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Captulo 18

Breve revisin de los marcadores moleculares

Miroslava Rentara Alcntara

Variacin morfolgica y variacin molecular

Hoy en da los bilogos evolutivos usan tanto datos morfolgicos como moleculares para establecer hiptesis de relaciones filogenticas entre organismos, para estimar la variacin dentro de las poblaciones y para probar hiptesis de adaptaciones ecolgicas. Sin embargo, es comn observar incongruencias entre los anlisis basados en datos morfolgicos y los basados en datos moleculares (Hillis y Wiens, 2000), lo que ha originado polmicas respecto a qu tipo de datos pueden proveer de informacin adecuada para sustentar y probar hiptesis evolutivas. El principal argumento en favor de la utilizacin de caracteres moleculares es que son universales. En muchos casos, principalmente cuando se requiere comparar linajes con divergencia temprana, es imposible establecer hiptesis de homologa morfolgica; en cambio, existen genes presentes en todos los genomas celulares como los ribosomales, que pueden proveer de informacin para reconstrucciones filogenticas, donde los caracteres morfolgicos son inaplicables (Avise, 1994). Adems, estudios tericos y empricos han mostrado que en la reconstruccin de filogenias es crucial contar con numerosos caracteres informativos (Hillis et al., 1994) y los estudios tpicos de secuencias nucleotdicas implican varios cientos o miles de caracteres en contraste con los estudios morfolgicos, en los que un anlisis incluye
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raramente ms de cien caracteres (Sanderson y Donoghue, 1989). Los datos moleculares tambin tienen la ventaja de trabajar directamente con la base gentica de la variacin, mientras que la base gentica de la mayora de los caracteres morfolgicos se asume. Asimismo, en el acercamiento molecular los caracteres se pueden seleccionar y definir de una manera relativamente objetiva (Hillis y Wiens, 2000). En los estudios morfolgicos, en cambio, los caracteres deben ser descubiertos y delimitados generalmente sin ningn criterio explcito para la seleccin o la codificacin del carcter, por lo que tienen el potencial de ser arbitrarios. Por ejemplo, los morfologistas no divulgan generalmente sus criterios para incluir o excluir caracteres y cuando se dan los criterios, varan considerablemente entre estudios (Hillis y Wiens, 2000). Sin embargo, tienen la ventaja de permitir un muestreo taxonmico mucho ms cuidadoso que el que se realiza con anlisis moleculares, lo que es importante para las revisiones sistemticas, los estudios de la evolucin del carcter y la valoracin filogentica. Asimismo, los especmenes de museo ofrecen muchos caracteres morfolgicos para una gran cantidad de taxa, mientras que un muestreo de este tipo para un estudio molecular puede ser difcil por el alto costo de la secuenciacin, la necesidad de material relativamente fresco y la inaccesibilidad de las reas donde se distribuyen algunos de ellos (Hillis y Wiens, 2000). La morfologa es tambin la nica manera en que la mayora de los taxa fsiles pueden analizarse filogenticamente y las especies extintas no slo representan una gran proporcin de la biodiversidad de la tierra, sino que tambin pueden ser cruciales para el entendimiento de las relaciones entre los taxas vivos (Smith, 1998). De lo anterior se puede apreciar que tanto los acercamientos moleculares como morfolgicos tienen ventajas y desventajas; que ambos enfoques siguen desempeando un papel crucial en casi todos los grupos de organismos y que hasta nuestros das las especies se describen y se identifican con base en ambas clases de datos.

Marcadores moleculares
Los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos campos de la biologa como evolucin, ecologa, bio-medicina, ciencias forenses y estudios de diversidad. Adems se utilizan para localizar y aislar genes de inters. En la actualidad existen varias tcnicas moleculares que

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nos permiten conocer cmo se encuentran las proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, como con los anlisis de protenas, o de manera directa con estudios de ADN. Los diferentes tipos de marcadores se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci nicos o mltiples y son de tipo dominante o co-dominante (Simpson, 1997). ADN nuclear (nADN) En eucariontes, la mayor parte de la informacin gentica se encuentra contenida en el ncleo de la clula. El nADN se encuentra empaquetado y asociado a protenas histonas, conformando los cromosomas. El nADN contiene regiones nicas de una sola copia y no nicas duplicadas o regiones repetitivas (Stansfield, 1992). Se considera que los organismos diploides tienen dos copias de cada regin gentica (locus) en los pares homlogos de los cromosomas, llamadas alelos, sin tener en cuenta si contienen regiones codificantes (exones) o no codificantes (intrones o regiones intergnicas). ADN de cloroplasto (clADN) En los organismos fotosintticos con cloroplastos existe un ADN tpicamente bacteriano circular, de 120 a 200 kb (Brown et al. 1979), con intrones y exones que se considera muy conservado, ya que se trata fundamentalmente del mismo genoma desde las hepticas hasta las plantas superiores. Cada cloroplasto contiene varias regiones nucleotdicas, cada una con 8 a 10 molculas de ADN. Un organismo unicelular como Euglena puede contener de 40 a 50 cloroplastos, por lo que la celula entera puede contener ms de 500 copias del genoma del cloroplasto (Stansfield, 1992). ADN mitocondrial (mtADN) El genoma mitocondrial (mtADN) tiene un tamao de 15 a 17 kb (Brown et al. 1979) y su longitud vara considerablemente entre especies: 20 micrmetros en Neurospora; 25 micrmetros en levaduras; 30 micrmetros en plantas superiores; 5 micrmetros en algunos animales metazoarios (multicelulares). Se considera que la mayora del mtADN de hongos y plantas no codifica, ya que el mtARN contiene intrones. El mtARN de animales carece de intrones y

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se transcribe como ARN policistrnico que se parte en ARN monocistrnico antes de la traduccin (Stansfield, 1992). Las molculas de cloroplasto y mitocondria son especialmente importantes para trazar historias filogeogrficas y de estructura poblacional gentica estrechamente relacionada al linaje, porque son de herencia uniparental y no recombinan. Tambin nos permiten inferir cambios demogrficos y de dispersin entre especies (Dirienzo y Wilson, 1991). ADN ribosomal (RADN) El rADN puede encontrarse en mitocondrias, cloroplasto y ncleo. Contiene la informacin para el ARN que conforma los ribosomas, por lo que es informacin que se transcribe pero no se traduce. El rADN se presenta en repeticiones tndem y est formado por tres subunidades altamente conservadas (18 rADN, 5.8 rADN y 28 rADN), separadas por dos espaciadores con elevadas tasas de sustitucin (ITS1 e ITS2). Estas repeticiones en tandm se encuentran conservadas a lo largo de todo un genoma y evolucionan concertadamente, lo que se atribuye a eventos recombinatorios como entrecruzamiento desigual y conversin gnica. Estas secuencias, por la baja tasa de sustitucin que presentan, son extremadamente tiles en el planteamiento de hiptesis de relaciones filogenticas de taxa con tiempos de divergencia muy antiguos (Hills et al., 1991).

Isoenzimas/aloenzimas
Las isoenzimas fueron originalmente definidas como formas moleculares mltiples de las enzimas que tienen funciones idnticas o similares y estn presentes en el mismo individuo (Market y Moller, 1959). Las isoenzimas pueden presentar varias formas allicas, conocidas como aloenzimas (Prakash et al., 1969). En su mayora son selectivamente neutras y se utilizan como marcadores hereditarios para cuantificar las frecuencias allicas y genotpicas de los individuos, que son los estimadores bsicos de la composicin gentica de una poblacin. En estudios de gentica las isoenzimas fueron usadas desde 1966, cuantificando la variacin gentica en poblaciones humanas y de Drosophila y un poco ms tarde en estudios de plantas superiores (Harris, 1966; Johnson et al., 1966; Hubby y Lewontin, 1966; figura 1). La aplicacin de las isoenzimas est dirigida a la cuantificacin de heterocigosis, diversidad gentica, diferenciacin gentica y otras medidas de variacin gentica intra e interpoblacional. Tambin han sido aplicadas exitosamente

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para evaluar y entender aspectos de biologa evolutiva como los sistemas de reproduccin y patrones de fecundacin cruzada, relaciones entre fenotipo y ambiente, filogenias, endemismo, diversidad en plantas clonales y apomcticas e interacciones planta-animal (Prez-Nasser y Piero, 1997) (vanse los captulos 6 y 7 de este libro). Por ejemplo, en el estudio de los sistemas reproductivos de plantas las aloenzimas tienen las siguientes ventajas: 1) son expresadas codominantemente, por lo que los genotipos homcigos y hetercigos pueden ser distinguidos con mucha precisin, y es poco probable que afecten el comportamiento del polinizador; 2) muchos de sus loci son polimrficos, casi cualquier especie presenta al menos uno o dos; 3) probablemente no estn sujetas a fuertes fuerzas selectivas, por lo que se consideran buenos marcadores (Brown et al. 1989); 4) la tcnica es barata en comparacin con otras. Por otro lado, presentan algunas limitaciones: revelan poca variacin y la tcnica es muy laboriosa, requiere de mucho tiempo y entrenamiento y, sobre todo, es poco reproducible entre laboratorios. En la electroforesis de enzimas se utilizan cuatro mtodos principales: a) gel de almidn (horizontal y vertical); b) gel de poliacrilamida; c) gel de agarosa y d) gel de acetato de celulosa. La electroforesis horizontal en geles de almidn sigue siendo la preferida, ya que es relativamente barata, de fcil manipulacin, buena resolucin, no es txica y se puede analizar de forma rpida la variacin para uno o varios loci. Para un locus dado, el nmero de bandas vara entre individuos homcigos y hetercigos (figura 1) y tambin vara en funcin de la estructura cuaternaria de la enzima; si es monomrica los individuos homcigos representan una sola banda y los hetercigos presentan dos bandas; si es una enzima dimrica, los hetercigos presentan tres bandas (dos homodmeros de los padres y un producto adicional de movilidad intermedia); en las enzimas tetramricas se observan 5 bandas en los individuos hetercigos.

RAPD s
Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores que amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies. Los RAPDs se basan en la probabilidad estadstica de que se presenten sitios complementarios al oligonucletido de 10 pares de bases (pb) a lo largo del genoma. El polimorfismo de las bandas entre los individuos se debe a cambios en la secuencia de los nucletidos en los sitios de acoplamiento del

546 Las herramientas moleculares Figura 1. Patrones de la fosfoglucosa isomerasa para ecotipos de arroz rojo y variedades de arroz en gel de almidn de papa agarosa al 12% (foto de Ortiz et al., 2002)

oligonucletido y por insercin o delecin de los fragmentos en estos sitios (Williams et al., 1990; figura 2). Estos marcadores son dominantes, es decir, no pueden discernir los homcigos dominantes de los hetercigos para un segmento particular (Whitkus et al., 1994; Backeljau et al., 1995), por lo que la estimacin de las frecuencias allicas se debe hacer de manera indirecta, asumiendo equilibrio de HardyWeinberg (Aagaard et al., 1998). Los RAPDs son tiles en la elaboracin de mapas genticos, en el estudio de parentesco y en el anlisis de la estructura poblacional, ya que ayudan a estimar tamao efectivo, aislamiento reproductivo y niveles de fecundacin cruzada (Otero et al., 1997; Parker et al., 1998; vanse tambin los captulos 2, 3 y 6 de este libro). Dado el gran polimorfismo que detectan una de sus mejores aplicaciones es la identificacin gentica de individuos, que incluye casos de clones, hbridos somticos y mutantes. Otra aplicacin paralela es la deteccin de uniformidad gentica con un marcador eficiente y rpido, lo cual puede ser til en la determinacin de estabilidad en programas de reforestacin (Otero et al., 1997).

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Entre las principales ventajas de los RAPDs esta que amplifican regiones tanto codificantes del ADN como las no codificantes y revelan niveles de variacin ms altos que los RFLPs e isoenzimas (Williams et al., 1990; Lynch y Milligan, 1994; Otero et al., 1997; Russell et al., 1997; Parker et al., 1998); es una tcnica relativamente fcil que no necesita conocimiento previo de la secuencia de ADN, no requiere la construccin o el mantenimiento de una librera genmica, el nmero de loci que puede ser examinado es ilimitado y no requiere pruebas radiactivas (Reiter et al., 1992; Whitkus et al. 1994). Sin embargo los problemas prcticos detectados con los RAPDs son la presencia de bandas errneas (artefactos), la reproducibilidad de los resultados y la comigracin de bandas. Asimismo, muchos de los alelos raros presentes en las poblaciones estudiadas con RAPDs no son detectados o pueden ser mal interpretados (Zhivotovsky, 1999). Por otro lado, como los loci son dominantes, los RAPDs dan menos informacin gentica por locus que los marcadores codominantes. Al analizar los datos obtenidos con RAPDs se deben tener en cuenta dos supuestos: 1) cada uno de los marcadores representa un locus mendeliano en el cual el marcador visible, el alelo dominante, est en equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y 2) los alelos marcados para diferentes loci no migran a la misma posicin en el gel (Lynch y Milligan, 1994).
Figura 2. Patrones de bandeo con RAPDs en Ferocactus robustus en gel de agarosa y tincin con bromuro de etidio (foto de Israel Carrillo).

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Microsatlites
Los microsatlites o secuencias simples repetidas (SSRs; Litt y Luty, 1989) son secuencias de ADN formadas de 1 a 4 pares de bases, por ejemplo mononucletidos (TT)n, dinucletidos (AT)n, o tetranucletidos (AAGG)n. Estos loci se encuentran en regiones codificantes y no codificantes del ADN y es probable que se formen por eventos de rompimiento que generan polimorfismos con valores superiores al 90% (Armour et al., 1994; Coltman et al., 1996; Gupta et al., 1996; figura 3). Los microsatlites de ADN nuclear han sido detectados en mltiples grupos de plantas y animales, y han sido utilizados fundamentalmente para estudios de variacin gentica intra e interespecfica (Edwars et al., 1991; Armour et al., 1993; Devey et al., 1996; Queller et al., 1993; Weight y Bentzen, 1994), anlisis de linajes (Queller et al., 1993) y de sistemas reproductivos (Awadalla y Ritland, 1997). Recientemente se han encontrado microsatlites en algunos organelos citoplasmticos, como el cloroplasto (SSRc; Powell et al., 1995a, b; Vendramn et al., 1996; figura 3 ) y la mitocondria (SSRm; Soranzo et al., 1998) lo que ha enriquecido la fuente de estudios evolutivos, ya que estos organelos son heredados uniparentalmente y no estn sujetos a recombinacin, por lo que los cambios acumulados que observamos en las poblaciones se deben slo a los procesos de mutacin y demogrficos (Echt et al., 1998). Esto permite contestar preguntas evolutivas muy puntuales relacionadas con el monitoreo del flujo gentico, introgresin (Vendramin et al., 1998), anlisis de paternidad (McCracken et al., 1999), para hacer inferencias de parmetros demogrficos y para determinar patrones evolutivos de los procesos histricos del origen de especies, formas o razas (Golstein et al., 1996). Los microsatlites han tomado ventaja sobre otros marcadores genticos como los AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el ms alto grado de polimorfismo; ii) segregan de manera mendeliana y son codominantes; iii) la presencia de un solo locus gentico por microsatlite hace que la lectura de las bandas sea clara y fcil de interpretar y iv) son selectivamente neutros (Golstein y Pollock, 1994; Vendramin et al., 1996). Adems, para trabajar con SRR es necesario conocer la secuencia de la regin a analizar para contar con primers especficos que amplifiquen la regin repetitiva (el microsatlite) responsable de la variacin observada, que adems es homloga para diferentes especies o incluso gneros (Golstein et al., 1996). Esto es, los microsatlites son especficos para ciertos grupos de especies y

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homlogos entre s (Vendramin et al., 1996), lo que permite hacer estudios comparativos entre especies o gneros de un mismo grupo. Por otra parte, se han realizado estimaciones de las tasas de mutacin de estas regiones y se ha llegado a la conclusin de que los microsatlite del ADN nuclear tienen tasas de mutacin de 1x 10 -3 a 1x 10 -6 (Wiessenbach et al., 1992; Weber y Wong, 1993), ms altas que las que se presentan en el ADN de cloroplasto las cuales segn Provan et al. (1999) son de 3.2-7.9 x 10-5. Conocer las tasas de mutacin nos brinda una base importante para realizar anlisis robustos de la genealoga de las poblaciones que nos hablen acerca de la historia evolutiva de las especies, ventaja muy importante sobre otros marcadores genticos. Otra ventaja que presenta el uso de microsatlites con relacin al uso de secuencias, es que la mutacin es homognea: en la mayora de los SSR las mutaciones son de un paso (una unidad repetitiva) siguiendo el modelo mutacional SSM de Ohta y Kimura (1973). Sin embargo el nmero de mutaciones vara si se trata de diferentes tipos de microsatlites, por ejemplo, Golstein et al. (1995b) mencionan que las mutaciones de repeticiones formadas por dinucletidos o trinucletidos son de dos pasos o incluso de mltiples pasos, lo que ha sido confirmado por estudios en trinucletidos. Por ejemplo, en el humano el microsatlite formado por las repeticiones CAG asociado con un desorden neurolgico, puede mutar de pocos a cientos de alelos (Ashley y Warren 1995). Sin embargo este comportamiento asimtrico del tamao de las mutaciones de SSR ha sido raramente reportado. Al ser los microsatlites altamente polimrficos, pueden ser ventajosos con relacin al uso de secuencias, aunque la variacin del ADN nuclear debe analizarse con precaucin, ya que pudo haberse generado por duplicaciones o por la presencia de familias multignicas (Rieseberg,1991), que generan un alto grado de homogeneidad dentro y entre especies, proceso conocido como evolucin concertada. Estos fenmenos pueden distorsionar la historia evolutiva de los organismos en estudio y confundir las relaciones filogenticas (Rieseberg et al., 1991b). Es decir, se pueden presentar aparentes reticulaciones o escenarios de hibridizacin introgresiva. Finalmente, los microsatlites han sido utilizados para hacer reconstrucciones de rboles de genes con base en la teora de coalescencia (vase el captulo 4 de este libro). Los fragmentos son separados en geles de acrilamida y son visualizados con nitrato de plata o radioactividad.

550 Las herramientas moleculares Figura 3. Patrones del microsatlite Pt63718 de cloroplasto en Pinus strobiformis en gel de acrilamida al 6% y tincin con nitrato de plata (foto de Alejandra Moreno Letelier)

ISSRs
Es un marcador molecular conocido como secuencias repetidas intersimples. Esta es una tcnica relativamente nueva y es similar a los RAPDs, excepto que en los ISSRs el primer es un di trinucleotido repetido (Culler y Wolfe, 2001 vase el captulo 19 de este libro). Los dos mtodos que se utilizan en la electroforesis de ISSRs son: a) gel de agarosa visualizado con bromuro de etidio, y b) geles de acrilamida teidos con nitrato de plata. Las bandas que se obtienen con este marcador van de 100 a 2000 pb. La variacin allica en los ISSRs consiste de la presencia o ausencia de los productos amplificados. Comparada con los primers de los RAPDs las secuencias de los ISSRs es usualmente larga lo que resulta en una mayor reproductibilidad de las bandas.

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Los ISSRs han sido utilizado en especies cultivadas desde 1994, pero slo recientemente se han utilizado en estudios de la variacin poblacional en especies silvestres (Wolfe y Liston, 1998; Wolfe et al. 1998 a,b). Hasta la fecha slo existen algunos estudios donde se ha comparado directamente la variacin gentica, incluyendo estimaciones de la tasa de fecundacin cruzada (que tradicionalmente se estima con marcadores codominantes) y se ha utilizado esta tcnica en especies donde la variacin poblacional con enzimas es pequea o no existe. Dada la alta variacin gentica entre individuos de una misma poblacin, sera recomendable utilizar estos marcadores para anlisis de paternidad. Entre las ventajas principales de los ISSRs es que tienen un gran nmero de bandas polimorficas. En un estudio realizado en Viola pubescens una planta cleistogamica se report una gran variacin gentica. A nivel de especie, el 100% de los loci fueron polimorficos an cuando los primers (se utilizaron tres) fueron seleccionados al azar. Dentro de cada poblacin cerca del 71% de 83 loci fueron polimorficos (Culley y Wolfe 2001). Adems es una tcnica relativamente fcil de montar, altamente repetible y ya existen primers universales para plantas.
Figura 4. Patrones de ISSRs en Opuntia rastrera en gel de agarosa al 1.5% y tincin con bromuro de etidio (foto de Lucia Plasencia)

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Por otro lado las limitaciones de los ISSRs son: que las bandas son ledas como marcadores dominantes, es decir cuando tenemos la presencia de la banda no se sabe si el individuo es homcigo dominante o hercigo, que la diversidad gentica est basada considerando que cada banda representa un locus con dos alelos y que el alelo dominante esta en equilibrio de HardyWeinberg con un alelo recesivo y por ltimo que es una tcnica relativamente cara, ya que involucra el uso de geles de poliacrilamida y para su visualizacin nitrato de plata.

RFLP s
El anlisis de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLPs) fue el primer marcador de ADN utilizado por bilogos poblacionales (Parker et al., 1998). Este mtodo expresa diferencias especficas del ADN que fueron reconocidas por enzimas de restriccin particulares (endonucleasas). Cada una de las endonucleasas (de origen bacteriano), reconoce y corta solamente una secuencia especfica de bases nitrogenadas en el ADN, siempre y cuando stas no estn protegidas (metiladas). Por consiguiente cualquier ADN que no est metilado puede ser reconocido y cortado en fragmentos de longitud definida; y cualquier mutacin dentro de esos sitios, podra cambiar el patrn del fragmento y permitir que se detecte un RFLP al comparar dos o ms genomas (Valadez y Kahl, 2000). Para detectar RFLPs hay dos tcnicas: southern blots e hibridizacin, y PCR. Southern blots e hibridizacin Es necesario en primer lugar aislar el ADN del organismo de inters (vase el captulo 15 de este libro, purificarlo y cortarlo con una o ms endonucleasas de restriccin. Los fragmentos resultantes se separan en geles de agarosa por electroforesis y se transfieren a una membrana que puede ser de nylon o de nitrocelulosa (southern blotting). La subsecuente hibridacin con una sonda marcada y deteccin con autorradiografa, luminografa o quimioluminiscencia har visible un fragmento de ADN especfico, que puede ser comparado con el fragmento resultante de otros genomas tratados de la misma forma (Parket et al., 1998). La sonda marcada se obtiene de fragmentos de ADN nuclear, de organelos o bien de ADN complementario, tambin denominado ADN copia (ADNc) que es una molcula de una sola hilera producida en el laboratorio usando mRNA como molde y transcripcin reversa (vase el captulo 15 de este

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libro). Para el caso de obtenerla a partir de ADN nuclear, se requiere construir una biblioteca genmica mediante el aislamiento, restriccin y clonacin del ADN en un vector apropiado (Valadez y Kahl, 2000), que se explica a continuacin. Las bibliotecas de ADN son colecciones de vectores recombinantes, que cuentan con secuencias de ADN insertadas. La figura 5 muestra la construccin de una biblioteca de ADNc en el vector lambda gt10. En la figura se puede observar cmo, mediante ADN transcriptasas, polimerasas o ligasas se construye un fragmento de ADN (el de inters) y se inserta en el fago a utilizar (parte A de la figura); una vez obtenido el fago se procede a infectar una colonia de E. coli en una caja de Petri. Cada infeccin producir una placa caracterstica en la caja de Petri (en una caja de Petri de 150 mm pueden caber 50 mil placas). Una vez que las placas se han formado se coloca un filtro de nitrocelulosa en contacto con las colonias de la caja de Petri. El ADN transferido al filtro es desnaturalizado y fijado en el filtro mediante el uso de luz ultravioleta. De esta forma el filtro puede ser hibridizado con una sonda radiactiva de ADNc de inters y sometido a autorradiografia; una mancha en la autorradiografia permitir identificar la placa de la caja de Petri que contiene el fago con el ADN de inters. El fago puede entonces ser extrado del agar de la caja de Petri y reinfectar a E. coli. La repeticin de este proceso de separacin de un fago recombinante, permite clonar el ADN que contiene el fago. Este proceso ha permitido desarrollar bibliotecas de ADN de diferentes tejidos. RFLP-PCR El segundo mtodo que se utiliza para la tcnica de RFLPs es la PCR. Los RFLPs son causados por rearreglos del ADN, tales como prdidas, inserciones o sustituciones de secuencias o nucletidos nicos, lo que genera una ganancia o prdida de sitios de restriccin. Esto es detectado a travs de diferencias en el peso molecular de los fragmentos homlogos de restriccin del ADN genmico (figura 6). Con el producto amplificado de PCR se realiza una digestin con diferentes enzimas de restriccin. Los fragmentos resultantes de la digestin son separados por electroforesis en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio o con acrilamida teidos con nitrato de plata (Karl et al., 1992); este mtodo es ms barato y rpido que el anterior. Los RFLPs generalmente se han utilizado para construir mapas genticos, para la clonacin de genes basados en mapas y para ayudar a resolver problemas taxonmicos o filogenticos.

554 Las herramientas moleculares Figura 5. Construccin de una biblioteca de ADN en el vector lambda gt10 (A). En (B) se muestra en forma esquematizada el cernimiento para obtener la clona pura
A mARN mARN mARN cADN mARN cADN GGAATTCC CCAATTCC Digestin por Eco Rl GGAATTCC GG GG CCAATTCC Eco Rl dirigido, ? GT 10, Ligasa de ASDN Inserto COS Paquete de ADN recombinante de ? gt 10 en el fago Biblioteca de ? gt 10 Seal en la placa donde est el fango Autorradiografa + oligo (dT) AAA B Caja de E. coli infectadas con el fgo

AAA Transcriptasa de reversa dNTPs AAA TTT ARNasa HPolimerasa de ADN dNTPs AAA TTT Ligasa Eco Rl GGAATTCC CCAATTCC

Transferencia al filtro

ADN fijo en el filtro Hibridizacin con ADN o ARN

COS

Autorradiografa

El grado de polimorfismo detectado con esta tcnica difiere ampliamente entre las especies dependiendo de la sonda utilizada. Entre las principales desventajas que presenta est el requerimiento de grandes cantidades de ADN de buena calidad para la deteccin de loci de copias nicas, adems requiere de muchas manipulaciones y solamente se detecta una fraccin de la variabilidad de secuencias existentes en el genoma, es decir, su informacin es limitada.

AFLP s
Los AFLPs (polimorfismos de longitud de los fragmentos amplificados) son una tcnica que combina la digestin de dos enzimas de restriccin, generalmente Mse I que reconoce y corta 4 pb y Eco RI que reconoce y corta 6 pb dentro de una secuencia, con la unin de secuencias especficas al nucletido ligado a los extremos de los fragmentos de restriccin y dos

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Figura 6. Patrones de PCR-RFLPs del intrn de la mitocondria NAD1B2f y NAD1C1r digerido con la enzima Hae III en Pinus pinceana en gel de acrilamida al 5% y tincin con nitrato de plata (foto de Miroslava Rentera Alcntara)

amplificaciones de PCR usando primers marcados basados en las secuencias ligadas. La primera amplificacin se lleva a cabo con el uso de iniciadores que contienen una base extra en el extremo 3, lo que produce un conjunto de fragmentos que adems de llevar la secuencia complementaria al iniciador, complementan a la base extra adicionada. Posteriormente estos productos amplificados sirven para hacer la segunda amplificacin en la que se consideran iniciadores con dos o tres bases extras. Los fragmentos resultantes son complementarios, adems del iniciador, a las extensiones consideradas, razn por la cual slo una porcin del genoma fragmentado es finalmente amplificado (Vos et al., 1995).

556 Las herramientas moleculares Figura 7. Patrones de AFLPs en Allium sativum en gel de acrilamida y tincin con nitrato de plata (foto de Meryem Ipek)

Esta tcnica detecta mltiples loci polimrficos y es til para generar huellas genticas y mapeo; tambin se ha utilizado para la caracterizacin de germoplasma, estudios filogenticos en plantas, bacterias, hongos y en estudios de gentica de poblaciones. Entre las ventajas que se pueden encontrar en los AFLPs est que no requieren ninguna informacin previa de la secuencia para su anlisis; se producen una gran cantidad de bandas polimrficas; la tcnica es altamente reproducible y existen kits estandarizados. Sin embargo, requiere gran nmero de pasos para producir resultados. Aunque actualmente el equipo es sofisticado y se necesita la radiactividad para generar los AFLPs, el mtodo se puede automatizar fcilmente para el

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alto rendimiento del procesamiento de muestras. Las marcas fluorescentes estn substituyendo a la radiactividad y el nmero de datos producidos en un tiempo corto compensa los costos. Las bandas observadas en los geles de AFLPs son clasificadas como presencia o ausencia de cada individuo y el anlisis se desarrolla como un sistema dominante recesivo (Simpson, 1997).

Secuenciacin de ADN
Los anlisis ms detallados de diferenciacin de ADN pueden obtenerse secuenciando la regin de inters para diferentes individuos. Hasta hace poco tiempo, el uso extenso de secuencias de ADN para los estudios de poblaciones no haban sido prcticos porque los fragmentos de ADN para cada individuo tenan que ser aislados para libreras de ADN subgenmico despus de haber sido identificados por southern blotting e hibridizacin. Sin embargo, actualmente el uso de secuencias es muy comn: se ha aplicado en anlisis de gentica de poblaciones y problemas taxonmicos. Este mtodo incluye cuatro pasos: i) identificar secuencias que tenga la variacin necesaria; ii) aislar y purificar un nmero elevado de la secuencia (ya sea por clonacin o amplificacin); iii) secuenciar; iv) alinear la secuencia (con los programas MALIGN, Clustal V para Macintosh ver. 1.5, JACK ver. 4.2). Las tcnicas que existen para secuenciar son la qumica, la enzimtica y la automtica. La qumica diseada por Alan Maxan y Walter Gilbert consiste en dividir el ADN en cuatro muestras y tratar cada una con agentes qumicos que rompen el ADN especficamente en una base, bajo condiciones en las que solo unos pocos nucletidos del fragmento se afectan. Los fragmentos se marcan con radiactividad y se auto radiografan. En el mtodo enzimtico de Fred Sanger el ADN a ser secuenciado se utiliza como patrn de referencia para producir una sntesis in vitro, mediante una polimerasa y una rplica de ADN que inicia la sntesis del ADN siempre en el mismo sitio. El punto crtico es el uso de trifosfato de dideoxirribonuclesido: la deoxirribosa no cuenta con el grupo 3-OH, de tal forma que cuando el nucletido es incorporado a la cadena de ADN, se bloquea la adicin del siguiente nucletido, por lo que cada molcula de ADN sintetizada va a terminar aleatoriamente en dicho nucletido. Esta sntesis se lleva a cabo en cuatro muestras; en cada muestra se incorpora un dideoxinuclesido con una base diferente (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) y los otros tres deoxinucletidos

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normales. Los fragmentos sintetizados durante el proceso van a terminar en sitios diferentes de la cadena del ADN, generando una escalera de molculas de ADN que pueden ser detectadas por auto radiografa. Las cuatro muestras se corren en electroforesis en lneas paralelas para determinar el orden de los nucletidos, identificando la secuencia de ADN que ser complementaria al ADN que sirvi de modelo para la sntesis (figura 8).
Figura 8. Mtodo se secuenciacin enzimtica de ADN. 1) Sntesis en presencia del ADN de inters, polimerasa, un fragmento de ADN como iniciador, nucletidos y dideoxinucletidos atpicos; 2) Sntesis por separado para cada nucletido, generando fragmentos de ADN con el dideoxinucletido incorporado; 3) separacin de los fragmentos en un gel para identificar la secuencia

A A T T G

C C G

A G A A
G

C C G T T C A ddATP

Polimerasa

1
5 3 GGATTG A CGTAACT GT T C T A A C T C A A ADN Polimerasa + dATP dCTP dTTP dGTP + dd AT P + dd C T P + dd T T P + dd G T P 5

C A A G C A C A A CG A TTG A

C A A G C C A A G C A T C A A C G A T

C A A A C A A C G A T T G

G A G T T A C G

Breve revisin de los marcadores moleculares 559

Recientemente se ha introducido la secuenciacin automtica que utiliza la reaccin de Fred Sanger pero con fluorescencia en vez de radiactividad, que se detecta por medio de un lser. Cada emisin fluorescente es transmitida como una seal directamente a la computadora donde un programa la interpreta y la codifica como un nucletido particular (Swofford et el., 1996; Griffiths et al., 1996; Ferl et al., 1991). La captura de secuencias se hace ms rpida debido a que incorporan programas que leen los nucletidos directamente desde el gel (figura 9). Entre las principales ventajas que tiene la secuenciacin de ADN es su alta reproducibilidad y que es codominante; su mayor limitante es su alto costo pero es la mejor alternativa entre los mtodos con istopos radiactivos.
Figura 9. Ejemplo de patrones de secuenciacin automtica

Microarrays (microarreglos)
El microarray es un arreglo de cientos de millares de secuencias de ADN inmovilizadas y bien ordenadas en forma de matriz adheridas a una superficie slida, generalmente de cristal. Cada secuencia corresponde a un gen diferente. Esta tcnica es utilizada para detectar niveles de expresin de los genes colocados en el microarray. Esto se logra extrayendo el mARN de la clula de inters o de algn tejido particular, sometindolo a transcripcin inversa para obtener cADN (vase el captulo 16 de este libro)y combinando ste con un marcador fluorescente (usualmente los tintes de cianina Cy3 y Cy5) para generar una sonda, que es hibridizada sobre la matriz del microarray, de manera que para cada gen se detecta el grado de fluorescencia, lo cual da el nivel de expresin del gene.

560 Las herramientas moleculares

Los microarrreglos pueden ser divididos en dos tipos principales que difieren en su construccin: spotted microarrays (microarreglos punteados) y arreglos de oligonucletidos de alta densidad. Los microarreglos punteados usan generalmente muestras de ADN de 500 a 5000 bases (Ekins et al., 1999) producidos por PCR a partir de bibliotecas o de bases de datos como GenBank, UniGene, dbEST, etc. Las secuencias son depositadas sobre la superficie slida por un robot en lugares definidos. Hay dos mtodos de depositar los puntos: Distribuidor activo: basado en la tecnologa de las impresoras de inyeccin de tinta. Distribuidor pasivo: aplica la solucin de ADN con un alfiler que toca la superficie slida. Se puede obtener una mayor densidad de manchas usando este mtodo. La superficie slida generalmente es un portaobjetos especialmente cubierto pero tambin se pueden usar membranas de nylon y portaobjetos cubiertos de oro. El tamao de los puntos de la matriz tpicamente vara de 80 a 150 m de dimetro y en un solo portaobjetos cabe un mximo de 80,000 puntos. En los microarrays punteados es comn comparar las expresiones genticas de dos muestras biolgicas (tejido con tumor vs. tejido sin tumor, por ejemplo) en un mismo portaobjetos, as que el mRNA es preparado para que los dos niveles de expresin puedan ser medidos (Schena et al., 1995; figura 9). Por su parte, los microarreglos de oligonucletidos de alta densidad son construidos comercialmente y tienen una precisin y densidad muy alta al usar oligonucletidos cortos de 20 a 25 bases. Dos de las compaas que construyen estas clases de micrroarreglos son Affymetrix y Agilent Technologies. Los microarreglos de Affymetrix son los ms populares y son conocidos como GeneChipsTM, producidos sintetizando decenas de miles de oligonucletidos cortos in situ usando tcnicas de fotolitografa. Affymetrix produce diferentes microarrays, cada uno con diferente composicin de genes (Lockart et al., 1996). Los microarreglos necesitan ser ledos por un instrumento apropiado para convertir la distribucin de florescencia o radioactividad en una imagen de computadora. En el caso de las sondas fluorescentes, se pueden usar escners de lser o cmaras CCD. En la imagen de computadora cada intensidad del punto corresponde a un nivel de expresin de la sonda. Puesto que un punto contiene mltiples pixeles, es normal promediar todos los pixeles de un mismo punto junto con los pixeles del borde exterior. Sin embargo, la cuantificacin

Breve revisin de los marcadores moleculares 561

Figura 10. Tcnica de microarrays para detectar niveles de expresin de genes (tomada de la pgina web del Instituto de Neurobiologa, UNAM)
Preparar la sonda de ADN complementario (ADNc) Normal Tumor Preparar la coleccin de ADNc en una micromatriz

RT/PCR Mercado con compuestos fluorescentes

Combinar en cantidades iguales

Hibridar la sonda a la micromatriz Tecnologa de micromatrices

SCAN

del grado de fluorescencia est sujeta a las fluctuaciones de intensidad dentro de cada punto, aunque stas pueden ser superadas con las tcnicas desarrolladas por Brown et al. (1999). Los microarreglos de Affymetrix presentan problemas similares, pero tambin se han desarrollado algoritmos para combatirlos. Esta tecnologa permite a los investigadores estudiar la relacin de genes individuales de enfermedades (por ejemplo el cncer), y despus aplicar el conocimiento al tratamiento de pacientes. Tambin se ha utilizado en el estudio de tejidos finos, en clulas normales durante el desarrollo y estudios de animales transgenicos. La tecnologa de los microarreglos tambin tiene uso potencial en el desarrollo de nuevas drogas as como en la investigacin de farmacogenmicos (cuyo fin es encontrar la correlacin entre las respuestas teraputicas a las drogas y los perfiles genticos de los pacientes) y de toxicogenmicos (cuya meta es encontrar correlaciones entre los toxicantes y los cambios en los perfiles genticos de los objetos expuestos a los toxicantes; Leming Shi, 1998, 2002).

562 Las herramientas moleculares

Los dos grandes problemas que se presentan con los datos de microarreglos son por un lado los niveles de expresin, que varan de experimento a experimento, y por las diversas fuentes de errores aleatorios y sistemticos durante el anlisis. Por otro lado, hay un pequeo nmero de muestras comparado con el gran nmero de variables, lo que causa que las tcnicas estadsticas tradicionales fracasen. Otra gran limitante de los microarrays proviene, irnicamente, de su productividad notable, y actualmente los cientficos apenas pueden hacer frente al volumen enorme de informacin producida por los microarreglos, adems de tener un alto costo.

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