Contraste de fases | Contraste de fases

PALABRAS CLAVE: imagen de clulas vivas, contraste, ndice de refraccin, DIC, contraste de fases apodizado, contraste de modulacin Hoffman DEFINICION: La microscopia de contraste de fases es una tcnica ptica que explota los cambios en el ndice de refraccin para producir imgenes de alto contraste de especimenes transparentes. TECNOLOGA: En las imgenes de contraste, los pequeos cambios en la longitud del camino ptico (conforme la luz se mueve a travs de materiales diferentes de diferentes ndices de refraccin, por ejemplo, agua, componentes celulares) son trasladados pticamente dentro de los cambios correspondientes en la intensidad de la luz, los cuales pueden ser observados como diferencias en los contrastes de la imagen. La luz desde una lmpara de halgeno-tungsteno es dirigida a travs de un lente colector y enfocada en anillos especializados posicionado en el condensador. Los frentes de onda pasando a travs del anillo iluminan al espcimen y pasan directamente a travs de estos o son difractados y retardados por los gradientes de fase en el espcimen. La luz sin desviar y difracta colectada por el objetivo es separada por un plato de fases y enfocada en el plano intermedio de la imagen para formar la imagen final. Un desventaja de las imgenes de contraste de fases es la ocurrencia de halos alrededor de las reas de alto desplazamiento de fases. APLICACIONES: La imagen de contraste de fases es aplicable a varios objetos transparentes, como clulas vivas en cultivos, micro-organismo, rebanadas delgadas de tejido, patrones litogrficos, vibras, dispersiones de ltex, fragmentos de vidrio, y partculas subcelulares (incluyendo ncleos y otros organelos) donde la tcnica revela estructuras que no son visibles en campo claro. Una ventaja de la microscopia de contraste de fases es que las clulas vivas pueden ser observadas en detalle sin la necesidad de teirlas o usar fluorforos. IMAGEN: Imagen Ejemplo preferiblemente contrastada con campo claro CONFIGURACIN DEL MICROSCOPIO: La capacidad de contraste de fases se puede agregar a casi cualquier microscopio de campo claro, utilizando los objetivos de contraste de fases especializados que se conformen a los parmetros de longitud de tubo y un condensador que acepte anillos de fase del tamao correcto. Nikon, y los principales fabricantes de microscopios, brindan accesorios de contraste de fases para sus sistemas de investigacin para microscopios biolgicos verticales e invertidos as como para sus microscopios educacionales. SISTEMA RECOMENDADO: Series invertidas Nikon Ti y TE2000 y los microscopios de las series Eclipse-i. La tecnologa original patentada de Nikon de contraste de fases apodizada reduce los efectos de halo en las imgenes de contraste de fases. LIGAS: Contraste de fases: [microscopyu] Configuracin del microscopio para contraste de fases: [microscopyu]

Microscopio de contraste de fase

Hasta mediados del siglo XX un gran nmero de microscopios de luz haban salido al mercado, destacando los microscopios de la firma Carl Zeiss, debido a la colaboracin

entre Ernst Abbe y Zeiss. Esta firma logr la produccin de microscopios de gran calidad, gracias a la aplicacin de la teora de formacin de imgenes de Abbe, diseando por primera vez un microscopio basado en clculos matemticos y conocimientos de ptica geomtrica. No obstante ello, se presentaban problemas muy grandes al tratar de observar muestras transparentes a la luz visible, como es el caso de algunos seres vivos. En el ao 1935, el fsico holands Fritz Zernike desarroll el Microscopio de Contraste de Fase, con lo cual se le otorg el Premio Nobel de Fsica en el ao 1953. Su contribucin consisti al afirmar que la imagen vista bajo un microscopio convencional, es formada por el objetivo del microscopio, y finalmente se observa en el ocular. Si la muestra no absorbe la luz, no habr esencialmente contraste en la imagen visible (ser toda blanca); por ejemplo, la mayora de las clulas vivas absorben poca luz (a excepcin de las clulas rojas de la sangre y los cloroplastos) y por lo tanto, son difciles de visualizar a travs de un microscopio convencional. Por otro lado, aunque las clulas absorben poca luz, tienen diversos espesores y diversos ndices de refraccin en sus partes, lo que conduce a las diferencias de fase de las ondas de luz que pasan a travs de ellas. La fase de un haz de luz es inobservable a la vista (apenas se ve la intensidad, no la fase). Zernike calcul la manera de hacer que las diferencias de fase se observaran en la imagen como en la intensidad, logrando as, visualizar detalles que no eran posibles apreciar en un microscopio convencional. Este tipo de microscopios se utiliza habitualmente para estudiar clulas vivas.

Fig 2.- Fritz Zernike (1888-1966), la ptica de microscopio de contraste de fase y un microscopio moderno de contraste de fase. Se muestra una foto de Fritz Zernike (1888-1966) y el diseo de un microscopio de contraste de fase (Gundlach, 2003; Locquin, M y Langeron, M. 1985).