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A CIENCIA TECNOlOGIA
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005 AUMENTOS

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UNICAM~

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DESNATURA~AO E PROPRIEDADES FUNCIONAIS~

No campo da bioquimica :lativo, isto protefna s6

e da biofisica, 0 estado da estrutura que interessa ao pesquisador

e 0 estado

e, a proteina com sua conforma<;ao tal como ela e conhecida em seu meio natural. Nesse caso, a e desnaturada para se estudar sua forma nativa, especialmente em rela<;ao a seu funcionarnento.
de aliment os, por outro lado, a estrutura nativa de uma protefna, ou rnistura do tecn610go ou do consurnidor, seja desejavel. Alguns cientistas taxativamente negativo, apenas relativa de acordo com as necessidades

Na ciencia e tecnologia elas, tern uma importancia consideram erroneamente

o que faz com que, em rnuitos cas os, urn certo grau de desnatura~iio sem que exista uma preocupa<;ao em definir seu grau ou severidade. Ocorre que a desnatuta<;ao

a desnatura<;iio proteica como sendo urn acontecirnento

e urn processo gradativo, diffcil de definit mas que possui varios estagios e depois as quimicas. e possivellirnitar desnatura<;:iio as condi<;6es dos processos tecnol6gicos

separados p0r barrei.t:as ou timites sutis, dando-se primeiro as altera<;6es fisico-quimicas Contudo, cleve ser lembrado que rnanipulando-se

a extensao da desnatura<;ao para atingir objetivos especificos, rnuito embora existarn exce<;:6es. Excetuarn-se casos, como 0 da obten<;iio de extratos enzirnaticos para aplica<;ao industrial, onde qualquer diminui a atividade da enzima e deveria, port an to, ser evitada. Devido a associa<;iio fntima que existe entre aprotefna generica, entre a macromolecula e seumicroarnbiente,

e seu solvente ou, dito de uma forma rnais de arranjos quaternarios, das unidades e subunidades

nao e possivel restringir a ocorrencia deste fenomeno

a estrutura

terciaria unicarnente.

Assim, devemos considerar que os desrnanches

quando provocados

por agentes externos, causam altera<;6es no microarnbiente

e podern significar a desnatura<;ao autornatica das estruturas quaternaria

e terciaria .

Considerando-se

que a estrutura terciaria de urna proteina e

resultado de urn nfunero relativarnente

grande de intera<;6es ffsico-quimicas e, as vezes, de algurnasliga<;6es quimicas, nao seria possivel definir com brevidade e precisao qualquer mudan<;:a de estado da estrutura superior damacrornolecula. denotar qualquer altera<;ao, ou altera<;6es, nas esttuturas quaternaria, terciaria

E por

essa razao das

e pela falta de urn termo quirnico ou ffsico-qufrnico melhor, que se ernprega a palavra desnatura<;do para ou secundaria macromoleculas. A extensao da desnatura<;ao

e, entao,

J.TIuito dificil de seT medida. Necessitar-se-ia

determinar

quais e

quantas das intera<;6es hidrof6bicas,

polares, ionicas, etc. originais foram desfeitas e, talvez, restabelecidas

de forma diferente. severidade

Tal somat6ria

de mudam;as

de est ado seria obviamente

varilivel e dependeria

da

das condi<;6es que for<;aram essas mudan<;as.

De maneira estrutura tereiaria,

geral, mecanicamente mas raramente

podem-se

imprimir altera<;6es na estrutura secundaria.

quaternaria

e ate na

atinge-se

a estrutura

Urn caso especial

desse tipo de SaD esticadas paralela

desnatura<;ao ocorre quando seestica

urn fio de cabelo: as helices a, dentro da microfibrila,

ate. que as pontes de H intern as se desfa<;am. Quando a for<;a for retirada, aparecer, s6 que as cadeias polipeptfdicas (queratinafi). Enquanto Assim, por meios apenas meciinicos, a estrurura secundaria
0

novas pontes de H poderao

adotarao uma estrutura semi-rfgida de chapa pregueadafi

dessa protefna pode ser alterada. no campo dos alimentos exist em

exemplo anterior tern aplica<;ao apenas na cosmetologia,

de fato muitos cas os e bastante interessantes. Podemosconsiderar como exemplo 0 caso da d~atufa<;iio da clara (albumina) do ovo, que e. efetuada simples mente com urn garfo ou batedeira. A agita<;iio faz com que as moleculas em solu<;iio flu am em camadas cad a vez mais fin as e se orientem para dentro e para fora da solu<;iio (figura 3.1). Aproveitando-se enormearea superficial, isto do ar introduzido, A reorienta<;iio a albumin a tende a formar urn filme com uma que foi for<;ada por meiomeciinico leva

e:

espuma.

reacomoda<;iio de resfduos pol ares e ni'io-poJares da moJecula. 0 que parece mais 16gico acontecer e que as molecuJas da ovalbumina e outra moderadamente associadas moJeculares (a mais abundante hidrof6bica, das protefnas da clara) possuam uma face bastante hidrofflica mediante fracas for<;as de van der Waals. Essas agrega<;6es quaternarias, facilmente perturbadas ou quebradas por de tal forma que, no meio aquoso nativo, varias deJas se encontrem estruturas

atraves das suas faces hidrof6bicas podem ser consideradas

meios meciinicos. Estando sob agita<;iio, as agrega<;6es moleculares nativas desmancham-se, exigindo a reorienta<;iio das faces, sendc, que a mais hidrof6bica orienta-se para fora, e a hidrofilica, para 0 interior do filme (figura 3.1). Nesse processo'pode ainda existir alguma alterac;iio na estrutura terciaria da proteina.

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o que
espurna,
0

se observa com a espuma da clara do ovo e que ela e muito estavel; com
0

a medida

que se efetua uma no volume da assim como da rede molecular que urn processo

perda de umidade

tempo, deveria ser observada


0 0

urna dirninui~ao
0

correspondente

que nao ocorre. Mais provavelmente

que deve ocorrer e

endurecimento constatar

formada pelo soluto no filme, e isso pode ser rea~6es de oxida~ao de ~upos mecanico de desnatura~ao subseqiientes.

resultado de intera~6es polares e hidrof6bicas, podernos

-SH atingidos pelo ar. Resumindo,

pode abrir caminho para a ocorrencia

de altera~6es ffsico-qufrnicas e qufmicas

E interessante observar aqui que a propriedade funcional das protefnas da clara de ovo forma urn filme extenso e e reprirnida quando a gerna do ovo, rica em compostos emulsificantes, e rnisturada com a clara antes de se efetuar a agita~ao. Durante a emulsifica<;ao formam-se micelas de simetria esferica, as quais sac suficientemente estaveis e soluveis para impedir a reorienta<;ao das moIeculas de albumina para fora e ~ra dentro da solu~ao.
Outro exernplo de desnatura~o medinica e a efetuada nas protefnas do trigo durante a mistura da massa para se obter a rede estrutural que da 0 corpo e a textura caracterfsticos do pao de trigo. As principais proteinas envolvidas no processo sac as protefnas de reserva da semente, as gliadinas e as gluteninas. Mesmo que a exata estrutura<;ao dessas proteinas nao seja ainda conhecida, sabe-se que as gliadin as (tipos a, yew) sac monomer os globulares de peso molecular em torno de 36.000 que se associam entre si mediante contatos hidrof6bicos formando microfibril as de milhares e milhares <Ie A de comprimento. Na forma nativa, nurnerosas dessas microfibrilas encontram-se armazenadas em densos pacotes, talvez associadas por pontes de H, numa enorme estrutura quaternaria com pesos moleculares de ate 20xl06 por microfibrila (figura 3.2). As gluteninas (I e II), por sua vez, tambem encontram-se nativamente associadas em superestruturas tipo quatermiria usando uma combina~ao de pontes de dissulfeto e hidrof6bicas, como se ve na figura 3.2.

o 0(-

Gliodino ,42 A, PM 36.000

~s-s~s-s~s

-6--v-0- -6- --O-Q-----, I I

Gluteninas 1 ell

unidas por ligacOes covalentes e hidrofObicas.

---6- -O------ -0-0--0-I I , I ' I I '

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Figura 3.2 . Estruturasquatemarias da semente. idealizadas alem de servirem de reservat6rios compactos

' ' -<D~-<D


:

S-S

I s

S-S

I s

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das gliadinas e gluteninas de N,

do trigo. Uma passivel fun~ao de tais estruturas,


0

e a de fomecer

N em forma gradativa durante a germina~ao

As estruturas acima descritas nao s~~ soluveis em agua mas, quando esta e acrescentada a farinha e se inicia a mistura da massa, hidratam-se e separam-se as microfibrilas das gliadinas e das gluteninas dando origem a complexos gliadina-glutenina (qudncluem tamhe'm outras protefnas, como albwninas e globulinas) atraves de fon;as de tipo hidrof6bicas e polares em geral. Esses complexos possuem extensibilidade em qualquer dire~ao, conferindo assim propriedades visco-elasticas a toda a massa. Ja que 0 teor proteico alcan~a apenas 10% do peso total da farinha, e 6bvio que a intera~ao das protefnas com 0 amido e as gorduras deva ser de extrema importancia para estender a elasticidade atraves de toda a massa. Essas interaes serao atingidas mais provavelmente a expensas de uma maior perda das estruturas nativas de todas as proteinas envolvidas. As desnatura~6es mecinicas sao praticamente ~reversiveis.

~ Meiosjisico-qufmicos de desnatura~ao sac aqueles que, como 0 ~gr, 0 tipo de solven't~e pH fora do normal, perturb am as liga~6es fisico-quimicas e alter am os angulos e 1/J comprometendo;'alem das estruturas quaternaria e terciaria, a estrutura secundaria das proteinas.
.. ..

Temperaturas entre 50 e 100Cprovocam agita~ao termica, vibra~6es e perturba~6es que quebram as pontes de H e de van der Waals, assim como as liga~6es polares, lan~ando grupam~ntos uns contra os outros de forma aleat6ria, podendo caUSar~esnatura~o de tipo irreversivel. Tal desnatura~ao resulta irreversivel por causa da estabilidade das novas irlt~~a~6esou ligii~6esque ~e formam e da aleatoriedade das mudan~as / na configura~ao espacial da moIecula. ~~ Em geral, quanta maior 0 peso molecular, mais facilmente a protefnasera desnaturada pelo calor. A ausencia de estrutura quaternaria' e uma quantidade maior de pontes dissulfeto tambem conferem maior resistencia a desnatura~ao termica. Toxinas proteicas como a produzida pelo C.botullinum e a ricina da mamona (PM ::::: 0.000) sac facilmcnte inativadas a 190C, enquanto que 0 fator alergenico CB-lA da 5 mamona (PM::::: 11.000) precisa ser inativado a 120C. "

:.,1

Fora os processos de desnatura~ao por acli~ao de calor, a subtra~ao de calor ate 0 congelamento ",. tambem costuma desnaturar irreversivelmente algumas proteinas. Certas enzimas, no entanto, nao desnaturam e ate conservam atividade a temperaturas de -40C, como ocorre com a a-galactosidase, que degrada as oligossacarideos do amendoim e da soja. Lembrando que na maioria dos metodos de estocagem a desnatura~ao proteica nao e ainda desejavel, e pertinente salientar que quanta mais Tllpido for 0 congelamento menos desnaturante esse processo sera. 0 mecanismo pelo qual ocorre esta desnatura~o e menos evidente do que aquele das altas temperaturas, mas deve estar relacionado com a mudan~a da for~a innica e a constante dieletrica no microambiente da proteina. As mudan~as de solvente, de for~a i6nica e 0 acrescimo de substincias que quebram as p()?te~ d:eH estruturais ou as intera~6es de van der Waals causam desnatura~ao tanto reversivel quanta irreversivel, 'dependendo do tipo de protefna e da severidade do tratamento. A extra~ao em solu~ao de alcool
"-

aparentemente nao causa dano nenhum as prolaminas de sementes, ate por que nao se conhece em detalhe o tipo de estrutura superior que elas possuem. No entanto, a precipita~o com acetona' das albumin as cloToplasticas de folhas acarreta sua desnatura~ao permanente. Da mesma forma que a mudan~a do solvente altera a ccinstante dieletrica segundo a equa~ao 3.1.
E

do meio, a presen~a de

SaIS aumenta a condutividade ou entao diminui E, 0 que, por sua vez, muda a for~a das liga~6eseletrostaticas

onde q e q' sap as cargas dos grupos que interagem rea distancia entre elas

que uma diminuic;ao de leva ao encurtarnento automatico de r, 0 que ocasipna \.1[.Fl'O grande aumento de F. A tendencia da proteina com 0 abaixarnento de , portanto, e colapsar intem~~ente. Quando 0 objetivo e obter-se urn preparado cnzimatico pouco desnaturado, pode-se acrescentar etanol, propanol ou acetona a -15C a soluc;ao enzimatica previamente mantida a Oc. Logo ap6s, 0 precipitado devera ser redissolvido em tampao a OCe desidratado por liofilizac;ao.As baixas temperaturas evitam a agitac;aotermica e as chances de interay6es estranhas.

E faci! observar

E comum acrescentar-se

NaCI a extratos alco6licos visando a remoyao, por precipitayao, de proteinas

interferentes. Urn processo de resultados semelhantes ao anterior porem de mecanismo urn tanto diferente e que leva a desnaturayao permanente e 0 da precipitac;ao de proteinas com acetato de Pb. A desnaturac;ao aqui ocorre pela ligayao irreversivel do elemento ou ion pesado com cadeias latera is dos aminoacidos HIS, TRP, LYS, ARG, (CYS)2, etc., atraves dos pares de eletrons nao-compartilhados que se alojam nos orbitais superioresd efvazios do metal. Essas ligac;6esocorrem intra e intermolecular mente seqiiestrando e tirando da soluc;ao enormes redes moleculares. A forma basica do acetato de ~hunpP e mais efetiva devido ao aumento do poder nucleofilico dos elementos N, S e 0, doadores de eletrons em meio .alcalino. Mudanc;as no pH do meio, desde que nao sejam extremas ( Iou 1,5unidades) em tomo do pH natural, causam desnaturac;ao reversivel nas estruturas terciarias da maioria das proteinas. Tais alterac;6es sap uma resposta ao maior ou menor grau de dissociac;aodas cadeias laterais ionizaveis que result am em maiores ou menores (e ate
0

desaparecimento de) foryas de atrac;ao responsaveis em parte pelas estruturas terciarias.

Para melhor entender a precipitayao e a desnaturac;ao ocasionadas pelas mudanc;as de pH, e conveniente que se tenha antes uma visao global da solubilidade das protefnas em meio aquoso em func;ao do pH. Por razao dos diversos pK, tanto acidos quanta basicos, uma proteina deve possuir urn ponto isoeletrico, isto 6, urn pH onde a sornat6ria das cargas positivas seja igual a das cargas negativas. Para as proteinas de maior expressao nos tecidos vegetais ou animais, 0 pI se encontra em tomo de 4,6 (figura 3.3). o ~n.funeno_da_~olubilidade de. uma .proteinadevc.se.rvisulllizado como a capacidade de urn nfunero s~stancial de grup;~'p~i~~'esk;~~iizado~ na superficie da mesma se solvatar na agua atraves de pontes de tCCrn'6mero de grupos pol~.I"es inevitavelmente dependera das ~struturas primaria, secundaria, etc, que, em illtull."a uistancia, dete-;~inarao tamb6m a densidade e a forma da macromolecwa. A capacidade de --SOlv~lta~Ko,opoi~m, depe~d~;aodo pH e da forya i6nica Il- do solvente. Deixando Il- constante e aproximando-nos do ponto isoeletrico da proteina pe!o lado alcalino na escala de pH da figura 3.3, podemos imaginar urn numero cada vez maior de cargas se neutralizando intra e intermolecularmente, forrna:ndo assim enormes complexos eletrostaticos, excluindo a agua do microambiente molecular e eliminando gradativamente pontes de H dos grupos polares que vao sendo neutralizados. Quando 0 nfunero possive! de cargas positivas e negativas atingir 0 maximo, a carga liquida da proteina sera zero, tendo-se chegado ao ponto de solubilidade minima (figura 3.4).

100 80 60 40

CD
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. H H-O"

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Figura 3.4 Ilustrac;ao diagramatica da solubilidade de uma protefna em termos de pontes de H e em funC;aodo pH. Os numeros proximos das cargas dao uma ideia de sua magnitude. No extrema acido da escala, as pontes sac impedidas, enquanto que no extremo alcalino elas nao 0 sao.

A medida que diminulmOS0 pH e nos afastamosdo pI (figuras 3.3 e 3.4; pH < pI), vemos urn novo aumento da solubilidade, provavelmente devido a diminui~ao do numero de cargas negativas e ao aumento das positivas, 0 que resulta em carga liquida positiva. 0 excesso de carga positiva na macromolecula fad. com que suas partes se afastem, quer pelo enfraquecimento das for~s eletrostaticas de atra~ao, quer pelo aparecimento de for~s de repulsao. A abertura da estrutura molecular possibilita 0 restabelecimento de grande numero de liga~6es de H entre a protefna e 0 solvente, a molecula de HOH sendo receptora tanto de H quanta de fons de H +. Continuando a diminuir 0 pH, a concentral;ao de H3+0 torna-se crftica observando-se uma nova queda na solubilidade, pais existe uma forte competi~ao entre os H e H + da macromolecula e 0 excesso de H + do meio, isto e, nao ha suficientes mo\eculas de HOH capazes de funcionarem como receptor as em pontes de H. Dito de outra forma, a dupla fun~3.oda agua como receptora e doadora de hidrogenio (atomos ou fons), vital na ponte de H, deixa de existir por forl;a da satural;3.0 da agua com os H + do acido acrescentado. 0 valor de pH no qual a protefna se precipita varia s~ndo a protein a mas, em geral, esta abaixo de 2,0 (pH < < pI). .~",--'
Temos entao que 0 maximo registrado na solubilidade na faixa de pH < pI e devido a ocorrencia de dois eventos simultaneos mas de efeitos contrapostos: urn que oferece novos sftios da macromolecula para pontes de H e outro que vai quebrando pontes pela inaceptabilidade dos H. Quando 0 pH e aumentado acima do pI, ha urn excesso de cargas negativas que garantem a manuten~ao de pontes de H e 0 esticamento da cadeia polipeptfdica, 0 que possibi\ita a solubilidade da proteina. Ja na regiao pH > > pI, a solubilidade progride devido ao aumento do numero de grupos com cargas negativas (sulfidrila da CYS e fen61ico da TYR), ocorrendo que nao apenas podem se estabelecer novas pontes de H como a concentra~ao crescente de fons OH nao afeta adversamente as pontes. Aqui a proteina funcionara apenas como receptora de H, ao passo que 0 OH' continua sendo receptor e doador. A solubilidade da maioria das proteinas esta sensivelmente re\acionada com a for~a ionica,u da solu~~o. No ponto isoeletrico, as intera~6es protefna . protefna atingem seu maximo. Se nesse ponto ainda conseguissemos reduzir as intera~6es proteina-solvente, a insolubilidade da proteina poderia ser total. A '\ protefna precipitada em seu pI mediante a adi~ao de um sal chama-s~.p':.()(e[na isoeletrica, e 0 fenomeno denomina-ses'!lt.t,!gout. Quando 0 processo e realizado sistematicamente e mantendo-se-atemperatura entre I 0 e 2C, diversos tipos-de protefnas hidrossoluveis podemser fracionados ou separados com re\ativamente pouca desnatura~ao. 0 metodo e bastante simples, requer apenas 0 uso de centrifuga comum, pode ser usado \ para separar gran des quantidades de proteina mas proporciona baixo fndice de pureza. Para detalhes sobre o procedimento de salting - out com sulfato de amonio, ver Green e Hughes (1955). A dependencia que existe entre a solubilidade de uma protefna e a for~a ionica,u pode ser vista mais claramente num pH longe do pI. Na figura 3.5 poclemos observar 0 efeito de varios sais na solubilidade da carboxiemoglobina. E facil notar que, para essa proteina, os sulfatos de amonio e potassio (anion divalente e cation monovalente) sao os mais eficientes na precipita~ao. Quando a for~a ionica e baixa, a solubilidade e escassa, especialmente para as globulinas, talvez devido a falta de uma certa condutividade do meio. Com o aumento da concentra~iio do sal, ocorre a estabiliza~iio dos grupos carregados da protefna; isto e, diminui o coeficiente de atividade (lgy IX,u112),0 que redunda em beneficio da solubilidade. A precipita~ao que se observa com maiores concentra~6es do sal e provavelmente 0 resultado da competi<;aodos fons inorganicos com os ions proteicos pela agua disponlvel para so\vat~.2-,,--~---/ A solubilidade da protefna obedece a uma re\a~ao semilogaritmica com respeito it for<;aionica da " solu~ao, como aparece na equa<;iio3.2.

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onde Sea solubilidade


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</ f3 it'solubilidade na ausencia de sal.

(interse<;ii.o tangente da curva sobre a ordenada). da ,u e a for<;aionica ~ I CiZi2 e Ks a constante de salling oUl.
2

As globulinas, portanto, sac bast ante sensiveis ao efeito -=:=-=--=---"---'-; e e devido a essa peculiaridade que sa/tingjn, podemos separar as globulinas dasalbuminas com tanta facilidade - ai,nda que grosseiramente.

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2,0

For~o ionica

Em concentra<;6es muito pequenas de sa!, O,OOlM NaCI (pH 5,4), a solubilidade da ,B-Iactoglobulina, por exemplo, e 0,02%, mas essa solubilidade aumcnta com a concentra<;ao de sal ate atingir 0,3%, quando a concentra<;ao do sal e 0,02M. Alem do tipo de protefna, uma serie de outros fatores determina os parametros da equaao 3.2. A temperatura, 0 pH, 0 tipo de sal; a concentraiio da protefna. etc. modificam a solubilidade. Por exemplo, a medida que a temperatura aumenta e as condi'Soes de pH se afastam do pI, 0 valor de f3 aumenta. Agentes como a ureia ((NHz)zC=O), 0 hidrocloreto de guanidfnio ((NHz)zC=NHi CI) e outras amidas de baixo peso molecular tem a propriedade de desnaturar as protefnas, aumentando sua solubilidade em agua por urn mecanismo que ainda esta em discussao. Linus Pauling propos em 1936 que 0 poder desnaturante dessas arnidas est a na sua capacidade de quebrar as ligaoes de H da estrutura superior. Outros autores, porem, contestaram mais tarde essa teoria, sugerindo a existencia de "urnefeito de solubilizaao dos grupos Ilao-polares" imposto pelas altas concentra<;oes de ureiaou guanidfnio (ver Kilara e Sharkasi, p.329). Os dois argument os, contudo, nao sao excludentes, sendo que urn efeito combinado de quebra de pontes de H estruturais e "solubilizaao" de grupos nao-polares e talvez 0 que deve ocorrer.

da proteina, par sua vez, pode ser.v~o tafito como uma "inte.ra~o dos grupos amfdicos" sobre os residuos hidrof6bicos (Robinson e Jenks) quanto como uma altera~o das propriedades dieletricas do solvente. Na realidade,
. .

o efeito da solubiliza~ao dos grupos nao-polares

esses agentes sac usados como supersolubilizantes


.
.

das macromoleculas

em

concenti"a~es de ate 8M, como no caso da ureia.O NaHC03, em concentra~6es de ate 4%, e tambem um agente desnaturante-solubilizante de proteinas. Agentes que desnaturam as proteinas por quebra das intera~6es de van der Waals sac detergentes de tipo SOS (sodium dodecyl sulfate ou SLS sodium lauryl sulfate), que sac capazes-d~ pen~trar nas regioes hidrof6bicas das macromoleculas para se ligarem as cadeias nao-polares, dando-lhes a compatibilidade necessaria com 0 meio polar. 0 efeito desses fortes detergentes nas estruturas superiores e tao dramatico, que concentra~es de SOS inferiores a 0,1 % podem causae a inversao e a inativac;aototal de uma enzima em soluC;ao.

!a

que estes dois 6ltimos tipos de agentes desnaturantes nao possuem antagonismo funcional,
0

. costuma-se empregar

sistema desnaturante ureia 6-8M e SOS 0,5 - 1% como meio de "esticar" qualquer

proteina nativa ou complexos delas, desde que nao apresentem liga~es dissulfeto. Vma vez acrescentados esses agentes desnaturantes, e praticamente imposslvel remove-Ios completamente, porem e POSSlVel reduzir sua concentra~o por dialise, obtendo-se assim algum grau de renatura~o das proteinas.

A desnatura~o ocasionada por meios quimicos envolve quebra ou forma~o de ligac;oescovalentes e e geralmente irreversivel. As rea~oes mais usuais sao as de 6xido-redu~ao que agem sabre grupos -SH e oS-So, respectivamente. Pode ainda ocorrer desnaturaC;ao atraves de prote6lise ou mediante a a~o da radiac;ao \ VV, ionizante ou, talvez, no momenta de se efetuar uma modifica~o qufmica. Um exemplo que mostra de forma muito clara oefeito desnaturante da quebra de uma ligaC;ao peptidica eo da a~o da renina na precipita~o da caseina do leite. A a-caseina e uma fosfoproteina de 199aminoacidos (variante genetica B) que, em razao de sua estrutura terciaria, nao e soluvel em pH inferior a 9. No leite, ela se encontra num arranjo quaternario semi-soluvel com moleculas de K-caseina, como aparece na figura 3.6. A K-caseina e uma fosfoglicoproteina de 169 residuos que se associa atraves da regiao hidrof6bica as submicelas insoluveis das caseinas a e f3, formando assim a micela das caseinas.
i

A renina, com especificidade proteolitica sui generis, cliva a ligac;aopeptidica PHE(105) - MET(l06) da /C-caseina,liberando 0 glicopeptideo mais hidrofilico (63 residuos), que fica em soluc;ao,e a/C-paracaseina. Esta ultima permanece provavelmente associada ao complexo das caseinas que, por perder pader de sustentac;ao no meio aquoso, precipita formando 0 coagulo do queijo. A desnaturac;ao da micela e evidente, mesmo que ela tenha sido descaracterizada pela perda de glicopeptideo hidrossoluvel.

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hidrofobico \J . \

Figura 3.6

RepresentalJao esquematica da micela das caselnas. (a) submicela composta por associalJao hidrof6bica das caselnas a, f3 e /C.:(b) as submicelas se associam em micelas atraves de pontes de sal com Ions ea2+.

Salvo em poucos casos de modificac;ao quimica limitada em que se acrescenta urn grupo facilmente removivel, como a substituic;ao do grupo a-NHz com anidrido maleico ou a reduc;ao de algumas pontes dissulfeto com mercaptoetanol, as desnaturac;6es qufmicas sao praticamente irreversiveis. E importante deixar claro que tal irreversibilidade nao significa necessariamente a deteriorac;ao das propriedades funcionais da proteina e sim apenas sua modificac;iio.Rea<;6esde modificac;ao e deteriorac;ao quimicas sao o tema dos capitulos seguintes. Deve ser enfatizado, tambem, que a combinac;aode agentes desnaturantes produz sempre efeitos mais drasticos e violentos do que quando usados individualmente. Por exemplo: a adic;ao de calor a qualquer urn dos metod os, seja mecanico ou fisico-quimico. Em pH 2 e a 40C, ba desamidar;ao das GLN e ASN, assim como oxidac;ao e quebra do anel do TRP, enquanto que, em pH 10 e sob a mesma temperatura, formam-se ligac;6es cruzadas entre as CYS e LYS, ha f3 eliminac;iio de grupos eletronegativos e racemizac;ao de aminoacidos.