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NDICE MEMORIA

ndice memoria .......................................................................................... 1 Resumen ................................................................................................... 5 Resum....................................................................................................... 7 Abstract .................................................................................................... 9 Agradecimientos ....................................................................................... 11 Captulo 1: Protenas Globulares ........................................................ 13 1.1. Interpretacin de las estructuras de las protenas por rayos-X .......... 13 Estructuras cristalinas ............................................................ 14 Conservacin de sus conformaciones nativas ............................ 15 Percepcin ms eficaz en forma simplificada ............................. 15 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3.

1.2. Determinacin de la estructura proteica mediante resonancia magntica nuclear bidimensional (2D-NMR)............................................. 16 1.3. Estructura Terciaria ..................................................................... 16 Hlices y hojas ................................................................. 16 Variacin de la polaridad en las cadenas laterales...................... 17 Ordenacin por eficacia .......................................................... 17 Dominios en los polipptidos ................................................... 18 Estructuras supersecundarias ................................................. 19 Patrones de plegamiento de protenas...................................... 20 1.3.1. 1.3.2. 1.3.3. 1.3.4. 1.3.5. 1.3.6. 2.1.

Captulo 2: Estabilidad de las Protenas .............................................. 21 Fuerzas electrostticas ................................................................ 21 Interacciones inicas ............................................................. 22 Interacciones dipolo-dipolo ..................................................... 22 2.1.1. 2.1.2. 2.2. 2.3. 2.4. 3.1. 3.2. 4.1.

Fuerzas por enlace de hidrgeno................................................... 23 Fuerzas hidrofbicas.................................................................... 24 Desnaturalizacin de las protenas ................................................ 27 Extraccin y purificacin .............................................................. 30 Caracterizacin ........................................................................... 32 Aminocidos estndar ................................................................. 33 Propiedades generales ........................................................... 34
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Captulo 3: Caracterizacin y Purificacin de Protenas ...................... 29

Captulo 4: Aminocidos ..................................................................... 33 4.1.1.

Sergi Muoz Martin

4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.1.5. 4.2. 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 5.1.

Enlaces de los pptidos .......................................................... 35 Clasificacin y caractersticas .................................................. 36 Propiedades cido-base .......................................................... 38 La nomenclatura ................................................................... 41 Clasificacin ......................................................................... 44 Convencin de Fisher ............................................................. 45 Sistema Cahn-Ingold-Prelog ................................................... 47 Quiralidad y bioqumica .......................................................... 48 Derivados aminocidos en las protenas ................................... 49 Papeles especializados de los aminocidos ................................ 50

Actividad ptica .......................................................................... 44

Aminocidos no estndar ............................................................. 49

Captulo 5: Protenas y Aminocidos Experimentales ......................... 51 Albmina de suero bovino, BSA .................................................... 51 Caractersticas ...................................................................... 52 Funciones de la albmina ....................................................... 52 Causas de la deficiencia de la albmina .................................... 52 Tipos de albmina ................................................................. 53 Tipos de Desoxiribonucleasas .................................................. 54 Determinacin de desoxiribonucleasas ..................................... 54 Fenilalanina .......................................................................... 55 Triptfano ............................................................................ 56 Tirosina ................................................................................ 57 5.1.1. 5.1.2. 5.1.3. 5.1.4. 5.2. 5.2.1. 5.2.2. 5.3. 5.3.1. 5.3.2. 5.3.3. 6.1.

Desoxiribonucleasa, DNAsa .......................................................... 53

Aminocidos aromticos .............................................................. 55

Captulo 6: Tcnicas Utilizadas ........................................................... 59 Espectrofotometra ...................................................................... 59 El espectro electromagntico .................................................. 59 La radiacin electromagntica y su interaccin con la materia .... 61 Absorcin y emisin de radiacin por parte de la materia. .......... 62 Ley de Bouguer - Lambert - Beer ............................................ 62 Aplicacin de espectrofotometra ............................................. 66 Espectrofotmetro ................................................................. 67 Partes del espectrofotmetro .................................................. 68 Aplicaciones de la espectrofotometra visible y ultravioleta ......... 69 6.1.1. 6.1.2. 6.1.3. 6.1.4. 6.1.5. 6.1.6. 6.1.7. 6.1.8. 6.2.

La derivada ................................................................................ 70
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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

6.2.1. 6.2.2. 6.2.3. 6.2.4. 6.2.5. 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 8.1. 8.2. 8.3.

Definicin de derivada como un lmite ...................................... 73 Segunda derivada ................................................................. 74 Espectroscopia derivada en los espectros de absorcin: ............. 75 Segunda derivada de espectroscopia ....................................... 77 Cuarta derivada de espectroscopia .......................................... 78

Captulo 7: Software e Instrumentacin ............................................. 79 RasMol ...................................................................................... 79 Vision Pro .................................................................................. 82 Thermo Scientific Evolution 300 .................................................... 83 Autoclave................................................................................... 84 Reactivos ................................................................................... 87 Instrumentacin ......................................................................... 87 Procedimiento experimental ......................................................... 88 Procedimiento ....................................................................... 89

Captulo 8: Mtodo Experimental ........................................................ 87

8.3.1. 9.1.

Captulo 9: Resultados Experimentales............................................... 91 Protena BSA (Albumin Serum Bovine)........................................... 91 Desnaturalizacin trmica ...................................................... 91 Desnaturalizacin cido- Base ................................................ 94 Desnaturalizacin Trmica ...................................................... 96 Desnaturalizacin cido Base ............................................... 98 9.1.1. 9.1.2. 9.2. 9.2.1. 9.2.2.

Protena DNAsa (Deoxyribonuclease I Pancreas Bovine) ................... 96

9.3. Comparacin de la evolucin graficada con la estructura primaria de las protenas. ......................................................................................... 100 9.3.1. 9.3.2. Estructura primaria de BSA. ................................................. 100 Esctructura primaria de DNAsa.............................................. 102

Captulo 10: Conclusiones................................................................. 107 Captulo 11: Evaluacin Econmica .................................................. 109 11.1. 11.2. 11.3. 12.1. 12.2. Costes de material y energa ................................................... 109 Costes de personal ................................................................. 110 Costes amortizaciones ............................................................ 111 Referencias bibliogrficas ........................................................ 113 Bibliografa de Consulta .......................................................... 114

Captulo 12: Bibliografa ................................................................... 113

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RESUMEN
La presente memoria forma parte de un mtodo donde se describe un enfoque alternativo para el estudio de la estructura de la protena utilizando la deteccin de radiacin ultravioleta (UV), donde los cambios de la absorbancia mxima de los aminocidos aromticos y cadenas laterales son inducidos por la desnaturalizacin trmica o de pH. El mtodo se basa en la hiptesis de que a medida que se desnaturalice la protena irn sobresaliendo al exterior otros grupos de aminocidos aromticos que en un principio no eran detectables. Se ha investigado el potencial de la segunda derivada de los espectros de los rayos UV, en funcin de la temperatura y de cambios de pH en dos protenas de diferentes propiedades fsicas y qumicas para representar cadenas laterales totalmente expuestas. Se demuestra que los pequeos cambios en la longitud de onda mxima de la regin espectral de Phe, Tyr y Trp en la presencia de la especificada desnaturalizacin puede ser medido con fiabilidad, y que la magnitud y la direccin del rastreo de picos se ven influidos por varios factores, como el tamao de la protena, carga, el medio o ambiente y la accesibilidad de los grupos aromticos de los disolventes. La evaluacin de los datos empricos UV espectral a la luz de la informacin conocida de la protena estructural, muestra que el cambio aplicado a las interacciones en protenas, revela la informacin de cuando se produce dicha influencia en la estructura de la cadena y en el comportamiento de los aminocidos aromticos.

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RESUM
La present memria forma part dun mtode on es descriu una visi alternativa per lestudi de lestructura de la protena utilitzant la detecci de radiaci ultraviolada (UV), on els canvis de labsorbncia mxima dels aminocids aromtics i les cadenes laterals sn indudes per la desnaturalitzaci trmica o de pH. El mtode es basa en la hiptesis de que a mida que es desnaturalitzi la protena aniran sobresortint a lexterior altres grups daminocids aromtics que en un principi no eren observables. Se ha investigat el potencial de la segona derivada dels espectres dels raigs UV, en funci de la temperatura i de canvis de pH en dos protenes de diferents propietats fsiques i qumiques per a representar cadenes laterals totalment exposades. Es demostra que els petits canvis en la longitud dona mxima de la regi espectral de Phe, Tyr y Trp en la presencia de la especificada desnaturalitzaci pot ser mesurat amb fiabilitat, i que la magnitud i la direcci del rastreig de pics es veuen influts per diferents factors, com la dimensi de la protena, carga, el medi o ambient i la accessibilitat dels grups aromtics dels dissolvents. Lavaluaci de les dades empriques UV espectral a la llum de la informaci coneguda de la protena estructural, mostra que el canvi aplicat a les interaccions en protenes, revela la informaci de quan es produeix dita influencia en la estructura de la cadena i en el comportament dels aminocids aromtics.

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ABSTRACT
This report describes an alternative approach to the study of protein structure using derivate absorbance in the ultraviolate region where changes in the maximum absorbance of aromatic amino acids and side chains are induced by thermal or acid-basic denaturalization. It has been investigated the potential of the second derivative of UV spectra, depending on temperature and pH changes in two proteins (Bovine Serum Albumin and Desoxyribonuclease I). We show that small changes in the wavelength maximum of the spectral region of Phe, Tyr and Trp in the presence of the specified distortion can be measured reliably, and that these changes are influenced by several factors as for example the protein size, protein charge, or the environment and accessibility to different solvents.

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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera expresar mi profundo agradecimiento al Dr. Francesc Sepulcre y a Antonio Gmez, la oportunidad que me han brindado para realizar este proyecto y aprender de l, y al Departamento de Biotecnologa de la Escuela Superior de Agricultura de Barcelona (ESAB) de la Universidad Politcnica de Catalua el permitirme realizarlo. No puedo nombrar a todos, pero si quiero reconocer especficamente el valor de algunos de ellos: A mis padres, por su apoyo incondicional, sus consejos siempre me han ayudado. Y por supuesto al resto de mi familia: mi hermana, mis tos, mis primos, mis suegros y mis cuados por toda la confianza puesta en m. Muy especialmente, agradezco a Sheila Bentez su dedicacin ya que sus consejos e indicaciones han servido para resolver muchas dudas surgidas en el desarrollo del mismo. A mi compaera Cristina Ayuso agradecerle todas las horas compartidas dentro y fuera del laboratorio, los momentos y la experiencia adquirida juntos, han sido ms que un placer. Agradecer tambin a todos mis profesores, desde el colegio hasta la universidad, que han hecho posible alcanzar el nivel de conocimientos tcnicos necesarios para realizar este proyecto, y en especial a mi profesora de secundaria y bachillerato Montserrat Serradell, que tanto me ense a disfrutar con la qumica. Y por supuesto a todos mis compaeros y amigos dentro y fuera de la universidad, de un valor incalculable, quienes como deca Scrates: Amigo es no solo quien te perdona un error, sino tambin quien ayuda a que no vuelvas a cometerlo. A mi pareja Emma lvarez, porque tu apoyo durante toda la carrera siempre ha sido muy importante para m. A todos, muchas gracias.

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CAPTULO 1: PROTENAS GLOBULARES

Las protenas globulares comprenden un grupo de sustancias muy diferentes que, en su estado nativo, aparecen como molculas esferoidales compactas. Los enzimas son protenas globulares, lo mismo que las protenas de transporte y los receptores. En esta seccin se considerarn las estructuras terciarias de las protenas globulares. Sin embargo, la mayor parte del conocimiento estructural detallado de las protenas, y por ello una gran extensin de su funcin, proviene de la determinacin de la estructura cristalina por rayos-X.

1.1. Interpretacin de las estructuras de las protenas por rayos-X


La cristalografa de rayos-X es una tcnica que da directamente imgenes de las molculas. Deben emplearse rayos-X para conseguirlo porque, de acuerdo con los principios de la ptica, la incertidumbre en la localizacin de un objeto es aproximadamente igual a la longitud de onda de la radiacin empleada para observarlo (las longitudes de onda de los rayos-X y las distancias del enlace covalente son ambas de ~ 1,5 ; las molculas individuales no pueden percibirse en un microscopio de luz porque la luz visible tiene una longitud de onda mnima de 4000 ). No existe, sin embargo, ningn artificio como un microscopio de rayos-X, porque no existen lentes para rayos- X. En vez de ello, para percibirla, se expone un cristal de la molcula que se trata de visualizar a un haz paralelo de rayos-X monocromtico y se registra la imagen de difraccin consiguiente sobre una pelcula fotogrfica o por un contador de radiacin. Seguidamente se expondrn algunos de los problemas especiales asociados con la interpretacin de las estructuras de las protenas por cristalografa de rayosX. La accin de los rayos-X se ejerce, casi exclusivamente, sobre los electrones, no sobre el ncleo. Una estructura de rayos-X es, por tanto, una imagen de la densidad electrnica del objeto en estudio. Estos mapas de densidad electrnica
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pueden presentarse como una serie de secciones paralelas a travs del objeto. En cada seccin, la densidad electrnica est representada por los contornos del mismo modo que se representa la altitud en un mapa topogrfico. Al apilar estas secciones, trazadas sobre transparencias, se obtiene un mapa de densidad electrnica tridimensional. Sin embargo, el anlisis estructural moderno se lleva a cabo con ayuda de computadores grficos, en los cuales los mapas de densidad electrnica muestran el contorno en las tres dimensiones.

1.1.1. Estructuras cristalinas


Las molculas en los cristales de las protenas, al igual que en otras sustancias cristalinas, se hallan dispuestas en redes tridimensionales que se repiten con regularidad. Los cristales de protena se diferencian, sin embargo, de los de las molculas orgnicas e inorgnicas ms pequeas en que se hallan muy hidratados; contienen, tpicamente, del 40 al 60 % de agua en volumen. El disolvente acuoso de cristalizacin es necesario para la integridad estructural de los cristales de protena. Ello es debido a que se necesita el agua para la pureza estructural de las propias protenas nativas. El elevado contenido de disolvente de los cristales de protena les confiere una consistencia blanda, como de gelatina, de modo que sus molculas carecen de la ordenacin rgida caracterstica de los cristales de molculas pequeas como las de NaCl o de glicina. Las molculas situadas en un cristal de protena se encuentran desordenadas de un modo tpico, que asciende a unos pocos angstroms, de tal forma que el mapa de densidad electrnica correspondiente carece de informacin respecto a los detalles estructurales de menor tamao. Se dice, por tanto, que el cristal posee un lmite de resolucin del referido tamao. Los cristales de protena muestran limites de resolucin comprendidos entre 2 a 3,5 , aunque pocos se hallan ms ordenados (poseen un poder de resolucin mayor) y muchos se hallan ms desordenados (tienen una resolucin menor). De la misma manera que un mapa de densidad electrnica de una protena debe interpretarse refirindolo a sus posiciones atmicas, la exactitud y la factibilidad del anlisis de la estructura del cristal dependen del lmite de resolucin del cristal. La mayor parte de las estructuras de los cristales de protena estn escasamente definidas para que sus densidades electrnicas sean capaces de revelar con claridad, las posiciones de cada uno de los tomos individuales. No obstante, la forma caracterstica del esqueleto del polipptido permite, habitualmente, que puedan trazarse, lo cual a su vez permite deducir las posiciones y las orientaciones de sus cadenas laterales. Pero las cadenas laterales de forma y de tamao comparables como son las de Leu, Ile, Thr y Val, no pueden diferenciarse con un grado razonable de confianza (los tomos de hidrgeno, que slo poseen un electrn, no son visibles en las estructuras de las protenas por rayos-X), de modo que una estructura de una protena no puede dilucidarse solamente de su mapa de densidad electrnica. Debe conocerse la estructura primaria de la protena, lo que permite adaptar la secuencia de los restos aminocidos, por observacin visual, al mapa de densidad electrnica. Los refinamientos matemticos pueden reducir entonces los errores de las posiciones atmicas en la estructura del cristal a unos 0,1 (en comparacin, los
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errores en las determinaciones de la estructura por rayos-X en las molculas pequeas pueden ser tan pequeos como 0,001 ).

1.1.2. Conservacin de sus conformaciones nativas


Cul es la relacin existente entre la estructura de una protena en un cristal y la que exhibe en disolucin que es donde funcionan normalmente la mayor parte de las protenas? Varias lneas de evidencia indican que las protenas cristalizadas adoptan con mucha proximidad las mismas estructuras que tienen en disolucin:
1. La molcula de una protena en un cristal se halla esencialmente en disolucin

debido a que est baada por el disolvente de cristalizacin en toda su superficie con excepcin de unas pocas zonas, generalmente pequeas, en las que establece contacto con molculas de protena vecinas.
2. Una

protena puede cristalizar en una o varias formas o "hbitos", dependiendo de las condiciones de cristalizacin, que se diferencian en cmo se hallan dispuestas las molculas de protena en el espacio que las relaciona entre s. En varios casos, cuando se han analizado independientemente las diferentes formas de cristalizar de la misma protena, las molculas han mostrado, virtualmente, las mismas conformaciones. Es evidente que las fuerzas de empaquetamiento en el cristal no afectan mucho a la estructura de las molculas de la protena. relevantes bio1gicamente es, sin embargo, la observacin de que muchos enzimas son catalticamente activos en el estado cristalino. La actividad cataltica de un enzima es muy sensible a las orientaciones relativas de los grupos que intervienen en el enlace y en la catlisis. Los enzimas cristalizados activos deben poseer, por tanto, conformaciones que se parezcan estrechamente a las que exhiben en disolucin.

3. La evidencia ms fuerte de que las protenas cristalizadas poseen estructuras

1.1.3. Percepcin ms eficaz en forma simplificada


Los varios centenares de tomos diferentes del hidrgeno de una protena, aunque sea pequea, convierten la comprensin de la estructura detallada de una protena en un esfuerzo considerable. El mtodo ms instructivo para estudiar la estructura de una protena es el examen directo del modelo del esqueleto (bolas y varillas). Desgraciadamente este tipo de modelos es raramente asequible y las fotografas de ellos son demasiado confusas para que resulten tiles. Una alternativa prctica es el diagrama espacial obtenido por computador en el que el esqueleto del polipptido se halle representado solamente por sus tomos de C y se incluyan unas pocas cadenas laterales clave nicamente. Otra posibilidad es una versin artstica de un modelo de protena que se ha simplificado y distorsionado ligeramente con objeto de mejorar su claridad visual. Puede obtenerse un nivel ulterior de abstraccin representando la protena en un dibujo que ponga de manifiesto su estructura secundaria.
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1.2. Determinacin de la estructura proteica mediante resonancia magntica nuclear bidimensional (2D-NMR)
La determinacin de las estructuras tridimensionales de protenas globulares pequeas en solucin acuosa ha sido posible gracias al desarrollo, durante la pasada dcada, de la espectroscopia de NMR bidimensional (2D) (y ms recientemente de tcnicas 3D y 4D). Estos anlisis mediante NMR, proporcionan las distancias intraatmicas entre protones especficos que estn separados por una distancia < 5 en la protena nativa. Estas distancias, junto con restricciones geomtricas conocidas, como distancias y ngulos de los enlaces covalentes, planaridad de los grupos, quiralidad y radios de Van der Waals, se usan para calcular la estructura tridimensional de la protena. Actualmente, esta tcnica de rpido desarrollo posee una precisin que, en el mejor de los casos, es ms o menos comparable a la de una estructura cristalina de rayos-X con una resolucin de 2 a 2,5 . Por ahora, est limitada a protenas de menos de unos 200 restos de aminocidos. En la mayor parte de los casos en que se conocen tanto la estructura cristalina de rayos-X como la de NMR para una protena determinada, las dos estructuras son compatibles. Los mtodos de NMR, adems proporcionan un medio de verificacin mutua con las tcnicas de rayos-X, pueden determinar las estructuras de protenas y otras macromolculas difciles de cristalizar. Adems, dado que la NMR puede registrar movimientos durante escalas temporales que abarcan diez rdenes de magnitud, puede ser usada para el estudio del plegamiento y dinmica de las protenas.

1.3. Estructura Terciaria


La estructura terciaria de una protena es su disposicin espacial; es decir, el plegamiento de los elementos estructurales secundarios, junto con las disposiciones espaciales de sus cadenas laterales. La mioglobina de la esperma de ballena fue la primera estructura de una protena por rayos-X que se puso de manifiesto al final de los aos 50. Su cadena polipeptdica efecta un recorrido tortuoso, como el de un gusano, por el que estos investigadores se vieron sorprendidos e indicaron su desacuerdo con esta falta de regularidad estructural. En los aos siguientes se describieron casi 200 estructuras de protenas. Cada una de ellas es singular y representa una entidad muy complicada. No obstante, sus estructuras terciarias muestran diversos rasgos sobresalientes comunes, como se ver ms adelante.

1.3.1. Hlices y hojas


Los tipos principales de elementos estructurales secundarios, las hlices y las hojas plegadas, aparecen corrientemente en las protenas, pero en proporciones y combinaciones variables. Algunas protenas, tal como la mioglobina, estn constituidas solamente por hlices , separadas por enlaces cortos que las conectan,que poseen una conformacin arrollada. Otras, como ocurre con la concanavalina A, poseen una proporcin grande de hojas pero
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carecen de hlices . Sin embargo, la mayor parte de las protenas poseen cantidades significativas de ambos tipos de estructura secundaria (por trmino medio, ~ 27 % de hlice y 23 % de hoja ).

1.3.2. Variacin de la polaridad en las cadenas laterales


Las estructuras primarias de las protenas globulares carecen, en general, de secuencias que se repiten o seudorrepetitivas, que son las responsables de las conformaciones regulares de las protenas fibrosas. Las cadenas laterales de los aminocidos en las protenas globulares se hallan, no obstante, distribuidas espacialmente de acuerdo con sus polaridades:
1. Los restos no polares Val, Leu, Ile, Met y Phe aparecen, casi siempre, en el

interior de una protena, fuera del contacto con el disolvente acuoso.


2. Los residuos polares con carga Arg, His, Lys, Asp y Glu se hallan situados,

casi invariablemente, en la superficie de una protena, en contacto con el disolvente acuoso. Ello es debido a que la inmersin de un ion en el interior, virtualmente anhidro, de una protena da por resultado la prdida, no compensada, de gran parte de su energa de hidratacin. Son raros los casos en que estos grupos aparecen en el interior de una protena y habitualmente desempean una funcin qumica especfica como la de promover la catlisis o la de participar en la unin con un in metlico.
3. Los grupos polares sin carga Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr y Trp aparecen

habitualmente sobre la superficie de la protena pero, con frecuencia, aparecen en el interior de la molcula. En este ltimo caso, estos restos se hallan casi siempre unidos hidrofbicamente a otros grupos de la protena. En realidad, virtualmente todos ocultos, comportndose como dadores en enlaces de hidrgeno que forman con grupos aceptores, que tambin se hallan ocultos; en cierto sentido la formacin de un enlace de hidrogeno "neutraliza" la polaridad de un grupo capaz de establecerlo.

1.3.3. Ordenacin por eficacia


Las protenas globulares son muy compactas, hay poco espacio en su interior, de modo que el agua se halla ampliamente excluida de dicho espacio. La ordenacin micelar de sus cadenas laterales (los grupos polares al exterior y los grupos no polares al interior) ha conducido a describirlas como gotas de aceite con una cubierta polar". Esta generalizacin, aunque es pintoresca, carece de precisin. La densidad de empaquetamiento (que es la relacin del volumen definido por las envolventes de Van der Waals de los tomos de una regin y el volumen total de la regin) de las regiones internas de las protenas globulares es de ~ 075, que es del mismo orden que el de los cristales moleculares de las molculas orgnicas pequeas. En comparacin, las esferas empaquetadas en contacto, de igual tamao, poseen una densidad de empaquetamiento de 074, mientras que los lquidos orgnicos (gotas de aceite) muestran una densidad de empaquetamiento que, en la mayor parte de los casos, se halla entre 060 y

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070. El interior de una protena es, por tanto, ms semejante a un cristal molecular que a una gota de aceite; es decir, se halla empaquetado eficazmente.

1.3.4. Dominios en los polipptidos


Las cadenas de polipptidos que estn constituidas por ms de ~200 restos suelen plegarse formando dos o ms agrupaciones globulares, conocidos como dominios, que confieren a estas protenas una apariencia bi- o multiglobular. La mayor parte de los dominios estn constituidos por 100 a 200 restos aminocidos y poseen por trmino medio un dimetro de ~ 25 . Cada subunidad de la deshidrogenasa del 3-fosfato del gliceraldehido, por ejemplo, tiene dos dominios diferentes. 1

Figura 1. Una subunidad del enzima deshidrogenasa del 3 fosfato de gliceraldehido, procedente de Bacillus stearothermophilus.

Una cadena polipeptdica oscila hacia atrs y hacia adelante en el interior de un dominio, pero los dominios vecinos se hallan conectados, habitualmente, por uno o, menos frecuentemente, por dos segmentos polipeptdicos. Los dominios son, por tanto, unidades independientes, desde el punto de vista estructural, cada una de las cuales posee las caractersticas de una protena globular pequea. En realidad, la protelisis limitada de una protena con varios dominios libera, con frecuencia, sus dominios sin alterar mucho sus estructuras. No obstante, la estructura en dominios de una protena no es siempre evidente ya que sus dominios pueden establecer contactos tan extensos entre s que la protena aparece como una entidad globular simple. Los dominios desempean frecuentemente una funcin especfica, tal como la unin con una molcula pequea. Los sitios de enlace de molculas pequeas en las protenas con varios dominios aparecen, con frecuencia, en las hendiduras situadas entre los dominios; es decir, que las molculas pequeas se hallan unidas a grupos de los dominios. Esta disposicin surge, en parte, de la

Referencia Figura 1: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra.


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necesidad de una interaccin flexible entre la protena y la molcula pequea, que proporciona la conexin covalente relativamente plegable entre los dominios.

1.3.5. Estructuras supersecundarias


En muchas protenas globulares, que no se hallan relacionadas, aparecen algunas agrupaciones de elementos estructurales llamadas estructuras supersecundarias.
1. La forma ms corriente de estructura supersecundaria es la unidad , en la

que la conexin transversal entre dos hebras paralelas de hoja est constituida por una hlice , con arrollamiento normalmente hacia la derecha.
2. Otra estructura supersecundaria corriente, el meandro , est constituida por

una hoja anti paralela formada por segmentos secuenciales de cadena de polipptido que estn conectados por vueltas que cambian el sentido y son relativamente cerradas.
3. En una unidad , dos hlices antiparalelas se empaquetan una contra otra,

con sus ejes inclinados de modo que permita una interpenetracin favorable energticamente de sus cadenas laterales en contacto.
4. Las hojas extendidas se arrollan frecuentemente para formar barriles . Se

han designado tres topologas (modos de ordenacin de las hebras y de sus interconexiones) de barriles diferentes, en analoga con los motivos geomtricos que se encuentran en los tejidos y en la cermica de los nativos americanos y de los griegos. Las estructuras supersecundarias pueden tener significado funcional y estructural. Una unidad , por ejemplo, en la que las hebras formen una hoja paralela, con conexiones transversales mediante una hlice con giro hacia la derecha (una unidad doble ) forma el sitio de unin del nucletido en muchos enzimas que se unen con estas molculas, segn pudo demostrar Michael Rossmann2.

Protein Structure and Function. Gregory A Petsko, Dagmar Ringe.


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Figura 2. Representacin ideal del dominio al que se une el coenzima de varias deshidrogenasas.3

1.3.6. Patrones de plegamiento de protenas


Actualmente, se conocen alrededor de 400 estructuras de protenas de alta resolucin y este nmero crece rpidamente. Las comparaciones estructurales entre estas protenas revelan que sus elementos de estructura secundaria estn organizados en un nmero asombrosamente pequeo de patrones geomtricos bsicos para la formacin de estructuras terciarias. Los anlisis de estos patrones sugieren que las estructuras terciarias pueden ser racionalizadas, en gran parte, en trminos de unas pocas restricciones estructurales bastante simples, tales como la rigidez del esqueleto polipeptdico, la tendencia de los elementos de estructura secundaria adyacentes en la secuencia a plegarse conjuntamente de manera antiparalela y la necesidad de empaquetar eficientemente las superficies en contacto de los elementos de estructura secundaria adyacentes en el espacio. Sin embargo, todava no se puede predecir correctamente el patrn de plegamiento de un polipptido determinado.

Referencia Figura 2: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra.

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CAPTULO 2: ESTABILIDAD DE LAS PROTENAS

Aunque pueda parecer increble, las medidas termodinmicas indican que las protenas nativas slo son entidades marginalmente estables en las condiciones fisiolgicas. La energa libre que se necesita para desnaturalizarlas es de ~ 04 kJ/mol de restos aminocidos, de modo que las protenas constituidas por 100 restos son tpicamente estables solamente por alrededor de 40 kJ/mol. Contrasta con este valor la energa necesaria para romper un enlace de hidrgeno tpico que es de ~ 20 kJ mol-1. Las diversas influencias no covalentes a las que se hallan sometidas las protenas -interacciones electrostticas (tanto atracciones como repulsiones), enlaces de hidrgeno (los intramoleculares y con el agua) y las fuerzas hidrofbicas- poseen cada una magnitudes de energa que pueden alcanzar hasta millares de kilojoules por mol en el conjunto de una molcula de protena. Por consiguiente, la estructura de una protena es el resultado de un equilibrio delicado entre fuerzas contrapuestas potentes.

2.1. Fuerzas electrostticas


Las molculas son conjuntos de partculas con carga elctrica y de aqu que, con un grado razonable de aproximacin, sus interacciones puedan determinarse por las leyes de la electrosttica clsica (clculos ms exactos precisan de la aplicacin de la mecnica cuntica). La energa de asociacin, U, de dos cargas elctricas, q1 y q2 que estn separadas a la distancia r, se calcula por integracin de la ley de Coulomb, para

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determinar el trabajo necesario para separar dichas cargas a una distancia infinita:

U=

kq1q2 Dr

(1)

En la que k = 90 x 109 J m C-2 y D es la constante dielctrica del medio en el que se hallan sumergidas las cargas (recurdese que D = 1 en el vaco y que, para la mayor parte, aumenta con la polaridad del medio). La constante dielctrica de una regin separada de una protena es difcil de calcular. Para el interior de una protena se toman usualmente las que se hallan en el intervalo de 2 a 5, en analoga con las constantes dielctricas que se miden en las sustancias que tienen polaridades anlogas, tales como el benceno y el ter dietlico. Aunque los efectos electrostticos se encuentran entre los factores ms importantes que gobiernan las conformaciones de las protenas, su cuantificacin sigue siendo una de las mayores fuentes de error en la determinacin de las estabilidades de las protenas. Ello es debido a que las interacciones electrostticas tienen un alcance bastante elevado, en comparacin con otros tipos de interacciones intramoleculares y, por tanto, incluyen a muchos tomos, mientras que los otros tipos de interacciones se pueden describir de forma ms simple.

2.1.1. Interacciones inicas


La asociacin de dos grupos inicos de una protena con carga opuesta se conoce como par inico o puente salino. De acuerdo con la ecuacin anterior, la energa de un par inico tpico, a saber el grupo carboxilo de Glu y el grupo amonio de Lys, cuyos centros de carga se hallan separados por 40 , en un medio de constante dielctrica 4, es de -86 kJ/mol (una carga electrnica = 160 x 10-19C). Sin embargo los iones libres en disolucin acuosa se hallan muy solvatados, de modo que la energa libre de solvatacin de dos iones separados es casi igual a la energa libre de formacin de su par inico sin solvatar. Por esta razn, los pares inicos contribuyen poco a la estabilidad respecto a la estructura de la protena nativa. Ello explica las observaciones de que los pares inicos ocultos (sin solvatar) aparecen raramente en las protenas y que los pares inicos que se hallan expuestos al disolvente acuoso (razonablemente corrientes en las protenas) se conservan poco en las protenas homlogas.

2.1.2. Interacciones dipolo-dipolo


Las asociaciones no covalentes entre molculas neutras elctricamente, conocidas colectivamente como fuerzas de van der Waals, proceden de las interacciones electrostticas entre dipolos permanentes o dipolos inducidos. Estas fuerzas son las responsables de numerosas interacciones, de fuerza variable, entre tomos vecinos que no se hallan enlazados.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

Las interacciones entre dipolos permanentes son determinantes estructurales importantes en las protenas porque muchos de sus grupos, tales como los grupos carbonilo y amida del esqueleto peptdico, poseen momentos dipolares permanentes. Estas interacciones son, generalmente, mucho ms dbiles que las interacciones carga-carga de los pares inicos. Un dipolo permanente induce tambin un momento dipolar sobre un grupo vecino, de modo que se establece una interaccin atractiva. Esta interaccin dipolo-dipolo inducido es, en general, mucho ms dbil que las interacciones dipolo-dipolo. Aunque las molculas no polares son casi elctricamente neutras en cualquier momento, poseen un pequeo momento dipolar que es consecuencia del movimiento de fluctuacin rpida de sus electrones. Este momento dipolar transitorio polariza a los electrones de un grupo vecino y, por ello, provoca la aparicin de un momento dipolar tal que, en las proximidades de sus distancias de contacto de Van der Waals, los grupos se atraen entre s. Estas fuerzas, que reciben el nombre de fuerzas de dispersin de London, son extremadamente dbiles. Las fuerzas de London aportan, tambin, una parte importante de la energa de enlace en las interacciones complementarias espaciales entre las protenas y las molculas con las que se unen especficamente.

2.2. Fuerzas por enlace de hidrgeno


Los enlaces de hidrgeno (D-H A), son predominantemente interacciones electrostticas entre un grupo dador dbilmente cido (D-H) y un tomo aceptor (A) que es portador de un par de electrones solitario. En los sistemas biolgicos, D y A pueden ser los tomos muy electronegativos de N y de 0 y, en ocasiones, los tomos de S. Los enlaces de hidrgeno, cuyas energas de asociacin oscilan en el intervalo de -12 a -30 kJ/mol, estn mucho ms orientados que las fuerzas de Van der Waals, aunque sus direcciones de enlace estn menos dirigidas que en los enlaces covalentes. La distancia D A se encuentra normalmente en el intervalo de 27 a 31 . Los enlaces de hidrgeno tienden a ser lineales, con el enlace D-H sealando a lo largo del orbital del par solitario del aceptor. Sin embargo, no son infrecuentes grandes desviaciones de esta geometra ideal. Por ejemplo, en los enlaces de hidrgeno de las hlices y de las hojas con plegamiento , los enlaces N-H apuntan aproximadamente a lo largo de los enlaces C=O, en lugar de hacerlo sobre el orbital del par solitario del O, y en las hojas con plegamiento paralelo, los enlaces de hidrgeno se separan significativamente de la linealidad. Los grupos que establecen enlaces de hidrgeno internos en una protena se hallan dispuestos de modo que se forman casi todos los enlaces de hidrgeno posibles. Est claro que los enlaces de hidrgeno tienen una influencia principal sobre las estructuras de las protenas. Sin embargo, una protena desplegada establece todos sus enlaces de hidrgeno con las molculas del disolvente acuoso (se recordar que el agua es un potente dador y aceptor de enlaces de hidrgeno). La energa libre de estabilizacin que los enlaces de hidrgeno internos confieren a una protena nativa es, por tanto, igual a la diferencia de

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energa libre de los enlaces de hidrgeno entre la protena nativa y la protena desplegada. Puesto que, en una primera aproximacin los diversos enlaces de hidrgeno a que se hace referencia tienen todos la misma energa libre, los enlaces de hidrogeno internos no estabilizan de modo significativo la estructura de una protena nativa con relacin a su estado desplegado y en realidad an podran desestabilizarla ligeramente. Esta idea la confirma la observacin de que las protenas se desnaturalizan con ms facilidad en disoluciones acuosas que contienen disolventes orgnicos de constante dielctrica baja, como el alcohol o la acetona, que cuando ambos disolventes se hallan ausentes. Como la naturaleza electrosttica de las asociaciones por enlaces de hidrgeno los hace ms fuertes a medida que la constante dielctrica del medio es menor, esto se opone al resultado que podra esperarse si los enlaces de hidrgeno internos fuesen la influencia principal en la estabilizacin de la estructura de las protenas. No obstante, los enlaces de hidrogeno internos de una protena proporcionan una base estructural para su modelo de plegamiento: Si una protena se plegase de modo que impidiese la formacin de algunos de sus enlaces de hidrgeno internos, se perdera su energa libre y tales conformaciones seran menos estables que aquellas en que se estableciesen todos los enlaces de hidrgeno internos posibles.

2.3. Fuerzas hidrofbicas


Efecto hidrofbico es el nombre que se da a las interacciones que provocan las sustancias no polares para conseguir que sus contactos con el agua sean mnimos y a las de las molculas anfipticas, tales como los jabones y los detergentes, para formar micelas en las disoluciones acuosas. Como las protenas nativas forman una especie de micela intramolecular en la que la mayor parte de las cadenas laterales no polares se hallan fuera del contacto con el disolvente acuoso, las interacciones hidrofbicas deben constituir un determinante importante de las estructuras de las protenas. El efecto hidrofbico es una consecuencia de las propiedades especiales del agua como disolvente, solamente una de las cuales es su constante dielctrica elevada. De hecho, otros disolventes polares, tales como el dimetilsulfxido (DMSO) y la N,N-dimetilformamida (DMF), tienden a desnaturalizar las protenas. Cul es el mecanismo fsico por el que se excluyen del medio de la disolucin acuosa las entidades no polares? Recurdese que la entropa es una medida del orden de un sistema y que disminuye al aumentar el orden. As, la disminucin de entropa cuando una molcula no polar o cadena lateral se solvata por el agua (el inverso del proceso comentado) debe ser consecuencia de un proceso de ordenacin. Esto es una observacin experimental, no una conclusin terica. Las magnitudes de las variaciones de entropa son demasiado grandes para que puedan atribuirse a los cambios de las conformaciones de los hidrocarburos; ms bien, como sealaron Henry Frank y Marjorie Evans en 1945, estas variaciones de entropa slo pueden proceder de alguna clase de ordenacin de la estructura del agua. El agua lquida posee una estructura de enlaces de hidrgeno muy ordenada y extensa.
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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

La insinuacin de un grupo no polar en el interior de su estructura la altera: Un grupo no polar no puede ni aceptar ni ceder enlaces de hidrgeno, de modo que las molculas de agua situadas en la superficie de la cavidad ocupada por el grupo no polar no pueden unirse mediante enlaces de hidrgeno con otras molculas de agua del modo habitual. Con objeto de recuperar la energa de enlace de hidrgeno prdida, estas molculas de agua superficiales deben orientarse ellas mismas de modo que formen una red de enlaces de hidrgeno que cierre la cavidad.

Figura 3. Preferencia en las orientaciones de las molculas de agua que se hallan prximas a un soluto no polar.4

Esta orientacin constituye una ordenacin de la estructura del agua, ya que el nmero de modalidades por las que las molculas de agua pueden formar enlaces de hidrgeno alrededor de la superficie de un grupo no polar es inferior al que pueden exhibir en el conjunto del agua. Desgraciadamente, la complejidad de la estructura bsica del agua no ha permitido, todava, una descripcin estructural detallada de este proceso de ordenacin. Se ha propuesto un modelo en el que el agua forma jaulas (estructuras cerradas) de enlaces de hidrgeno casi cristalinas en torno a los grupos no polares, que son semejantes a las de los clatratos.

Referencia Figura 3 y 4: Fonaments de Bioqumica. Juli Perit/Ramon Sendra. - 25 -

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Figura 4. Estructura del clatrato (n-C4H9)3S+F- 23 H2O

Las magnitudes de las variaciones de entropa que se producen cuando las sustancias no polares se disuelven en el agua indican, sin embargo, que las estructuras del agua resultantes slo pueden estar ordenadas ms ligeramente que el grueso del agua. Deben ser, tambin, muy diferentes de las del hielo ordinario, ya que, por ejemplo, la solvatacin de los grupos no polares por el agua origina un gran decremento en el volumen del agua. La desfavorable energa libre de hidratacin de una sustancia no polar, originada por la ordenacin que induce de las molculas de agua que la rodean, tiene por resultado neto que la sustancia no polar queda excluida de la fase acuosa. Esto es debido a que el rea de la cavidad que contiene un agregado de molculas no polares es menor que la suma de las reas de las superficies de las cavidades que cada una de estas molculas ocuparan individualmente. La agregacin de las molculas no polares disminuye, por tanto, el rea superficial de la cavidad y, por ello, la perdida de entropa de todo el sistema. En cierto sentido, los grupos no polares se ven forzados a salir de la fase acuosa por las interacciones hidrofbicas. Las medidas termodinmicas indican que la variacin de energa libre en la separacin de un grupo CH2- de una disolucin acuosa es de cerca de -3 kJ /mol. Aunque sta es una cantidad relativamente pequea de energa libre, en asociaciones moleculares en las que intervienen nmeros grandes de contactos no polares, las interacciones hidrofbicas constituyen una fuerza poderosa. Las fuerzas hidrofbicas constituyen una fuerza importante entre las causas que obligan a plegarse a las protenas para adoptar sus conformaciones nativas. Con el ndice hidroptico se indica las hidropatias (ndice de las tendencias combinadas de carcter hidrofbico e hidroflico) de las cadenas laterales de los aminocidos; en realidad, estos valores constituyen un buen criterio para la prediccin de que porciones de una cadena de un polipptido se hallan en el interior de una protena, fuera del contacto con el disolvente acuoso, y que porciones se hallan en el exterior, en contacto con el disolvente acuoso.
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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

En las protenas los efectos de las fuerzas hidrofbicas se mencionan, con frecuencia, como enlaces hidrofbicos, presumiblemente para indicar la naturaleza especfica del plegamiento de la protena por influencia del efecto hidrofbico. Sin embargo, debe tenerse presente que el enlace hidrofbico no origina interacciones especificas dirigidas, como las que habitualmente se asocian al termino "enlace".

2.4. Desnaturalizacin de las protenas


Las pequeas estabilidades de la conformacin de las protenas nativas las convierten en muy susceptibles a la desnaturalizacin, al alterarse el equilibrio de las dbiles fuerzas no enlazantes que mantienen la conformacin precedente. Cuando se calienta una protena en disolucin, sus propiedades conformacionales sensibles, tales como la rotacin ptica, la viscosidad y la absorcin UV, varan abruptamente en un intervalo muy limitado de temperaturas. Estos cambios discontinuos indican que la estructura de dicha protena se despliega de manera cooperativa: Cualquier desplegamiento parcial de la estructura desestabiliza la estructura restante que debe colapsarse simultneamente hasta adoptar el arrollamiento al azar. La temperatura en el punto medio de este proceso se conoce como temperatura de fusin, Tm de la protena en analoga con el punto de fusin de un slido. La mayor parte de las protenas tienen valores de Tm bastante por debajo de 100 C. Entre las excepciones a esta generalizacin, se encuentran, sin embargo, las protenas de las bacterias termoflicas, organismos que habitan las fuentes termales con temperaturas que se aproximan a los 100 C. Es interesante que las estructuras por rayos-X de estas proteinas termoestables no son sino sutilmente diferentes de las de sus homlogos normalmente estables. Adems de por las temperaturas elevadas, las protenas se desnaturalizan por otras condiciones y sustancias:
1. Las variaciones de pH alteran los estados de ionizacin de las cadenas

laterales de los aminocidos, lo que cambia la distribucin de carga de la protena y los requerimientos para el enlace de hidrogeno.
2. Los detergentes, algunos de los cuales perturban de modo significativo las

estructuras de las protenas a concentraciones tan bajas como 10-6 M, se asocian hidrofbicamente con los restos no polares de una protena, interfiriendo, por tanto, con las interacciones hidrofbicas responsables de la estructura de la protena nativa. tales como los alcoholes alifticos, interfieren con las fuerzas hidrofbicas que estabilizan las estructuras de la protena mediante sus propias interacciones hidrofbicas con el agua. Sin embargo, las sustancias orgnicas con varios grupos hidroxilo, tales como el etilenglicol o sacarosa, son desnaturalizantes relativamente dbiles, porque su capacidad para establecer enlaces de hidrgeno los convierte en agentes con escasa capacidad para romper la estructura del agua.

3. Las concentraciones elevadas de sustancias orgnicas solubles en el agua,

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Figura 5. Representacin de las molculas de sacarosa y etilenglicol

El orden de eficacia de los diversos iones en la estabilizacin de una protena, que es ampliamente independiente de la identidad de la protena, mantiene paralelismo con su capacidad para precipitar a las protenas por salado. Este orden se conoce como las series de Hofmeister:

Figura 6. Representacin de la serie Hofmeister

Los iones de las series de Hofmeister que tienden a desnaturalizar a las protenas, I-, ClO4-, SCN-, Li+, Mg2+, Ca2+ y Ba2+, se dice que son caotrpicos. Esta lista debera incluir tambin al ion guanidinio (Gu+) y a la urea no inica, que, cuando las concentraciones se encuentran en el intervalo de 5 a 10 M, son los desnaturalizantes de protenas ms empleados. El efecto de los diversos iones sobre las protenas es acumulativo, en su sentido ms amplio: GuSCN es un desnaturalizante mucho ms potente que GuCl que se utiliza con frecuencia, mientras que Gu2SO4 estabiliza la estructura de las protenas.

Figura 7. Representacin de la molcula de urea y del in guanidinio

Los agentes caotrpicos aumentan la solubilidad de las sustancias no polares en el agua. Por consiguiente, su eficacia como desnaturalizantes descansa en su capacidad para romper las interacciones hidrofbicas, aunque la manera como lo hacen no se comprende bien. Recprocamente, aquellas sustancias relacionadas que estabilizan a las protenas fortalecen las fuerzas hidrofbicas, aumentando de esta manera la tendencia del agua a expulsar a las protenas. Ello explica la correlacin entre las capacidades de un ion para estabilizar a las protenas y para precipitarlas por salado.

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CAPTULO 3: CARACTERIZACIN Y PURIFICACIN DE PROTENAS

Cada tipo de clula puede contener millares de protenas diferentes, cada especie de organismo contiene un conjunto caracterstico de protenas qumicamente diferentes de las de otros organismos. Las protenas son molculas relativamente frgiles, que conservan su actividad biolgica solamente en un intervalo relativamente limitado de pH y de temperatura. El aislamiento en forma pura de una protena determinada procedente de una clula o tejido, puede por tanto parecer que constituye una tarea difcil, especialmente porque, cualquier protena determinada puede existir slo en una concentracin muy baja en el interior de la clula, acompaada de millares de otras protenas. A pesar de todas estas dificultades, se han conseguido aislar muchas de ellas en forma pura. Por otra parte, los mtodos corrientes para la separacin de protenas poseen un poder de resolucin elevado. En este apartado se describen el sistema empleado en su purificacin y algunos de los mtodos para su caracterizacin. Aunque el presente captulo no se extiende mucho acerca de la biologa de las protenas, mucho de lo que se sabe en la actualidad acerca de su biologa depende de la posibilidad de disponer de preparaciones de protenas de elevado grado de pureza, cuyo aislamiento ha precisado de una gran cantidad de oscuro y cuidadoso esfuerzo.

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3.1. Extraccin y purificacin


El gran nmero de protenas que existen, su gran variedad de actividades biolgicas y las diferencias qumicas existentes entre las protenas homlogas de los distintos organismos determinan que la extraccin, la purificacin y la caracterizacin de las protenas constituyan un punto central en toda investigacin bioqumica. Se han purificado ya, al menos parcialmente, alrededor de un millar de enzimas diferentes, y algo ms de 200 se han obtenido en forma cristalina pura. Adems, centenares de otras protenas distintas de los enzimas se han aislado con un elevado grado de pureza. Los mtodos iniciales de aislamiento de las protenas fueron empricos, lentos y muy laboriosos; actualmente se han transformado en un arte depurado. No existe un procedimiento nico, o un conjunto de procedimientos mediante los cuales todas y cada una de las protenas puedan aislarse, sino que normalmente se sigue una secuencia de etapas de separacin para cualquier protena, que dar por resultado un grado de purificacin elevado y un alto rendimiento. El objetivo general consiste en aumentar la pureza o la actividad biolgica de la protena deseada por unidad de peso mediante la eliminacin del material inactivo o de las protenas no deseadas, mientras que al mismo tiempo se consigue un rendimiento mximo. El primer requisito es un mtodo especfico y sensible para distinguir y medir cuantitativamente la protena que se va a aislar. Si se trata de un enzima, se requiere un sistema de ensayo cuantitativo que permita determinar su actividad cataltica. Si la protena es una hormona, debe disponerse de un ensayo biolgico adecuado. Si la protena posee un componente qumico distintivo, por ejemplo un metal como el cobre, puede utilizarse un mtodo analtico sensible para este componente. Tambin es necesario un procedimiento para liberar la protena en forma soluble de la clula intacta o de la estructura del tejido sin provocar prdidas de actividad. Normalmente se emplea la trituracin mecnica u homogenizacin de los tejidos animales para romper las membranas celulares y liberar los contenidos celulares, los cuales pueden ser valorados despus para determinar su contenido en la protena deseada. Con las bacterias, las levaduras y muchas clulas vegetales, se necesitan procedimientos mucho ms vigorosos para romper sus gruesas paredes celulares, por ejemplo la radiacin snica, la trituracin con arena o la fragmentacin en una prensa de elevada presin. A veces la pared celular puede ser debilitada o lisada por tratamiento con ciertos enzimas. Normalmente la etapa siguiente consiste en determinar si la protena en cuestin se halla localizada en uno de los orgnulos subcelulares principales, como el ncleo, las mitocondrias o la porcin soluble del citoplasma. Ello puede conseguirse efectuando la separacin de los orgnulos subcelulares mediante centrifugacin diferencial. Si la protena se encuentra en una de las fracciones celulares principales, puede conseguirse un grado sustancial de purificacin utilizando aquella fraccin celular como punto de partida para la siguiente etapa de purificacin. Si la protena deseada se halla por casualidad asociada a una membrana o a un orgnulo membranoso, debe ser extrada de all en forma soluble, lo cual puede conseguirse, frecuentemente, por simple
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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

extraccin con agua o bien por ruptura mecnica o snica de las membranas, y tambin mediante el empleo de detergentes para lograr la desintegracin de la estructura membranosa. Una vez que se ha obtenido la protena deseada en forma soluble, pueden aplicarse los mtodos de fraccionamiento (dilisis, ultrafiltracin, electroforesis, centrifugacin, cromatografa de exclusin molecular, precipitacin isoelctrica, fraccionamiento con disolventes y efecto de la temperatura) con objeto de separarla de las protenas contaminantes. Por ensayo directo puede determinarse en cul de las fracciones aparece la protena deseada y si se ha enriquecido selectivamente por aumento de la actividad especfica. Puesto que las clulas de partida o el extracto de tejido pueden contener centenares de protenas diferentes, la purificacin de una protena determinada puede precisar de muchas etapas para separar muchas otras protenas de aquella que se va a purificar. Se utiliza una serie de procedimientos segn secuencias que se escogen empricamente. Entre los procedimientos de separacin utilizados como etapas iniciales tenemos la precipitacin isoelctrica, el fraccionamiento por salado o la precipitacin con disolventes. En cada etapa de fraccionamiento deben determinarse el factor de enriquecimiento y el rendimiento en la protena deseada. Estas etapas iniciales, en las cuales el poder de resolucin no es grande, van seguidas generalmente de procedimientos cromatogrficos. Se emplean con frecuencia la cromatografa de exclusin molecular y la de intercambio inico, en una u otra secuencia, con objeto de obtener fracciones enriquecidas en la protena deseada, basndose en el tamao molecular y en la carga elctrica, respectivamente. Cuando es posible efectuar la cromatografa de afinidad, constituye un mtodo de gran poder resolutivo que puede emplearse despus o en vez de otras formas de cromatografa. A veces, y como ltima etapa de purificacin, generalmente en pequea escala, se somete la protena a una u otra forma de electroforesis de zona, electroforesis discontinua o enfoque isoelctrico, con objeto de conseguir una separacin altamente resolutiva de la protena deseada con respecto a las impurezas que todava la acompaan. Si el rendimiento global en protena purificada al final de una secuencia de tales etapas de purificacin ha sido lo suficientemente elevado, es a menudo posible la cristalizacin de la protena. Un procedimiento a seguir para ello podra ser la adicin muy lenta de sal de modo que se aproxime a la concentracin necesaria para la precipitacin por salado, o bien que se alcance el pH prximo a la precipitacin isoelctrica. Otro mtodo es invertir este procedimiento; la protena se precipita por salado, se diluye solamente lo suficiente para conseguir su redisolucin y se abandona la disolucin para que pierda agua por evaporacin. Sin embargo, la cristalizacin no constituye necesariamente un signo de pureza total, ya que los cristales de protena contienen, con frecuencia, impurezas retenidas. En todos estos procedimientos el pH debe ser cuidadosamente controlado mediante tampones apropiados y la temperatura ha de ser mantenida a su nivel ptimo, el cual, para la mayor parte de las protenas, se halla prximo a los 0 C.

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3.2. Caracterizacin
Despus de haberse aislado una protena determinada en forma muy purificada, debe establecerse su homogeneidad. A este objeto era prctica corriente el anlisis par electroforesis libre y por sedimentacin en la ultracentrfuga, pero estos mtodos, relativamente poco sensibles y caros, han sido sustituidos en gran parte, par mtodos ms sencillos, por ejemplo, la cromatografa de exclusin molecular, la electroforesis sobre geles de poliacrilamida y el enfoque isoelctrico, los cuales poseen mucha mayor capacidad de resolucin y pueden detectar fcilmente la presencia de impurezas proteicas de menor cuanta. Una vez establecida la homogeneidad de la protena, puede caracterizarse mediante una sucesin de mtodos, con objeto de establecer
1. Su peso molecular. 2. Si contiene una cadena polipeptdica sencilla o mltiple. 3. El peso molecular de las cadenas polipeptdicas. 4. Su composicin en aminocidos. 5. Su secuencia de aminocidos.

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CAPTULO 4: AMINOCIDOS

No debe sorprender que gran parte de la investigacin bioqumica inicial haya estado relacionada con el estudio de las protenas. Las protenas constituyen la clase de macromolculas biolgicas que poseen las propiedades fsico-qumicas mejor definidas y, por consiguiente, son ms fciles de aislar y caracterizar, en general, que los cidos nucleicos, los polisacridos o los lpidos. Adems, las protenas, particularmente en forma de enzimas, desempean una funcin bioqumica obvia. El papel central que juegan las protenas en los procesos biolgicos ha sido reconocido, por tanto, desde los comienzos de la bioqumica. Contrasta con ello la tarea desempeada por los cidos nucleicos en la transmisin y en la expresin de la informacin gentica, que no fue puesto de manifiesto hasta el final de los aos cuarenta. El papel de los lpidos en las membranas biolgicas no fue apreciado hasta los aos sesenta y las funciones biolgicas de los polisacridos todava son, en cierta medida, desconocidos. Estudiamos en este apartado las propiedades de las unidades monomricas de las protenas, los aminocidos. Los aminocidos son, tambin, metabolitos energticos y muchos de ellos son elementos nutritivos esenciales. Adems, como veremos, muchos aminocidos y sus derivados son de importancia bioqumica por sus propios meritos.

4.1. Aminocidos estndar


Los anlisis de un amplio nmero de protenas de casi cualquier procedencia que pueda concebirse han mostrado que todas las protenas estn compuestas por los 20 aminocidos "estndar" que se hallan relacionados en la Tabla 15. Estas sustancias se conocen como alfa-aminocidos ya que, con excepcin de la

Ver tabla 1 que se adjunta en el anexo de la memoria de este proyecto.


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prolina, poseen un grupo amino primario y un grupo cido carboxlico como sustituyentes en el mismo tomo de carbono, Figura 8. (La prolina, la nica excepcin de esta estructura general, posee un grupo amino secundario y es, por tanto, un alfa-iminocido aunque, no obstante, corrientemente se menciona como un aminocido.)

Figura 8. Frmula de estructura general de los aminocidos.

4.1.1. Propiedades generales


Los valores de pK de los 20 alfa-aminocidos estndar ya se encuentran tabulados.En la consulta de cualquiera de estas tablas, se encontrar diferentes medidas de pK, que se refieren, respectivamente, a los grupos del cido alfacarboxlico y alfa-amino. Tambin podemos encontrar un tercer pK referido a los grupos laterales con propiedades cido-base. Los valores de pK de los grupos del cido carboxlico se encuentran situados en un intervalo pequeo de alrededor de 22, de modo que por encima de pH 35 estos grupos se hallan casi por completo en sus formas de carboxilato. Los grupos alfa-amino poseen todos los valores de pK cercanos a 94 y, por tanto, se hallan casi completamente en forma de in amonio por debajo de pH 80. Esto conduce a un punto estructural importante: En el intervalo de pH fisiolgico tanto los grupos de cido carboxlico como los grupos amino de los alfa-aminocidos se hallan completamente ionizados, como se observa en la Figura 9.

Figura 9. Forma de los aminocidos que aparecen a valores de pH fisiolgicos.

Un aminocido puede, por esta razn, actuar bien como cido o como base. Las sustancias que exhiben esta propiedad se dice que son anfotricas y se las designa como anfolitos (electrolitos anfotricos).

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

Las molculas portadoras de grupos cargados de polaridad opuesta se conocen como zwitterions o iones dipolares. El carcter zwitterinico de los alfaaminocidos se ha establecido por varios mtodos, entre los que se hallan medidas espectroscpicas y de determinacin de la estructura cristalina por rayos-X (en el estado slido los alfa-aminocidos son zwitterinicos debido a que los grupos amino bsicos sustraen un protn del grupo cido carboxlico ms prximo). Debido a que los aminocidos exhiben el carcter de zwitteriones poseen propiedades fsicas que son caractersticas de los compuestos inicos. Por ejemplo, la mayor parte de los alfa-aminocidos muestran puntos de fusin prximos a 300 C, mientras que los derivados no inicos funden habitualmente alrededor de 100C. Adems, los aminocidos, al igual que otros compuestos inicos, son ms solubles en disolventes polares que en los disolventes no polares. En realidad, la mayor parte de los alfa-aminocidos son muy solubles en el agua pero son muy insolubles en los disolventes orgnicos.

4.1.2. Enlaces de los pptidos


Los alfa-aminocidos se polimerizan, al menos conceptualmente, mediante la eliminacin de una molcula de agua tal como se indica en la Figura 10. El enlace resultante CO-NH se conoce como enlace pptido. Los polmetros compuestos por dos, tres, unos pocos (3-10) y muchos restos aminocidos (tambin llamados unidades pptido) se conocen como dipptido, tripptidos, oligopptidos y polipptidos, respectivamente. Sin embargo, estas sustancias se designan con frecuencia, a fin de simplificar, como "pptidos". Las protenas son molculas constituidas por una a ms cadenas de polipptidos. La longitud de estos polipptidos se halla comprendida en el intervalo de ~ 40 hasta el de unos 4000 restos aminocidos y como la masa media de un resto aminocido es de ~ 110 D, poseen masas moleculares comprendidas entre ~ 4 y unos 440 kD.

Figura 10. Condensacin de los aminocidos para formar un dipptido.

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Los polipptidos son grupos de pptidos lineales; es decir, cada resto aminocido se halla unido a sus vecinos en una unin cabeza-cola, en vez de formar cadenas ramificadas. Esta observacin refleja la elegante simplicidad subyacente de la va por la que los sistemas vivos construyen estas macromolculas ya que, como veremos ms adelante, los cidos nucleicos que codifican las secuencias de los aminocidos de los polipptidos son, tambin, polmeros lineales. Esto permite la correspondencia directa entre la secuencia del monmero (nucletido) del cido nucleico y la secuencia del monmero (aminocido) del polipptido correspondiente sin la complicacin adicional de especificar las posiciones y las secuencias de cualquier cadena ramificada. Al disponer de 20 posibilidades de eleccin para cada resto aminocido en una cadena polipeptdica, es fcil ver que pueden existir un gran nmero de molculas de protena diferentes. Por ejemplo, para los dipptidos, cada una de las 20 posibilidades de eleccin del primer resto aminocido pueden tener 20 posibilidades de eleccin para el segundo resto aminocido, lo que da un total de 202 = 400 dipptidos distintos. Anlogamente, para los tripptidos, existen 20 posibilidades para cada uno de los 400 dipptidos con lo que se obtienen un total de 203 = 8000 tripptidos diferentes. Una molcula de protena, ms o menos tpica, est constituida por una cadena polipeptdica nica de 100 restos. Existen 20100 = 1,27 X 10130 cadenas polipeptdicas nicas posibles de esta longitud, una cantidad mucho mayor que el nmero de tomos que se estima que existen en el universo (9 x 1078). Est claro que la naturaleza podra haber confeccionado solamente una fraccin mnima de las molculas de protena diferentes que son posibles. No obstante, los diversos organismos que se hallan en la tierra sintetizan colectivamente un nmero enorme de molculas de protena diferentes, cuyo gran intervalo de caractersticas fsico-qumicas se justifican ampliamente desde las variadas propiedades de los 20 aminocidos "estndar".

4.1.3. Clasificacin y caractersticas


El modo ms corriente y quiz el ms til de clasificar a los 20 aminocidos "estndar" es de acuerdo con las polaridades de sus cadenas laterales (grupos R). Ello es debido a que las protenas se pliegan, adoptando sus conformaciones nativas, en gran medida como respuesta a la tendencia a separar sus cadenas laterales hidrofbicas del contacto con el agua y a solvatar sus cadenas laterales hidroflicas. De acuerdo con este esquema de clasificacin existen tres tipos principales de aminocidos: (1) con grupos R no polares, (2) con grupos R polares sin carga, y (3) con grupos R polares con carga. a) Las cadenas laterales no polares de los aminocidos pose en una gran variedad de formas y de tamaos Son nueve los aminocidos que se clasifican como poseedores de cadenas laterales no polares. La glicina (que cuando se encontr que era un componente de la gelatina, en 1820, fue el primer aminocido que se identifico en los hidrolizados de protena) posee la cadena lateral ms pequea posible, un tomo de H. Alanina, Valina, leucina e isoleucina poseen cadenas laterales de hidrocarburo aliftico cuyo tamao se sita desde el de un grupo metilo para la alanina hasta los grupos butilo isomricos de la leucina y la isoleucina.
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La metionina posee una cadena lateral de ter tilico, que se parece a un grupo n-butilo en muchas de sus propiedades fsicas (C y S poseen electronegatividades casi iguales y el S es aproximadamente del mismo tamao que un grupo metileno). La prolina, que es un alfa-iminocido cclico, muestra limitaciones de conformacin impuestas por la naturaleza cclica de su grupo lateral pirrolidino, que es singular entre los 20 aminocidos "estndar". La fenilalanina con su porcin fenilo, y el triptfano, con su grupo indol, contienen grupos laterales aromticos, que se caracterizan por su tamao y por su ausencia de polaridad. b) Las cadenas laterales polares sin carga poseen grupos hidroxilo, amida o tiol. Seis aminocidos se clasifican comnmente como poseedores de cadenas laterales polares sin carga. Serina y treonina son portadoras de grupos R hidroxlicos de tamaos diferentes. Asparagina y glutamina poseen cadenas laterales portadoras de amida de diferentes tamaos. La tirosina posee un grupo fenlico. La cistena tiene un grupo tiol y es un ejemplar nico entre los 20 aminocidos porque forma, con frecuencia, un enlace disulfuro con otro resto de cistena por oxidacin de sus grupos tiol. Este compuesto dimrico se designa en la literatura bioqumica antigua como el aminocido cistina. El puente disulfuro tiene una gran importancia en la estructura de las protenas: Puede unir cadenas polipeptdicas separadas o establecer enlaces entrecruzados entre dos cistenas de la misma cadena. La semejanza que induce a confusin entre los nombres de cistena y cistina ha conducido a designar el primero como hemi-cistina. Sin embargo, la comprobacin de que la cistina se origina por enlace entrecruzado de dos restos de cistena, despus de que ha tenido lugar la biosntesis del polipptido ha determinado que el nombre de cistina sea menos empleado corrientemente. c) Las cadenas laterales polares con carga pueden poseer carga positiva o negativa Cinco aminocidos poseen cadenas laterales con carga. Los aminocidos bsicos estn cargados positivamente a valores de pH fisiolgicos y comprenden a la lisina, que posee una cadena lateral de butilamonio, la arginina, que es portadora de un grupo guanidino, y la histidina que es portadora de una porcin de imidazolio. La histidina, con pKR = 60, es el nico de los 20 aminocidos que se ioniza dentro del intervalo de pH fisiolgico. A pH 60, su grupo lateral imidazol slo se halla cargado un 50 %, de modo que en el extremo bsico del intervalo de pH fisiolgico, la histidina es neutra. En consecuencia, las cadenas laterales de histidina participan con frecuencia en las reacciones catalticas de los enzimas. Los aminocidos acdicos, cido asprtico y cido glutmico, se hallan cargados negativamente por encima de pH 3; en su estado inico se mencionan, frecuentemente, como aspartato y glutamato. La asparagina y la glutamina son, respectivamente, las amidas de los cidos asprtico y glutmico. La colocacin de los 20 aminocidos entre estos tres grupos diferentes es, por supuesto, ms bien arbitraria. Por ejemplo, la glicina y la alanina, los
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ms pequeos de los aminocidos, y el triptfano, con su anillo heterocclico, podran tambin clasificarse bien como aminocidos polares sin carga. De modo anlogo, la tirosina y la cistena, con sus cadenas laterales ionizables, podran considerarse tambin como aminocidos polares con carga, particularmente a valores de pH ms altos, mientras que la asparagina y la glutamina son casi tan polares como sus correspondientes carboxilatos, aspartato y glutamato. Los 20 aminocidos varan considerablemente en sus propiedades fsicoqumicas, tales como polaridad, acidez, basicidad, aromaticidad, tamao, flexibilidad de su conformacin, capacidad para establecer enlaces entrecruzados, capacidad para formar enlaces de hidrgeno y reactividad qumica. Estas diversas caractersticas, muchas de las cuales estn interrelacionadas, son responsables en gran parte del amplio abanico de propiedades que exhiben las protenas.

4.1.4. Propiedades cido-base


Los aminocidos y las protenas poseen propiedades cido-base notables. Los alfa-aminocidos poseen dos o, los que tienen grupos laterales ionizables, tres grupos cido-base. La curva de valoracin de la glicina, el aminocido ms sencillo, aparece en la Figura 11. A valores de pH bajos, los grupos cido-base de la glicina se hallan ambos completamente protonizados, de modo que adopta la forma de catin +H3NCH2COOH. En el curso de una valoracin con una base fuerte, como NaOH, la glicina pierde dos protones de modo escalonado caracterstico como lo hace un cido poliprtico. Los valores de pK de los dos grupos ionizables de la glicina son lo suficientemente diferentes de modo que la ecuacin de Henderson-Hasselbalch:

[A ] pH = pK + log

[HA]

(2)

Se aproxima a cada una de las ramas de la curva de valoracin. En consecuencia, el pK para cada etapa de ionizacin es el del punto medio de su rama correspondiente de la curva de valoracin: a pH 235 las concentraciones de la forma catinica, +H3NCH2COOH, Y de la forma zwitterinica, +H3NCH2COO-, son iguales y, anlogamente, a pH 978 las concentraciones de la forma zwitterinica y de la forma aninica, H2NCH2COO-, son iguales.

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Figura 11. Curva de valoracin de Glicina.6

Obsrvese que los aminocidos nunca adoptan la forma neutra en disolucin acuosa. El pH al que una molcula no es portadora de carga elctrica neta se conoce como su punto isoelctrico, pI. En los alfa-aminocidos, la aplicacin de la ecuacin de Henderson-Hasselbalch indica que, para un grado de precisin elevado,

1 pI = ( pK i + pK j ) 2

(3)

En la que Ki y Kj son las constantes de disociacin de las dos ionizaciones en las que intervienen las especies neutras. En un cido monoamino, monocarboxlico como la glicina, Ki y kj representan K1 y k2. Sin embargo en los cidos asprtico y glutmico, Ki y kj representan K1 y kR, mientras que en arginina, histidina y lisina, estas cantidades son KR y k2.

Referencia Figura 11: Bioqumica. Donald Voet/Judith G.Voet


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El pK (476) del cido actico, que es tpico de los cidos monocarboxlicos alifticos, es ~24 unidades de pH ms elevado que el pK1 de su derivado alfaamino, glicina. Esta gran diferencia en los valores de pK del mismo grupo funcional se debe, a la influencia electrosttica del grupo amonio con carga positiva de la glicina; esto es, el grupo NH3+ colabora en la repulsin del protn de su grupo COOH. Recprocamente, el grupo carboxilato de la glicina incrementa la basicidad de su grupo amino (pK2 = 978) con respecto al que posee el ster metlico de la glicina (pK = 775). Sin embargo, los grupos NH3+ de la glicina y de sus steres son significativamente ms cidos que las aminas alifticas (pK 107) debido a que el grupo carboxilato tiene el carcter de atraer electrones. La influencia electrnica de un grupo funcional sobre otro se amortigua rpidamente a medida que aumenta la distancia entre los grupos. De aqu que los valores de pK de los grupos alfa-carboxilato de los aminocidos y los carboxilatos de las cadenas laterales de los cidos asprtico y glutmico formen una serie que se va aproximando al valor del pK de un cido monocarboxlico aliftico. Anlogamente, la constante de ionizacin del grupo amino de la cadena lateral de lisina no puede distinguirse del de una amina aliftica. Las protenas muestran curvas de valoracin complejas: Las curvas de valoracin de los alfa-aminocidos con cadenas laterales ionizables, tales como el cido glutmico, exhiben los tres valores de pK esperados. Sin embargo, las curvas de valoracin de los polipptidos y de las protenas, un ejemplo de las cuales se muestra en la Figura 12, raramente proporcionan ninguna indicacin de los valores individuales de pK debido al gran nmero de grupos ionizables que representan (tpicamente el 25 % de las cadenas laterales de los aminocidos de una protena son ionizables). Adems, la estructura covalente y tridimensional de una protena puede provocar que se desplace el pK de cada grupo ionizable hasta varias unidades de pH respecto al que exhibe en el alfa-aminocido libre, como resultado de la influencia de los grupos prximos con carga, de los efectos del medio procedentes de la proximidad de grupos de constante dielctrica baja y de los efectos de las asociaciones por enlaces de hidrgeno. La curva de valoracin de una protena depende, tambin, de la concentracin de sal, debido a que los iones actan electrostticamente recubriendo las cargas de las cadenas laterales con lo que atenan las interacciones carga- carga entre ellas.

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Figura 12. Curvas de valoracin del enzima ribonucleasa A a 25C.7

4.1.5. La nomenclatura
Las abreviaturas de tres letras para representar los 20 restos aminocidos se dan en la tabla siguiente:

Tabla 1. Aminocidos y abreviaturas. Aminocido Alanina Arginina Aspargina cido asprtico Aspargina Cistena cido glutmico Glutamina Smbolo de tres letras Ala Arg Asn Asp Asx Cys Glu Gln Smbolo de una letra A R N D B C E Q

Referencia Figura 12: Bioqumica. Donald Voet/Judith G.Voet


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Sergi Muoz Martin cido glutmico Glicina Histidina Isoleucina leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptfano Tirosina Valina Glx Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Z G H I L K M F P S T W Y V

Vale la pena memorizar estos smbolos ya que se emplean con profusin en toda la literatura bioqumica, incluido este texto. En la mayor parte de los casos, estas abreviaturas proceden de las tres primeras letras del nombre en ingls del aminocido correspondiente, y en la conversacin se pronuncian tal como se leen. El smbolo Glx puede significar Glu o Gln y, anlogamente, Asx significa Asp o Asn. Estos smbolos ambiguos derivan de la experiencia del laboratorio, Asn y Gln se hidrolizan con facilidad y rinden cido asprtico y cido glutmico, respectivamente, en las condiciones cidas o bsicas que se emplean habitualmente en la ruptura de las protenas. Por esta razn, si no se adoptan precauciones especiales, no podemos determinar si cuando se detecta Glu, se trata de Glu original o de Gln; con el Asp ocurre lo mismo. En la Tabla 1 aparecen, tambin, los smbolos de una letra de los aminocidos. Este cdigo ms compacto es particularmente til cuando se comparan las secuencias aminocidas de las protenas semejantes. Los restos aminocidos de los polipptidos se designan sustituyendo el sufijo -ino del nombre del aminocido por -il. Las cadenas polipeptdicas se describen iniciando el nombre a partir del amino final (conocido como N-terminal) y designando secuencialmente cada resto hasta que se alcanza el carboxilo final (C-terminal). El resto aminocido C-terminal recibe el nombre del aminocido progenitor. As, el compuesto mostrado en la figura 13 se designa como alaniltirosilaspartilglicina. Por supuesto que estos nombres aplicados a las cadenas polipeptdicas que tengan ms de unos pocos restos son extremadamente farragosos. El empleo de las abreviaturas para designar los restos aminocidos resuelve, parcialmente, este problema. As el tetrapptido anterior se designara por Ala-Tyr-Asp-Gly, empleando las abreviaturas de tres letras y por AYDG, empleando los smbolos de una letra. Tngase en cuenta que estas abreviaciones se escriben siempre de modo que el N-terminal de la cadena polipeptdica se halla a la izquierda y el resto C-terminal se halla a la derecha.

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Figura 13. El tetrapptido Ala-Tyr-Asp-Gly.

Los diversos tomos de las cadenas laterales de los aminocidos se designan, frecuentemente, con la secuencia de las letras del alfabeto griego, partiendo del tomo de carbono adyacente al grupo carbonilo peptdico. Por tanto, como indica la figura 14, se dice que el resto Lys posee un grupo amino y que Glu posee un grupo -carboxilo. Desgraciadamente este sistema de designacin resulta ambiguo para diversos aminocidos.

Figura 14. Titulacin mediante el alfabeto griego empleada para identificar tomos en los grupos R lisilo y glutamilo.

En consecuencia, los esquemas de numeracin estndar empleados para las molculas orgnicas se aplican tambin en estos casos.

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4.2. Actividad ptica


Todos los aminocidos aislados despus de la hidrlisis suave de las protenas, con excepcin de la glicina, son activos pticamente, es decir, hacen girar el plano de la luz polarizada. Las molculas con actividad ptica poseen una asimetra tal que no pueden superponerse sobre su imagen en el espejo, del mismo modo que una mano izquierda no puede superponerse sobre su imagen especular, la mano derecha. Esta situacin es caracterstica de las sustancias que contienen tomos de carbono tetradricos unidos a cuatro sustituyentes diferentes. Las dos molculas dibujadas en la figura 15 no pueden superponerse ya que son imgenes especulares. Los tomos centrales de estas constelaciones atmicas se conocen como centros asimtricos, o centros quirales y de ellos se dice que poseen la propiedad de quiralidad (del griego: cheir, mana). Los tomos C de todos los aminocidos, con excepcin de la glicina, son centros asimtricos. La glicina, que posee dos tomos de H como sustituyentes en su tomo de C, puede superponerse sobre su imagen especular y por ello no muestra actividad ptica.

Figura 15. Los dos enantimeros del fluoclorobromometano.

Las molculas que no pueden superponerse sobre sus imgenes especulares se conocen como enantimeros, el uno del otro. Las molculas enantiomricas no pueden distinguirse fsica y qumicamente por la mayor parte de las tcnicas. Solamente cuando se comprueba. La asimetra, por ejemplo, mediante La luz polarizada en el plano o por reactantes que contienen tambin centros quirales, pueden distinguirse y manipularse de modo diferente. Existen tres sistemas de nomenclatura empleados corrientemente, mediante los que puede clasificarse un estereoismero determinado de una molcula con actividad ptica. A continuacin se explican los mencionados sistemas.

4.2.1. Clasificacin
Las molculas se clasifican como dextrorrotatorias (del griego: dextro, derecha) o levorrotatorias (del griego: levo, izquierda), dependiendo de si hacen girar el plano de luz polarizada en el sentido de las agujas del reloj o en sentido contrario desde el punto en que lo contempla el observador. Esto puede determinarse mediante el instrumento conocido como polarmetro. La medida cuantitativa de la actividad ptica de la molcula se conoce como rotacin especfica:

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[ ]25 = D

rotacinobservada( grados) longitudrecorridoptico(dm)concntracin( gcm 3 )

(4)

en la que el superndice 25 se refiere a la temperatura a la que se acostumbran a efectuar las medidas del polarmetro (25C) Y el subndice D indica la luz monocromtica que se emplea tradicionalmente en polarimetra, la as llamada lnea D en el espectro del sodio (5893 nm). A las molculas dextrorrotatorias y levorrotatorias se les asignan valores positivos y negativos de []25D. A las molculas dextrorrotatorias se las designa, de acuerdo con lo anterior, por el prefijo (+) y a los enantimeros levorrotatorios con el prefijo (-). En una nomenclatura equivalente, aunque arcaica, se utilizan las minsculas d (dextro) y l (levo). El signo y la magnitud de la rotacin especfica de una molcula depende de la estructura de sta, de un modo complicado y no bien comprendido. Todava no es posible el predecir con seguridad la magnitud ni aun el signo de la rotacin especfica de una molcula determinada. Por ejemplo, prolina, leucina y arginina, que se aslan de las protenas, poseen rotaciones especficas en disoluciones acuosas puras de -862, -104 y +125 C, respectivamente. Sus enantimeros exhiben valores de []25D de la misma magnitud pero de signo opuesto. Como poda esperarse de la naturaleza cido-base de los aminocidos, estas cantidades varan con el pH de la disolucin. Un problema con esta clasificacin operativa de los ismeros pticos es que no proporciona en el presente una indicacin interpretable de la configuracin absoluta (distribucin espacial) de los grupos qumicos en torno de un centro quiral. Adems, una molcula con ms de un centro asimtrico puede tener una rotacin ptica que no se halla relacionada obviamente con el poder rotatorio de los centros asimtricos individuales.

4.2.2. Convencin de Fisher


En este sistema, la configuracin de los grupos alrededor del centro asimtrico se relaciona con el gliceraldehdo, una molcula que posee un centro asimtrico. Por la convencin introducida por Emil Fischer en 1891, los estereoismeros (+) y (-) del gliceraldehdo se designan como D-gliceraldehdo y L-gliceraldehdo, respectivamente (obsrvese el empleo de letras maysculas de tamao pequeo). Admitiendo la probabilidad de que slo fuese correcta la suposicin en un 50 %, pens Fischer que las configuraciones de estas molculas eran las que aparecen en la Figura 16. Propuso tambin Fischer una notacin convenientemente reducida para estas molculas, conocida como proyecciones de Fischer, que tambin aparecen en la figura 16. En la convencin de Fischer los enlaces horizontales se proyectan por encima del plano del papel y los enlaces verticales lo hacen por debajo del plano del papel, como se indica de modo explicito por las frmulas geomtricas acompaantes.

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Figura 16. Configuraciones de la conveccin de Fischer.

La configuracin de los grupos en torno de un centro quiral pueden relacionarse con la del gliceraldehdo, convirtiendo estos grupos en los del gliceraldehdo mediante reacciones de estereoqumica conocida. En los alfa-aminocidos, los grupos amino, carboxilo, R y H se distribuyen alrededor del tomo de C en la relacin en que lo hacen en el gliceraldehdo los grupos hidroxilo, aldehdo, CH20H y H. De la misma manera, se dice que el Lgliceraldehdo y los L--aminocidos poseen la misma configuracin relativa figura 17.

Figura 17. Configuraciones.

Empleando este mtodo pueden describirse las configuraciones de los alfaaminocidos sin necesidad de referirse a sus rotaciones especficas. Todos los alfa-aminocidos procedentes de las protenas poseen configuraciones L-estereoqumicas; es decir, que todos poseen la misma configuracin relativa entorno de sus tomos de C. En 1949 se demostr por la entonces nueva tcnica de cristalografa de rayos X que la eleccin arbitraria efectuada por Fischer era correcta: la designacin de la configuracin relativa de los centros quirales es la misma que su configuracin absoluta. Puede recordarse con facilidad la configuracin absoluta de los restos de los L--aminocidos empleando el "truco" nemotcnico cuyo diagrama aparece en la figura 18.

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Figura 18. Truco nemotcnico para poner de manifiesto L-aminocidos.

Los diasteremeros pueden distinguirse qumica y fsicamente Una molcula puede tener mltiples centros asimtricos. En tales molculas, los trminos estereoismeros e ismeros pticos se refieren a molculas con configuraciones diferentes, al menos alrededor de uno de sus centros quirales, pero por lo dems son idnticas. El trmino enantimero se conserva para designar una molcula que es la imagen especular de la que se considera, es decir, que se diferencian en todos sus centros quirales. Como cada centro asimtrico en una molcula quiral puede tener dos configuraciones posibles, una molcula con n centros quirales tiene 2n-1 estereoismeros posibles diferentes y 2n-1 pares enantiomricos. Treonina e isoleucina poseen cada una dos centros quirales y, por tanto, 22 = 4 estereoismeros posibles. Las formas de treonina y de isoleucina que se aslan de las protenas, que por convencin son llamadas formas L. Las imgenes en el espejo de las formas L son las formas D. Los otros dos ismeros pticos se dice que son diasteremeros (o formas alo) de las formas enantiomricas D y L.

4.2.3. Sistema Cahn-Ingold-Prelog


A pesar de su utilidad, el esquema de Fischer resulta dificultoso y en ocasiones ambiguo, para molculas con ms de un centro asimtrico. Por esta razn, Robert Cahn, Christopher Ingold y Vladimir Prelog formularon, en 1956, el siguiente esquema de nomenclatura absoluta. En el sistema propuesto, los cuatro grupos que rodean a un centro quiral se ordenan de acuerdo con un esquema de prioridad especfica: Los tomos de nmero atmico superior unidos a un centro quiral se colocan por encima de los de nmero atmico inferior. Por ejemplo, el tomo de oxgeno de un grupo OH precede al tomo de carbono de un grupo CH3 que se halla unido al mismo tomo de C quiral. Si alguno de los tomos del primer sustituyente son del mismo elemento, la prioridad de estos grupos se establece desde los nmeros atmicos del segundo, tercero, etc., tomos situados fuera del centro asimtrico. De aqu que un grupo CH2OH preceda a un grupo CH3. Existen otras reglas (dadas en la bibliografa y en muchos textos de qumica orgnica) para asignar prioridad de clasificacin a sustituyentes con enlaces mltiples o con istopos diferentes. El orden de prioridad de algunos grupos funcionales comunes es

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SH > OH > NH2 > COOH > CHO > CH2OH > C6H5 > CH3 > 2H > 1H Hay que tener presente que cada uno de los grupos sustituyentes en un centro quiral deben tener una prioridad de clasificacin diferente, de otro modo el centro no sera asimtrico. A los grupos ordenados por su prioridad, se les asignan las letras W, X, Y, Z de modo tal que su clasificacin por orden de prioridad es W > X > Y > Z. Para establecer la configuracin del centro quiral, este se contempla desde el centro asimtrico hacia el grupo Z (el de prioridad inferior). Si el orden de los grupos W X Y, tal como se ve desde esta direccin, es el de las agujas del reloj, entonces la configuracin del centro asimtrico se designa por (R) (del latn: rectus, derecha). Si el orden de W X Y es el contrario al de las agujas del reloj el centro asimtrico se designa por (S) (del latn: sinistrus, izquierda). Una ventaja principal del llamado sistema Cahn- Ingold-Prelog o sistema (RS) es que las quiralidades de los compuestos con mltiples centros asimtricos pueden describirse sin ambigedad. Los centros proquirales poseen sustituyentes que pueden distinguirse Dos sustituyentes idnticos qumicamente en un centro tetradrico que pudiera ser quiral son diferentes desde el punto de vista geomtrico; es decir, el centro no posee simetra de rotacin de modo que se le pueden asignar sin ambigedad lado izquierdo y derecho. Los objetos planos que no tienen simetra de rotacin poseen tambin la propiedad de proquiralidad. Por ejemplo, en muchas reacciones enzimticas la adicin estereoespecfica a un tomo de carbono trigonal se produce desde un lado determinado de aquel tomo de carbono y rinde un centro quiral. Si un tomo de carbono trigonal se halla encarado respecto al observador de modo que el orden de prioridad de sus sustituyentes disminuye en el sentido de las agujas del reloj la cara se designa como cara re (de rectus). La cara opuesta se designa como cara si (de sinistrus), ya que la prioridad de sus sustituyentes decrece en la direccin contraria a las agujas del reloj. El sistema (RS) no se emplea mucho en la actualidad en bioqumica. Una razn para ello reside en que compuestos relacionados ntimamente, que poseen la misma representacin de configuracin empleando la convencin DL de Fischer, pueden tener representaciones diferentes mediante el sistema (RS). En consecuencia, emplearemos la convencin de Fischer en la mayor parte de los casos. El sistema (RS), sin embargo, es indispensable para describir la proquiralidad en reacciones estereoespecficas, de modo que lo hallaremos muy valioso para la descripcin de reacciones enzimticas.

4.2.4. Quiralidad y bioqumica


La sntesis qumica ordinaria de molculas quirales produce mezclas racmicas de estas molculas (cantidades iguales de cada uno de los miembros de un par enantiomrico), debido a que los procesos ordinarios fsicos y qumicos no exhiben preferencia estereoqumica. Por consiguiente, existen probabilidades iguales de que en tales procesos se produzca un centro asimtrico de cada mano. Con objeto de obtener un producto
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con actividad ptica neta debe emplearse un proceso quiral. Este tipo de procesos se basa en el empleo de reactivos quirales aunque, al menos en principio, el empleo de alguna influencia asimtrica como puede ser la luz polarizada en una direccin puede producir una asimetra neta en un producto de reaccin. Una de las caractersticas ms notables de la vida es su produccin de molculas con actividad ptica. La biosntesis de una sustancia que posea centros asimtricos produce, casi invariablemente, un estereoismero puro. El hecho de que los restos aminocidos de todas las protenas posean la configuracin L constituye un ejemplo de este fenmeno. Esta observacin ha promovido la intuicin de que un ensayo sencillo para diagnosticar acerca de la existencia, pasada o presente, de vida extraterrestre seria el determinar la existencia de actividad ptica en las rocas lunares o en los meteoritos que han cado sobre la tierra. Cualquier hallazgo de este tipo sugerira que las molculas asimtricas que se detectasen se habran producido por biosntesis. As, aun teniendo en cuenta que se han extrado alfa-aminocidos de meteoritos carbonceos, la observacin de que vienen en forma de mezclas racmicas sugiere que su origen es qumico en vez de biolgico. Uno de los enigmas del origen de la vida es porque la vida terrestre est basada sobre ciertas molculas quirales en lugar de sus enantimeros, es decir, sobre los L-aminocidos en vez de los D-aminocidos. Los argumentos de que efectos fsicos como la luz polarizada podran haber provocado una asimetra neta significativa en molculas sintetizadas prebiticamente no han resultado convincentes. Quizs las formas de vida basadas en los L-aminocidos surgieron al azar y simplemente "devoraron" cualquier forma de vida basada en los Daminocidos.

4.3. Aminocidos no estndar


Los 20 aminocidos corrientes no son, en modo alguno, los (nicos aminocidos que aparecen en los sistemas biolgicos. Los aminocidos "no estndar" son, con frecuencia, constituyentes importantes de las protenas y de polipptidos con actividad biolgica. Muchos aminocidos, sin embargo, no son constituyentes de las protenas. Junto con sus derivados, desempean una variedad de papeles de importancia biolgica.

4.3.1. Derivados aminocidos en las protenas


El cdigo gentico "universal", que es casi idntico en todas las formas de vida conocidas, especifica solamente los 20 aminocidos "estndar". No obstante, otros muchos aminocidos, una seleccin, son componentes de algunas protenas. En todos los casos conocidos excepto uno, sin embargo, estos aminocidos poco frecuentes proceden de la modificacin especfica de un resto aminocido despus de que se ha sintetizado la cadena polipeptdica. Entre los ms importantes de estos restos aminocidos modificados se encuentran la 4hidroxiprolina y la 5-hidroxilisina. Los restos de ambos aminocidos son constituyentes estructurales importantes del colgeno, una protena fibrosa, que
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es la ms abundante en los mamferos. Los aminocidos de las protenas que forman complejos con los cidos nucleicos se hallan modificados con frecuencia. Por ejemplo, las protenas de los ribosomas y las de los cromosomas, conocidas como histonas, pueden metilarse, acetilarse o fosforilarse selectivamente. La N-formilmetionina es, inicialmente, el resto N-terminal de todas las protenas procariticas, pero habitualmente resulta eliminada como parte del proceso de maduracin de la protena. El cido -carboxiglutmico es un constituyente de varias protenas que intervienen en la coagulacin de la sangre.

4.3.2. Papeles especializados de los aminocidos


Adems de su papel en las protenas, los aminocidos y sus derivados desempean muchas funciones biolgicas importantes. Este empleo alternativo de los aminocidos constituye un ejemplo de oportunismo biolgico, que encontraremos repetidamente: La naturaleza tiende a adaptar los materiales y los procesos que ya estn presentes a la ejecucin de nuevas funciones. Los aminocidos y sus derivados funcionan, con frecuencia, como mensajeros qumicos en la comunicacin entre las clulas. Por ejemplo, la glicina, el acido aminobutrico (GABA; un producto de descarboxilacin del glutamato) y la dopamina (un producto de la tirosina) son neurotransmisores (sustancias que liberan las clulas nerviosas para alterar el comportamiento de sus vecinos; la histamina (producto de descarboxilacin de la histidina) es un mediador local potente de las reacciones alrgicas y la tiroxina (producto de la tirosina) es una hormona tiroidea que contiene yodo y estimula, generalmente, el metabolismo de los vertebrados. Algunos aminocidos son intermediarios importantes en diversos procesos metablicos. Entre ellos se encuentran la citrulina y la ornitina, que son intermediarios en la biosntesis de la urea; la homocistena, un intermediario en el metabolismo aminocido y la S-adenosilmetionina, agente de metilacin biolgica. La diversidad de la naturaleza es notable. Se han encontrado unos 250 aminocidos diferentes en diversas plantas y hongos. Los papeles biolgicos de la mayor parte de ellos permanecen en la obscuridad, aunque el hecho de que muchos de ellos son txicos sugiere que desempean una funcin protectora. En realidad, algunos, como la azaserina, son antibiticos tiles en medicina. Muchos de estos aminocidos son derivados sencillos de los 20 aminocidos "estndar" aunque algunos de ellos, entre los que se encuentran la azaserina y la cianoalanina, poseen estructuras poco habituales. Aunque en las protenas solamente se encuentran L-aminocidos, en muchos organismos se hallan presentes D-aminocidos. Estas sustancias que se sintetizan directamente se hallan distribuidas, quiz ms profusamente, como constituyentes de las paredes de las clulas bacterianas. Puede ser que su funcin, como tales constituyentes, sea defensiva ya que los D-aminocidos determinan que las paredes celulares de la bacteria sean menos susceptibles al ataque por las peptidasas (enzimas que hidrolizan los enlaces pptido) que muchos organismos emplean para digerir las paredes celulares bacterianas. Los D-aminocidos aparecen tambin como componentes de muchos antibiticos, entre los que se encuentran la valinomicina, la actinomicina o y la gramicidina S.
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CAPTULO 5:PROTENAS Y AMINOCIDOS EXPERIMENTALES

5.1. Albmina de suero bovino, BSA


La albmina de suero bovino es una protena que se encuentra en gran proporcin en el plasma sanguneo, siendo la principal protena de la sangre y a su vez la ms abundante en el ser humano. Es sintetizada en el hgado. La concentracin normal en la sangre humana oscila entre 35 y 50 g/dL, y supone un 5431% de la protena plasmtica. El resto de protenas presentes en el plasma se llaman en conjunto globulinas. La albmina es fundamental para el mantenimiento de la presin oncnica (tambin osmtica es la presin hidrosttica a consecuencia del efecto osmtico ejercido por las protenas dentro de un espacio especfico: matriz extracelular, vasos sanguneo, delimitado por una membrana electivamente permeable), necesaria para la distribucin correcta de los lquidos corporales entre el compartimento intravascular y el extravascular, localizado entre los tejidos. La albmina tiene carga elctrica negativa. La membrana basal del glomrulo renal (es la unidad anatmica funcional del rin donde radica la funcin de aclarado o filtracin del plasma sanguneo), tambin est cargada negativamente, lo que impide la filtracin glomerular de la albmina a la orina. En el sndrome nefrtico (trastorno renal que se caracteriza por la presencia de niveles altos de protena en la orina, niveles bajos de protena en la sangre y en algunos casos, edema y colesterol alto), esta propiedad es menor, y se pierde gran cantidad de albmina por la orina.

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Debido a que pequeos animales como por ejemplo las ratas, viven con una baja presin sangunea, necesitan una baja presin onctica, tambin necesitan una baja cantidad de albmina para mantener la distribucin de fluidos. Si efectuamos una electroforesis (tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico) de las protenas del suero a un pH fisiolgico, la protena albmina es la que ms avanza debido a su elevada concentracin de cargas negativa (obviando la pequea banda llamada pre albmina, que la precede).

5.1.1. Caractersticas
a) Posee un pK de 8.5 b) Tiene un pH de 8 c) Tiene un peso molecular de 69.000 d) Tiene un pI de 4,9

5.1.2. Funciones de la albmina


a) Mantenimiento de la presin oncnica. b) Transporte de hormonas tiroideas. c) Transporte de hormonas liposolubles. d) Transporte de cidos grasos libres. (No esterificados) e) Transporte de bilirrubina (pigmento biliar de color amarillo anaranjado que resulta de la degradacin de la hemoglobina) no conjugada. f) Transporte de muchos frmacos y drogas. g) Unin competitiva con iones de calcio. h) Control del pH. i) Funciona como un transportador de la sangre y lo contiene el plasma

5.1.3. Causas de la deficiencia de la albmina


a) Cirrosis heptica (): Por disminucin en su sntesis heptica. b) Desnutricin. c) Sndrome nefrtico: Por aumento en su excrecin. d) Trastornos intestinales: Prdida en la absorcin de aminocidos durante la digestin y prdida por las diarreas. e) Enfermedades genticas que provocan hipoalbuminemia, que son muy raras.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

5.1.4. Tipos de albmina


a) Seroalbmina: Es la protena del suero sanguneo. Es la protena ms importante del plasma de la sangre. Las concentraciones bajas de esta sustancia se presentan en las personas que padecen de malnutricin, inflamacin y enfermedades graves del hgado y el rin. La albmina srica, o seroalbmina, se encarga de transportar sustancias de naturaleza qumica muy diversa, como cidos grasos, aminocidos, esteroides, metales (como el calcio), y numerosos frmacos, facilitando la transferencia de muchas de ellas desde la circulacin sangunea a rganos como el hgado, el rin, el intestino y el cerebro. Por este motivo existen receptores de superficie para albmina en las clulas de estos rganos. Su principal funcin es regular la presin coloidosmtica de la sangre, y presenta una gran afinidad por pequeas molculas hidrofbicas cargadas negativamente. La seroalbmina est formada por 585 aminocidos. b) Ovoalbmina: Es la albmina presente en la clara del huevo. c) Lactolbumina: Es la albmina presente en la leche.

5.2. Desoxiribonucleasa, DNAsa


La desoxiribonucleasa (DNAsa, para abreviar) es una enzima que cataliza la hidrlisis de fosfodister vnculos en el ADN columna vertebral. En bioqumica, se llaman enzimas a las sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas, siempre que sea termodinmicamente posible (si bien no pueden hacer que el proceso sea ms termodinmicamente favorable). En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en diferentes molculas, los productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran en tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas. La hidrlisis es una reaccin qumica durante el cual una o ms molculas de agua se dividen en hidrgeno y en hidrxido de iones que pueden llegar a participar en otras reacciones. Es el tipo de reaccin que se utiliza para romper ciertos polmeros, especialmente los formulados por el paso del crecimiento de la polimerizacin. El ADN (cido Desoxiribonucleico) es un cido nucleico que contiene las instrucciones genticas utilizadas en el desarrollo y el funcionamiento de todos los organismos que viven y algunos virus. La funcin principal de las molculas ADN es el almacenamiento a largo plazo de la informacin. ADN a menudo se compara con un conjunto de planos o un cdigo, ya que contiene las instrucciones necesarias para construir otros componentes de las clulas, como las protenas y las molculas del ARN. Los segmentos de ADN que llevan esta informacin gentica se llaman genes, pero otras secuencias de ADN tienen fines estructurales o estn implicadas en la regulacin de la utilizacin de esta informacin gentica. Desoxiribonucleasas son, por lo tanto un tipo de nucleasa (enzima hidrolasa del tipo esterasa que degradan en cidos nucleicos). Una amplia variedad de desoxiribonucleasas se conocen, que difieren en su sustrato especfico, los mecanismos qumicos, y las funciones biolgicas.
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5.2.1. Tipos de Desoxiribonucleasas


Los dos tipos principales de DNAsa se encuentran en metazoos (los animales son un grupo importante de la mayora de multicelulares, organismos eucariotas del Reino Animal o Metazoos) que se conoce como desoxiribunecleasa I y desoxirribonucleasa II. a) Desoxirribonucleica I (generalmente con el nombre DNAsa I), es una enzima codificada por el gen humano DNAsa I. La DNasa I es una nucleasa que hidroliza ADN preferentemente en fosfodister con vnculos adyacentes a una pirimidina de nucletidos, dando fin a 5'-fosfato polinucletidos con un grupo hidroxilo libre en la posicin 3 ', en promedio la produccin de tetranucletidos. Acta en una sola cadena de ADN, la doble cadena de ADN, y la cromatina. Se ha sugerido como uno de las desoxiribonucleasas responsable de la fragmentacin del ADN durante la apoptosis (es el proceso de muerte celular programada que puede ocurrir en organismos multicelulares). DNAsa I se une al citoesqueleto de la protena actina. Los monmeros de actina se unen con muy alta afinidad y los polmeros de actina con menor afinidad. La funcin de esta interaccin no est clara. Sin embargo, desde determinados actina DNAsa I se inactiva enzimticamente, la DNAsa-actina complejo podra ser una forma de almacenamiento DNAsa I que evita daos de la informacin gentica. Este gen codifica un miembro de la familia DNAsa. Las mutaciones en este gen se han asociado con lupus eritematoso sistmico (LES), una enfermedad autoinmune. Una forma recombinante de esta protena se utiliza para tratar uno de los sntomas de la fibrosis qustica por hidrlisis extracelular de ADN en el esputo y la reduccin de su viscosidad. Variantes de empalme alternativo transcripcional de este gen se han observado, pero no se han caracterizado completamente. b) Desoxiribonucleasa II, o cido DNasa, hidroliza desoxiribonucletidos vinculados y productos desnaturalizados de ADN rendimiento con 3fosfato. Como su nombre lo indica, es ms eficaz a pH cido. Hay varios DNAsas II conocidas, incluyendo:

DNAsa II alfa (por lo general, acabada de llamar DNAsa II) DNAsa II beta (tambin llamado DLAD, o DNasa II-Como cido ADNasa)

5.2.2. Determinacin de desoxiribonucleasas


El ADN absorbe la luz ultravioleta con una longitud de onda de mxima absorcin cerca de 260 nm. Esta absorcin se debe a los electrones en las bases aromticas del ADN. En dsDNA, o incluso regiones de ARN doble anclado en la estructura donde se produce, las bases se apilan paralelas entre s y la superposicin de la base de orbitales moleculares conduce a una disminucin de la absorbancia de luz ultravioleta. Este fenmeno se denomina efecto hipercromico. Cuando se libera ADNasa, dsDNA de nucletidos, las bases ya no son apiladas como en dsDNA, de manera que se reduce al mnimo la superposicin orbital y UV absorbancia aumenta. Este aumento de la absorbancia de la base en unidad de Kunitz ADNasa actividad. Kunitz es una unidad definida como la cantidad de enzima que causa un aumento de la absorbancia a 260 nm de 0,001 por ml, cuando acta sobre el ADN altamente polimerizada a 25 C y Ph 50 en condiciones determinadas.
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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

5.3. Aminocidos aromticos


5.3.1. Fenilalanina
La fenilalanina es un aminocido aromtico neutro, al igual que la tirosina y el triptfano. Es un aminocido no polar, siendo uno de los aminocidos ms hidrfobos. Su smbolo es F en cdigo de una letra y Phe en cdigo de tres letras. La fenilcetonuria es una enfermedad caracterizada por presentar altas concentraciones de fenilalanina en sangre. La fenilalanina debido a la presencia de estos anillos aromticos, se usa para detectar protenas por absorcin de luz, al igual que la tirosina y el triptfano. La fenilalanina se convierte en tirosina por la fenilalanina hidroxilasa, con tetrahidrobiopterina como cofactor. Un dficit en esta enzima, una mutacin en el sitio de unin del cofactor o un dficit de ste son los responsables de la fenilcetonuria, una enfermedad hereditaria autosmica recesiva que se manifiesta con retraso mental grave. El dficit en fenilalanina hidroxilasa se traduce en una acumulacin de fenilalanina y una disminucin de tirosina en sangre. La fenilalanina es sustrato de la tirosina hidroxilasa, primer paso de la sntesis de catecolaminas (adrenalina, dopamina y noradrenalina). La fenilalanina se usa cuando los niveles de tirosina son bajos, ya que este aminocido es el sustrato preferente de dicha enzima. En la fenilcetonuria, debido a los bajos niveles de tirosina, aun existiendo grandes cantidades de fenilalanina, la sntesis de catecolaminas es baja. La fenilalanina es esencial en base a que no puede ser sintetizado por nuestro organismo y debe ser aportado por la dieta. Su aporte es importante para la produccin de tirosina. La fenilalanina forma parte de FMLP, pptidos sintticos que estimulan la quimiotaxis, desgranulacin y formacin de iones superxido de fagocitos, como neutrfilos. En la imagen los tomos de hidrgeno estn en blanco, los de carbono en gris, los de nitrgeno en azul y los de oxgeno en rojo. La fenilalanina es codificada por UUU o por UUC.

Figura 19. Molcula del aminocido de Fenilalanina.

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5.3.2. Triptfano
El triptfano es un aminocido aromtico neutro, al igual que la tirosina y la fenilalanina. Su smbolo es W en cdigo de una letra y Trp en cdigo de tres letras. Es un aminocido no polar. Es precursor del neurotransmisor serotonina, de la melatonina y de la vitamina B3 o niacina. El triptfano, al igual que la fenilalanina y la tirosina tambin se usa para detectar protenas por absorcin de luz, al igual que la fenilalanina y la tirosina, siendo el triptfano es el que ms absorbe. El triptfano se considera un aminocido no polar, an pudiendo formar puentes de hidrgeno con el agua. El triptfano es precursor de la serotonina, mediante una reaccin catalizada por la triptfano hidroxilasa. La serotonina lleva a cabo funciones relacionadas con la conducta, como regulacin del sueo, hambre, agresividad, afectividad, etc. y a partir de ella se produce la melatonina. Por otra parte, la triptfano hidroxilasa al igual que la serotonina se relaciona con la hipertensin pulmonar inducida por hipoxia. El triptfano tambin es precursor de la vitamina B3 o niacina, cuyo dficit produce la enfermedad conocida como pelagra, caracterizada por dermatitis, diarrrea y demencia (las 3 D). El triptfano es un aminocido esencial ya que no puede ser sintetizado por nuestro organismo y debe ser aportado por la dieta. Este aporte es muy importante al ser precursor de los compuestos mencionados. En las bacterias el triptfano se sintetiza a partir de un opern regulado por el propio nivel de triptfano. En la imagen los tomos de hidrgeno estn en blanco, los de carbono en gris, los de nitrgeno en azul y los de oxgeno en rojo. El triptfano, junto a la metiotina, son los nicos aminocidos sintetizados por un solo codn. En el caso del triptfano es: UGG.

Figura 20. Molcula del aminocido de Triptfano.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

5.3.3. Tirosina
La tirosina es un aminocido aromtico neutro, al igual que el triptfano y la fenilalanina, aunque tiene un OH que le confiere cierta polaridad y a pH elevado se ioniza. Su smbolo es Y en cdigo de una letra y Tyr en cdigo de tres letras. Es precursor de ciertos neurotransmisores, de las hormonas tiroideas y de las melaninas. Dentro de las clulas, su fosforilacin es clave en muchos procesos de sealizacin. A diferencia de los anteriores tiene un OH lo que le confiere cierta polaridad. La tirosina sufre fosforilacin en su grupo OH por numerosas tirosin quinasas, implicadas en transduccin de seales y en la regulacin de la actividad enzimtica, ya que la fosforilacin de residuos de tirosina activa o inhibe enzimas, y receptores. En muchos caso a travs de secuencias ITAM o ITIM (Inmunoreceptores basados en motivos de activacin o inhibicin, respectivamente, ricos en tirosina). Tambin puede sufrir sulfatacin, relacionada con interacciones fuertes protena-protena. Estas dos formas modificadas de la tirosina pueden ser detectadas especficamente por anticuerpos. Las quinasas de tirosina son actualmente una diana para el tratamiento frente al cncer. Se estudian nuevos frmacos en el cncer de pulmn de clulas no pequeas (NSCLC) en el cncer tiroideo anaplsico o en algunos tipos de cncer gstrico. La tirosina es un precursor de los neurotransmisores catecolaminas: dopamina, norepinefrina o noradrenalina y epinefrina o adrenalina, tan importantes en el sistema nervioso central, sistema nervioso autonmo simptico y mdula suprarrenal. Tambin es precursor de las hormonas tiroideas tiroxina (T4) y triyodotironina (T3) sintetizadas en la glndula tiroides. En la imagen los tomos de hidrgeno estn en blanco, los de carbono en gris, los de nitrgeno en azul y los de oxgeno en rojo. La tirosina es sintetizada por uno de estos dos codones: UAU, UAC.

Figura 21. Molcula del aminocido de Tirosina.

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CAPTULO 6: TCNICAS UTILIZADAS

6.1. Espectrofotometra
La mayora de los problemas analticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o ms componentes de la misma. Se pueden plantear las siguientes cuestiones: una, de carcter cualitativo (de qu componente se trata?), y otra de carcter cuantitativo (cunto hay de ese componente?). Para ello, se puede utilizar el mtodo instrumental de anlisis, como es la espectrofotometra para medir la absorcin de radiacin ultravioleta y visible que interacta con la materia (tomos y molculas), la misma, se considera una tcnica cualitativa y cuantitativa basndose en la medicin del color o de la longitud de onda de una radiacin e intensidad de la misma.

6.1.1. El espectro electromagntico


Desde Newton, sabemos que la luz blanca se descompone en los colores que la integran si la hacemos pasar a travs de un prisma. Es el efecto que se repite, por ejemplo en el arco iris, el cual se dice que es el espectro de la luz visible procedente del sol, son las gotas de lluvia y el aire atmosfrico lo que hacen de espectroscopio. La principal emisin de radiacin de los cuerpos es la radiacin electromagntica en forma de luz visible, de la misma manera cada elemento qumico absorbe y emite luz de colores que componen su espectro. La longitud de onda de la radiacin puede ser desde muy pequea, en el caso de la radiacin gamma, y hasta muy grande en caso de las ondas radio. Se mide, usando desde nanmetros y Angstroms hasta cientos de metros. Recordemos que un nanmetro es la milmillonsima parte de un metro (1 m = 109 nm) y que

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un Angstrom es la diez mil millonsima parte de un metro (1 m = 1010 A), por lo que un nanmetro equivale a 10 Angstroms (1nm = 10 A). La luz que recibimos del Sol es radiacin electromagntica que se desplaza a 300.000 km/s en su totalidad, pero la longitud de onda no es la misma en todos los fotones luminosos, sino que vara entre los 4000 A y los 7000 A, aproximadamente, o lo que es lo mismo, entre los = 400 nm y los = 700 nm. La luz blanca se descompone, en un espectro de diferentes bandas coloreadas, cada una definida por una longitud de onda distinta. As, la luz de menor longitud de onda es la luz violeta, que es de alrededor de unos 4000 Angstroms, y la luz de mayor longitud de onda es la luz roja, que es de alrededor de unos 7000 Angstroms. Sin embargo, hay radiaciones de mayor y tambin de menor longitud de onda, es decir, que tienen una longitud de onda inferior a 4000 Angstroms y que tienen una longitud de onda superior a los 7000 Angstroms. Las radiaciones que van desde el violeta al rojo se dice que forman el espectro visible, pues proceden de la descomposicin de la luz blanca. Las radiaciones de longitud de onda inferior al violeta se llaman radiaciones ultravioletas, rayos X y rayos gamma, por orden decreciente en la longitud de onda. Las radiaciones de longitud de onda superior al rojo son las denominadas infrarrojas, microondas y ondas de radio, por orden creciente de longitud de onda.

Figura 22. Representacin de mayor a menor longitud de onda del espectro de la radiacin

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada Tabla 2. Colores de la luz visible. Longitud de onda de absorcin mxima (nm) 380-420 420-440 440-470 470-500 500-520 520-550 550-580 580-620 Color absorbido Violeta Azul-Violeta Azul Verde-Azul Verde Verde-Amarillento Amarillo Naranja Color observado Amarillo verdoso Amarillo Naranja Rojo Prpura Violeta Azul-Violeta Azul

6.1.2. La radiacin electromagntica y su interaccin con la materia


Los modelos explicativos de la estructura de la materia que tienen como fundamento las caractersticas ondulatorias de las partculas que la constituyen proporcionan un marco de referencia conveniente para describir las interacciones entre la radiacin electromagntica y la materia. Estas interacciones a su vez son el fundamento de las aplicaciones espectroscpicas. La energa radiante se encuentra constituida por fotones cada uno de los cuales tiene como caracterstica una longitud de onda. Toda la radiacin electromagntica se mueve a la misma velocidad en el vaco y esa velocidad de desplazamiento en el vaco es la mxima observada en el universo. En algn medio material, la interaccin entre los campos elctricos y magnticos que existen en la materia y los correspondientes de la radiacin pueden llegara a reducir esa velocidad de propagacin; por esta razn es solamente en el vaco en donde se observa esa velocidad mxima Si se asigna una longitud de onda caracterstica a cada tipo de radiacin, la propagacin de esa onda se har con una frecuencia tal que al multiplicarla por su longitud debe dar la velocidad de propagacin.

=c/
=c/

(5) (6)

Donde:

Lambda (): longitud de onda. Nu (): frecuencia de esa onda. C: velocidad de la luz en el vaco, su valor es: 2,99792458108 ms-1.

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La radiacin electromagntica que constituyen las ondas de radio de banda AM, de la frecuencia 1000 kHz tiene una longitud de 2,99792458108 ms-1/1,0106 s-1 = 299,8 m. Esta onda se convierte en seal, la cual se interpreta mediante el uso de un circuito apropiado que se encuentra en el aparato receptor de radio. Ondas ms cortas que la referida anteriormente son las que se interpretan con los ojos, sin ayuda de ningn traductor construido artificialmente. La radiacin electromagntica que se percibe como color rojo tiene una longitud del orden de los 700 nm, por lo tanto su frecuencia es 2,99792458108 ms-1/7,010-7 m = 4,281014 s-1. Es decir 428 THz (terahercios). La energa asociada a cada una de estas ondas, se obtiene mediante la ecuacin de Planck:

E = h /
Para las dos ondas descritas anteriormente las energas respectivas sern: EAM = 6,626075510-34 Js1,0106 s-1 = 6,62610-28 J Eroja = 6,626075510-34 Js4,281014 s-1 = 2,83610-19 J

(7)

6.1.3. Absorcin y emisin de radiacin por parte de la materia.


Una descripcin simplificada de la estructura de la materia permite explicar los enlaces entre los tomos para formar molculas en trminos de localizacin de ciertas partculas subatmicas, como los electrones, entre esos tomos. Esas partculas evidencian sus caractersticas ondulatorias ya que interactan con la radiacin electromagntica. La molcula en su forma estable bajo las condiciones ambientales se encuentra en un determinado nivel energtico. Si se logra hacer incidir sobre esa molcula un fotn de radiacin electromagntica con la energa apropiada, la molcula aumenta su contenido energtico absorbiendo ese fotn. Se dice entonces que la molcula ha pasado a un estado excitado. La molcula excitada se encuentra en un estado que no es estable en las condiciones ambientales corrientes, por lo tanto tiende a volver a la condicin estable, y para conseguirlo emite un fotn con la misma energa que se excit anteriormente. Por lo tanto cuando un elemento irradia energa no lo hace en todas las longitudes de onda, solamente en aquellas de las que est provisto. Esas longitudes de onda sirven para caracterizar a cada elemento. Tambin ocurre que cuando un elemento recibe energa no absorbe todas las longitudes de onda, sino solo aquellas de las que es capaz de proveerse. Coinciden por tanto, las bandas del espectro en las que emite radiacin con los huecos o lneas negras del espectro de absorcin de la radiacin, como si un espectro fuera el negativo del otro.

6.1.4. Ley de Bouguer - Lambert - Beer


1. Ley de Bouguer

La ley de Bouguer surge para describir de forma correcta, sin excepcin, la absorcin de la radiacin monocromtica por varios espesores de un medio ho- 62 -

Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

mogneo. La energa de la radiacin transmitida disminuye en forma exponencial al aumentar en forma aritmtica el espesor del medio absorbente. El descubrimiento de Bouguer se puede formular en forma matemtica como sigue:

dI = 1I db

(8)

El signo negativo indica que la energa disminuye con la absorcin. Podemos expresar esta ecuacin con los siguientes clculos: la disminucin de la energa radiante por unidad de espesor del medio absorbente es proporcional a la energa radiante:

dI - = 1 dl I I0 0

I1

(9)

- (ln I1 ln I 0 ) = 1l ln I 0 ln I1 = 1l
ln I0 = 1l I1

(10) (11)

(12)

Y resolviendo la integral entre los lmites I0/I y 0/l:

log
Donde:

I0 = 2 l I1

(13)

I1 = intensidad de luz transmitida. I0 = intensidad de luz incidente. = coeficiente de extincin en unidades de M-3 cm-1.

se refiere a las sustancias en general, sin estar en disolucin.

2. Ley de Lambert

Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta.

I1 = I 0 10 l

(14)

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log
3. Ley de Beer

I0 = l I1

(15)

Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentracin de la sustancia absorbente en el medio.

I1 = I 0 10 c log I0 = c I1

(16)

(17)

Donde C = concentracin de la sustancia absorbente La combinacin de las leyes de Bouguer, Lambert y de Beer, y a travs de sus observaciones establecieron relaciones de la variacin de la intensidad de luz transmitida por una muestra con el espesor de ella o con la concentracin de la sustancia, para materiales translcidos. Estas relaciones se conocen como la ley de Bouguer Lambert - Beer o ley general de la espectrofotometra que permite hallar la concentracin de una especie qumica a partir de la medida de la intensidad de luz absorbida por la muestra. Esta ley se puede expresar en trminos de potencia de luz o de intensidad de luz, asumiendo luz monocromtica, como:

I1 = I 0 10 cl
Donde:

(18)

l, es la longitud de la trayectoria del haz de luz a travs de la muestra o el espesor de la celda en cm.

Figura 23. Representacin de la absorcin de un haz de luz atravesando una cubeta de tamao l.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

La relacin I1 / I0 se conoce como transmitancia, T, y es la medida primaria que se realiza en los instrumentos para medir la absorcin de luz por parte de una muestra. Si la relacin se expresa en forma porcentual, entonces se llama porcentaje de transmitancia:

%T = 100

I1 I0

(19)

La luz absorbida sera I0 I1, es decir, la diferencia entre la intensidad de la luz incidente y la intensidad transmitida despus de pasar a travs de la muestra. A veces se expresa en forma porcentual, en funcin de la transmitancia medida como: Porcentaje de absorcin = (Tblanco Tmuestra) 100 o absorbancia. Cuando se toma el logaritmo decimal negativo de la relacin It / I0, entonces:

log

I1 = log T I0

(20)

O podemos tomar tambin la ecuacin

log

I0 = log I 0 log I1 I1

(21)

La relacin que representa la cantidad de luz absorbida por la muestra es -log I1 / I0 = - log T, y recibe el nombre de Absorbancia, y se designa con la letra A. La ley de Bouguer Lambert - Beer se puede entonces escribir de las siguientes formas:

I0 = 10 lc I1
log T = lc log T = A = lc

(22)

(23) (24)

El coeficiente de absortividad molar , es funcin de la longitud de onda, del ndice de refraccin de la solucin y es caracterstico de cada sistema solutosolvente. Es una propiedad intensiva, que no depende de la concentracin de la sustancia y representa la absorcin de luz por parte de un mol de soluto para una longitud de onda dada. Si no se conoce el peso molecular de la sustancia se puede expresar como:

A = lc

(25)

El registro de la variacin del coeficiente de absortividad molar , o de la absorbancia A, o de la transmitancia T, en funcin de la longitud de onda da
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origen a lo que se denomina "espectro" o curva espectral de una sustancia qumica e indica las caractersticas de absorcin de dicha sustancia con relacin a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva espectral se presenta como absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de absorcin, o en funcin de la transmitancia, denominndose el espectro, espectro de transmisin. De igual forma cuando se registra la emisin de radiacin en funcin de la longitud de onda, los espectros se denominan como espectros de emisin, o espectros de fluorescencia.

6.1.5. Aplicacin de espectrofotometra


La espectrofotometra es un mtodo analtico que utiliza los efectos de la interaccin de las radiaciones electromagnticas con la materia (tomos y molculas) para medir la absorcin o la transmisin de luz por las sustancias. Tambin se refiere a los mtodos cuantitativos de anlisis qumico que utilizan la luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como mtodos espectrofotomtricos, y segn sea la radiacin utilizada, como espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra), ultravioleta e infrarroja. Es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc) y estado de agregacin (slido, lquido, gas). Los fundamentos fsico-qumicos de la espectrofotometra son relativamente sencillos. Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma de energa interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosntesis en plantas y bacterias. La Mecnica Cuntica nos dice que la luz est compuesta de fotones cada uno de los cules tiene una energa:

E fotn = h =

H c

(26)

donde c, como ya se ha expresado anteriormente, es la velocidad de la luz, es su frecuencia, su longitud de onda y h la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia qumica absorbe luz de longitud de onda , esto significa que las molculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda. Cuando una molcula absorbe un fotn en este intervalo espectral, se excita pasando un electrn de un orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energa superior. De esta manera la molcula almacena la energa del fotn:

A + h A*
E ( A* ) = E ( A) + E fotn

(27) (28)

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

Como la energa se conserva, la diferencia de energa entre el estado fundamental de la molcula (A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energa del fotn. Es decir, una molcula slo puede absorber fotones cuya energa h sea igual a la energa de un estado molecular excitado. Cada molcula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrnica y que la distinguen del resto de molculas. Como consecuencia, el espectro de absorcin, es decir, la luz absorbida en funcin de la longitud de onda, constituye una verdadera sea de identidad de cada sustancia o molcula. Cuando dos o ms sustancias aparecen mezcladas en una misma muestra sus espectros de absorcin aparecen superpuestos tal como se representa en la siguiente figura:

Figura 24. Espectros de absorcin de dos sustancias mezcladas con distinta absorcin.

6.1.6. Espectrofotmetro
Los espectros de absorcin se miden mediante un instrumento denominado espectrofotmetro. Los instrumentos constan de una fuente de luz blanca caracterizada por un espectro de emisin continuo en un intervalo amplio de longitudes de onda y de un monocromador (Prisma) que acta como filtro ptico transmitiendo un haz de luz de longitud de onda fija e intensidad. Este haz de luz penetra en la cubeta de anlisis donde se encuentra la muestra. Un detector sensible a la luz mide la intensidad de luz en el haz de salida.

Figura 25. Esquema representativo del funcionamiento del espectrofotmetro.


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La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida que atraviesa la cubeta debido a la absorcin de las molculas de la muestra. El ritmo de absorcin depende de la intensidad inicial de luz y de la concentracin de molculas. De esta manera, cuando un haz de luz de intensidad I recorre una distancia dL en una muestra con una concentracin de molculas [B], se produce una atenuacin de intensidad dI dada por:

dI = cI dl
La constante k se denomina coeficiente de absortividad molar. La expresin anterior se puede integrar de la siguiente forma:

(29)

dI = cl I
dI I = c dl 0 I0
I1 l

(30)

(31)

ln

I1 = cl I0

(32)

Lo cual da lugar a la ley de Bouguer Lambert Beer:

A = ln

I0 = cl I1

(33)

6.1.7. Partes del espectrofotmetro


El espectrofotmetro, bsicamente consta de los siguientes componentes:
1. Fuente de luz: Lmpara que emite una mezcla de longitudes de onda. 2. Colimador (Rendija): Conjunto de lentes que enfocan la luz convirtindola en

un haz de rayos paralelos.


3. Monocromador: Dispositivo que selecciona luz de una nica longitud de onda. 4. Detector fotoelctrico: Transductor de luz en electricidad. La luz provoca el

desplazamiento de electrones en el metal del detector, produciendo una corriente elctrica que es proporcional a la intensidad de la luz recibida.
5. Registrador (programa): Mide la seal del detector, la compara y genera una

medida en una escala determinada.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

Figura 26. Esquema de las partes de un espectrofotmetro.

Figura 27. Espectrofotmetro UV-Visible utilizado en el mtodo experimental.

6.1.8. Aplicaciones de la espectrofotometra visible y ultravioleta


La espectrofotometra es de gran utilidad en el anlisis de espacies qumicas sobre todo para el qumico analtico. En bioqumica se utiliza por ejemplo para:
1. Identificar compuestos por su espectro de absorcin. 2. Conocer la concentracin de un compuesto en una disolucin. 3. Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de anlisis qumico. 4. Seguir el curso de reacciones qumicas y enzimticas.

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6.2. La derivada
La derivada de una funcin en un punto es el valor de la pendiente de la recta tangente en dicho punto. La pendiente est dada por la tangente del ngulo que forma la recta tangente a la curva (funcin) con el eje de las abscisas, en ese punto.

Figura 28. Recta tangente a la parbola x2.

La derivada de una funcin mide el coeficiente de variacin de dicha funcin. Es decir, provee una formulacin matemtica de la nocin del coeficiente de cambio. El coeficiente de cambio indica lo rpido que crece (o decrece) una funcin en un punto (razn de cambio promedio) respecto del eje X de un plano cartesiano de dos dimensiones. Por ejemplo si tomamos la velocidad de algo, su coeficiente es la aceleracin, la cual mide cunto cambia la velocidad en un tiempo dado. El concepto de derivada es uno de los dos conceptos centrales del clculo infinitesimal. El otro concepto contrario es la "anti derivada" o integral; ambos estn relacionados por el teorema fundamental del clculo. A su vez, los dos conceptos centrales del clculo estn basados en el concepto de lmite, el cual separa las matemticas previas, como el lgebra, la trigonometra o la geometra analtica del clculo. Quiz la derivada es el concepto ms importante del clculo infinitesimal. La derivada es un concepto que tiene muchas aplicaciones. Se aplica en aquellos casos donde es necesario medir la rapidez con que se produce el cambio de una magnitud o situacin. Es una herramienta de clculo fundamental en los estudios de Fsica, Qumica y Biologa, o en ciencias sociales como la Economa y la Sociologa. Por ejemplo, cuando se refiere a la grfica de dos dimensiones de f, se considera la derivada como la pendiente de la recta tangente del grfico en el punto x. Se puede aproximar la pendiente de esta tangente como el lmite cuando la distancia entre los dos puntos que determinan una recta secante tiende a cero, es decir, se transforma la recta secante en una recta tangente. Con esta interpretacin, pueden determinarse muchas propiedades geomtricas de los grficos de funciones, tales como concavidad o convexidad. Algunas funciones no tienen derivada en todos o en alguno de sus puntos. Por ejemplo, una funcin no tiene derivada en los puntos en que se tiene una tangente vertical, una discontinuidad o un punto anguloso. Afortunadamente,
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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

gran cantidad de las funciones que se consideran en las aplicaciones son continuas y su grfica es una curva suave, por lo que es susceptible de derivacin. Las funciones que son diferenciables (derivables si se habla en una sola variable), son aproximables linealmente. Es importante entender qu es una funcin matemtica para hablar de derivadas. Una ecuacin que relaciona dos variables x e y puede entenderse como una funcin, siempre y cuando a cada valor de x le corresponda uno y solamente un valor de y. La correspondencia entre estas dos variables se puede abstraer mediante parejas (x,y), donde y es el valor numrico que resulta de evaluar la ecuacin usando algn nmero x. Tales parejas se pueden interpretar como puntos geomtricos en un plano cartesiano de manera que, al graficar muchos puntos, se obtiene un dibujo que representa la funcin. Por ejemplo, dada la funcin

y=

x x2 +1

(34)

Las parejas se obtienen dando valores arbitrarios a x y calculando y, como se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 3. Clculo de los valores x e y de la funcin. x -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 y -0,192 -0,235 -0,3 -0,4 -0,5 0,0 0,5 0,4 0,3 0,235 0,192

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Figura 29. Representacin grfica de la funcin y.

En esta tabla se obtienen valores para puntos (x,y) que pueden ser graficados en un plano cartesiano con ejes x e y. En lenguaje matemtico las funciones se denotan sustituyendo la variable y por f(x) e indicando as que f(x) es una funcin de x. Es decir, indica que la variable ser, en este caso, x. La funcin anterior tendra el aspecto siguiente:

f ( x) =

x x +1
2

(35)

Y del mismo modo, los puntos tendran el aspecto (x,f(x)). Se suele imaginar la derivada en un punto x para la funcin f(x) como la pendiente (inclinacin) que existe en el punto (x,f(x)). En la grfica de una funcin, la pendiente representa la rapidez con que cambia dicha funcin: si la pendiente es muy grande, entonces la funcin en este punto crece muy deprisa; si la pendiente es muy pequea, entonces la funcin crece muy despacio en ese punto. En trminos geomtricos, est pendiente es "la inclinacin" de una lnea recta que toca el punto en el que se evala la derivada de la funcin. Esta inclinacin (un valor numrico) depende de la forma que tiene la funcin en esa zona del grfico que la representa en el plano cartesiano. Derivar una funcin no es en absoluto complicado si se sabe utilizar las reglas de derivacin descubiertas por Gottfried Leibniz e Isaac Newton. Dichas reglas son fruto de un concienzudo esfuerzo puramente lgico. Se puede comparar el proceso que lleva a una regla de derivacin al proceso utilizado para obtener la famosa solucin que resuelve las ecuaciones de segundo grado de forma automtica, y que est descrito en la mayora de libros de texto. Se requiere un poco de prctica para aplicar correctamente la reglas de derivacin sin caer en errores elementales. Utilizando las reglas de derivacin sobre una funcin, se obtiene otra funcin llamada derivada, o bien primera derivada. Si se denota por f(x) a una funcin y g(x) a la funcin que resulta de derivar f(x), entonces g(a) representa la pendiente que existe en el punto geomtrico (a,f(a)). La funcin g(x) representa la pendiente que posee la recta tangente a cualquier punto de la funcin, siendo stos de la forma (x,f(x).
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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

6.2.1. Definicin de derivada como un lmite


En terminologa clsica, diferenciacin manifiesta el coeficiente en que una cantidad "y" cambia a consecuencia de un cambio en otra cantidad "x". En matemticas coeficiente es un factor multiplicativo que pertenece a cierto objeto como una variable, un vector unitario, una funcin base, etc. En fsica coeficiente es una expresin numrica que mediante alguna frmula determina las caractersticas o propiedades de un cuerpo.

Figura 30. Representacin en la que muestra los incrementos de la funcin en x y en y.

En nuestro caso, observando la grfica anterior, el coeficiente del que hablamos vendra representado en el punto 'P' de la funcin por el resultado de la divisin representada por la relacin (dx / dy), que como puede comprobarse en la grfica, es un valor que se mantiene constante a lo largo de la lnea recta azul que representa la tangente en el punto 'P' de la funcin. Esto es fcil de entender puesto que el triangulo rectngulo formado en la grafica con vrtice en el punto 'P', por mucho que lo dibujemos mas grande, al ser una figura proporcional el resultado de (dx /dy) es siempre el mismo. Esta definicin, que es laboriosa de calcular algebraicamente por la regla de los cuatro pasos, constituye la aproximacin ms veloz a la derivada, puesto que el acercamiento a la pendiente de la recta tangente es tanto por la derecha como por la izquierda de manera simultnea. Tambin puede definirse alternativamente la derivada de una funcin en cualquier punto de su dominio de la siguiente manera:

f ' ( x) = lim h x

f ( x) f ( h) xh

(36)

La cual representa un acercamiento de la pendiente de la secante a la de la tangente ya sea por la derecha o por la izquierda segn el signo de h, en la cual es posible cancelar siempre el factor " x - h " en lugar de solo h. El aspecto de este lmite est relacionado ms con la velocidad instantnea del movimiento uniformemente acelerado que con la pendiente de la recta tangente a una curva.
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No obstante su aparente diferencia, el clculo de la derivada por definicin con cualquiera de los lmites anteriormente expresados, proporciona siempre el mismo resultado. El estudiante debe utilizar el que le resulte ms conveniente. En particular, se tiene que la derivada de la funcin en el punto x = a (varios autores prefieren utilizar la notacin "xo" en lugar de a) se define como sigue:

f ' (a) = lim h0

f ( a + h) f ( a ) f ( x ) f (a ) = lim xa h xa

(37)

Si este lmite existe, de lo contrario, f '(a) no est definida. Esta ltima expresin coincide con la velocidad instantnea del movimiento continuo uniforme acelerado en cinemtica. Aunque podran calcularse todas las derivadas empleando la definicin de derivada como un lmite, para lo cual se tendra que ser muy hbil en el clculo de lmites indeterminados de la forma 0 sobre 0 (lo cual sera muy laborioso), existen reglas bien establecidas, conocidas como teoremas para el clculo de derivadas, las cuales permiten calcular la derivada de una funcin de acuerdo a su forma sin tener que calcular forzosamente el lmite y hacer los cuatro pasos cada vez. Tales reglas se deducen sucesivamente de la definicin de derivada y de reglas previas, como puede apreciarse en todo buen texto de clculo infinitesimal. El conocimiento de todas las expresiones anteriores y su significado representan el acercamiento epistmico ms completo posible en torno a la definicin de derivada, y con ello, al aspecto esencial del clculo diferencial.

6.2.2. Segunda derivada


La segunda derivada es un teorema o mtodo de clculo matemtico en el que se utiliza para efectuar una prueba simple correspondiente a los mximos y mnimos relativos. Dada una funcin f: I R derivable, se dice que es convexa si las rectas tangentes en cada punto quedan por debajo de la grfica de f. Si en cambio las rectas tangentes quedan por encima de la grfica, se dice que f cncava.

Figura 31. Representacin de la segunda derivada.


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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

Sea a perteneciente a I, se dice que a es un punto de inflexin de f, si f pasa de cncava a convexa en a o viceversa. Un punto de inflexin se caracteriza tambin porque la recta tangente a la curva que pasa por l atraviesa la grfica.
1. Si f (x) > 0 para todo I, entonces f es convexa. 2. Si f (x) < 0 para todo I, entonces f es cncava. 3. Si f (a) = 0 y la derivada segunda es positiva a la izquierda de a y negativa

a la derecha (o viceversa), entonces a es un punto de inflexin de f. A partir de las proposiciones anteriores, se puede establecer el siguiente criterio para el estudio de extremos relativos:
1. Si f (a) = 0 y f (a) < 0, entonces f tiene un mximo relativo en a. 2. Si f (a) = 0 y f (a) > 0, entonces f tiene un mnimo relativo en a.

6.2.3. Espectroscopia derivada en los espectros de absorcin:


En la espectrofotometra derivada, los espectros se obtienen representando grficamente la primera derivada o una derivada de orden mayor, de la absorbancia o de la transmitancia, con respecto a la longitud de onda. A menudo estas representaciones grficas revelan detalles espectrales que se pierden en un espectro ordinario. A veces se pueden realizar las medidas de concentracin de un analito determinado en presencia de un interferente con ms facilidad y exactitud. En muchas zonas de las regiones ultravioleta y visible la relacin seal/ruido no es un factor limitante serio, es en estas regiones donde ms se utilizan los espectros derivados. Como desventaja hay que sealar que una reduccin en la relacin seal/ruido acompaa a la obtencin de las derivadas. Muchas de las aplicaciones ms importantes de la espectroscopia derivada en las regiones ultravioleta y visible son las identificaciones cualitativas de especies, en las cuales la observacin en detalle de un espectro derivado hace posible distinguir entre compuestos que tienen espectros solapados. La espectrofotometra de longitud de onda dual ha demostrado ser particularmente til para la obtencin de espectros de absorcin ultravioleta/visible de especies presentes en disoluciones turbias, donde la dispersin de la luz elimina los detalles en el espectro de absorcin. Por ejemplo, tres aminocidos, el triptfano, la tirosina y la fenilalanina contienen cadenas aromticas secundarias, que presentan picos de absorcin agudos en la zona de 240 a 300 nm. Estos picos agudos no estn claros en los espectros de las preparaciones de protenas tpicas, tales como la albmina bovina o de huevo, ya que las molculas grandes dispersan fuertemente la radiacin, dando lugar slo a un pico de absorcin suave tal como el que aparece en la figura 32. La estructura fina aromtica se descubre en los espectros de primera y segunda derivada, como muestran las curvas de la figura 32.

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Figura 32. Representaciones del espectro de absorcin y primera y segunda derivada.

Es relativamente fcil caracterizar protenas cuando la absorcin de cromforos est presente en la regin visible. Sin embargo, es ms difcil obtener la informacin estructural de absorcin de las protenas en la regin ultravioleta, es aqu donde muchas transiciones individuales electrnicas que se superponen en su estructura, son encontradas. No slo los tres aminocidos aromticos (fenilalanina, tirosina y triptfano), sino tambin cisteina, histidina y los componentes ultravioletas visibles de cromforos visibles, como el grupo hemo, contribuyen a la absorbancia ultravioleta de protenas que causan espectros sin estructura. No obstante, una mejor resolucin puede ser alcanzada, mediante el clculo de la segunda o la cuarta derivada en los espectros. La segunda derivada de espectroscopia es el mtodo ms extensamente usado, en particular para la deteccin de cambios estructurales. La cuarta derivada de espectroscopia tiene la ventaja que un mximo en el espectro original corresponde a un mximo en la derivada del espectro. Adems, las cuartas derivadas son ms selectivas para cintas estrechas que las segundas derivadas, y ellos permiten un estudio ms detallado del ambiente de los tres aminocidos aromticos. Un cambio de una protena, un cambio de conformacin, una variacin de hidratacin, una disociacin, o una desnaturalizacin, pueden causar un cambio de ambiente de uno o varios de estos aminocidos. Sin embargo, el espectro ultravioleta visible de una protena es amplio y sin rasgos distintivos: los cambios interesantes son enmascarados por las contribuciones de todos los otros aminocidos aromticos cuyo ambiente no ha cambiado.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

6.2.4. Segunda derivada de espectroscopia


La segunda derivada de espectroscopia es el medio para extraer informacin del espectro original. En contraste con los espectros relativamente sin rasgos distintivos, las segundas derivadas se caracterizan por afilados picos y valles. La Figura 33 muestra el espectro ultravioleta de una levadura, la Figura 34 muestra la segunda derivada del espectro de la Figura 33.

Figura 33. Espectro de una levadura.

En la segunda derivada del espectro de la protena, la relacin entre la intensidad mxima, a travs de los valores, y las posiciones de los picos y valles estn en funcin de las cantidades relativas de los aminocidos y la polaridad de los mismos en los entornos de las tirosinas y los triptfanos.

Figura 34. Segunda derivada del espectro de la levadura

Extrayendo el significado fsico de los cambios de la segunda derivada de los espectros, se sabe la composicin de aminocidos de la protena y la utilizacin de los espectros constituyentes en los espectros observados.

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6.2.5. Cuarta derivada de espectroscopia


La selectiva mejora de la resolucin en las derivadas de espectroscopia es llevada an ms lejos en la cuarta derivada. De un punto de vista metodolgico, las derivadas, por lo general, son calculadas cambiando un espectro de una longitud de onda determinada y la posterior substraccin del espectro original. Por lo tanto permite estudiar con criterio selectivo ciertas transiciones electrnicas, segn sus anchuras de cinta espectrales. Como en el caso de la segunda derivada de espectroscopia, la amplitud y la posicin de las cintas espectrales derivadas de los aminocidos aromticos son relacionadas con la polaridad del medio.

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CAPTULO 7: SOFTWARE E INSTRUMENTACIN

7.1. RasMol
RasMol es un programa de grficos moleculares para la visualizacin de protenas, cidos nucleicos y molculas pequeas. El programa est dirigido a mostrar, la enseanza y la generacin de la publicacin de imgenes de calidad. El programa ha sido desarrollado en la Universidad de Edimburgo por la Unidad de Investigacin de Biocomputacin y el Departamento de Estructura Biomolecular de Investigacin y Desarrollo de Glaxo en Greenford, Reino Unido.

Figura 35.Representacin de la molcula de DNASA.


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RasMol coordina los archivos en varios formatos y muestra interactivamente la molcula en la pantalla en una variedad de colores y representaciones muy variadas. Actualmente apoya formatos de archivo de entrada como Brookhaven Protein Databank (PDB), Tripos' Alchemy, Sybyl Mol2 formats, Molecular Design Limited's (MDL) Mol file format, Minnesota Supercomputer Center's (MSC) XMol XYZ format y CHARMm format files. Si la conectividad de la informacin y / o estructura secundaria de informacin no est contenida en el expediente se calcula automticamente. La estructura de la molcula cargada puede ser mostrada en alambre, esqueleto, bastones, en espacio completo, bolas y bastones, cintas, hebras, dibujo y superficie molecular. Los tomos tambin pueden ser etiquetados con cadenas de texto arbitrario mediante la opcin etiquetas.

Figura 36. Representacin de la molcula de BSA en esqueleto.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

Figura 37. Representacin de la molcula de BSA en bolas y bastones.

Diferentes partes de la molcula se pueden mostrar de color independiente del resto de la molcula o mostrados simultneamente en diferentes representaciones. La molcula puede ser rotada, trasladada, hacerle zoom interactivamente utilizando el ratn, las barras de desplazamiento, la lnea de comandos o una marca en el cuadro adjunto.

Figura 38. Representacin independiente y simultnea de los aminocidos de Tirosina de la molcula de DNASA
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RasMol tambin puede leer una lista de comandos preparados a partir de un "script 'archivo (o por medio de la comunicacin) para que una determinada imagen o el punto de vista se restablezcan rpidamente. RasMol tambin puede crear un archivo de comandos que contiene los comandos necesarios para regenerar la imagen actual y mostrarla de la manera que se desee.

Figura 39. Cuadro de comandos de RasMol.

Por ltimo, la imagen puede ser prestada por escrito en una variedad de formatos tanto both raster and vector PostScript, GIF, PPM, BMP, PICT, Sun rasterfile, MolScript input script o Kinemage. RasMol se ejecutar sobre una amplia gama de arquitecturas y sistemas, incluyendo SGI, sun4, sun3, sun386i, DEC, HP y E & S, IBM RS/6000, Cray, Sequent, DEC Alpha (OSF / 1, OpenVMS y Windows NT), IBM PC (en Microsoft Windows, Windows NT, OS / 2, Linux, * BSD y BSD386), Apple Macintosh (Sistema 7.0 o posterior), PowerMac y VAX VMS (DEC bajo Windows). UNIX y requieren un SLB versiones de 8 bits, 24 bits o 32 bits de Windows X frame buffer (X11R4 o posteriores). La versin X de RasMol en Windows proporciona soporte opcional para la aceleracin de la prestacin de la memoria compartida (a travs de la XInput y extensiones de MIT-SHM) si estn disponibles.

7.2. Vision Pro


Vision Pro es un poderoso y verstil servicio de softwareTM que ofrece un instrumento avanzado de control y capacidades de manipulacin de datos. Creado para optimizar y aporta una visin fcil de usar, en un entorno grfico para el anlisis espectrofotomtrico.

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Pro software ofrece una completa serie de opciones mejorar la productividad de su instrumento de UV-visible. El mtodo de instalacin, la recopilacin de datos, clculos, el informe de presentacin, el cumplimiento de la normativa y todos los aspectos de su anlisis se pueden realizar la serie de software Vision Pro. Vision Pro software cuenta con avanzadafuncionalidad de escaneado, nico y mltiple; fija las mediciones avanzadas de longitud de onda, completa la correccin de longitud de onda de referencia y completa el anlisis cuantitativo. Adems, incluye un componente de anlisis simultneo de concentracin de mltiples componentes. Ofrece una avanzada herramienta de clculo a tiempo real o despus de correr el procesamiento de datos. A su vez, tambin incorporada en la hoja de clculo la funcionalidad de UV programadas por el usuario y proporciona clculos completos de la flexibilidad como formato de resultados finales. Vision Pro tiene la posibilidad de presentar un informe donde se puede incluir mtodos, grficos y datos flexibles del compositor. La aplicacin permite la fusin de ADN el control de la calefaccin/ refrigeracin de los ciclos. Esto ahorra tiempo y permite realizar experimentos hasta 6 veces ms rpido que con la temperatura fija tradicional de rampas. Vision Life tambin ofrece una amplia gama de mtodos de clculo de temperatura que pueden tambin ser ampliada con el uso UV calc. Este software es ideal para laboratorios que necesitan producir la publicacin de resultados de calidad hacia la informacin que se aporta a los clientes. El software automatiza la enzimtica en experimentos de anlisis de alimentos, orientando al usuario paso a paso a travs del mtodo, clculos, y la presentacin de datos. El software est diseado especficamente para graficar el anlisis y para presentar informes. Adems le permite lanzar cualquier paquete de anlisis a datos externos, incluyendo Microsoft Excel, sin tener que salir de la aplicacin Vision Pro. La importacin / exportacin de datos permite la fcil circulacin de datos entre otros programas.

7.3. Thermo Scientific Evolution 300


El Thermo Scientific Evolution 300 es el espectrofotmetro utilizado en el mtodo experimental. Es el espectrofotmetro ms rpido de doble haz de investigacin de su clase. Equipado con una amplia muestra del compartimiento y una coleccin de ms de 70 accesorios, que permite analizar cualquier muestra con una gran facilidad.

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Figura 40. Espectrofotmetro Evolution 300 UV-Visible.

El Evolution 300 cuenta con una evolucin real de diseo de doble haz, ancho de banda variable, y una larga vida de la lmpara de xenn que garantiza la confianza mxima en el anlisis de la muestras. La capacidad de ancho de banda variable de anlisis se puede acomodar en 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, y 4,0 nm para todas las necesidades analticas que se precisen. Para mayor seguridad, la lmpara de mercurio y la validacin del carrusel de calibracin automatizada de accesorios proporcionan verificacin de rendimiento para garantizar el cumplimiento de las normativas. El espectrofotmetro combina la agilidad de una rpida tasa de adquisicin de datos con una temperatura controlada por clulas-cambiador o una poderosa rpida mezcla de accesorios para aumentar la funcionalidad. Los accesorios para Evolution 300 pueden ser instalados y eliminados sin necesidad de reiniciar el instrumento. Los accesorios son inmediatamente detectados por el software Vision Pro configurndolos automticamente. Todas las aplicaciones comunes, como la exploracin, anlisis de longitud de onda fija, y la cintica, se pueden controlar directamente desde Vision Pro. Para aplicaciones avanzadas, tambin incluye un poderoso conjunto de software para el anlisis exacto de sus muestras.

7.4. Autoclave
Un autoclave es un dispositivo que sirve para esterilizar material mdico o de laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presin y temperatura, evitando con las altas presiones que el agua llegue a ebullicin. El fundamento del autoclave es que coagula las protenas de los microorganismos debido a la presin y temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunos

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

microorganismos, as como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave. Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generacin de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presin interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centgrados. Un tiempo tpico de esterilizacin a esta temperatura y presin es de 15 a 20 minutos. Para realizar este proceso hay que seguir lo siguientes pasos:
1. Mirar el nivel del agua del interior del autoclave, asegurarse que este a nivel

de la cesta de carga o a un nivel un poco superior.


2. Cargar la cesta con el material a autoclavar. 3. Cerrar la tapa apretando bien la manivela de cierre. 4. Comprobar que la vlvula de vapor y desage este bien cerrada. 5. Poner el autoclave en marcha. 6. Una vez finalizado el proceso, parar la mquina y abrir la vlvula de vapor

(nunca abrir la tapa superior) para que salga el vapor de agua a alta presin.
7. Una vez ya no salga ms vapor de agua aflojar la manivela de cierre y abrir el

autoclave.
8. Dejar enfriar el material. 9. Coger el material con guantes de proteccin.

Figura 41. Autoclave

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CAPTULO 8:MTODO EXPERIMENTAL

8.1. Reactivos8

Protena BSA (Bovine Serum Albumin). Protena DNAsa 1 (Desoxyrribonuclease I). Disolucin tampn bsica. Disolucin tampn cida. cido Clorhdrico (HCl). Hidrxido de Sodio (NaOH). Agua Destilada (H2O).

8.2. Instrumentacin

Espectrofotmetro Evolution 300 UV-Visible. Cubetas de cuarzo con volumen interno de 1ml. pH-metro de la marca CRISOM. Agitador magntico. Autoclave. Pipetas aforadas de volumen 10 ml.

Consultar las fichas de seguridad en el anexo adjunto a la memoria del proyecto.


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Micropipeta. Eppendorfs. Tubos de centrfuga de 15 ml. Puntas de pipeta. Gradilla de puntas. Vasos de precipitados. Pera o succionador. Pipetas Pasteur.

8.3. Procedimiento experimental


Sondeando la estructura de la protena y la dinmica de la segunda derivada del anlisis de absorcin en el ultravioleta: Se describe un enfoque para el estudio de la estructura de la protena utilizando la regin ultravioleta del espectro de absorbancia (UV), donde los cambios de la absorbancia de los aminocidos aromticos son inducidos por la desnaturalizacin trmica o por medio cido-base. El mtodo se basa en la hiptesis de que a medida que se desnaturalice la protena irn cambiando la estructura terciaria y secundaria de las protenas, lo que provocar el cambio de posicin respecto del solvente de lo aminocidos aromticos. Se ha investigado el potencial de este mtodo de sonda de medicin de la dinmica de las protenas de alta resolucin de segunda derivada de los espectros de los rayos UV, en funcin de la temperatura y de cambios de medio cido-base de dos protenas de diferentes propiedades fsicas y qumicas, para representar cadenas laterales totalmente expuestas. Se demuestra que los pequeos cambios en la posicin del mximo de la longitud de onda de Phe, Tyr y Trp, puede ser medido con fiabilidad, y que la magnitud y la direccin del rastreo de picos se ven influidos por varios factores, como el tamao y carga de la protena, y el medio o ambiente local y la accesibilidad de los grupos aromticos de los disolventes. Aspectos dinmicos de la estructura de la protena se han convertido cada vez de ms inters debido a su papel potencial en la estructura de la protena, la estabilidad y funcin. La estructura y las mociones de las cadenas polipeptdicas en protenas, pueden ser estudiadas por una serie de mtodos, cada uno de ellos dando una imagen distinta de la estructura dinmica, debido a la escala de tiempo y la magnitud de las propuestas de resolucin, que pueden ser probadas por una particular tecnologa. Se pueden alcanzar imgenes de alta resolucin mediante RMN (Keniry Carver y 2002, Adams et al. 2004), ERS (Poluektov et al. 2003), de intercambio de istopos de seguimiento por espectrometra de masas (Zhang y Smith 1993; Yan et al. 2004) y espectroscopia infrarroja (Yu et al. 2004). A ms baja resolucin,
- 88 -

Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

con una nica imagen de protenas, el comportamiento dinmico es proporcionado por el uso de un pequeo soluto neutro como O2 y acrilamida (Lakowicz et al. 1983; Fasano et al. 2003; Ruiz et al. 2003) para estudiar el enfriamiento de la protena en la fluorescencia. Para obtener una imagen ms completa de la estructura tridimensional de la protena y de su dinmica de desnaturalizacin, la espectroscopia de absorbancia ultravioleta se puede utilizar para monitorizar las seales de los tres aminocidos aromticos: Phe, Tyr y Trp. El espectro de absorbancia de cada uno de estos aminocidos contiene una amplia superposicin de varios picos de entre 200 y 300 nm. Estos se derivan de las bandas ms dbiles en la participacin de las transiciones de los electrones de los anillos aromticos (Donovan 1969; Wetzel et al. 1980). El clculo de la derivada de una curva de absorbancia mejora y facilita la resolucin del complejo espectro de orden cero (Giese y francs en 1955; Grum et al. 1972). En la segunda derivada del espectro (d2A/d2), la absorbancia que se derivan de estos residuos es resuelta como mnimos en la regin espectral de 245-270 nm (Phe), 265-285 (Tyr), y 265-295 nm (Trp) y, por tanto, la superposicin espectral se reduce significativamente (Ichikawa y Terada 1977; Balestrieri et al. 1978; Levine y Feferici 1982; Kueltzo et al. 2003). Acontecimientos recientes en alta resolucin de espectroscopia ultravioleta de absorbancia, permiten que la derivada en la posicin de los picos defina una resolucin mayor y tambin acercarse a 0,01 nm. Por lo tanto, pequeos cambios en las posiciones de los mximos de absorbancia se pueden detectar, y son la base de los estudios descritos en este proyecto. El anlisis de la segunda derivada de los espectros se ha utilizado para cuantificar el contenido de aminocidos (Ichikawa y Terada 1977, 1979; Balestrieri et al. 1978, 1980, Levine y Federici 1982), detectar cambios conformacionales en trminos de alteraciones en la cadena lateral, en microentornos aromticos ( Solli y Herskovits 1973; Ichikawa y Terada, 1979; Mach et al. 1991; Mach y Middaugh 1994), y ms recientemente, para generar diagramas de fase emprica analizando la estabilidad de las protenas de una serie de condiciones de la solucin (Kueltzo et al. 2003 ). Para complementar estas aplicaciones, el mtodo aqu descrito utiliza la desnaturalizacin de los grupos aromticos Phe, Tyr y Trp, para tratar las caractersticas de la estructura de la protena.

8.3.1. Procedimiento
1. Se introducen dos cubetas de cuarzo vacas y se realiza una lnea base con

alta resolucin de 240 a 850 nm, de la que se obtiene una recta de calibracin, ahora se tiene la certeza de tener el espectrofotmetro a punto.
2. Fijamos el mtodo de barrido con los siguientes datos:

Modo dato: Absorbancia. Lambda de inicio a 240 nm.

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Sergi Muoz Martin


Lambda de parada 340 nm. Ancho de banda de 10 nm. Velocidad barrido: Intelliscan Intervalo de datos con Alta Resolucin. Lmpara: de Xenn (en la desnaturalizacin trmica se fijaran tantos ciclos como C se quiera aumentar hasta la temperatura final). Suavizado Muy Alto para eliminar los posibles ruidos que se puedan detectar. Activar Tabla de Resultados con Registro de Picos en 100 (lo mximo que registra la mquina, para que nos coja todos los posibles, despus ya se descartaran).

3. Se introduce en la primera cubeta la protena a tratar y en la segunda (cubeta

de referencia) el medio a contrarrestar (agua destilada).


4. Finalmente se guardan los datos en modo lote resultados, para analizarlos en

el software Vision Pro, y tambin como ASCI para poderlos posteriormente con procesadores de textos y hojas de clculo.

tratar

- 90 -

CAPTULO 9: RESULTADOS EXPERIMENTALES

Se quiere estudiar la desnaturalizacin trmica y cido-bsica de dos protenas globulares mediante la monitorizacin de los mximos de absorbancia de los aminocidos aromticos en la regin ultravioleta. Posteriormente se comparar esta evolucin graficada con el patrn de cada aminocido y con la estructura primaria de las protenas escogidas para este estudio.

9.1. Protena BSA (Albumin Serum Bovine)


9.1.1. Desnaturalizacin trmica
Se prepara una disolucin en agua de [BSA] = 10 mg/ml. Se pone funcionamiento el procedimiento anteriormente expuesto, y se obtiene seguimiento de los cambios de absorbancia de la protena. En esta ocasin definen 7 ciclos de temperatura, fijando un aumento de temperatura de 30 hasta 90C. en un se C

Se observa que en las regiones de 2400024320 nm y 33680-34000 nm, la protena BSA no muestra absorcin en ultravioleta visible. Se deduce que los aminocidos aromticos absorben en las siguientes regiones espectrales:

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Sergi Muoz Martin


Fenilalanina: regin espectral de 245 a 270 nm. Tirosina: regin espectral de 265 a 285 nm. Triptfano: regin espectral de 265 a 295 nm.

Se grafican los resultados obtenidos del barrido espectral, dentro de las anteriores regiones. Cuando se estudia la segunda derivada esta absorbancia se representa en valor absoluto.

273,00

1 2

267,00 A bs orbanc ia

3 4

261,00

5 6 7

255,00

8 9

249,00

10 11

243,00 30,00 40,00 50,00 60,00 T em peratura 70,00 80,00 90,00

Figura 42. Representacin de la desnaturalizacin trmica con BSA en la regin espectral de Fenilalanina.

- 92 -

Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

290,00

285,00

2 3

280,00 A bs orbanc ia

4 5

275,00

6 7 8

270,00
9

265,00

260,00 30,00 40,00 50,00 60,00 T em peratura 70,00 80,00 90,00

Figura 43. Representacin de la desnaturalizacin trmica con BSA en la regin espectral de Tirosina.

300,00
1

295,00 290,00 285,00 280,00 275,00 270,00 265,00 260,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 T em peratura

2 3 4 5

A bs orbanc ia

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Figura 44. Representacin de la desnaturalizacin trmica con BSA en la regin espectral de Triptfano.
- 93 -

Sergi Muoz Martin

9.1.2. Desnaturalizacin cido- Base


Se prepara una disolucin en agua de [BSA] = 10 mg/ml, seguidamente, se pone en funcionamiento el procedimiento anteriormente expuesto, obteniendo un seguimiento de los cambios de absorbancia de la protena. En esta ocasin se fijan 11 ciclos a diferente pH, se descarta hacer un estudio a pH 7 dado que el agua destilada se encuentra dentro de este trmino con un pH de 617, por tanto nuestra disolucin de agua ms BSA se encuentra a pH de 688 y no comporta ninguna desnaturalizacin. Se observa que en las regiones de 2400024320 nm y 33680-34000 nm, la protena BSA no muestra absorcin en ultravioleta - visible. Se deduce que los aminocidos aromticos absorben en las siguientes regiones espectrales:

Fenilalanina: regin espectral de 245 a 270 nm. Tirosina: regin espectral de 265 a 285 nm. Triptfano: regin espectral de 265 a 295 nm.

Se grafican los resultados obtenidos del barrido espectral dentro de las anteriores regiones.

279,00 275,00 271,00 267,00

1 2 3 4 5 6 7

Absorbancia

263,00 259,00 255,00 251,00 247,00 243,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

8 9 10

pH
Figura 45. Representacin de la desnaturalizacin por medio cido-bsico con BSA en la regin espectral de la Fenilalanina.

- 94 -

Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

290,00

286,00

1 2

282,00

Absorbancia

278,00

4 5

274,00

6
270,00

7 8

266,00

262,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

pH
Figura 46. Representacin de la desnaturalizacin por medio cido - bsico con BSA en la regin espectral de la Tirosina.

298,00

1
294,00 290,00

2 3 4

286,00

5 6

Absorbancia

282,00

7
278,00 274,00

8 9 10

270,00 266,00 262,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

11 12

pH

Figura 47. Representacin de la desnaturalizacin por medio cido bsico con BSA en la regin espectral de la Triptfano.

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Sergi Muoz Martin

9.2. Protena DNAsa Pancreas Bovine)


9.2.1. Desnaturalizacin Trmica

(Deoxyribonuclease

Se prepara una disolucin en agua de [DNAsa] = 08787 mg/ml, seguidamente se pone en funcionamiento el procedimiento anterior, obteniendo un seguimiento de los cambios de absorbancia de la protena. Se observa que en las regiones de 2400024320 nm y 33680-34000 nm, la protena BSA no muestra absorcin en ultravioleta visible. Se deduce que los aminocidos aromticos absorben en las siguientes regiones espectrales:

Fenilalanina: regin espectral de 245 a 270 nm. Tirosina: regin espectral de 265 a 285 nm. Triptfano: regin espectral de 265 a 295 nm.

Se grafican los resultados obtenidos del barrido espectral dentro de las anteriores regiones. Cuando se estudia la segunda derivada, esta absorbancia se representa en valor absoluto. Tambin se hace uso de la cuarta derivada, para obtener el recorrido de los picos ms significativos que aparecen en los espectros graficados en este captulo.

290,00 285,00 280,00 275,00 270,00 1 2 3 4 5 6 245,00 240,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00

Absorbancia

265,00 260,00 255,00 250,00

Temperaturas

Figura 48. Representacin de la desnaturalizacin trmica con DNAsa en la regin espectral de Fenilalanina.

- 96 -

Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

330,00 320,00 310,00 300,00

1 2 3 4 5 6 7 8

Absorbancia

290,00 280,00 270,00 260,00 250,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00

Temperaturas

Figura 49. Representacin de la desnaturalizacin trmica con DNAsa en la regin espectral de Tirosina.

340,00

1
330,00 320,00 310,00 300,00

2 3 4 5

Absorbancia

6 7 8 9 10

290,00 280,00 270,00 260,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00

Temperaturas

Figura 50. Representacin de la desnaturalizacin trmica con DNAsa en la regin espectral de Triptfano.

- 97 -

Sergi Muoz Martin

9.2.2. Desnaturalizacin cido Base


Se prepara una disolucin en agua de [DNAsa] = 08787 mg/ml, seguidamente se pone en funcionamiento el procedimiento anteriormente expuesto, obteniendo un seguimiento de los cambios de absorbancia de la protena Se observa que en las regiones de 2400024320 nm y 33680-34000 nm, la protena BSA no muestra absorcin en ultravioleta visible. Se obtiene que los aminocidos aromticos muestran unas regiones en forma de picos, expresadas en las siguientes regiones espectrales:

Fenilalanina: regin espectral de 245 a 270 nm. Tirosina: regin espectral de 265 a 285 nm. Triptfano: regin espectral de 265 a 295 nm.

Se grafican los resultados obtenidos del barrido espectral dentro de las anteriores regiones espectrales. Cuando se estudia la segunda derivada, esta absorbancia se representa en valor absoluto. Tambin se hace uso de la cuarta derivada, para obtener el recorrido de los picos ms significativos que aparecen en los espectros graficados en este captulo.

270,00

1
265,00

Absorbancia

260,00

3 4

255,00

5 6

250,00

7
245,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

pH

Figura 51. Representacin de la desnaturalizacin por medio cidobsico con DNAsa en la regin espectral de la Fenilalanina.

- 98 -

Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

285,00

280,00

1 2

Absorbancia

275,00

3 4

270,00

5 6

265,00

260,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

pH

Figura 52. Representacin de la desnaturalizacin por medio cidobsico con DNAsa en la regin espectral de la Tirosina.

295,00

1
290,00

2
285,00

Absorbancia

3 4 5

280,00 275,00 270,00 265,00 260,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00

6 7 8 9 10

pH

Figura 53. Representacin de la desnaturalizacin por medio cidobsico con DNAsa en la regin espectral de la Triptfano.

- 99 -

Sergi Muoz Martin

9.3. Comparacin de la evolucin graficada con la estructura primaria de las protenas.


9.3.1. Estructura primaria de BSA.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 A A A A A A A A A 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 ASP ALA HIS LYS SER GLU VAL ALA HIS ARG PHE LYS ASP LEU GLY GLU GLU ASN PHE LYS ALA LEU VAL LEU ILE ALA PHE ALA GLN TYR LEU GLN GLN CYS PRO PHE GLU ASP HIS VAL LYS LEU VAL ASN GLU VAL THR GLU PHE ALA LYS THR CYS VAL ALA ASP GLU SER ALA GLU ASN CYS ASP LYS SER LEU HIS THR LEU PHE GLY ASP LYS LEU CYS THR VAL ALA THR LEU ARG GLU THR TYR GLY GLU MET ALA ASP CYS CYS ALA LYS GLN GLU PRO GLU ARG ASN GLU CYS PHE LEU GLN HIS LYS ASP ASP ASN PRO ASN LEU PRO ARG LEU VAL ARG PRO GLU VAL ASP VAL MET CYS THR ALA PHE HIS ASP ASN GLU GLU THR PHE LEU LYS LYS TYR LEU TYR GLU ILE ALA ARG ARG HIS PRO TYR PHE TYR ALA PRO GLU LEU LEU PHE PHE ALA LYS ARG TYR LYS ALA ALA PHE THR GLU CYS CYS GLN ALA ALA ASP LYS ALA ALA CYS LEU LEU PRO LYS LEU ASP GLU LEU ARG ASP GLU GLY LYS ALA SER SER ALA LYS GLN ARG LEU LYS CYS ALA SER LEU GLN LYS PHE GLY GLU ARG ALA PHE LYS ALA TRP ALA VAL ALA ARG LEU SER GLN ARG PHE PRO LYS ALA GLU PHE ALA GLU VAL SER LYS LEU VAL THR ASP LEU THR LYS VAL HIS THR GLU CYS CYS HIS GLY ASP LEU LEU GLU CYS ALA ASP ASP ARG ALA ASP LEU ALA LYS TYR ILE CYS GLU ASN GLN ASP SER ILE SER SER LYS LEU LYS GLU CYS CYS GLU LYS PRO LEU LEU GLU LYS SER HIS CYS ILE ALA GLU VAL GLU ASN ASP GLU MET PRO ALA ASP LEU PRO SER LEU ALA ALA ASP PHE VAL GLU SER LYS ASP VAL CYS LYS ASN TYR ALA GLU ALA LYS ASP VAL PHE LEU GLY MET PHE LEU TYR GLU TYR ALA ARG ARG HIS PRO ASP TYR SER VAL VAL LEU LEU LEU ARG LEU ALA LYS THR TYR GLU THR THR LEU GLU LYS CYS CYS ALA ALA ALA ASP PRO HIS GLU CYS TYR ALA LYS VAL PHE ASP GLU PHE LYS PRO LEU VAL GLU GLU PRO GLN ASN LEU ILE LYS GLN ASN CYS GLU LEU PHE GLU GLN LEU GLY GLU TYR LYS PHE GLN ASN ALA LEU LEU VAL ARG TYR THR LYS LYS VAL PRO GLN VAL SER THR PRO THR LEU VAL GLU VAL SER ARG ASN

10 A 11 A 12 A 13 A 14 A 15 A 16 A 17 A 18 A 19 A 20 A 21 A 22 A 23 A 24 A 25 A 26 A 27 A 28 A 29 A 30 A 31 A 32 A 33 A

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

34 A 35 A 36 A 37 A 38 A 39 A 40 A 41 A 42 A 43 A 44 A 45 A

585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585 585

LEU GLY LYS VAL GLY SER LYS CYS CYS LYS HIS PRO GLU ALA LYS ARG MET PRO CYS ALA GLU ASP TYR LEU SER VAL VAL LEU ASN GLN LEU CYS VAL LEU HIS GLU LYS THR PRO VAL SER ASP ARG VAL THR LYS CYS CYS THR GLU SER LEU VAL ASN ARG ARG PRO CYS PHE SER ALA LEU GLU VAL ASP GLU THR TYR VAL PRO LYS GLU PHE ASN ALA GLU THR PHE THR PHE HIS ALA ASP ILE CYS THR LEU SER GLU LYS GLU ARG GLN ILE LYS LYS GLN THR ALA LEU VAL GLU LEU VAL LYS HIS LYS PRO LYS ALA THR LYS GLU GLN LEU LYS ALA VAL MET ASP ASP PHE ALA ALA PHE VAL GLU LYS CYS CYS LYS ALA ASP ASP LYS GLU THR CYS PHE ALA GLU GLU GLY LYS LYS LEU VAL ALA ALA SER GLN ALA ALA LEU GLY LEU

A travs del software Rasmol, se introduce la estructura primaria de la protena Albmina y se seleccionan los tres aminocidos aromticos a estudiar. Simultneamente, una vez visualizados estos aminocidos, se puede localizar su posicin en la molcula. A continuacin se exponen unas tablas con los resultados obtenidos.

Tabla 4. Localizacin de las 31 Fenilalaninas. Aminocido Posicin en la molcula Aminocido Posicin en la molcula Phe 22BA Phe 36A Phe 49A Phe 127A Phe 134A Phe 157A Phe 165A Phe 206A Phe 326A Phe 374A Phe 395A Phe 502A Phe 509A Phe 4BBA Phe 11A Phe 19A Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Interna Interna Interna Phe 27A Phe 56BA Phe 70A Phe 102A Phe 149A Phe 156A Phe 211A Phe 223A Phe 309A Phe 330A Phe 377A Phe 403A Phe 507A Phe 554 Phe 551A Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna

- 101 -

Sergi Muoz Martin Tabla 5. Localizacin de las 18 Tirosinas. Aminocido Posicin en la molcula Aminocido Posicin en la molcula Tyr B4A Tyr 161A Tyr 263A Tyr 332A Tyr 334A Tyr 401A Tyr 452A Tyr 497A Tyr 13BA Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Interna Tyr 14BA Tyr 30A Tyr 140A Tyr 150A Tyr 319A Tyr 341A Tyr 353A Tyr 370A Tyr 411A Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna

Tabla 6. Localizacin del Triptfano. Aminocido Posicin en la molcula Trp 214A Interna

9.3.2. Esctructura primaria de DNAsa


1 2 3 4 5 6 7 8 9 A A A A A A A A A 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 373 ACE ASP GLU ASP GLU THR THR ALA LEU VAL CYS ASP ASN GLY SER GLY LEU VAL LYS ALA GLY PHE ALA GLY ASP ASP ALA PRO ARG ALA VAL PHE PRO SER ILE VAL GLY ARG PRO ARG HIS GLN GLY VAL MET VAL GLY MET GLY GLN LYS ASP SER TYR VAL GLY ASP GLU ALA GLN SER LYS ARG GLY ILE LEU THR LEU LYS TYR PRO ILE GLU HIC GLY ILE ILE THR ASN TRP ASP ASP MET GLU LYS ILE TRP HIS HIS THR PHE TYR ASN GLU LEU ARG VAL ALA PRO GLU GLU HIS PRO THR LEU LEU THR GLU ALA PRO LEU ASN PRO LYS ALA ASN ARG GLU LYS MET THR GLN ILE MET PHE GLU THR PHE ASN VAL PRO ALA MET TYR VAL ALA ILE GLN ALA VAL LEU SER LEU TYR ALA SER GLY ARG THR THR GLY ILE VAL LEU ASP SER GLY ASP GLY VAL THR HIS ASN VAL PRO ILE TYR GLU GLY TYR ALA LEU PRO HIS ALA ILE MET ARG LEU ASP LEU ALA GLY ARG ASP LEU THR ASP TYR LEU MET LYS ILE LEU THR GLU ARG GLY TYR SER PHE VAL THR THR ALA GLU ARG GLU ILE VAL ARG ASP ILE LYS GLU LYS LEU CYS TYR VAL ALA LEU ASP PHE GLU ASN GLU MET ALA THR ALA ALA SER SER
- 102 -

10 A 11 A 12 A 13 A 14 A 15 A 16 A 17 A 18 A

Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada

19 A 20 A 21 A 22 A 23 A 24 A 25 A 26 A 27 A 28 A 29 1 2 3 4 5 6 7 8 9

373 373 373 373 373 373 373 373 373 373

SER SER LEU GLU LYS SER TYR GLU LEU PRO ASP GLY GLN VAL ILE THR ILE GLY ASN GLU ARG PHE ARG CYS PRO GLU THR LEU PHE GLN PRO SER PHE ILE GLY MET GLU SER ALA GLY ILE HIS GLU THR THR TYR ASN SER ILE MET LYS CYS ASP ILE ASP ILE ARG LYS ASP LEU TYR ALA ASN ASN VAL MET SER GLY GLY THR THR MET TYR PRO GLY ILE ALA ASP ARG MET GLN LYS GLU ILE THR ALA LEU ALA PRO SER THR MET LYS ILE LYS ILE ILE ALA PRO PRO GLU ARG LYS TYR SER VAL TRP ILE GLY GLY SER ILE LEU ALA SER LEU SER THR PHE GLN GLN MET TRP ILE THR LYS GLN GLU TYR ASP GLU ALA GLY PRO SER ILE VAL HIS ARG LEU LYS ILE ALA ALA PHE ASN ILE ARG THR PHE GLY GLU THR LYS MET SER ASN ALA THR LEU ALA SER TYR ILE VAL ARG ILE VAL ARG ARG TYR ASP ILE VAL LEU ILE GLN GLU VAL ARG ASP SER HIS LEU VAL ALA VAL GLY LYS LEU LEU ASP TYR LEU ASN GLN ASP ASP PRO ASN THR TYR HIS TYR VAL VAL SER GLU PRO LEU GLY ARG ASN SER TYR LYS GLU ARG TYR LEU PHE LEU PHE ARG PRO ASN LYS VAL SER VAL LEU ASP THR TYR GLN TYR ASP ASP GLY CYS GLY ASN CYS GLY ASN ASP SER PHE SER ARG GLU PRO ALA VAL VAL LYS PHE SER SER HIS SER THR LYS VAL LYS GLU PHE ALA ILE VAL ALA LEU HIS SER ALA PRO SER ASP ALA VAL ALA GLU ILE ASN SER LEU TYR ASP VAL TYR LEU ASP VAL GLN GLN LYS TRP HIS LEU ASN ASP VAL MET LEU MET GLY ASP PHE ASN ALA ASP CYS SER TYR VAL THR SER SER GLN TRP SER SER ILE ARG LEU ARG THR SER SER THR PHE GLN TRP LEU ILE PRO ASP SER ALA ASP THR THR ALA THR SER THR ASN CYS ALA TYR ASP ARG ILE VAL VAL ALA GLY SER LEU LEU GLN SER SER VAL VAL PRO GLY SER ALA ALA PRO PHE ASP PHE GLN ALA ALA TYR GLY LEU SER ASN GLU MET ALA LEU ALA ILE SER ASP HIS TYR PRO VAL GLU VAL THR LEU THR

A 373 D D D D D D D D D 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260 260

10 D 11 D 12 D 13 D 14 D 15 D 16 D 17 D 18 D 19 D 20 D

Utilizando el software Rasmol se seleccionan los tres aminocidos aromticos a estudiar. Simultneamente, una vez visualizados estos aminocidos, se puede localizar su posicin en la molcula. A continuacin se exponen unas tablas con los resultados obtenidos.

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Sergi Muoz Martin

Tabla 7. Localizacin de las 22 Fenilalaninas. Aminocido Posicin en la molcula Aminocido Posicin en la molcula Phe B2D Phe B4D Phe 21A Phe 109D Phe 124A Phe 127A Phe 192D Phe 200A Phe 223A Phe 233D Phe 235D Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Phe 266A Phe 6D Phe 11D Phe 31A Phe 90A Phe 116D Phe 128D Phe 169D Phe 255A Phe 262A Phe 352A Externa Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna

Tabla 8. Localizacin de las 32 Tirosinas. Aminocido Posicin en la molcula Aminocido Posicin en la molcula Tyr 1BBA Tyr 19BA Tyr 24D Tyr 32D Tyr 47D Tyr 54D Tyr 69A Tyr 76D Tyr 91A Tyr 95D Tyr 146D Tyr 151D Tyr 166A Tyr 169A Tyr 175D Tyr 211D Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Externa Tyr 239D Tyr 240A Tyr 279A Tyr 362A Tyr 21BA Tyr 53A Tyr 60D Tyr 63D Tyr 65D Tyr 133A Tyr 143A Tyr 253D Tyr 294A Tyr 306A Tyr 337A Externa Externa Externa Externa Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna Interna

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada Tabla 9. Localizacin de los 7 Triptfanos. Aminocido Posicin en la molcula Aminocido Posicin en la molcula Trp 79A Trp 158D Trp 181D Trp 194D Externa Externa Externa Externa Trp B6A Trp 240A Trp 356A Interna Interna Interna

El objetivo de tabular los resultados que nos ofrece la estructura primaria a travs del programa, es visualizar con facilidad que aminocidos se encuentran dentro de la molcula. stos sern los que al aplicar cualquier tipo de desnaturalizacin sufrirn los cambios, permitiendo observar los cambios de absorbancia. En este estudio, por tanto, vase dnde se producirn estos cambios si aplicamos las dos desnaturalizaciones mencionadas a lo largo del captulo en la protena de BSA y en la protena de DNAsa.

En una desnaturalizacin trmica de la protena BSA se observa que los cambios se producen entre un rango de 60 a 90C en todas las regiones espectrales. Se destaca que, en la regin de la Tirosina hay un cambio significativo a 80C de 261 a 273 nm. En una desnaturalizacin por medio cido-bsico de la protena BSA se observa que los cambios se producen entre los pH 5-6 y 9-11 en las tres diferentes regiones espectrales. En una desnaturalizacin trmica de la protena DNAsa I, aparece un salto en la regin espectral correspondiente a la Fenilalanina a una temperatura de 35C. Mientras que en las dos regiones restantes, los cambios significativos se producen a 75-80C. En una desnaturalizacin por medio cido-bsico de la protena DNAsa de pncreas bovino, a un ph de 2 y 8 de la regin espectral de la Fenilalanina, sobresalen posibles cambios de los aminocidos a estudiar. Mientras que, a partir de 280 nm, es decir en la regin que corresponde al Triptfano, estos cambios se producen a un pH de 9 y 11.

Inicialmente, antes de desnaturalizar la protena mediante cualquiera de los dos mtodos utilizados, algunos de los aminocidos aromticos se encuentran en el interior de la protena. Estos aminocidos en un espectro realizado tanto a temperatura ambiente como a pH 7, no son apreciados. Al desnaturalizar, estos grupos cambian de posicin y salen hacia el exterior, situndose en un ambiente que les permita no estar apantallados y absorber. Es aqu cuando en el espectro, se observan los cambios de absorbancia, y por eso decimos que la protena se ha desnaturalizado.

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CAPTULO 10: CONCLUSIONES

Una alternativa para el estudio de la estructura de la protena es utilizar la radiacin ultravioleta (UV), donde los cambios de absorbancia de los aminocidos aromticos de la protena provocados por la desnaturalizacin trmica o de pH son detectables. Aunque se utilicen protenas con diferentes propiedades fsicas y qumicas, stas se desnaturalizan cambiando su estructura si se les aplica un cambio de temperatura, de pH, de medio, de luz, presin, etc. En los espectros originales, generalmente, se observa un slo pico de absorcin suave. La aplicacin de la segunda y de la cuarta derivada permite y facilita enormemente observar los picos de absorcin del espectro. Los espectros de las protenas desnaturalizadas permiten observar aminocidos, que anteriormente estaban en el interior de la molcula y que no absorbian por estar apantallados por el resto de aminocidos, que ahora una vez desnaturalizada la protena, salen y absorben, pudiendo ser detectados en el espectro. En las protenas de BSA y DNAsa ocurre lo que anteriormente se ha dicho. Grupos aromticos que inicialmente estn en el interior de la protena salen al exterior cambiando de posicin cuando se desnaturaliza trmicamente o por medio cido-base. En el caso de la desnaturalizacin trmica de la BSA se observan alteraciones a 60 y a 80 C, en cambio en la DNAsa las variaciones ya se percibien de los 30 hasta los 80 C, es cuando a partir de esta temperatura la protena est completamente desnaturalizada. Para la desnaturalizacin por medio cido-base de la BSA se manifiestan cambios en la zona cida a un pH de 5 y en la zona bsica a 9. En cambio, para la protena de DNAsa los cambios se observan en la zona cida a pH 3, pero en sin embargo en la zona bsica esta protena es estable observando muy pequeas variaciones en un pH de 8.
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CAPTULO 11: EVALUACIN ECONMICA

Para realizar la evaluacin econmica de este proyecto se han tenido en cuenta los gatos correspondientes a:

Costes de material y energa. Costes de personal Amortizaciones

11.1.

Costes de material y energa

Para calcular los costes de este apartado se han tenido la cuenta los materiales y productos utilizados y la electricidad. Empezaremos detallando la parte de material y productos. El precio tanto de material como producto se ha obtenido multiplicando el precio unitario por la cantidad que se necesita y sumndole un IVA del 7%.
Tabla 10. Precio productos. Cantidad (G) Albmina de suero bovino Desoxirribonucleasa I de pncreas bovino 20 0,1 Precio envase 60,24 88,30 Total () Total () 60,24 88,30 148,54

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Sergi Muoz Martin Tabla 11.Material Cantidad Puntas micropipeta Gradilla para puntas Tubos de centrfuga Vasos de precipitados Pera Pipetas Pasteur 100 1 5 3 1 50 Precio () 11,00 29,60 27,00 6,00 6,00 13,20 IVA 7% () 0,77 2,07 1,89 1,26 0,42 0,92 Total () Total () 11,77 31,67 28,89 19,26 6,42 14,12 112,13

A continuacin se detalla la parte de electricidad. Para calcularlo se ha estimado el consumo en el laboratorio. Se han utilizado facturas de luz de la ciudad para el clculo ya que no se conoca el tipo de contratacin que poda tener el laboratorio. Es decir el clculo de la energa es aproximado.
Tabla 12. Costes electricidad Periodo Potencia kW Precio kW (/mes) Consumo (kWh) Precio kWh () Subtotal() 3 4,4 1,581887 180 0,089868 37,0571484

Impuesto Elec. () 1,894619463 Conservacin () IVA 16% () Total 0,81 6,361882858 46,12

11.2.

Costes de personal

Para el clculo de los costes de personal se tiene que tener en cuenta el sueldo bruto anual de cada trabajador as como las horas trabajadas. Mediante la siguiente formula se han calculado los costes.

SBA+SS aopersona Coste Personal()=RH(horapersona) N horas trabajadas ao

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada Tabla 13.Costes Personal Cuota SS () 4800 Horas trabajadas 170 Horas trabajadas anuales 1760 Total ()

Trabajadores Tcnico Laboratorio

n trab. SBA () 1 15000

Total () 1912,50 1912,50

11.3.

Costes amortizaciones

Para el clculo de las amortizaciones hay que tener en cuenta el coste inicial de los aparatos adems de la vida til de estos. Mediante la siguiente formula se obtienen los costes para la amortizacin de nuestro proyecto.

Cuota cuadrimestral=

Valor Amortitzable() 2Tiempo Vida til (aos)

Tabla 14.Costes amortizaciones Precio () Espectrofotmetro 15000,00 pH-metro Agitador Magntico Autoclave Peltiers Micropipeta Cubetas de cuarzo Pipeta aforada 10 mL 600,00 200,00 4500,00 6000,00 221,70 83,70 38,10 IVA 7% () 1050,00 42,00 14,00 315,00 420,00 15,52 5,86 2,67 Precio total () 16050,00 642,00 214,00 4815,00 6420,00 237,22 89,56 40,77 Tiempo vida til 15 10 10 10 15 4 5 4 Cuota Anual () 1070,00 64,20 21,40 481,50 428,00 59,30 17,91 10,20 Total () Cuota cuatrimestral () 535,00 32,10 10,70 240,25 214,00 29,65 8,96 5,10 1075,76

El coste del proyecto es la suma de los costes de las anteriores partes, que queda resumido en la siguiente tabla:

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Sergi Muoz Martin Tabla 15.Costes totales del proyecto Coste () Productos Material Luz Personal Amortizaciones Total 148,54 112,13 46,12 1912,50 1075,76 3295,05

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CAPTULO 12: BIBLIOGRAFA

12.1. Referencias bibliogrficas


[1] Albert L.Lehninger. Bioqumica.Las Bases moleculares de la estructura y Funcion Celular. Ediciones Omega,S.A. Barcelona [2] Juli Peret,Ramon Sendra, Merc Pamblanco, Carme Ba. Fonaments de Bioqumica. Educaci Material. Universitat de Valencia 2005. [3] Donald Voet, Judith.G.Voet. Biochemistry. Ediciones Omega,S.A. [4] X Fuentes Arderiu, M. J. Castieiras Lacambra, J. M. Queralt Compa. Bioqumica Clnica y Patologa Molecular: Volumen 1. Reverte. 1998. [5] Robert Thornton Morrison, Robert Neilson Boyd. Qumica Orgnica. Pearson Educacin. 1998. [6] Douglas A. Skoog, Donald M. West. Fundamentos de qumica analtica. Cengage Learning Editores. 2005. [7] Gregory A Petsko,Dagmar Ringe. Protein Structure and Function. Published by New Science Press Ltd,2004. [8] Carlos Gmez, Moreno Calera. Estructura de Protenas. Editorial Ariel,2003. [9] Rodney F. Boyer. Modern Experimental Biochemistry. Addison-Wesley Publishing Company [10] Colin Ratledge, Bjrn Kristiansen. Basic Biotechnology. Cambridge University Press. [11] Laura H.Lucas, Baran A.Ersoy, Lisa A.Kueltzo, Sangeeta B.Joshi, Duane T. Brandau, Nagarajan Thyagarajapuram, Laura J.Peek, C.Russell Middaugh. Probing protein structure and dynamics by second-derivative ultraviolet absorption analysis of cation interactions. Protein Science (2006). Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press. [12] Reinhard Lange, Claude Balny. UV-visible spectroscopy under high pressure. Elseiver Science B.V. 2002.

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Sergi Muoz Martin

12.2.

Bibliografa de Consulta

[1] Gerardo Turcatti, Sannah Zoffmann, John A. Lowe III, Susan E. Drozda, Grard Chassing, Thue W. Schwartz, Andr Chollet. Characterization of Non-peptide Antagonist and Peptide Agonist Binding Sites of the NK1 Receptor with Fluorescent Ligands. The Journal of Biological Chemistry. 1997. [2] Hans Binder. Gran Lindblom. A Molecular View on the Interaction of the Trojan Peptide Penetratin with the Polar Interface of Lipid Bilayers. Biophysical Journal. 2004. [3] JoAnne McLaurin and Avijit Chakrabarttty. Characterization of the interactions of Alzheimer amyloid peptides with phospholipid membranes. Eur. J. Biochem. 1997. [4] Charalambos Fotakis, Dionisios Christodouleas, Petros Chatzigeorgiou, Maria Zervou,NikolasPloutarch Benetis, Kyriakos Viras, Thomas Mavromoustakos. Development of a CP 31 P NMR Broadline Simulation Methodology for Studying the Interactions of Antihypertensive AT1 Antagonist Losartan with Phospholipid Bilayers. Biophysical Journal. 2009. [5] Erik G. Brandt, Olle Edholm. Dynamic Structure Factors from Lipid Membrane Molecular Dynamics Simulations. Biophysical Journal. 2009. [6] Tae Ho Yoon, In Ho Kim. Phosphatidylcholine isolation from egg yolk phospholipids by highperformance liquid chromatography. Elsevier. Journal of Chromatography. 2002. [7] Burcu Meryem Aydn, Murat Acar, Mustafa Ark, Yavuz Onganer. The fluorescence resonance energy transfer between dye compounds in micellar media. Elsevier. 2009. [8] Jeremy P. Bradshaw, Sarah M. A. Davies,Thomas Hauss. Interaction of Substance P with Phospholipid Bilayers: A Neutron Diffraction Study. Biophysical Journal. 1996. [9] Martina Dyck, Andreas Kerth, Alfred Blume, Mathias Lsche. Interaction of the Neurotransmitter, Neuropeptide Y, with Phospholipid Membranes: Infrared Spectroscopic Characterization at the Air/Water Interface. The Journal of physical chemistry. 2009. [10] Troy Wymore, Tuck C. Wong. Molecular Dynamics Study of Substance P Peptides in a Biphasic Membrane Mimic. Biophysical Journal. 1999. [11] Lingang Zhang, Jichun Hu, Zuhong Lu. Preparation of Liposomes with a Controlled Assembly Procedure. Journal Of Colloid and Interface Science. 1997 [12] Indu R. Chandrashekar, Sudha M. Cowsik. Three-Dimensional Structure of the Mammalian Tachykinin Peptide Neurokinin A Bound to Lipid Micelles. Biophysical Journal. 2003. [13] Keniry Carver y 2002, Adams et al. 2004. [14] Yuan et al. 2003. [15] Zhang y Smith 1993; Yan et al. 2004. [16] Yu et al. 2004. [17] Lakowicz et al. 1983; Fasano et al. 2003; Ruiz et al. 2003. [18] Donovan 1969; Wetzel et al. 1980. [19] Giese y francs en 1955; Grum et al. 1972. [20] Ichikawa y Terada 1977; Balestrieri et al. 1978; Levine y Feferici 1982; Kueltzo et al. 2003. [21] Ichikawa y Terada 1977, 1979; Balestrieri et al. 1978, 1980, Levine y Federici 1982. [22] Solli y Herskovits 1973; Ichikawa y Terada, 1979; Mach et al. 1991; Mach y Middaugh 1994. [23] Kueltzo et al. 2003.

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Estudio y funcin de protenas receptoras de membrana: espectroscopia ultravioleta derivada


http://www.bio.puc.cl (Consultada en 10/04/2009) http://www.expasy.com (Consultada en 15/05/2009) http://www.geocities.com/ceniuschile/aminacid.gif (Consultada en 01/06/2009) http://www.google.es (Consultada en 2009) http://www.medmol.es (Consultada en 10/05/2009) http://www.openrasmol.org/ (Consultada en 04/06/2009) http://www.panreac.es (Consultada en 01/06/2009) http://www.pdb.org (Consultada en 2009) http://www.scirus.com (Consultada en 2009) http://www.sigmaaldrich.com (Consultada en 10/05/2009) http://www.thermo.com/com/cda/product/detail/1,,10122916,00.html (Consultada en 10/06/2009) http://www.thermo.com/uv-vis (Consultada en 12/06/2009) http://www.unizar.es/guiar/1/Accident/An_riesgo/FrasesR.htm (Consultada en 18/05/2009) http://www.wikipedia.es (Consultada en 2009) http://www.winklerltda.com (Consultada en 11/05/2009)

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