MAKALAH MIKROBIOLOGI AGROINDUSTRI PRODUKSI ENZIM PROTEASE DARI JAMUR RHIZOPUS OLIGOSPORUS

Disusun oleh: Nama NIM : Qoriatul Arbaiyah Alimusa : 11627

JURUSAN MIKROBIOLOGI PERTANIAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2012

PROTEASE RHIZOPUS OLIGOSPORUS I. PENDAHULUAN

A. Latar belakang Jamur merupakan mikrobia multiseluler yg dimanfaatkan manusia dalam fermentasi maupun budidaya. Dalam bidang fermentasi umumnya jamur yang digunakan dalam bentuk hifa.Contoh pd pembuatan tempe, angkak dan kecap. Yg dibudi dayakan untuk diambil badan buahnya dikenal sebagai cendawan, misal jamur tiram, jamur merang, jamr kuping. Macammacam produk industri dalam bidang pertanian seperti, bahan yang dapat dimakan langsung : tempe dan kecap dan lain-lain. Bahan obat-obatan : pembuatan antibiotik (penicilin) Tetrasiklin dihasilkan oleh jamur Streptomycin dan sefalosporin dihasilkan oleh jamur cephalosporium. Bahan kimia untuk keamanan lingkungan : produksi enzim (protein pada jamur). Dewasa ini industri enzim telah berkembang pesat dan menempati posisi penting dalam bidang industri. Kesadaran masyarakat terhadap masalah lingkungan yang semakin tinggi serta adanya tekanan dari para ahli dan pecinta lingkungan menjadikan teknologi enzim sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan berbagai proses kimiawi dalam bidang industri (Falch 1991). Enzim merupakan katalisator pilihan yang diharapkan dapat mengurangi dampak pencemaran dan pemborosan energi karena reaksinya tidak membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, dan tidak beracun (Aunstrup et al. 1979). Protease merupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena aplikasinya yang sangat luas. Industri pengguna protease di antaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil, makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu, farmasi, makanan, bir, film, dan limbah (Moon dan Parulekar 1993). Oleh karena itu, tidak mengherankan apabila protease yang digunakan mencapai 60% dari total enzim yang diperjualbelikan di seluruh dunia (Ward 1985). B. Tujuan Mengetahui produksi protease oleh Rhizopus oligosporus.

II. ISI
A. Rhizopus oligosporus dan protease

Rhizopus oligosporus merupakan kapang dari filum Zygomycota yang banyak menghasilkan enzim protease. sering R.oligosporus dimanfaatkan banyak dalam ditemui di tanah, buah, dan sayuran yang membusuk, serta roti yang sudah lama. R.oligosporus termasuk dalam Zygomycota yang pembuatantempe dari proses fermentasi kacang kedelai, karena R.oligosporus yang menghasilkan enzim fitase yang memecah fitat membuat komponen makro pada kedelai dipecah menjadi komponenmikro sehingga tempe lebih mudah dicerna dan zat gizinya lebih mudah terserap tubuh Fungi ini juga dapat memfermentasi substrat lain, memproduksi enzim, dan mengolah limbah. Salah satu enzim yang diproduksi tersebut adalah dari golongan protease. Beberapa manfaat dari R.oligosporus antara lain meliputi aktivitas

enzimatiknya, kemampuan menghasilkan antibiotik alami yang secara khusus dapat melawan bakteri gram positif, biosintesa vitamin-vitamin B, kebutuhannya akan senyawa sumber karbon dan nitrogen, perkecambahan spora, dan penetrisi miselia jamur tempe ke dalam jaringan biji kedelai.

Adapun klasifikasi ilmiahnya adalah sebagai berikut : Kerajaan Divisi : Kelas : Ordo : Famili : Genus : Spesies : Fungi Zygomycota Zygomycetes Mucorales Mucoraceae Rhizopus R. oligosporus

Nama binomial : Rhizopus oligosporus (Saito)

R. oligosporus mempunyai koloni abu-abu kecoklatan dengan tinggi 1 mm atau lebih. Sporangiofor tunggal atau dalam kelompok dengan dinding halus atau agak sedikit kasar, dengan panjang lebih dari 1000 mikro meter dan diameter 10-18 mikro meter. Sporangia globosa yang pada saat masak berwarna hitam kecoklatan, dengan diameter 100-180 mikro meter. Klamidospora banyak, tunggal atau rantaian pendek, tidak berwarna, dengan berisigranula, terbentuk pada hifa, sporangiofor dan sporangia. Bentuk klamidospora globosa, elip atau silindris dengan ukuran 7-30 mikro meter atau 12-45 mikro meter x 7-35 mikro meter. Protease (peptidase atau proteinase) merupakan enzim golongan hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yanglebih sederhana, seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi hidrolisis pada ikatan peptida. Enzim ini diperlukan oleh semua makhluk hidup karena bersifat esensial dalam metabolisme protein. Peranannya dalam tubuh antara lain membantu pencernaan protein dalam makanan, menggunakan kembali proteinprotein intraseluler, koagulasi sel darah, dan akivasi berbagai jenis protein, enzim, hormon, serta neurotransmiter. Terdapat enam jenis aktivitas katalitik spesifik dari enzim peptidase, yaitu serin, treonin, sistein, aspartat, glutamat, dan metalo peptidase. Peptidase merupakan salah satu jenis enzim yang banyak digunakan dalam berbagai jenis industri, seperti roti, daging, tekstil, detergen, dan keju. Rennet merupakan enzim golongan peptidase yang digunakan dalam mengkoagulasikan protein susu dalam pembuatan keju. Jenis peptidase lain, seperti papain dan bromelain, banyak digunakan dalam mengempukkan tekstur daging. Peptidase juga dapat diaplikasikan dalam industri tekstil untuk membuat benang yang berkualitas baik. Ada berbagai teknik yang dapat digunakan untuk memproduksi enzim ini, yaitu dengan teknik sel bebas (misalnya dengan kultur terendam) ataupun dengan teknik sel imobil, yaitu dengan memerangkap sel dalam suatu membran atau matriks. Contoh bahan matriks yang dapat digunakan yaitu alginat dan nitroselulosa. Imobilisasi sel memiliki beberapa kelebihan dibanding teknik sel bebas dan sudah merupakan salah satu teknik yang umum digunakan untuk meningkatkan konsentrasi dan produktivitas sel. Enzim untuk proses lisis (enzim lisis) bekerja pada kelompok kimia khusus, misal, enzim glikosidase pada glikosida, pepsin serta tripsin pada ikatan peptida, dan esterase pada senyawa-senyawa ester. Berbagai substrat peptida yang berbeda dapat diserang oleh hanya satu enzim sehingga mengurangi jumlah enzim pencernaan yang seharusnya diperlukan. Enzim protease dapat pula mengatalisis proses hidrolisis senyawa ester. Penggunaan ester sebagai

substrat untuk sintesis telah mempermudah penelitian terhadap mekanisme kerja enzim protease. Enzim-enzim lisis tertentu memperlihatkan spesifisitas yang lebih tinggi. Jumlah enzim yang kecil di dalam sel mempersulit pengukuran kadarnya di dalam ekstrak jaringan atau cairan. Untungnya, aktivitas katalitis yang dimiliki enzim dapat menjadi sarana pemeriksaan yang sensitive dan spesifik bagi pengukuran kadar enzim itu sendiri. Kemampuan mengatalitis transformasi ribuan, puluhan ribu, atau bahkan lebih molekul substat menjadi produk dalam periode waktu yang singkat memberikan kepada setiap molekul enzim kemampuan untuk secara kimiawi menguatkan keberadaannya. Untuk mengukur kadar enzim di dalam sebuah sampel ekstrak jaringan atau cairan biologik lain, kecepatan reaksi yang dikatalitis oleh enzim dalam sampel tersebut harus ditentukan. Dalam kondisi yang tepat, hasil pengukuran kecepatan reaksi harus sebanding dengan jumlah enzim yang ada. Karena jumlah molekul atau massa enzim yang ada sukar ditentukan, hasil pengukuran tersebut dinyatakan dalam unit enzim.. Jumlah relatif enzim dalam berbagai ekstrak kemudian dapat dibandingkan. International Union of Biocemistry mengartikan satu unit aktivitas enzim sebagai 1 mikromol (1 mol; 10-6) substrat yang bereaksi atau produk yang ditransformasikan per menit. Setelah diketahui adanya aktivitas enzim didalam sampel yang akan diujikan maka dilakukan : 1. Purifikasi Pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstra sel Mentah (crude) yang mengandung banyak komponen lain. Molekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat dialysis atau filtrasi gel, asam nukleat melalui pngendapan dengan antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Permaslahannya adalah memisahkan enzim yang kita kehendaki dari ratusan protein yang mempunyai stuktur kimia dan fisika yang seupa. Perjalanan suatu pemurnian tipikal dan enzim hati dengan pemulihan yang baik serta pemurnian keseluruhan yang besarnya mencapai 490 kali lipat. Porosdur pemurnian klasik yang bermanfaat adalah pengendapan dengan berbagai konsentrasi garam (umumnya garam ammonium atau natrium sulfat) atau pelarut (aseton atau etanol), pemanasan diferensial atau denaturasi PH Diferensil, sentifugasi diferensial, filtrasi gel, dan elektroferosis. Adsopsi selektif dan elusi protein dari zat penukar anio selulosa, yaitu deitilaminoetil (DEAE) selulosa dan zat penukar anion selulosa, yaitu karboksimetil selulosa (CMC,

carbokxymethylcellulose) juga telah memberikan hasil yang sangat baik bagi pemurnian protein secara cepat dalam jumlah besar. Pemisahan protein dapat pula dilakukan pada baha berpori yang dikenal sebagai ayakan molecular.. Kalau campuran protein dialirkan lewat kolom yang mengandung ayakan molecular, protein yang berukuran kecil akan tersebar baik di dalam ruang antar partikel maupun di dalam ruang internal atau pori-pori penyangga. Ketika campuran protein dengan ukuran yang berbeda-beda mengalir lewat kolom, mobilitas protein yang berukuran kecil akan terhambat, relatif terhadap protein yang ukurannya terlalu besar untuk masuk ke dalam pori- poi ini. Dengan demikian,protein berukuran besar akan muncul dari dalam kolom sebelum protein yang berukuran kecil. Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas adalah kemampuannya untuk secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering, sejumlah kecil protein tertentu, dari campuran protein yang kompleks. Teknik ini menggunakan suatu ligand tak bergerak yang mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang ingin dimurnikan. Kalau campuran protein tersebut dipanjankan pada ligand tersebut. Protein yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein yang di kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai cairan elusi yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan konsentrasi tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan pemakaian sejumlah teknik klasik secara berturutan Ligand yang di suka adalah substrat serta derivat koenzim atau zat perwarna organic yang bertindak sebagai nukleotida atau analog koenzim yang berikatan secara kovalen dengan sebuah penyangga inert (misal, NAD-Spandex, Blue Sepharose). Ligand ini secara khas berikatan dengan penyangga lewat molekul penghubung.Yang mempunyai panjang tiga hingga delapan atom karbon. Pada kromatografi yang bersifat hidrofobik, hidrokarbon, alkil atau aril akan terikat ke penyangga seperti sephadex. Retensi protein pada penyangga ini melibatkan interaksi hidrofobik antara rantai alkil dan regio hidrofobik pada protein tersebut. Protein kemudian di masukan ke dalam larutan yang menggandung garam dengan konsentrasi tinggi (misal, [NH4]2SO4) dan dielusikan dengan garam yang sama yang memiliki gradien menurun.

B. Produksi enzim protease oleh Rhizopus oligosporus

Isolasi Enzim Protease (tempe, roti yang sudah lama, sayur/buah yang membusuk atau tanah) yang didalamnya telah terkandung sumber inokulum terkandung jamur Rhizopus oligosporus
PURIFIKASI BERTINGKAT (PENGENDAPAN) DIALISIS ENZIM

Adapun tahapan-tahapannya agar mendapat enzim protease murni adalah : 1. Isolasi a. Kedelai atau tempe, roti yang sudah lama, sayur/buah yang membusuk atau tanah yang didalamnya telah terkandung sumber inokulum terkandung jamur Rhizopus oligosporus sebanyak 2 gram digunting kecil-kecil kemudian digerus dengan mortal dingin (pemecahan secara mekanik) sambil ditambahkan dengan PBST-PMSF 5x V (pemecahan secara kimiawi). b. Kemudian dimasukan kedalam pipa polipropilen, dan di vorteks selama 10 menit, lalu disonifikasi (dengan gel ultrasonik) selama 10 menit dan kemudian di sentrifugal pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. c. Pisahkan antara supernatan dan pelatnya d. Ambil supernatannya kemudian ditambahkan dengan etanol absolut dingin dengan perbandingan 1:1 untuk pencucian, setelah itu di inkubasi dalam refrigerator selama 1 jam pada suhu 40C untuk pemisahan etanol dan proteinnya. e. Sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 10.000 rpm. f. Ambil endapan dan keringkan hingga bau etanol hilang, dan ditambahkan buffer tris CL 20 mM untuk penyangga agar protein tetap pada kondisi tersebut. Maka akan didapatkan ekstrak enzim kasar 2. Purifikasi (bertingkat) yakni :

Pengendapan dengan amonium sulfat 0-20% a. 10 ml ekstrak enzim kasar dimasukan kedalam beaker glass dengan penambahan 1,14 gr amonium sulfat secara perlahan dan kemudia distirer. b. Kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu 40C c. Setelah itu sentrifugal selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, semua pekejaan ini dilakukan dalam suasana dingin. d. Kemudian didapatkan endapan pelat 20% dan supernatan I e. Supernatan 1 digunakan untuk pengendapan Amonium sulfat 40%

Pengendapan dengan amonium sulfat 20-40% a. Superbatan I 10 ml dimasukan kedalam beaker glass dengan menambahkan 1,23 gr amonium sulfat secara perlahan-lahan kemudian di stirer
b.

Diamkan selama 30 menit pada suhu 40C Kemudia selama 10 menit di sentrifuse dengan kecepatan 10000 Didapatkan Supernatan II dan endapan pelet 40%

c. d.

rpm, semua perlakuaan dilakukan dalam suasana dingin. Pengendapan dengan amonium sulfat 40-60% a. Supernatan II sebanyak 10 ml dimasukan kedalam beaker glass

dengan menambahkan 1,32 gr amonium sulfat secara perlahan-lahan dan kemudian distirer.
b.

Diamkan selama 30 menit dengan suhu 40C kemudian sentrifus Maka akan didapat supernatan IV dan endapan pelet 60%

selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm c. 3. Dialisis enzim a. b. Sebanyak 6 ml fraksi I dan fraksi II, kemudian 2 ml fraksi III Masing-masing fraksi dilarutkan kedalam bufer 0,2 M dengan pH 8

kemudian masukan kedalam kantong selofan

c. d.

Kemudian untuk larutan dialisis dengan menggunakan bufer fosfat 0,05 Kemudian masukan kantong selofan yang telah berisi fraksi tadi

M dengan pH 8. kedalam larutan dialisis, usahakan agar kantong selalu mengambang didalam larutan dialisis. Biarkan selama semalam pada kondisi dingin. e. Fraksi dan bufer fosfat yang telah dimasukan kedalam kantong selofan pad f1 dibagi menjadi A:7ml, B:5,5 ml C:7ml dan D:7ml karena endapan terlalu kental dan banyak, f2:4,8 ml dan f3: 2,5 ml f. g. h. i. j. k. Bufer fosfat dalam kantong selofan ditambahkan dengan etanol absolute Inkubasi dalam refrigerator selama 1 jam atau sampai endapan terlihat Sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm, kemudian akan Supernatannya dibuang Pelet dikeringkan dan ditambahkan dengan bufer tris-Cl 1;1 kemudian Maka akan dihasilkan enzim murni. dingin dengan perbandingan 1:1 dan diinsersi

didapatkan pelet dan supernatan

simpan pada suhu -200C

Setelah dilakukan proses atau tahapan diatas, maka dihasilkan enzim protease murni yang siap digunakan. Biasanya siap digunakan sebagai bahan baku Industri seperti industri deterjen, kulit, tekstil, makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu, farmasi, makanan, bir, film, dan limbah (Moon dan Parulekar 1993). Oleh karena itu, tidak mengherankan apabila protease yang digunakan mencapai 60% dari total enzim yang diperjualbelikan di seluruh dunia (Ward 1985).

III. PENUTUP Produksi enzim protease akir-akhir ini merupakan salah satu produksi enzim yang vital. Protease merupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena aplikasinya yang sangat luas. Industri pengguna protease di antaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil, makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu, farmasi, makanan, bir, film, dan limbah. Oleh karena itu, tidak mengherankan apabila protease yang digunakan mencapai 60% dari total enzim yang diperjualbelikan di seluruh dunia selain itu penggunaan enzim pada industri juga

diharapkan dapat mengurangi dampak pencemaran dan pemborosan energi karena reaksinya tidak membutuhkan energi tinggi, bersifat spesifik, dan tidak beracun.