PRACTICA # 2 EXTRACCION DE ADN A PARTIR DE TEJIDOS VEGETALES

LILIBETH CANCHILA MUOZ MARIA JOSE CONTRERAS GOMEZ JAIR MERCADO NURIS TERESA MONTES VERBEL KAROL LISETH RUEDA CONCHA

PROFESOR: JAVIER BELTRAN

UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIA PROGRAMA DE BIOLOGIA LABORATORIO DE BILOGIA MOLECULAR SINCELEJO 2012

INTRODUCCION Existen mtodos y tecnologas diferentes para el aislamiento de ADN genmico. En general todos estos mtodos involucran la destruccin y lisis del material celular, seguido de una precipitacin de protenas tpicamente obtenida por digestin con proteinasa K, y la extraccin del ADN usando altas concentraciones de sales, extraccin orgnica o la unin del ADN a una fase slida (intercambio inico o tcnica de slica). Usualmente el material gentico es recuperado por precipitacin usando etanol o isopropanol. La eleccin de cada mtodo depender de muchos factores como: la cantidad requerida de ADN, la pureza y aplicacin del mismo. En cuanto a la cantidad y a la calidad del producto en los diferentes mtodos stos no siempre son reproducibles, porque se va sujeta a la manipulacin de los investigadores y el tipo de muestra usada. La separacin del ADN desde los componentes celulares est dividida dentro de 4 etapas: destruccin; lisis; remocin de protenas y contaminantes; recuperacin del ADN. En algunos mtodos las fases 1 y 2 se encuentran combinados. La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados. Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: cido nucleico diana; Organismo fuente; Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.); Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin); Uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de ADNc, etc.).

Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: Rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.); Tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.); Digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrpicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan fcilmente por filtracin o precipitacin. A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede aadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la precipitacin. Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante cambios del pH.

El objetivo de esta prctica fue la extraccin de cidos nucleicos (ADN) a partir de tejidos vegetales (Dioscorea alata).

MATERIALES Y METODOS Para la extraccin de ADN se utiliz la especie vegetal Dioscrea alata que se encontraba en cultivo in vitro, por tal razn fue necesario sacarla de recipiente y colocarla en papel absorbente para absorber el agar, luego se pesaron 50 mg de las hojas limpias de hongos en una balanza analtica, y fueron llevada a un mortero para su trituracin con nitrgeno lquido, despus de macerado se rasparon las paredes del mortero con una cuchilla y la muestra fue llevada a dos tubo de eppendorf; se adicionaron 200 l de buffer de lisis (NaCl 0.08 M, Tris HCl 0.1M, EDTA 0.06 M, SDS 0.5%) y se aade 3 l de proteinasa K que estuvo almacenada en un tubo eppendorf de 0.2 ml y refigerada permanentemente, inmediatamente se llev al vortex para mejor homogenizacin de la muestra y llevada a bao maria durante 10 minutos a una temperatura de 65C, al retirar la muestra del bao de maria se le agreg 48 l de acetato de amonio 5 M (pH 9) y se refriger en hielo (4C aprox.) durante 30 minutos. Posteriormente se centrifug (4C) a 13200 rpm durante 10 minutos y se recuperaron 200l del sobrenadante y se llevo a dos tubos eppendorf esteriles a los cuales se les agregaron 200l de cloroformo: alcohol isoamilico y se agito en el vortex por 1 minuto, se dejo reposar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente y se centrifugo despus a 13200rpm durante 5 minutos, se transfirieron 150 l de la fase acuosa a un tubo nuevo que contena 300 l de etanol absoluto y se almaceno la muestra a -20C durante 12 horas. Despus de transcurrido este tiempo se centrifugo nuevamente a 13200rpm durante 10 minutos. se retir el alcohol de la muestra y al precipitado se le agregaron 200l de etanol al 70% frio y se centrifugo a 13200rpm durante 10 minutos, se decant el alcohol y se dej evaporar a temperatura ambiente y se le agrego a la muestra 100 l de agua estril. Se almaceno la muestra para posterior uso.

RESULTADOS Y DISCUSION. La aplicacin de las diferentes tcnicas empleadas en biologa molecular para el anlisis del genoma, depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN. Para lo cual se utilizan diversos mtodos de extraccin, dependiendo del tipo de tejido a emplear. Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composicin de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extraccin de todo su contenido, incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por accin mecnica, pulverizando el tejido. Partiendo de una muestra de 1 gramo de una plntula de ame, se procedi a mezclar con el buffer de extraccin sin proteinasa k ( 1000l) que entra en las clulas y genera una desestabilizacin osmtica, haciendo que las clulas se hinchen y se estallen sus membranas celulares. Inicialmente fue necesario llevar a cabo una lisis para liberar al ADN del interior celular, para lo cual se utiliz el buffer de extraccin que contena principalmente una molcula quelante, (EDTA, cido etileno amino tetra actico), que tiene cuatro grupos carboxilo y dos grupos amino, cuya forma completamente de-protonizada puede unirse a cualquier complejo metlico en solucin, quitando a los cationes de la solucin para

desestabilizar la membrana celular e inhibir a las ADNasas; sales , que forman una capa inica suave que recubre al ADN protegindolo y ayudando a evitar su degradacin. Se utilizo buffer de lisis, cuya funcin es romper la membrana celular y nuclear, permitiendo esto la liberacin del ADN. Dicho buffer, para la extraccin de ADN, contena Proteinasa K, es una proteasa que degrada las protenas de membrana y facilita su lisis, liberando el ADN. Qumicamente la proteinasa K acta a nivel de los pptidos en los grupos carboxlicos alifticos y aminocidos aromticos propios en los lpidos de membrana. Este proceso de lisis de membrana fue complementado con el bao de Mara que a 65c activa de forma eficiente a la proteinasa K. Todo esto se logr en un tiempo de incubacin de 2 horas a 65 C para favorecer la reaccin. Luego procedimos a centrifugar para ayudar con el rompimiento de la membrana y a la vez para sedimentar los ncleos, quedando un sobrenadante compuesto por restos de membrana, organelas celulares, protoplasma. Esta incubacin facilit la ruptura de lpidos en la membrana celular, permitiendo la liberacin del ADN de la estructura celular. Concluido este paso, se llev a cabo la precipitacin del ADN con una sal a alta concentracin de 7.5 M (acetato de amonio), con la adicin de la sal, el ADN que est cargado negativamente se obtuvo una capa inica positiva que permiti su precipitacin. Posteriormente, result necesario tratar las muestras con cloroformo: alcohol isoamilico para eliminar las protenas, luego se agreg isopropanol, el alcohol en la solucin de precipitacin se utiliz para remover la concentracin residual de sales y promover la precipitacin del cido nucleico para ello se agreg de isopropanol el mismo volumen de la muestra. La precipitacin del ADN fue casi inmediata en presencia de la sal y el alcohol, sin embargo se incub la muestra durante 24 horas. Posteriormente, se centrifug la muestra, se removi la fase acuosa y se lav la pastilla de ADN con etanol al 70% para eliminar todas las sales en la solucin. Las muestras se centrifugaron nuevamente. La muestra fue lavada y precipitada con alcohol al 70% del cual el 40% es alcohol y el 30 % es agua. El alcohol se encarga de precipitar el ADN, pues este, es soluble en agua (y, por tanto, invisible a nuestros ojos, pues cada molcula est rodeada de agua y nuestra vista no percibe molculas individuales de ADN) pero insoluble en alcohol, lo cual origina que en presencia de ste se aglutine o "se precipite". Al aglutinarse, el ADN forma partculas macroscpicas y se hace visible. Finalmente el ADN es resuspendido en buffer TE, el cual es una solucin amortiguadora del pH comnmente empleada en biologa molecular, especialmente para procedimientos que buscan proteger al DNA o RNA. La capacidad amortiguadora del buffer depende del Tris, mientras que el EDTA es el

responsable de proteger a los cidos nucleicos inactivando a las DNAsas o RNAsas. El EDTA logra esta inactivacin, actuando como quelante de cationes divalentes como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales son indispensables para el funcionamiento de estas enzimas.

CONCLUSIONES

La proteinasa K es un buffer de lisis del material celular, la cual degrada los pptidos de membrana plasmtica y nuclear, facilitando la liberacin de ADN.

El ADN se precipita en alcohol, pues es insoluble en este, y se torna visible en la interfaz alcohol-H2O. El producto obtenido de la extraccin no es ADN puro, ya que, entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. No es posible verificar la eficacia del protocolo, ya que el ADN no fue visible.

BIBLIOGRAFIA

Rogers S.O., Bendish A.J., EXTRACCION OF DNA FROM PLANT TISSUES. Plant Molecular Biology Manual. A6:1-10.Kluwer Academic Publishers, Belgium, 1988.

LETELIER Ignacio. Grupos sanguneos. [En lnea]. Terra Networks, S.A. Chile. Disponibilidad: http://www.escolares.net/des cripcion.php?ide=942

Gustavo A. Saldaa, Efran G. Salazar. La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR [En lnea]. Microbial S. Girona Espaa. Disponibilidad: http://www.microbial

CUESTIONARIO 1. Existen diferencias significativas en los procesos de extraccin de ADN de clulas procariotas, vegetales y animales? La estructura de ADN de cadena doble es universal en todas las clulas vivas, pero las diferencias se producen en los mtodos para la extraccin de ADN genmico de los animales y clulas vegetales. El ADN genmico se encuentra en el ncleo de las clulas. La cantidad y pureza del ADN extrado depende del tipo y tamao de la celda, ya que ciertas clulas contienen ms ADN y las impurezas que otros. El ADN genmico en plantas es ms difcil de extraer, debido a la pared celular de la planta, que se retira por la homogeneizacin, o mediante la adicin de celulasas para degradar la celulosa que forma la pared celular. Adems, los metabolitos presentes en la clula vegetal puede interferir con la extraccin de ADN genmico por contaminacin de la muestra de ADN durante el proceso de precipitacin. Las diferencias de ADN entre plantas y animales se encuentran en la secuencia de bases en la hlice. Compuestos que se encuentran en las clulas vegetales estn ausentes en las clulas animales, y las secuencias de bases de ADN reflejar esto, ya que el ADN genmico de la planta es a menudo ms grande que el ADN de los animales. Estas diferencias afectan a los mtodos de extraccin, por los impactos sobre el rendimiento y la pureza del ADN. La extraccin de ADN genmico es el ms sencillo de los procedimientos, porque todo lo que se necesita es una buena lisis fuerte para liberar el ADN genmico en la solucin. Para las levaduras, clulas de las plantas y las bacterias, se trata de romper el fuerte muro, celular rgido antes de interrumpir mecnicamente la membrana.

2. se podrn realizar anlisis genticos de un organismo sin tener que realizar procesos de extraccin de ADN?

No, ya que el fin principal de la obtencin y purificacin de adn para adquirir material gentico es recuperar la cantidad mxima de ADN de alto peso molecular libre de protenas, fenol e inhibidores de las enzimas de restriccin, y de la tap polimerasa. La obtencin de ADN es clave para estudios posteriores y anlisis genticos. El aislamiento y purificacin de ADN es el paso inicial para la mayora de los protocolos empleados en biologa molecular por lo que resulta esencial disponer de mtodos sencillos y rpidos para su realizacin 3. qu caractersticas posee Fusarium que hace difcil su identificacin por mtodos tradicionales y que procedimientos moleculares son posibles utilizar en la actualidad para su identificacin? Sus caractersticas fisiolgicas y morfolgicas explica su capacidad para colonizar diversos nichos ecolgicos diseminados por todo el mundo, pero tambin dificulta el establecimiento de unas claves taxonmicas estables y ampliamente aceptadas para el gnero. Adems, muchas especies requieren condiciones especficas para desarrollarse adecuadamente y otras sufren mutaciones rpidamente. Esto explica la cantidad de clasificaciones y especies descritas por los diversos autores. Actualmente, la mayora de estas clasificaciones se basan en las caractersticas macro y microscpicas del cultivo. La Identificacin de especies de Fusarium por mtodos tradicionales requiere de habilidades especficas y experiencia, y hay un inters cada vez mayor de nuevos mtodos moleculares para la identificacin y cuantificacin de Fusarium de muestras de alimentos. PCR en tiempo real con tecnologa de punta de prueba (Taqman) se puede utilizar para la identificacin y cuantificacin de varias especies de Fusarium en muestras de grano de cereal. Hay varios pasos crticos que necesitan ser considerados al establecer un mtodo de PCR en tiempo real basado en la cuantificacin de ADN, incluyendo la extraccin de ADN de las muestras 4. Cules son las diferencias entre extraccin de ARN y ADN? Algunos protocolos de extracion de ADN Y ARN se diferencian en los tratamientos para inhibir las enzimas de cada tipo de acido nucleico, para el caso de ADN y ARN porciones que son tratados diferencialmente, ya sea con DNasa I (la extraccin de ADN y ARN recuperar) o con RNasa A (para recuperar selectivamente el ADN).

5. Cmo distinguira si posee una muestra de ADN contaminada con fenol? y si estuviera contaminada con protenas? Para conocer la pureza de una muestra de ADN se debe tener en cuenta la relacin de DO a 260 y 280 nm. Una preparacin pura de ADN= DO 260/280 debe ser 1.8, Valores menores de esta relacin indican contaminacin de la muestra con protena. Valores mayores hasta 2.0 indican preparaciones altamente purificadas de ADN. Valores mayores indican contaminaciones con fenol. 6. Describa una manera fcil y rpida de determinar la concentracin y pureza del producto purificado. La manera ms integral para evaluar la concentracin de ADN y la pureza es usar las mediciones de UV de electroforesis en gel de agarosa 7. Cul es el fundamento de la purificacin de ADN por medio de columnas comerciales? La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizacin de marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.