Você está na página 1de 4

4.4. Anlise do potencial antioxidante in vitro - reduo do radical DPPH 4.4.1.

- Determinao quantitativa A avaliao da atividade antioxidante in vitro ser feita atravs da capacidade dos volteis, extratos e fraes de descorar solues diludas do radical 2,2-difenil-1picril hidrazila -DPPH- conforme orientaes de Tepe, et al. 2005. A quantificao da descolorao ser obtida mediante leitura em ultravioleta em 517 nm, sempre fazendo tambm uma comparao com padres (controle positivo). Inicialmente, ser preparada 50 mL de uma soluo estoque de DPPH em etanol na concentrao de 40 g.mL-1 e mantida sob refrigerao e protegida da luz. Em seguida sero feitas diluies para 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 e 1 g.mL-1, a partir desta soluo estoque, para a construo da curva de calibrao. A curva ser construda a partir dos valores da absorbncia da radiao UV (517 nm) medidas em cubetas de quartzo com percurso ptico de 1 cm e tendo como branco o etanol. Aps obteno dos valores de absorbncia, ser determinado, atravs de regresso linear no programa Microcal Origin 7.0, a equao da curva de calibrao (Sanchez-Moreno, et al., 1998). 4.4.1.1- Leitura das medidas de absorbncia nas amostras Ser preparada uma soluo estoque (250 g.mL-1) dos extratos, fraes e dos leos essenciais e sero realizadas diluies para obteno de concentraes finais de 200, 150, 100, 50 e 25 g.mL-1. Da mesma forma, sero preparadas a partir de uma soluo estoque (250 g.mL-1) dos controles positivos, quercetina, rutina, cido glico, solues diluda nas concentraes de 200, 150, 100, 50 e 25 g.mL-1. As medidas das absorbncias das misturas reacionais (0,3 mL da soluo da amostra ou do controle positivo e 2,7 mL da soluo estoque de DPPH na concentrao de 40 g.mL-1), sero feitas a 517 nm, no primeiro, quinto e dcimo minutos, e aps esse perodo a cada 10 minutos at completar 1h para as fraes e 30 minutos para os volteis. A mistura de EtOH (2,7 mL) e amostra (0,3 mL) ser utilizada como branco. A partir da equao da curva de calibrao e dos valores de absorbncia no tempo de 30 minutos, para cada concentrao testada, sero determinados os percentuais de DPPH remanescentes (% DPPHREM), conforme a equao a seguir: (Sanchez-Moreno, et al., 1998; Espn, et al., 2000; Soler-Rivas, et al., 2000).

%DPPHREM = {[DPPH]T=t / [DPPH]T=0} x 100

onde:

[DPPHT=t = corresponde a concentrao de DPPH no meio, aps a reao com o extrato; [DPPHT=0 = concentrao inicial de DPPH, ou seja, 40 g.mL-1 (100 mol.mL-1). A concentrao eficiente, quantidade de antioxidante necessria para decrescer a concentrao inicial de DPPH em 50% (CE50), ser determinada usando os programas Excel e Microcal Origin 7.0, a partir de uma curva exponencial de primeira ordem, obtida plotando na abscissa as concentraes da amostra (g.mL-1) ou do controle positivo e na ordenada, a porcentagem remanescente de DPPH (%DPPHREM), conforme Sanchez-Moreno, et al., 1998 e Molyneux, 2004. Os valores de absorbncia nas concentraes de 250, 200, 150, 100, 50 e 25 g.mL-1, no tempo de 30 min sero tambm convertidos em porcentagem de atividade antioxidante (AA%), e ser determinado pela seguinte equao (Tepe, et al., 2005; Huang, et al., 2003). %AA= {[Abscontrole(AbsamostraAbsbranco)]x100}/Abscontrole, onde Abscontrole a absorbncia inicial da soluo etanlica de DPPH e Absamostra a absorbncia da mistura reacional (DPPH+amostra).

4.5. Avaliao da capacidade de varredura do radical ABTS. A avaliao da atividade antioxidante ser realizada de acordo com Re et al., 1999) O radical ABTS ser preparado a partir da reao de 5 mL da soluo estoque de ABTS (7 mM) com 88 L da soluo de persulfato de potssio (140 mM). Manter a mistura, temperatura ambiente, por 16 horas. Em seguida dilui-se 1 mL desta mistura em etanol at obter uma absorbncia de 0,70 0,05 nm a 734 nm. Preparar e usar apenas no dia da anlise. 4.5.1. Preparao e determinao da curva-padro do Trolox A partir de uma soluo padro de trolox (2000 M), preparar solues nas concentraes de 100, 500, 1000, 1500 M. Em ambiente escuro transferir uma alquota de 30 L de cada soluo de trolox para tubos de ensaio, misturar com 3,0 mL da soluo do radical ABTS e homogeneizar. Realizar a leitura (734 nm) aps 6 minutos da mistura e utilizar etanol como branco para calibrar o espectrofotmetro.

Plotar as concentraes de trolox (M) no eixo X e as respectivas absorbncias no eixo Y e calcular a equao da reta. A partir da equao da reta, calcula-se a absorbncia referente a 1000 M de trolox de acordo com a equao: y = ax + b 4.5.2. Avaliao da amostra frente ao radical ABTS Preparar a amostra na concentrao de 500 mg/L e concentraes de 375, 250, 125, e 62,5 mg/L. Colocar em tubos de ensaio (em triplicata) 40 L da amostra e 1960 L da soluo de ABTS e fazer a leitura nos tempos de 1, 4, 6, 15, 20 e 30 minutos a 734 nm. Os resultados sero expressos em Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC). Os resultados sero expressos em mM de trolox por grama de amostra. diluir para as

4.6. Determinao do Teor de Fenlicos Totais O contedo de fenis totais (FT) nas amostras sero determinados pelo mtodo de Folin-Ciocalteau com modificaes (Bonolia et al., 2004;Bonolib et al., 2004; Folin e Ciocalteau, 1927). Pesa-se 10 mg da amostra e dissolve em 10 mL de MeOH (1 mg/mL). Uma alquota de 100 L deve ser transferida para bales volumtricos (3) de 10 mL e adiciona-se 500 L do regente de Folin-Ciocalteau, 5 mL de gua destilada e agita-se por 1 minuto. Em seguida, adiciona-se 2 mL de Na2CO3 15% e agita-se por 30 segundos. Completa-se o volume dos bales volumtricos com gua destilada. Prepara-se um branco concomitantemente. As absorbncias das amostras sero medidas aps 2 horas de reao, no comprimento de onda (mx) 757 nm. Os teores de fenis (FT) sero determinados usando curva padro de cido glico e os valores sero expressos em equivalente de cido glico por grama de amostra (MG de EAG/g de amostra). Todas as anlises sero realizadas em triplicatas replicatas (n=3).

4.7. Determinao do Teor de Flavonides Totais O teor de flavonides totais (FLAT) nas amostras foi determinado por espectrofotometria de absoro molecular utilizando soluo metanlico de AlCl3 com modificaes (Markham, 1982). Pesa-se 10 mg da amostra e dissolve em 10 mL de MeOH (1 mg/mL). Uma alquota de 300 L da amostra deve transferida para bales volumtricos de 10 mL,

adiciona-se 240 L de cido actico glacial, 4 mL de piridina (20%), 1 mL de AlCl3 (50mg/ml), completa-se o volume do balo volumtrico com gua destilada. Realizouse o branco em paralelo. As medidas de absorbncias sero medidas aps 30 minutos de reao, no comprimento de onda (mx) 420 nm. Os teores de flavonides totais (FLAT) sero determinados usando uma curva analtica de rutina e os valores foram expressos em equivalentes de rutina por grama de amostra (mg de ER/g de amostra)