DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS

FUNDAMENTOS DE ANLISIS INSTRUMENTAL. 3 RELACIN DE PROBLEMAS.

1.- En ausencia de autoabsorcin, la intensidad de fluorescencia de una muestra es proporcional a la concentracin, solo a concentraciones bajas. Calcular el porcentaje de error que se comete suponiendo que la respuesta es lineal cuando se mide la intensidad relativa de fluorescencia de disoluciones 2.5x10-5 y 2.5x10-6 M de un compuesto cuya =4000 L mol-1 cm-1 si el valor de b es 1 cm.
Solucin: c=2.5x10 M: 11.65 %; c=2.5x10 M; 0.88 %
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2.- Se desea analizar vitamina B1 en un preparado comercial de 2.000 g por el mtodo del tiocromo. Se extrae con HCl y fosfatasa y se diluye a 100 mL. Se purifica una alcuota de 15 mL pasndola por una columna cromatogrfica, y por causas inherentes al proceso se diluye a 25 mL. De la anterior solucin, se forman dos porciones de 5 mL, una de ellas se trata con ferricianuro y ambas se aforan a 10 mL para examen fluorimtrico. Una solucin de referencia de 0.2 ppm de tiamina se somete al mismo tratamiento que la muestra problema, con excepcin de que la porcin introducida en la columna conserva su volumen original. Se toman dos alcuotas de 5 mL y una se oxida y ambas se aforan a 10 mL. Se mide la fluorescencia de ambas muestras dando lugar a intensidades de fluorescencia de 18 y 13 unidades de fluorescencia, respectivamente. Calcular los ppm de vitamina B1 en la muestra.
Solucin: 23 ppm

3.- La forma reducida del dinucletido de nicotinamida y adenina (NADH) es una coenzima importante y muy fluorescente. Tiene un mximo de absorcin de 340 nm y un mximo de emisin a 465 nm. Las soluciones patrn de esta sustancia generan las siguientes intensidades de fluorescencia:
Concentracin de NADH (mol/L) 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 Intensidad relativa 2.24 4.52 6.63 9.01 10.94 13.71 15.49 17.91

a) Trazar la curva de calibracin del NADH. b) Determinar la pendiente y ordenada en el origen por mnimos cuadrados para la grfica del apartado anterior. c) Calcule la desviacin estndar de la pendiente y la que corresponde a la regresin de la curva. d) Una solucin desconocida tiene una fluorescencia relativa de 12.16. Cul ser su concentracin en NADH? Calcular la desviacin la desviacin estndar relativa del resultado obtenido, as como la desviacin estndar relativa del resultado obtenido considerando que el valor de 12.16 es la media de tres medidas.
Solucin: b) Irel=22.35 cNADH + 3.6x10 ; c) sy/x=0.1747, sb=0.2696; d) c=0.544 M , DER=1.86 %; DER (con replicados)=1.2 %
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4.- En algunos mtodos fluorimtricos, el amortiguamiento de la fluorescencia es proporcional a la concentracin de las especies deseadas, por ejemplo, el metal X puede suponerse que amortigua la fluorescencia del ligando L. En una serie de medidas se obtuvieron los siguientes datos:
Solucin L (M) Blanco 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 1.0x10 -6 2.0x10 -6 3.0x10 -6 4.0x10 -6 5.0x10 -6 6.0x10 -6 X (M) 0.0 84.0 67.2 50.5 33.6 16.9 0.50 0.00 Seal fluorescente

Encuentre: a) La relacin molar del complejo formado entre X y L. b) La concentracin de X en una solucin, la cual, cuando se trata en la misma forma, da una lectura de 26.8 unidades.
Solucin: 3.42x10 M
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5.- A cuatro alcuotas de 10,0 mL de una muestra de agua se adicionaron 0.00, 1.00, 2.00 y 3.00 mL de una solucin estndar de NaF que contena 10.0 ppb de F- tal y como se muestra resumido en la tabla. Se adicionaron a cada una 5.00 mL exactos de una solucin que contena un exceso de complejo de Al con el rojo de Alizarina R, un complejo fuertemente fluorescente, y las disoluciones se diluyeron a 50.0 mL. La intensidad de de fluorescencia de las cuatro disoluciones y de un blanco fueron las siguientes: mL de Muestra Blanco, 0.00 10.00 10.00 10.00 10.00 mL de Festndar (10.0 ppb F-) 0.00 0.00 1.00 2.00 3.00 mL Complejo Alrojo Alizarina R (exc) 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 Lectura

73.0 68.2 55.3 41.3 28.8

a) Representar los datos y obtener la ecuacin de la recta por mnimos cuadrados b) Calcular los ppb de F- en la muestra

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1.- En ausencia de autoabsorcin, la intensidad de fluorescencia de una muestra es proporcional a la concentracin, solo a concentraciones bajas. Calcular el porcentaje de error que se comete suponiendo que la respuesta es lineal cuando se mide la intensidad relativa de fluorescencia de disoluciones 2.5x10-5 y 2.5x10-6 M de un compuesto cuya =4000 L mol-1 cm-1 si el valor de b es 1 cm.
Solucin: c=2.5x10 M: 11.65 %; c=2.5x10 M; 0.88 %
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Tericamente, la intensidad de fluorescencia,IF, es proporcional a la eficacia cuntica, , y a la intensidad de radiacin absorbida por la muestra (I0-I), diferencia entre la intensidad incidente y la intensidad transmitida:

IF = K(I0-I)
Por otra parte, la Transmitancia se define como la relacin entre la Intensidad transmitida, I, y la intensidad incidente I0, siendo la Absorbancia, A, el logaritmo decimal de la transmitancia cambiado de signo: I T= I = I 0 *T I0 A = bc = log T T = 10 A = 10 bc Por tanto:
IF = K(I0-I010-bc) = KI0(1-10-bc)

10-bc se puede aproximar, a concentraciones bajas a la serie de Taylor. Para ello es necesario hacer un cambio de base: 10 = eln10 = e2.303, por tanto: 10-bc= (e2.303) -bc = e-2.303bc El desarrollo de la serie de Taylor para ex cuando x tiende a cero es:
x x2 x3 xn n xi i f ( x ) = f ( 0) + f ' ( 0) + f ' ' ( 0) + f ' ' ' (0) + ... + f ( 0) = f ( 0) 1! 2! 3! n! i =0 i !

De tal manera que, cuando x tiende a cero (bajas absorbancias):

x 0 x 2 0 x3 0 xn 0 x 2 x3 xn e = e + e + e + e + ... + e = 1 + x + + + ... + 1! 2! 3! n! 2! 3! n!
x 0

Entonces:
2.303bc

(2.303bc) 2 (2.303bc) 3 (2.303bc) n = 1 2.303bc + + ... + 2! 3! n!

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Si la absorbancia es pequea, (A < 0.05) se pueden despreciar los trminos de orden 2 y superiores, por tanto: e-2.303bc 1-2.303bc y la intensidad de fluorescencia aproximada;

IFaprox = 2.303KI0bc = Kc (proporcional a la concentracin)

El porcentaje de error que se comete:

% E = 100 *

I Faprox I F IF

I Faprox 2.303bc 2.303 A = 100 * IF 1 = 100 * 1 10 bc 1 = 100 * 1 10 A 1

- Si la concentracin es 2.5x10-5 M:
bc = 4000*1*2.5x10-5 = 0.1 que supera el valor de 0.05

2.303 * 0.1 % E = 100 * 1 = 11.95% 0.1 1 10

- Si la concentracin es 2.5x10-6 M:
bc = 4000*1*2.5x10-6 = 0.01 que est por debajo del umbral de 0.05 de absorbancia.

2.303 * 0.01 % E = 100 * 1 = 1.17% 0.01 1 10

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2.- Se desea analizar vitamina B1 en un preparado comercial de 2.000 g por el mtodo del tiocromo. Se extrae con HCl y fosfatasa y se diluye a 100 mL. Se purifica una alcuota de 15 mL pasndola por una columna cromatogrfica, y por causas inherentes al proceso se diluye a 25 mL. De la anterior solucin, se forman dos porciones de 5 mL, una de ellas se trata con ferricianuro y ambas se aforan a 10 mL para examen fluorimtrico. Una solucin de referencia de 0.2 ppm de tiamina se somete al mismo tratamiento que la muestra problema, con excepcin de que la porcin introducida en la columna conserva su volumen original. Se toman dos alcuotas de 5 mL y una se oxida y ambas se aforan a 10 mL. Se mide la fluorescencia de ambas muestras dando lugar a intensidades de fluorescencia de 18 y 13 unidades de fluorescencia, respectivamente. Calcular los ppm de vitamina B1 en la muestra.
Solucin: 23 ppm

Como el tratamiento del patrn y de la muestra problema son idnticos, salvo la dilucin de 15 a 25 mL en la columna cromatogrfica, hacemos referencia a la concentracin de patrn de 0.2 ppm de tiamina, que da una fluorescencia de 13 unidades. Por tanto, 18 unidades de fluorescencia se corresponden a una concentracin de tiamina de: 18*0.2/13 = 0.2769 ppm Esta concentracin debe ser corregida por la exclusiva dilucin cromatogrfica que sufre la muestra problema. Luego la concentracin de tiamina en los 100 mL es: 0.2769 * 25/15 = 0.4615 ppm (mg/L) Para obtener los mg de tiamina en la muestra, se multiplica la concentracin por el volumen expresado en litros: mg de tiamina en 100 mL o 2 gramos de muestra = 0.4615 (mg/L) * 0.1 L = 0.04615 mg. Para obtener los ppm (mg analito / Kg muestra) de tiamina en la muestra: ppm de tiamina en la muestra = 0.04615 (mg) / 2x10-3 Kg = 23.1 ppm (mg/Kg o g/g)

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3.- La forma reducida del dinucletido de nicotinamida y adenina (NADH) es una coenzima importante y muy fluorescente. Tiene un mximo de absorcin de 340 nm y un mximo de emisin a 465 nm. Las soluciones patrn de esta sustancia generan las siguientes intensidades de fluorescencia:
Concentracin de NADH (mol/L) 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 Intensidad relativa 2.24 4.52 6.63 9.01 10.94 13.71 15.49 17.91

a) Trazar la curva de calibracin del NADH. b) Determinar la pendiente y ordenada en el origen por mnimos cuadrados para la grfica del apartado anterior. c) Calcule la desviacin estndar de la pendiente y la que corresponde a la regresin de la curva. d) Una solucin desconocida tiene una fluorescencia relativa de 12.16. Cul ser su concentracin en NADH? Calcular la desviacin la desviacin estndar relativa del resultado obtenido, as como la desviacin estndar relativa del resultado obtenido considerando que el valor de 12.16 es la media de tres medidas.
Solucin: b) Irel=22.35 cNADH + 3.6x10 ; c) sy/x=0.1747, sb=0.2696; d) c=0.544 M , DER=1.86 %; DER (con replicados)=1.2 %
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4.- En algunos mtodos fluorimtricos, el amortiguamiento de la fluorescencia es proporcional a la concentracin de las especies deseadas, por ejemplo, el metal X puede suponerse que amortigua la fluorescencia del ligando L. En una serie de medidas se obtuvieron los siguientes datos:
Solucin L (M) Blanco 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 5.0x10-6 1.0x10 -6 2.0x10 -6 3.0x10 -6 4.0x10 -6 5.0x10 -6 6.0x10 -6 X (M) 0.0 84.0 67.2 50.5 33.6 16.9 0.50 0.00 Seal fluorescente

Encuentre: a) La relacin molar del complejo formado entre X y L. b) La concentracin de X en una solucin, la cual, cuando se trata en la misma forma, da una lectura de 26.8 unidades.
Solucin: 3.42x10 M
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M + nL MLn
Observando los datos de intensidad de fluorescencia se deduce que: M no es fluorescente; L es fluorescente y; MLn no es fluorescente. Observando igualmente los datos, se deduce que n= 1 ya que se necesita la misma concentracin de ligando que de metal inicial para inhibir totalmente la fluorescencia. Por este motivo, no incluimos la concentracin de L de 5.0x10-6 M.

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5.- A cuatro alcuotas de 10,0 mL de una muestra de agua se adicionaron 0.00, 1.00, 2.00 y 3.00 mL de una solucin estndar de NaF que contena 10.0 ppb de F- tal y como se muestra resumido en la tabla. Se adicionaron a cada una 5.00 mL exactos de una solucin que contena un exceso de complejo de Al con el rojo de Alizarina R, un complejo fuertemente fluorescente, y las disoluciones se diluyeron a 50.0 mL. La intensidad de de fluorescencia de las cuatro disoluciones y de un blanco fueron las siguientes: mL de Muestra Blanco, 0.00 10.00 10.00 10.00 10.00 mL de Festndar (10.0 ppb F-) 0.00 0.00 1.00 2.00 3.00 mL Complejo Alrojo Alizarina R (exc) 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 Lectura

73.0 68.2 55.3 41.3 28.8

c) Representar los datos y obtener la ecuacin de la recta por mnimos cuadrados d) Calcular los ppb de F- en la muestra

El fluoruro destruye el complejo entre el aluminio y el rojo de Alizarina por formacin de AlF63-. Esto provoca por tanto una disminucin de la fluorescencia que puede servir, por tanto, para la determinacin de F-. En este caso, para amortiguar el efecto matriz se propone el mtodo de la adicin estndar. Debido a que se produce una disminucin de la fluorescencia, se ha de buscar el punto de corte entre la recta de calibrado y 73 (seal del blanco). La concentracin de F- en la disolucin de medida cuando se aade, por ejemplo, 1 mL de patrn de 10 ppb sobre un volumen final de 50 mL: C1*V1 = C2*V2; C2=C1V1/V2= 10*1/50 = 0.2 ppb. Con 2 mL 0.4 ppb y, con 3 mL 0.6 ppb.

Como la muestra problema se diluye 5 veces, [F-] = 5*7.22x10-2 = 0.361 ppb.