los colores del esquema de su muestra deben ser los que usted est observando. d) Debe ser cuidadoso con su observacin y establecer la relacin de forma y tamao con otras clulas. e) Al lado de la circunferencia en donde realiz su esquema, anote siempre: Nombre de la preparacin. Propsito. Tincin. Aumento total. Descripcin. Nombre de las partes que se ubican en el esquema, indicndolas con flechas.