Você está na página 1de 16

Quim. Nova, Vol. 30, No.

5, 1323-1338, 2007 ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO E DE NITROGNIO, ANTIOXIDANTES E MARCADORES DE DANO OXIDATIVO EM SANGUE HUMANO: PRINCIPAIS MTODOS ANALTICOS PARA SUA DETERMINAO Sandra Mary Lima Vasconcelos Faculdade de Nutrio, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-970 Macei - AL, Brasil Marlia Oliveira Fonseca Goulart* Instituto de Qumica e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-970 Macei - AL, Brasil Jos Benedito de Frana Moura Hospital Universitrio, Universidade Federal de Alagoas, Tabuleiro do Martins, 57072-900 Macei - AL, Brasil Vanusa Manfredini e Mara da Silveira Benfato Departamento de Biofsica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonalves, 9500, 91501-970 Porto Alegre - RS, Brasil Lauro Tatsuo Kubota Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas - SP, Brasil Recebido em 1/2/06; aceito em 9/1/07; publicado na web em 2/7/07

REACTIVE OXYGEN AND NITROGEN SPECIES, ANTIOXIDANTS AND MARKERS OF OXIDATIVE DAMAGE IN HUMAN BLOOD: MAIN ANALYTICAL METHODS FOR THEIR DETERMINATION. We review here the chemistry of reactive oxygen and nitrogen species, their biological sources and targets; particularly, biomolecules implicated in the redox balance of the human blood, and appraise the analytical methods available for their detection and quantification. Those biomolecules are represented by the enzymatic antioxidant defense machinery, whereas coadjutant reducing protection is provided by several low molecular weight molecules. Biomolecules can be injured by RONS yielding a large repertoire of oxidized products, some of which can be taken as biomarkers of oxidative damage. Their reliable determination is of utmost interest for their potentiality in diagnosis, prevention and treatment of maladies. Keywords: biomarkers of oxidative stress; oxidative and nitrosative stress; antioxidants.

INTRODUO O balano redox em lquidos biolgicos, organelas, clulas ou tecidos determinado pela presena de pares redox responsveis pelo fluxo de eltrons. Esses sofrem freqentes interconverses entre o estado reduzido e o oxidado. Alguns desses pares redox so interligados (redox cycling), outros constituem sistemas redox independentes. O balano redox, na clula, relaciona-se soma dos produtos do potencial de reduo e da capacidade redutora de uma srie de pares redox, acoplados, presentes. A capacidade redutora pode ser estimada pela determinao da concentrao de espcies reduzidas em um par redox e, o potencial de reduo, pelo emprego da Equao de Nernst1. Em termos matemticos, isto pode ser representado por:

de reao com molculas-alvo e da compartimentalizao celular destes processos, em que fatores de solubilidade e difusibilidade so determinantes2. ESTRESSE OXIDATIVO A produo de espcies reativas de oxignio (ERO), de nitrognio (ERN), entre outras espcies reativas, parte integrante do metabolismo humano e observada em diversas condies fisiolgicas. ERO e ERN tm importante funo biolgica, como na fagocitose, fenmeno em que essas espcies so produzidas para eliminar o agente agressor. Por outro lado, quando sua produo exacerbada, o organismo dispe de um eficiente sistema antioxidante que consegue controlar e restabelecer o equilbrio. O estresse oxidativo resulta do desequilbrio entre o sistema pr e antioxidante1,3, com predomnio dos oxidantes, com dano conseqente (Figura 1). A clula, unidade da vida, uma verdadeira usina de pr e antioxidantes (Figura 2). A Tabela 1 traz um resumo da natureza das principais espcies, de sua gerao e destino. AO DE ESPCIES REATIVAS SOBRE MACROMOLCULAS Em sistemas biolgicos, a membrana celular constitui um dos focos de atuao de ERO, de ERN e de outras espcies reativas (Figura 1, Tabela 1) e sua funo vital para a clula (Figura 2). Alm da membrana que envolve a clula, as membranas das

onde Ei o potencial de reduo da semi-clula para um dado par redox e [espcie reduzida]i a concentrao das espcies reduzidas em um par redox. Mudanas no balano redox de sistemas biolgicos podem causar o estresse oxidativo1. A intensidade e patogenicidade destes desequilbrios vo depender, naturalmente, das concentraes locais de espcies pr e antioxidantes, das constantes de velocidade

*e-mail: mofg@qui.ufal.br

Divulgao

1324

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

Figura 1. Fontes e respostas celulares s Espcies Reativas (ER) de Oxignio (ERO), de Nitrognio (ERN), derivados de Enxofre (ERS), de Cloro (ERCl), de carbono (ERC) e metais de transio [M n+)]. Oxidantes so gerados do metabolismo normal como na mitocndria, em peroxissomas e em uma variedade de enzimas citoslicas. Existem diversas fontes exgenas de produo de ER. Os sistemas de defesa antioxidante enzimtico e no enzimtico, quando eficientes, mantm a homeostase fisiolgica e quando esto ineficientes, permitem a instalao do estresse oxidativo, representado pelo dano celular em macromolculas como o DNA, protenas e lipdios, que se expressam clinicamente como envelhecimento ou doena. Adaptado da ref. 3

Figura 2. A clula como fonte de espcies reativas (ER). (A) Fontes celulares de ERO, ERN e outras, por ao de vrias enzimas. A capacidade de uma via especfica produzir ER varia com o tipo de clula e com o dano em curso; p. ex., na fagocitose, as NADPH oxidases da membrana de neutrfilos e macrfagos so particularmente ativadas e reduzem O2 a O2, a partir de um burst respiratrio necessrio para eliminar o agente agressor. (B) Distribuio dos antioxidantes, enzimas de desintoxicao e protenas de ligao a metais de transio que compreendem o sistema de defesa dentro das membranas e organelas celulares

Tabela 1. Natureza, gerao e destino de espcies radicalares (ou seus intermedirios) biologicamente importantes Espcies derivadas do oxignio nion-radical superxido O2 Gerado continuamente por diversos processos celulares (cadeia de transporte de eltrons na mitocndria, no microssomo, atravs enzimas como xantina oxidase e NADPH oxidase), ou pela reduo monoeletrnica de O2. Rapidamente desaparece em soluo aquosa por reao de dismutao: O2 + O2 + 2H+ H2O2 + O2 Em soluo aquosa um forte agente redutor. Sua habilidade em reduzir Fe3+ a Fe2+ pode acelerar a reao de Fenton: O2 + Fe3+ Fe2+ + O2 Em soluo aquosa um oxidante fraco, porm pode formar ERN: O2 + NO ONOO permevel a membranas. Em fagcitos, como neutrfilos e macrfagos, um dos microbicidas mais importantes. Intermedirio formado pela reao de dismutao de O2 catalisada pela enzima SOD, pela reduo de 2 ena molcula de O2 e pela ao de diversas enzimas oxidases in vivo, localizadas nos peroxissomas. muito difusvel dentro e entre as clulas in vivo. um fraco agente oxidante e um fraco agente redutor, reage lentamente com tiis, com sais de ferro e cobre reduzidos, com protenas heme e peroxidases para iniciar reaes radicalares e peroxidaes lipdicas. Em presena de metal de transio gera OH, atravs da reao de Fenton Fe2+ + H2O2 Fe3+ + -OH + OH

Perxido de hidrognio H2O2

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1325

Tabela 1. continuao Radical hidroxila OH o mais reativo e mais lesivo radical conhecido e para o qual, uma vez formado, o organismo humano no dispe de mecanismo de defesa, reage com uma srie de endobiticos, causa modificao no DNA (com modificao das bases e quebras das fitas), danos nas protenas e inativao enzimtica, peroxidao lipdica. mbito limitado de ao (poucos dimetros moleculares). Formados durante a decomposio de perxidos orgnicos e reaes de carbono radicalar com oxignio, como na peroxidao lipdica.

Radicais peroxila (RO2) alcoxila(RO) Oxignio singlete 1O2*

Estado eletronicamente excitado do oxignio, produzido por reaes fotoqumicas ou por outras radiaes; reage com um grande nmero de molculas biolgicas, incluindo lipdeos da membrana, iniciando processos de peroxidao. 1O2* pode ser gerado, entre outras reaes, por transferncia de energia a partir de um sensibilizador S, no estado excitado tripleto (3S*) (porfirinas, clorofila e riboflavina) para o oxignio. O sensibilizador S absorve energia e deixa o estado fundamental singlete (S), passando para o estado excitado singlete (1S*), a partir do qual convertido, por cruzamento intersistema, para o estado excitado triplete. 1 3 (3S*): S S* S* ; 3S* + 3O2* S + 1O2* Produzido no ar atmosfrico poludo e por fonte de luz intensa de algumas fotocopiadoras e outros equipamentos. extremamente danoso ao pulmo, oxidando rapidamente protenas, DNA e lipdeos. Espcies derivadas do nitrognio e cloro

Oznio O3

cido hipocloroso HOCl

Espcie no radicalar, membrana-permevel, oxida um grande nmero de compostos biolgicos, como tiis e tioteres, aminas, fenis e ligaes insaturadas, mais seletivo que o radical hidroxila, oxida ferro e protenas. Produzido por fagcitos ativados, reage com O2 para formar OH HOCl + O2 OH + OH + O2 produzido no miocrdio, como resultado de invaso de clulas inflamatrias. Sintetizado nos organismos vivos pela ao da enzima xido ntrico sintase (NOS), que converte o aminocido L-arginina a NO + L-citrulina (outro aminocido). um radical abundante que age em uma variedade de processos biolgicos, incluindo relaxao muscular, neurotransmisso e regulao imune. Originalmente identificado como fator relaxante derivado do endotlio (endothelium-derived relaxing factor: EDRF) um potente vasodilatador, envolvido na regulao da presso arterial. Difunde-se rapidamente entre e dentro das clulas. Quando exposto ao ar, reage com oxignio para formar NO2. 2NO + O2 2 NO2. Reage rapidamente com O2 e produz o intermedirio ONOO O2 + NO ONOO Formado a partir da exposio de NO ao ar ou da protonao de peroxinitrito 2NO + O2 Potente iniciador da peroxidao lipdica em fluidos biolgicos. 2 NO2

xido ntrico ou monxido de nitrognio NO

Dixido de nitrognio NO2 Cloreto de nitrila NO2Cl

Formado a partir de misturas de NO2 e HOCl. Oxidante, agente de clorao e de nitrao, pode inibir fosforilao dependente de quinase de resduos de tirosina, provoca a clorao de resduos de tirosina (3clorotirosina considerada biomarcador). Intermedirio formado pela reao O2 + NO ONOO Instvel, tempo de vida curto, oxidante potente, propriedades semelhantes ao radical hidroxila, causa danos a muitas molculas biolgicas, inclusive a grupos S-H das protenas, provoca hidroxilaao e nitrao de compostos aromticos. Forma OH independente da presena de metal de transio OH + NO2 Aps protonao, rearranja-se para nitrato (NO3-) e interage com bicarbonato ONOO + H+ (CO2/HCO3-), com alterao de sua reatividade. [NO2 OH] NO3 ONOOH Em presena de CO2, o peroxinitrito forma o peroxicarboxilato nitroso, que rapidamente se decompe, segundo as etapas 1 e 2. O CO2 est presente em elevada concentrao no compartimento intra e extracelular, o que favorece a formao do CO3, em presena de ONOO-. ONOO + CO2 ONOOCO2 NO2OCO2 (1) NO2OCO2 NO3 + CO2 (65%) (2) NO2OCO2 NO2 + CO3 (35%) O nion radical carbonato formado mediador de diversas reaes de oxidao e nitrao Oxidantes mais suaves e de vida mais longa que HOCl, reagem com tiis, tioteres e centros metlicos de ferro. Toxicidade varivel, dependendo da polaridade e da permeabilidade da membrana. Cloraminas de -aminocidos sofrem degradao para aldedos potencialmente txicos

Peroxinitrito ONOO

Cloraminas

1326

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

Tabela 1. continuao Espcies derivadas do enxofre Radical tila RS Denominao genrica para um grupo de radicais com o eltron desemparelhado residindo no enxofre. Formado quando um grupo tiol (RSH) reage com uma espcie radicalar (C, OH, RO, RO2, O2 , NO2 ou com metais de transio). Miscelneos e metais Fe, Cu, Mn, etc Catalisam reaes de radicais livres. Fe2+ em presena de O2 gera O2 que, por sua vez, pode reduzir Fe3+ a Fe2+ Fe2+ + O2 Fe3+ + O2 Fe2+ em presena de H2O2 gera OH (reao de Fenton) Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH Fe3+ em presena de H2O2 gera O2 de estudos de marcadores de dano oxidativo e de substncias antioxidantes em sistemas biolgicos. BIOMARCADORES Segundo Zwart e colaboradores8 e LaBaer11, os biomarcadores tm caractersticas passveis de avaliao e mensurao, como indicadoras de processos biolgicos normais, processos patognicos ou de resposta farmacolgica a uma interveno teraputica. Como tal, refletiriam mudanas em sistemas biolgicos relacionadas exposio ou aos efeitos de xenobiticos, ou outros tipos de fatores (aqui incluiramos aqueles relacionados a doenas). Eles podem ser classificados, segundo os mesmos autores 8,11 , como biomarcadores: de exposio, de efeito e de susceptibilidade. O biomarcador ideal deve reunir as seguintes caractersticas: mostrar alta especificidade para o efeito de interesse; refletir o efeito desde o incio; ser passvel de determinao e anlise fceis e de baixo custo; ser analisado por tcnica no invasiva, de alta sensibilidade, no fluido biolgico escolhido. Deve existir uma relao bem estabelecida entre a concentrao do biomarcador e a exposio ao agen-

organelas intracelulares, tais como mitocndria, retculo endoplasmtico, ncleo etc., apresentam uma estrutura bilipdica e uma variedade de protenas e acares4,5 (Figura 2). O dano celular resulta basicamente de ataque de ERO e ERN sobre as macromolculas, tais como acares (CHOH)n, DNA, protenas e lipdios, conforme mostrado na Tabela 2. H fortes evidncias de que o estresse oxidativo tem importncia capital nos processos de envelhecimento, transformao e morte celular, com conseqncias diretas em muitos processos patolgicos, entre eles, a induo do cncer e a propagao de AIDS em pacientes soropositivos (HIV+), bem como na fisiopatologia de muitas doenas crnicas, entre elas, doenas auto-imunes, cardiopatias, cncer, doenas do pulmo, intoxicao por xenobiticos e muitas outras (Tabela 3)6-10. Por outro lado, tambm fato reconhecido que ERO e ERN desempenham papis fisiolgicos importantes como o controle da presso sangnea, na sinalizao celular, na apoptose, na fagocitose de agentes patognicos, na fertilizao de ovos e no amadurecimento de frutos. Esse tpico ser reavaliado no final deste artigo. O reconhecimento dessa relao estimulou o desenvolvimento

Tabela 2. Atuao das principais espcies radicalares (ou seus intermedirios) sobre endobiticos Endobitico Acares (CHOH)n cidos nucleicos Sumrio das reaes mais importantes

OH reage com (CHOH)n por abstrao randomizada de um tomo de H de um dos tomos de C, produzindo um radical centrado no carbono. Isto leva quebra da cadeia de importantes molculas, tais como o cido hialurnico. ERO, principalmente OH, ataca o acar desoxirribose (principalmente em 4 e/ou 5) e as bases purnicas (adenina e guanina) e pirimidnicas (timina, citosina e uracila), com ataque preferencial guanina, gerando 8hidroxi- ou 8-oxoguanina5, mutagnicas. Como resultado, ocorre a quebra da cadeia do DNA, a ligao cruzada entre as fitas e modificaes nas suas bases levando a mutaes e apoptose. As protenas tm muitos stios reativos5. Durante o estresse oxidativo, o primeiro evento a formao de um radical centrado no carbono, por extrao de H do carbono , em uma ligao peptdica, da, ocorre fragmentao das cadeias e oxidao de quase todos os tipos de aminocidos, com produo freqente de compostos carbonilados, particularmente a partir de prolina, arginina e lisina (Figura 8). Essa modificao (contedo em protenas carboniladas) facilmente mensurvel. Adicionalmente, protenas podem conter stios de ligao com metais que so especialmente susceptveis a reaes reversveis de oxidao e reduo, as quais podem produzir uma seqncia de sinais que podem ser reconhecidos por proteases celulares especficas que degradam tais protenas. Muitas protenas intracelulares tm grupos sulfidrila reativos em resduos de cistena, que podem ser oxidados a dissulfeto ou cidos cisticos, que podem ser novamente reduzidos metabolicamente. Similarmente, muitas protenas tm um aminocido metionina que pode sofrer modificao reversvel a sulfxido ou sulfona. Os aminocidos aromticos formam quinurenina, grupos cateclicos e polmeros. H formao de produtos de adio com perxidos lipdicos e com hidroxialdedos derivados de lipdeos insaturados.

Protenas

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1327

Tabela 2. continuao Endobitico Lipdeos Sumrio das reaes mais importantes A peroxidao lipdica causada pelo ataque de uma ER (geralmente OH), que abstrai um tomo de hidrognio (H) de um grupo metileno allico, normalmente, de um cido graxo poli-insaturado, deixando um eltron desemparelhado no carbono, caracterizando a etapa de iniciao. Este radical usualmente estabilizado por rearranjo molecular, formando um dieno conjugado. Sob condies aerbicas, o carbono radicalar do dieno conjugado reage com O2 (que uma molcula hidrofbica e, portanto, se concentra no interior das membranas) e forma o radical peroxila. Este radical peroxila capaz de abstrair H de molculas de lipdeos adjacentes, cujo carbono radicalar sofre novo rearranjo, reage com O2 e forma outro radical peroxila e assim sucessivamente, caracterizando a reao em cadeia da etapa de propagao. O radical peroxila combina-se com o H abstrado, gerando o lipdeo hidroperxido (LOOH) que ao sofrer quebra, forma aldedos como malonaldedo e 4hidroxinonenaldedo, entre outros. Na decomposio dos hidroperxidos lipdicos so gerados radicais peroxila e alcoxila atravs da reao de Fenton. A terceira e ltima etapa da peroxidao lipdica, a etapa de terminao instala-se com a neutralizao dos radicais formados por ao de antioxidantes lipossolveis (-tocoferol, caroteno, NO) ou pela reao de dois radicais lipdicos formando produtos no radicalares. Nos sistemas biolgicos, a peroxidao lipdica pode ocorrer por via enzimtica (ciclooxigenases e peroxidases) e por via no enzimtica (auto-oxidao) cujo mecanismo supracitado envolve a participao de espcies reativas de oxignio, metais e outros radicais livres. Pode ocorrer peroxidao de estruturas supramoleculares, como em fosfolipdeos e em agregados de lipoprotenas5. Todas estas modificaes oxidativas causam mudanas nas propriedades fsicas e qumicas das membranas, alterando sua fluidez e permeabilidade, com expanso do lquido intracelular e risco de ruptura das membranas da clula e das organelas, com conseqente morte celular. Reaes envolvendo os vrios intermedirios entre si levam a novos produtos, por ex., malondialdedo (MDA) reage com o grupo amina de purinas e HNE reage com guanosina, entre outras reaes.

Tabela 3. Doenas selecionadas, relacionadas ao estresse oxidativo Doena Aterosclerose, Sndrome de Bloom, Sndrome de Down, Kwashiorkor, Doena de Keshan Doena de Parkinson, estados txicos causados por lcool, fumo, CCl4 etc. Doena de Alzheimer, Asma, Artrite reumatide, asbestose, Sndrome de Insuficincia Respiratria do Adulto Esclerose mltipla Doena granulomatosa crnica Diabetes mellitus, anoxia, injria da reperfuso, pr-eclmpsia Hipertenso arterial sistmica Hemocromatose idioptica, talassemia, anemia falciforme, doena de Wilson Doena granulomatosa crnica, Deficincia de enzimas antioxidantes (Acatalassemia, por ex.) Natureza do envolvimento com ER Falha ou consumo excessivo de defesas antioxidantes. Uso de drogas e toxinas. Na doena de Parkinson as toxinas produzidas estariam envolvidas com a produo de radicais livres. Produo de O2, H2O2 e HClO por clulas fagocticas ativadas. Perturbao estrutural da clula. As hemcias tornam-se mais susceptveis ao dos radicais livres. Defeito gentico no sistema antioxidante. Oxidao anormal de substratos ou mudanas na concentrao de oxignio. Produo de O2 por NADPH/NADP oxidase. Transferncia de eltrons ao oxignio por metais de transio. Defeito gentico no sistema antioxidante, especificamente o sistema NADPH oxidase.

te, ao dano induzido e susceptibilidade pesquisada. A Tabela 4 exemplifica alguns biomarcadores para doenas selecionadas12. til ressaltar que a rea de biomarcadores se encontra em desenvolvimento exponencial e no h qualquer pretenso, no presente artigo, de esgot-la em profundidade. ANLISE DE BALANO REDOX DE UM ORGANISMO EM AMOSTRAS DE SANGUE No caso de estresse oxidativo, os marcadores de balano redox, no invasivos, refletiriam o dano causado pelas ERO e ERN sobre o sistema biolgico e a eficincia da defesa antioxidante de contrapartida. Tratando-se desses biomarcadores, h um esforo mundial para sua validao multilaboratorial. Trabalhos de colaborao internacional, em andamento, liderados por Kadiiska13,14, utilizaram um modelo murino, aps injeo intraperitoneal de CCl4, com pes-

quisa de marcadores de balano redox em sangue, plasma e urina de ratos tratados com esse xenobitico, segundo protocolos bem estabelecidos13. Neste trabalho, dar-se- nfase caracterizao de alguns biomarcadores quantificveis em sangue humano e s tcnicas mais empregadas para sua anlise. Vale salientar que outros fluidos biolgicos, como urina, saliva, suor e at mesmo o ar expirado, que trariam informaes de produtos volteis de peroxidao lipdica8, so tambm utilizados para anlise de biomarcadores de balano redox; contudo, no fazem parte do escopo dessa reviso. O sangue total constitudo de elementos figurados que so eritrcitos e leuccitos, soro e plaquetas ou elementos da coagulao. O plasma compe-se da parte lquida do sangue, separada das clulas sanguneas e o soro constitui-se do plasma sem os fatores de coagulao, tais como fibrina15. O sangue humano uma excelente fonte de marcadores in vivo

1328

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

Tabela 4. Biomarcadores de dano oxidativo associado com algumas doenas humanas Doenas Cncer Doena cardiovascular Artrite reumatide Doena de Alzheimer Biomarcadores de dano MDA, razo GSH/GSSG, NO2-Tyr, 8-OH-dG HNE, razo GSH/GSSG, acrolena, NO2-Tyr, F2-isoprostano razo GSH/GSSG, F2-isoprostano MDA, HNE, razo GSH/GSSG, acrolena, NO2-Tyr, F2-isoprostano, AGE HNE, razo GSH/GSSG, protenas carboniladas, nvel de ferro razo GSH/GSSG, F2-isoprostano MDA, HNE, acrolena, NO2-Tyr, F2-isoprostano, NO2-Tyr MDA, razo GSH/GSSG, protenas S-glutationadas, NO2-Tyr, F2-isoprostano, AGE.

tanos, lipoperxidos e outros derivados da peroxidao lipdica das membranas celulares.

Doena de Parkinson Isquemia reperfuso Aterosclerose Diabetes mellitus

Figura 3. Reao utilizada no ensaio TEAC ou Teste do ABTS. A capacidade antioxidante determinada a partir da leitura da inibio do ction radical 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de diamnio) - ABTS+, produzido nesta reao

Fonte: Adaptada da ref. 90 de estresse oxidativo, uma vez que nele so transportados e redistribudos antioxidantes e endobiticos modificados por ao de ERO e ERN. considerado uma amostra biolgica nica, potencialmente mais informativa, j que, obtida de um indivduo, pode descrever seu estado de sade no momento da coleta16. Pode ser obtido em larga escala, com uma quantidade relativamente grande de protenas (em mg), disponvel para estudo de numerosas condies e estados de sade17. A anlise do balano redox pode ser feita em soro, e/ou plasma e/ou eritrcitos. O sistema antioxidante sanguneo classificado em enzimtico e no enzimtico. O enzimtico representado, principalmente, pelas enzimas antioxidantes: a superxido dismutase (SOD) que catalisa a dismutao do nion radical superxido (O2) a perxido de hidrognio (H2O2) e O2 (Equao 1), a catalase (CAT) que atua na decomposio de H2O2 a O2 e H2O (Equao 2) e a glutationa peroxidase (GPx), que atua sobre perxidos em geral, com utilizao de glutationa como co-fator (Equao 3). O sistema antioxidante no enzimtico formado por muitas substncias, com destaque para a glutationa (GSH), principal composto antioxidante intracelular, tocoferis, ascorbato, cido rico e -caroteno, alm de protenas de transporte de metais de transio, como a transferrina (transporte do ferro) e ceruloplasmina (transporte do cobre e oxidao do ferro para ser captado pela transferrina)18. Os metais de transio so potenciais formadores de espcies reativas atravs da reao com outros compostos, uma vez que sofrem reaes redox. Decorre, da, a necessidade de serem transportados associados a protenas, impedindo que essas reaes ocorram. 2 O2+ 2H+ 2 H2O2 2 GSH + H2O2 H2O2 + O2 2 H2O + O2 2 H2O + GSSG (1) (2) (3)

As substncias envolvidas no binmio antioxidante pr-oxidante caracterizam o ambiente redox biolgico (Tabela 5) e podem ser quantificadas associando as tcnicas bioqumicas tradicionais de amostragem e determinao espectrofotomtrica, tcnicas cromatogrficas, eletroanalticas, de ressonncia magntica e espectrometria de massas18-20. Tal combinao possibilita relacionar o balano redox avaliado em indivduos com diferentes aspectos ambientais (poluio urbana, por ex.), demogrficos, tnicos, culturais, clnicos e nutricionais, surgindo assim uma importante ferramenta no estudo de fenmenos biolgicos vinculados ao estresse oxidativo. Tabela 5. Exemplos de biomarcadores de doenas Doenas Diabetes mellitus Exemplos de biomarcadores Glicemia, frutosaminas, hemoglobina A1c, avaliao da retina, neuropatia perifrica e nefropatia Nveis pressricos, angiotensina I e II, aldosterona, renina plasmtica, atividade da ECA (Enzima Conversora da Angiotensina) Citocinas, leucotrienos Testes de funo pulmonar, citocinas, leucotrienos

Hipertenso arterial sistmica Artrite reumatide Asma, DPOC (doena pulmonar obstrutiva crnica) Injria cardiovascular cTroponina I e T Doena heptica ALT (alanina amino-transferase) e GT (-glutamil-transpeptidase) Fonte: Adaptada da ref.12

O sistema antioxidante enzimtico e a glutationa esto presentes, predominantemente, no meio intracelular (Figura 2), da a utilizao do eritrcito para sua anlise. Por outro lado, o sistema antioxidante no enzimtico localiza-se, principalmente, no meio extracelular, sendo por isso analisado em plasma e soro. No sangue circulam importantes antioxidantes, a exemplo das vitaminas C, E, -caroteno etc., bem como biomarcadores do dano causado por ERO e ERN e outros, como malondialdedo (MDA), isopros-

No que se refere aos antioxidantes, alguns autores defendem o estudo da capacidade antioxidante total (CAOT), ao invs de anlise de antioxidantes isolados, principalmente devido interao que existe entre eles no plasma ou soro20. Na anlise da CAOT, leva-se em conta a ao acumulativa de todos os antioxidantes presentes; obtm-se um parmetro integrado, capaz de revelar nuanas acerca do delicado equilbrio redox existente in vivo. A medida de CAOT auxilia na avaliao dos fatores nutricionais, fisiolgicos e ambientais do balano redox em seres humanos20. Por outro lado, a anlise de antioxidantes ou marcadores de dano isolados, adequadamente escolhidos, pode facilitar a compreenso de situaes especficas como, por ex., a anlise de peroxinitrito (ONOO-) em doena vascular ou em inflamao associada leishmaniose. Outro aspecto a dualidade das informaes obtidas: um aumento da CAOT no , necessariamente, uma condio desejvel (p. ex., verificado em pacientes com insuficincia renal crnica), nem indesejvel, uma vez que pode ocor-

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1329

rer quando h uma diminuio na produo de ERO e ERN (p. ex., em ratos submetidos restrio calrica)21. O mesmo raciocnio aplica-se a um marcador isolado. CAPACIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL (CAOT) Os diversos testes propostos na literatura variam quanto ao tipo de radicais gerados, ao indicador de oxidao escolhido e ao mtodo usado para sua deteco e quantificao. So chamados ensaios de captao (trap assays). Em todos esses ensaios, um radical gerado e reage com molculas-alvo, para produzir cor, fluorescncia, quimioluminescncia, perda ou ganho de sinais de ESR (Electron Spin Resonance ou Ressonncia do Spin Eletrnico) ou outra mudana mensurvel. A presena de antioxidantes altera esses sinais, o que permite sua anlise quantitativa18. Dentre os testes utilizados, citam-se aqueles conhecidos pelas siglas TRAP, ORAC, FRAP e TEAC18, 20-33 (Tabela 6). TRAP e ORAC so mtodos cuja determinao analtica envolve reaes de transferncia de tomos de hidrognio e FRAP e TEAC, transferncia de eltrons27. til registrar que o decrscimo da CAOT no significa necessariamente que o dano oxidativo ocorreu; pode significar simplesmente que o mecanismo de defesa cumpriu sua funo habitual18. TRAP (Total Radical - Trapping Antioxidant Parameter) O TRAP foi o primeiro ensaio desenvolvido para determinar a CAOT do plasma sangneo. O mtodo foi desenvolvido por Wayner et al.25. Consiste na gerao de radicais peroxila (RO2), por decomposio trmica, a uma velocidade controlada, de azoiniciadores (Equaes 4 e 5). O dicloridrato do 2,2-azobis-(2-metilpropanoamidina) (AAPH ou ABAP, C8H18N6.2HCl, M.M 271,20 g/mol)18,28,29 exemplo de azoiniciador hidrossolvel. Existem outros azocompostos, que se distinguem por serem lipossolveis, como, por exemplo, o AMVN (2,2-azobis-2,4-pentanonitrila). Estes reagem rapidamente com o oxignio originando radicais peroxila (Equaes 4 e 5). Aps adicionar AAPH ao plasma sangneo, a oxidao monitorada, a partir, por exemplo, de medidas de oxignio consumido, durante a reao, em eletrodo de oxignio. O perodo no qual a oxidao inibida pelos antioxidantes plasmticos comparado ao do trolox (cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2carboxlico, C14H18O4, M.M 250,3 g/mol), o anlogo hidrossolvel da vitamina E, usado como antioxidante de referncia e quantitativamente relacionado CAOT do plasma. Os valores de TRAP so expressos em mol de radical peroxila capturado por molcula de trolox/L de plasma. Cada molcula de

trolox captura duas molculas de RO2. O RO2 gerado para reagir com os antioxidantes do fluido biolgico pode tambm ser detectado diretamente atravs de mtodos de quimioluminescncia. No plasma humano, o valor normal de TRAP de 1 mM de RO2 capturado por litro; as maiores contribuies so do urato (35-65%), das protenas plasmticas (10-50%), do ascorbato (acima de 24%) e da vitamina E (5-10%). RN=NR R + O2 N2 + 2R RO2 (4) (5)

ORAC (Oxygen-Radical Absorbancy Capacity) Este mtodo usa a protena Phycoerythrin (PE) (Ficoeritrina), fotossinttica, marcadora de fluorescncia, como alvo dos radicais. O ORAC mede a diminuio da emisso de fluorescncia de PE adicionada ao plasma em presena de um composto azo, gerador de radicais (Equao 4). A habilidade antioxidante do plasma calculada a partir da medida da rea sob a curva de decaimento da fluorescncia (Area Under the Fluorescence Decay Curve AUC, com emisso a 565 nm) comparada ao padro que, na maioria das vezes, o trolox. A PE pode ser oxidada por AAPH para gerar radical peroxila (Teste ORACRO2) ou por Cu2+-H2O2 para gerar radical hidroxila (Teste ORACHO) ou ainda, adicionando-se ons Cu+ como redutores (Teste ORACCu+). O ORAC combina o tempo de inibio e a percentagem (%) de inibio da ao do radical pelo antioxidante e usa a rea sob a curva para a quantificao. O teste expressa os resultados como unidades de ORAC ou equivalentes do trolox, que corresponde quantidade de trolox em mol que tem a mesma atividade antioxidante para o radical peroxila em 1 L de plasma. Porm, se o gerador de radicais for o Cu2+, o trolox no pode ser usado como padro, pois o mesmo pode atuar como pr-oxidante na presena de Cu2+. Neste caso, a ao antioxidante ser expressa em unidade antioxidante: uma unidade equivale atividade antioxidante que causa o aumento da rea sob a curva de decaimento de fluorescncia de PE em 100%22. Esse o nico mtodo que permite a medida total dos radicais gerados e usa a tcnica de AUC ao invs da lag fase (fase de retardo), utilizada pelos outros mtodos para quantificao dos radicais. A AUC combina o percentual de inibio ao tempo de inibio da ao do radical (lag fase) pelo antioxidante22. Mais recentemente, Prior e colaboradores31 sistematizaram e validaram o uso do ORACFL, prprio para a quantificao da CAOT em plasma ou soro. A separao das fraes antioxidantes lipoflicas e hidroflicas do plasma, foi obtida por extrao com hexano, aps adi-

Tabela 6. Grupo de biomarcadores em sangue e principais mtodos de anlise Grupos de biomarcadores Antioxidantes Sub-grupos Capacidade antioxidante total Enzimas antioxidantes Antioxidantes no enzimticos Principais substncias e mtodos de anlise TRAP, ORAC, FRAP, TEAC, por espectrofotometria. SOD, GPx e CAT so avaliadas espectrofotometricamente. Sua atividade antioxidante e tcnica de anlise esto descritas no texto. Vitaminas E, C e -caroteno avaliadas por HPLC; glutationa avaliada por espectrofotometria; ceruloplasmina e transferrina, por turbidimetria e cido rico pelo mtodo enzimtico. Deteco de grupos carbonila por espectrofotometria. Deteco de malondialdedo por HPLC com deteco no ultravioleta. 3-Nitrotirosina (3-NO2-Tyr) por HPLC, com deteco eletroqumica. Deteco de 8-oxo-2-desoxiguanosina (8-oxodG) em linfcitos por HPLC Teste do cometa (comet assay) em leuccitos

Marcadores de dano oxidativo

Protenas oxidadas Lipdeos oxidados Protenas nitradas Oxidao das bases do DNA Quebra de DNA

1330

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

o de gua e etanol ao plasma. As duas fraes sofrem partio eficiente entre o hexano e os solventes aquosos. Esse mtodo pode ser empregado em outros fluidos biolgicos ou amostras de alimentos31. FRAP (Ferric-Reducing Ability of Plasma) Testa a fora antioxidante do plasma, via avaliao da reduo do complexo Fe3+-TPTZ (ferritripiridiltriazina) [2,4,6-tri(2-piridil)1,3,5-triazina, C18H12N6, M.M. 312,33 g/mol] a ferroso-tripiridiltriazina (Fe2+-TPTZ) por redutores, no caso, os antioxidantes plasmticos, em valor de pH baixo. Baseia-se no fato de que a habilidade de um composto em produzir Fe2+ a partir de Fe3+ define sua fora antioxidante. O complexo Fe2+-TPTZ tem uma cor azul intensa e pode ser monitorado, a 593 nm, em espectrofotmetro. A vitamina C e o cido rico, por ex., reduzem Fe3+ a Fe2+. Por outro lado, um antioxidante que reduz efetivamente um pr-oxidante, no reduz, necessariamente, Fe3+ a Fe2+. As limitaes do mtodo so, portanto: nem todo redutor que hbil para reduzir Fe3+ a Fe2+ antioxidante; nem todo antioxidante tem a habilidade especfica para reduzir Fe3+ a Fe2+, como por ex., a glutationa. O resultado final pode ser convertido a mmol de equivalentes de trolox por litro de plasma. A atividade relativa do trolox em FRAP de 2,0 mmol/L, ou seja, a reao direta de Fe2+ proporciona uma mudana de absorbncia que a metade de 1 equivalente molar para o trolox31. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) ou Teste do ABTS O TEAC baseia-se na inibio por antioxidantes do ction radical 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de diamnio) (C18H24N6O6S4, M.M. 548,7 g/mol, ABTS+), que apresenta absorbncia caracterstica primria em 415 nm e absores secundrias em 660, 734 e 820 nm. O mtodo original baseia-se na ativao de metamioglobina como peroxidase, em presena de ABTS. O complexo perferril da hemeprotena produziria o ction radical ABTS + de cor azul esverdeada. A adio desse radical a um meio contendo antioxidantes, permite avaliar, atravs do grau de descolorao, a capacidade antioxidante do mesmo. Alguns autores sugerem o uso de oxidao qumica de ABTS, com utilizao de reagentes como dixido de mangans ou persulfato de potssio, uma vez que outros antioxidantes podem contribuir para reduzir o radical ferrimioglobina formado durante a reao. O percentual de inibio de ABTS+ determinado em funo da concentrao e do tempo. Quando a medida relativa reatividade do trolox, como padro, sob as mesmas condies, o teste denominado TEAC, expresso como unidades equivalentes de trolox que correspondem a 1,0 mmol/L18,33. Esse mtodo aplicvel para o estudo de antioxidantes lipossolveis e hidrossolveis. A Tabela 7 ilustra valores de CAOT, obtidos em plasma e soro

humanos, com o emprego dos ensaios supracitados. Cao e Prior22 compararam TEAC e FRAP com ORAC na determinao in vivo da CAOT em soro humano e concluram que o ORAC apresenta maior especificidade. No ORAC, a razo molar de AAPH/antioxidante > 2000 e para a quantificao utiliza uma combinao do percentual de inibio com o tempo de inibio da ao do radical pelo antioxidante. No FRAP, a maior limitao diz respeito menor sensibilidade e especificidade do mtodo. No TEAC, a razo molar entre os reagentes H2O2/metamioglobina/ ABTS/trolox somente 10,2/0,25/25/1, o que pode reduzir ou equilibrar o aumento na produo de espcies radicalares. Alm disso, a quantificao da atividade antioxidante feita atravs do percentual de inibio em um tempo fixo, sem considerar o tempo de durao da inibio22,23. preciso destacar que esses mtodos se baseiam estritamente em reaes qumicas in vitro e no tm qualquer similaridade com sistemas biolgicos. A validade de seus dados limita-se a um contexto de interpretao estritamente qumico. Assim, Niki e Yoshida34 discriminam o que denominam potencial antioxidante qumico daquele biolgico (determinado in vivo ou em modelos biomimticos), onde a compartimentalizao e a partio dos protagonistas redox (agente oxidante e alvo) entre fase aquosa e fase lipdica so consideradas35. O uso de tais testes para determinar a bioatividade de uma amostra biolgica deve ser visto com cautela, uma vez que eles no medem biodisponibilidade, estabilidade in vivo, reteno de antioxidantes pelos tecidos, nem reatividade in situ25. Uma srie de novos mtodos, ainda no padronizados, foi e continua a ser relatada, o que mostra o vigor da rea de pesquisa. Em vista da necessidade de mtodos cada vez mais sensveis, de pesquisa in situ, da mimetizao do ambiente biolgico, h forte interesse nesse desenvolvimento. Como exemplo, podem-se citar alguns mtodos eletroqumicos, no caso, a coulometria em corrente constante, para anlise de CAOT em plasma humano32. O mtodo utiliza bromo eletrogerado (eletrlise corrente constante a partir de brometo de tetraetilamnio, em HClO4 0,1 mol/L) e o ponto final da titulao detectado amperometricamente32. CAPACIDADE ANTIOXIDANTE ESPECFICA Enzimas antioxidantes Superxido dismutase (SOD) As principais formas de superxido dismutases (EC 1.15.1.1), encontradas em humanos so a Cu/ZnSOD localizada no citosol (dimrica), alm de lisossomas, ncleo e espao entre as membranas interna e externa da mitocndria (tetramrica) e a MnSOD localizada na mitocndria (Figura 2). A maioria das anlises de SOD realizada verificando-se a atividade de SOD indiretamente, geralmente por adio ao eritrcito do sistema xantina - xantina oxidase como fonte de O2 e um composto

Tabela 7. Capacidade antioxidante total em plasma/soro humanos por vrios ensaios Mtodo TRAP Ensaio da Ficoeritrina (PE) ou ORAC Ensaio ABTS FRAP Resultados tpicos (M) e referncias ~1000 Free Radical Biol. Med. 1994, 21, 211. 1162 265 Free Radical. Biol. Med. 1995, 18, 29. 1320-1580 Redox Rep. 1996, 2, 161 612-1634 Anal. Biochem. 1996, 239, 70. Comentrios Uso de azoiniciadores na gerao de radicais, que reagem com O2, dando radical peroxila. Mede a diminuio da emisso de fluorescncia de PE, adicionada ao plasma, em presena de um composto azo, gerador de radicais. Ver Figura 3. A reduo de Fe3+ a Fe2+ define a capacidade antioxidante.

Fonte: Adaptada da ref. 18

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1331

que seja reduzido pelo O2 18,26 como, por ex., o 2-(4-iodofenil)-3-(4nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol (INT, C19H13ClIN5O2.x H2O, M.M. 505,7 g/mol). O O2 transfere um eltron ao INT e produz formazana, detectada em espectrofotmetro a 505 nm. A atividade da enzima medida a partir do grau de inibio da reao a que o eritrcito foi submetido e os valores so expressos em unidades por grama de hemoglobina (Hb) (U/g Hb). A inibio da formao do cromgeno proporcional atividade de SOD presente na amostra. Nessa tcnica, uma inibio de 50% definida como uma unidade de SOD36-39. Catalase (CAT) A catalase (EC 1.11.1.6), cujo stio ativo contm o grupo heme, est enclausurada no peroxissoma, a principal organela responsvel pela desintoxicao celular e pela oxidao de cidos graxos de cadeia longa, fonte inesgotvel de perxidos orgnicos, produtos carbonlicos e oxignio singlete. A catalase , tambm, encontrada nas mitocndrias das clulas do tecido cardaco. Os dois caminhos mais utilizados para estudo de sua atividade referem-se medida do decaimento na concentrao de H2O2 e da gerao do oxignio18,26. A leitura do decaimento de H2O2 feita por espectrofotometria no ultravioleta a 240 nm. Os valores de CAT tambm so expressos em unidades por g de hemoglobina (U/g Hb). Uma unidade de CAT corresponde atividade da enzima necessria para o consumo de 1 mol de H2O2 em 1 min40. Glutationa Peroxidase (GPx) A famlia de GPx (EC 1.11.1.9) reduz H2O2 e outros perxidos a gua ou lcool. Apresenta-se sob 4 formas: GPx 1 ou clssica, encontrada no citosol de todas as clulas do corpo; GPx 2 ou gastrointestinal, especfica do trato gastrointestinal; GPx 3 ou plasmtica ou extracelular, encontrada no fluido do revestimento interno do pulmo e no leite materno, alm do plasma em mamferos, e a GPx 4, que atua sobre perxidos de resduos de cidos graxos nas membranas e lipoprotenas, reduzindo, tambm, o hidroperxido da timina, formado como conseqncia do ataque dos radicais base timina do DNA41,42. A famlia de GPx integra o grupo de selenoprotenas, que tm, em seu stio ativo, o selnio (Se), obtido da dieta ligado metionina, em alimentos de origem vegetal (selenometionina) e, ligado cistena, em alimentos de origem animal (selenocistena). O Se reconhecidamente um nutriente antioxidante, com recomendaes de obteno na dieta considerando sua atividade antioxidante e nutricional43,44. No organismo humano, a selenometionina ocupa o lugar da metionina nas protenas e a selenocistena constituinte das selenoprotenas (selenocistena a forma na estrutura primria de todas as selenoprotenas, inclusive GPx)41,44. Uma unidade de GPx corresponde atividade de enzima necessria para converter 1 mol de NADPH a NADP+ em 1 min. Como as demais enzimas antioxidantes, os valores de GPx so expressos em unidades por g de hemoglobina (U/g Hb). Um mtodo muito utilizado para avaliar a atividade de GPx em eritrcitos consiste em adicionar ao lisado de hemcias uma mistura contendo NADPH, GSH, GR, EDTA (agente quelante que tem tambm a funo de impedir a oxidao de GSH a GSSG) e tampo fosfato. Uma alquota da mistura adicionada ao hemolisado, mantido em banho-maria a 37 C durante 1 min, adicionando-se, em seguida, H2O2 ou hidroperxido orgnico, para iniciar a reao, que acompanhada em espectrofotmetro. O mtodo similar quele tradicional de Mills45,46, que mede a velocidade de oxidao de GSH por H2O2 catalisada por GPx presente no hemolisado. O consumo de GSH medido, mantendo em concentraes constantes a GR e o NADPH que converte imediatamente a GSSG produzida em GSH. Portanto, a anlise de GPx

pode ser feita adicionando-se GSH, GR, NADPH e um perxido para dar incio reao (t-BOOH, por ex.), sendo monitorada a 340 nm quando o NADPH convertido a NADP47. Glutationa redutase (GR) A glutationa redutase (EC 1.6.4.2) uma flavoprotena dependente de NADPH e da integridade da via das pentoses. a enzima necessria para manuter a glutationa em sua forma reduzida e, possivelmente, para controlar o estado redox de NADP em tecidos onde GSSG est disponvel48. A recuperao de GSH por GR uma etapa essencial para manter ntegro o sistema de proteo celular, pois, baixas concentraes de GSH esto associadas ao estresse oxidativo1. A anlise de GR em eritrcitos feita utilizando-se tcnicas espectrofotomtricas, em valores de absorbncia de 340 nm, quando o NADPH convertido a NADP+. Uma unidade de GR definida como 1 mol de GSSG reduzida por min a 30 C, em pH 7,4 48,49. Conforme citado acima, a anlise de enzimas antioxidantes comumente realizada em eritrcitos49, o que requer o hemograma ou eritrograma dos indivduos estudados e aponta para a adoo da unidade de enzima expressa em unidade de enzima por grama de hemoglobina, cujos valores de referncia esto dispostos na Tabela 7. Sistema antioxidante no enzimtico Relaciona-se a um grupo de antioxidantes que podem ser agrupados em compostos produzidos in vivo, como o caso da glutationa, da ubiquinona e do cido rico, e em compostos obtidos diretamente da dieta tais como vitaminas E, C, -caroteno e outros. Glutationa A glutationa (GSH) (C10H17N3O6S, M.M 307 g mol-1) um tripeptdeo (L--glutamil-L-cisteinilglicina) que exerce funes essenciais na clula, destacando-se sua funo como cofator da famlia de enzimas glutationa peroxidases (GPx), em que desempenha papel protetor contra o estresse oxidativo, com sua oxidao a dissulfeto da glutationa (GSSG) (C20H32N6O12S2, Mr 612,6 g/mol). um tampo redox sulfidrlico que mantm os resduos cisteinila da hemoglobina e de outras protenas do eritrcito, no estado reduzido. A GSH o nico tiol no protico presente em espcies aerbias e seu papel intracelular antioxidante inclui a desintoxicao de xenobiticos e de ERO. A falha nesta funo resulta na formao de meta-hemoglobina e conseqente incapacidade do eritrcito em transportar oxignio, alm de causar uma variao na forma do eritrcito, impedindo sua passagem para rgos vitais50-52. O preparo das amostras muito importante para minimizar a atividade de -glutamil-transpeptidase, que quebra ligaes glutamilpeptdeo de GSH; a reduo de GSSG por GR ou a oxidao de GSH. Muitos procedimentos so desenvolvidos para inibir estas reaes enzimticas e no enzimticas: acidificao, utilizando, por ex., cido perclrico, capaz de inibir tanto a -glutamiltranspeptidase quanto a GR, e o uso de quelantes como o cido etilenediaminotetractico (EDTA), que limita a oxidao de GSH53. A concentrao de glutationa total (GSH + GSSG) pode ser medida usando-se 5,5-ditiobis-(2-cido nitrobenzico) (DTNB, C14H8N2O8S2, M.M 396,3 g/mol) e GR. A velocidade de reduo de DTNB verificada espectrofotometricamente a 412 nm, comprimento de onda relativo absoro do produto reduzido, o cido 5mercapto-2-nitrobenzico (TNB), ou sais correspondentes (Figura 4). O mesmo procedimento pode ser utilizado para a determinao de GSSG, com acompanhamento da mudana de absorbncia em NADPH a 340 nm. Entretanto, para evitar a interferncia de GSH, essa deve ser derivatizada com vinilpiridina26 (no interfere com

1332

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

GR) ou com N-etilmaleimidina (NEM)49,53,54. Quando NEM utilizada, o derivado formado deve ser eliminado antes da anlise, pois o mesmo inibe a GR. Outra forma de determinar a concentrao de glutationa nas hemcias descrita no trabalho de Calvo-Marzal e colaboradores55, onde se utilizam eletrodos de pasta de carbono modificados com Tetratiofulvaleno Tetracianoquinodimetano (TTF-TCNQ).

A CoQ transportada na circulao ligada a lipoprotenas, sendo 60% associada com LDL, 25% com HDL e 15% com outras lipoprotenas. A atividade antioxidante de CoQH2 depende, no somente da sua concentrao total, mas tambm do seu estado redox, ou seja, da proporo de CoQH2 em relao CoQ total. A ubiquinona, tanto na forma reduzida (CoQH2), como na forma oxidada (CoQ), pode ser quantificada em plasma humano obtido de sangue coletado em heparina, centrifugado e armazenado a -70 C, 30 min aps a coleta. A anlise feita em HPLC, com o plasma tratado com 1-propanol para dissociao de CoQ, e -tocoferol da lipoprotena e com a adio do anlogo dietoxlico da CoQ, como padro interno. O sobrenadante injetado diretamente na cmara de injeo do HPLC e CoQH2 e CoQ so determinadas26,49. cido rico O cido rico (URH3) deriva do metabolismo das purinas e produzido pela oxidao de hipoxantina e xantina pela xantina oxidase (XO) e xantina desidrogenase (XD). Na maioria das espcies, a enzima peroxissomal urato-oxidase converte urato a alantona, que, por sua vez, convertida a alantoato e depois a glioxilato e uria, todos produtos mais solveis em gua que o urato. Seres humanos e outros primatas no contm a urato-oxidase, da, o urato acumula-se no plasma e excretado na urina. Em pH fisiolgico, o cido rico dissociado a urato (UrH2-) (pKa 5,4)5. O urato tem solubilidade menor em gua e sua concentrao encontra-se muito prxima de seu limite de solubilidade (300 M) 5; por isso, o excesso de produo de urato leva formao de cristais, o que ocorre na gota, tratada com alopurinol, inibidor de XO/XD. Oxidantes fortes, tais como OH, podem oxidar o nion urato (UrH2-) ao radical urato, que dissociado (pKa 3,1), ao nion radical urato (UrH). Esse estvel graas ressonncia que permite a disperso da carga negativa. O urato tambm reage com radicais ROO antes de este penetrar a membrana celular e iniciar o dano e, com o dixido de nitrognio (NO2), para formar o nion nitroxila NO2- e por fim, atua como antioxidante, por sua capacidade de quelar metais de transio. O nion radical urato (UrH) pode reagir com ascorbato (AscH-), regenerando o urato5 (Equao 6)18. UrH + AscHUrH2- + Asc (6)

Figura 4. Reaes usadas para deteco de glutationa. (A) Reao enzimtica DTNB e do produto da sua reduo, TNB (cido 5-tio-2-nitrobenzico), sob ao de GSH, observado em 412 nm. (B) Reao no enzimtica para deteco de NADP a 340 nm

Coenzima Q (CoQ) A coenzima Q10 (Figura 5) ou ubiquinona o nico lipdio endogenamente sintetizado atravs da via do mevalonato, que apresenta funo redox56. um AO que desempenha papel central na cadeia respiratria mitocondrial, na cadeia de transporte de eltrons extra-mitocondrial, participa da regulao da permeabilidade, diminui a oxidao de protenas de membrana, previne a oxidao do DNA e impede a disfuno endotelial, provavelmente por aumentar a disponibilidade de NO. Sua forma antioxidante, o ubiquinol (CoQH2), produto da reduo de CoQ, inibe a iniciao e propagao da peroxidao lipdica, com conseqente impedimento da formao de ROO (radical peroxila). Alm disso, a coenzima Q regenera a vitamina E do radical tocoferila57,58.

O cido rico apresenta atividade antioxidante significativa e sua concentrao no plasma maior que a de outros antioxidantes, como vitaminas C e E20. A anlise de urato pode ser feita em soro ou em plasma (obtido em heparina ou EDTA), de preferncia frescos, pelo mtodo enzimtico automatizado, utilizando kits para dosagem, atravs da diminuio da absorbncia, aps tratamento com uricase. O cido rico, que absorve em 293 nm, ao ser convertido a alantona pela uricase, apresenta diminuio na sua absorbncia15. Vitamina E ou tocoferol O termo vitamina E a designao comum de duas diferentes famlias de compostos que ocorrem na natureza: os tocoferis e os tocotrienis, que exibem, qualitativamente, a atividade biolgica do -tocoferol, que o composto mais potente e, geralmente, a forma predominante. Estruturalmente, tocoferis e tocotrienis diferem apenas na cadeia lateral e ambos se subdividem em , , e , dependendo do nmero e posio do grupo metila no anel cromanol59. O tocoferol o antioxidante lipossolvel que atua bloqueando a etapa de propagao da peroxidao lipdica dos cidos graxos poliinsaturados das membranas e lipoprotenas. Intercepta o radical peroxila (RO2), resultante com formao do radical tocoferila, que ser regenerado por ascorbato, glutationa ou ubiquinol a tocoferol5,60. O tocoferol pode ser medido em plasma, soro, plaquetas e eritrcitos

Figura 5. Stios de ao de coenzima Q, vitamina E e ascorbato na peroxidao lipdica. LH: cido graxo polinsaturado; OH; radical hidroxila; Fe3+O2:radical perferrila; CoQH2: coenzima Q reduzida; CoQH-: semiubiquinona; L: carbono central radicalar do cido graxo; LOO: radical lipdico peroxila; vitE-OH: vitamina E (-tocoferol); vitE-O: vitamina E (radical -tocoferila); Asc: Ascorbato; Asc: radical ascorbila. Adaptado da ref. 57

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1333

por tcnicas cromatogrficas, sendo a HPLC em fase reversa, a tcnica de escolha, com deteco por espectrofotometria no UV (cujo comprimento de onda depender do solvente), por espectrofluorimetria ou ainda por mtodos eletroqumicos26. Por ser lipoflico, o tocoferol requer uma etapa pr-analtica de extrao com hexano, que realizada ao abrigo da luz e sob refrigerao. Vitamina C ou ascorbato O cido ascrbico essencial ao homem, pois no pode ser sintetizado a partir da glicose que seu precursor, como ocorre em plantas e na maioria dos animais. Em sistemas biolgicos, em pH fisiolgico (7,4), 99,95% da vitamina C (AsCH2) encontra-se na forma de ascorbato (Asc-), que a forma que atua como antioxidante, ao doar um H ou [H+ + e-] para um radical. O ascorbato (AscH-) atua como antioxidante sobre ERO e ERN, em ambiente biolgico aquoso, resultando na formao do nion radical semidesidroascorbato (Asc), ou ascorbila, pouco reativo. Atua eficientemente sobre o nionradical superxido (O 2), o perxido de hidrognio (H 2O2), o hipoclorito (ClO-) e os radicais hidroxila (OH) e peroxila (OOH). O ascorbato pode atuar diretamente nas membranas celulares, por impedir a iniciao da peroxidao lipdica ou indiretamente por regenerar a vitamina E, que atua como antioxidante na face lipoflica da membrana5. Alm disso, pode regenerar o nion radical urato a partir de urato, fechando o ciclo de atuao antioxidante do mesmo, como discutido anteriormente (Equao 6)18. A deteco de vitamina C em plasma ou em soro requer precauo, uma vez que um composto facilmente oxidvel. Devido a sua facilidade de oxidao, em pH neutro (fisiolgico) ou alcalino, recomendvel a acidificao do plasma, preferencialmente aps sua separao por centrifugao, adicionando-se cido tricloroactico, cido metafosfrico, ou cido oxlico, isolado ou em associao com cido tricloroactico. HPLC a tcnica mais comumente usada na sua separao e anlise. Recentemente, Katepe61 desenvolveu uma tcnica para deteco simultnea de ascorbato e malondialdedo em soro humano, utilizando HPLC com deteco no UV. -caroteno Os carotenides so pigmentos intensamente coloridos, lipossolveis, sintetizados por plantas e microrganismos, presentes em muitos alimentos, particularmente frutas, vegetais e peixes. Existem mais de 600 tipos de carotenides e apenas 10% tm atividade pr-vitamina A, que a capacidade de converso dos carotenides em retinol62. As propriedades antioxidantes dos carotenides esto associadas com sua capacidade de capturar radicais e outras espcies, como oxignio singlete, em baixas concentraes e em baixa presso parcial de oxignio, tais como aquelas da maioria dos tecidos sob condies fisiolgicas62. No entanto, as funes de carotenides na dieta, na preveno de doenas no esto definitivamente estabelecidas, havendo muita controvrsia na literatura. Neste aspecto, importante citar dois estudos de associao da suplementao de -caroteno e preveno de cncer de pulmo e doena arterial coronariana (DAC) em fumantes, onde se verificou, inclusive, um aumento da mortalidade: o CARET (Carotene and Retinol Efficacy Trial)63, com 18.314 fumantes acompanhados durante 4 anos revelou aumento de 46% na mortalidade por CA de pulmo, de 26% na mortalidade por DAC e de 17% na mortalidade geral e, o ATBC (Alpha-Tocopherol and Beta-Carotene Lung Cancer Prevention Study)64, de preveno secundria, com 29.133 fumantes acompanhados durante 6 anos revelou aumento de 18% na mortalidade por CA de pulmo, de 12% na mortalidade por DAC e de 8% na mortalidade total.

O mtodo mais comumente adotado para analisar carotenides em soro humano HPLC em fase reversa. A amostra de sangue deve ser coletada sem anticoagulante, uma vez que o EDTA (cido etilenodiaminotetraactico), o oxalato e o citrato reduzem a concentrao de -caroteno, porque catalisam as reaes de isomerizao ou de oxidao do mesmo. Alm disso, todas as etapas requerem proteo contra a luz26. As protenas devem ser previamente desnaturadas por exposio ao cido perclrico; o caroteno subseqentemente extrado com mistura de acetato de etila tetraidrofurano (1:1) e nenhuma etapa de evaporao requerida. A separao obtida usando-se eluio isocrtica em coluna C18 com deteco em ultravioleta a 436 nm65. A anlise pode ser realizada com cada um dos tipos de carotenides ou em termos da concentrao de carotenides total, que podem ser extrados tambm com solvente orgnico, geralmente hexano, e detectados medindo-se a absorbncia a 453 nm26. Protenas de transporte de metais de transio Os metais de transio Fe e Cu so essenciais ao organismo humano para a sntese de muitas enzimas e protenas envolvidas na respirao, transporte de O2, formao de xido ntrico e outras reaes redox (por ex., oxidao de adrenalina, noradrenalina e ascorbato). Sua habilidade na transferncia de eltrons os caracteriza como potentes pr-oxidantes, uma vez que tm o poder de converter H 2O2 em OH (Tabela 1). Alm disso, so potentes catalisadores de reaes de auto-oxidao e decompem perxidos lipdicos a radicais peroxila e alcoxila, muito reativos. Estes ctions podem ser dosados sob a forma livre, ou ligados a sua protena de transporte. Essa ltima forma a mais adequada, uma vez que os mesmos circulam no plasma, em sua quase totalidade, ligados s protenas transferrina e ceruloplasmina, respectivamente. Transferrina A transferrina uma betaglobulina sintetizada pelo fgado, responsvel pelo transporte de ferro no plasma. O Fe obtido da dieta pode ser o Fe3+ (frrico) ou Fe2+ (ferroso). Para entrar na clula duodenal necessrio que o Fe esteja na forma reduzida. No interior do eritrcito oxidado a Fe3+ e, em seguida, reduzido a Fe2+, para circular no plasma inicialmente ligado ceruloplasmina, que novamente o oxida, para que seja captado pela transferrina e da transportado para o fgado, onde armazenado e distribudo para as clulas66. A transferrina pode ser medida diretamente em soro ou plasma (coletado em heparina ou EDTA), fresco ou refrigerado (de 2 a 8 C) por at 7 dias ou congelado a -20 C, por at 3 meses. A anlise feita por turbidimetria, utilizando-se kits comerciais, em espectrofotmetro cuja leitura feita a 37 C em comprimento de onda de 340 nm. A transferrina pode tambm ser medida indiretamente pelo clculo que utiliza a Capacidade Total de Ligao do Ferro CTLF (ou TIBC Total Iron Binding Capacity), que se refere quantidade total de ferro que a transferrina capaz de ligar. A CTLF determinada medindo-se o excesso de ferro no sobrenadante de uma quantidade conhecida de ferro adicionado ao soro para saturar a transferrina, o qual separado aps precipitao da protena. De posse de tal valor, calcula-se a transferrina srica (TS) a partir da frmula67 TS (mg/100 mL) = (0,8 x CTLF) 43 Ceruloplasmina A ceruloplasmina ou ferroxidase I uma 2-glicoprotena que transporta cerca de 90 a 95% do cobre total no plasma66. O Cu2+, obtido da dieta, quelado pelo aminocido histidina e absorvido no

1334

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

duodeno. transportado ao fgado ligado albumina e l incorporado na protena ceruloplasmina. O Cu2+ ligado ceruloplasmina , ento, distribudo para as clulas. Alm do transporte de Cu2+, a ceruloplasmina oxida Fe2+ a Fe3+ para sua subseqente transferncia para a transferrina, da a sinonmia de ferroxidase, e catalisa a Snitrosao de biomolculas tilicas66,68,69. A determinao de ceruloplasmina humana baseia-se na reao entre essa enzima como antgeno e o anti-soro especfico obtido em kits disponveis no mercado. O princpio do mtodo a reao antgeno (a enzima presente no soro) com o anticorpo contido no kit. A reao d lugar a um complexo insolvel, produzindo uma turbidez que pode ser lida espectrofotometricamente. Portanto, sua anlise feita por imunoturbidimetria, a 37 C, utilizando-se espectrofotmetro, em 340 nm. A ceruloplasmina pode ser medida diretamente em soro fresco ou refrigerado entre 2 a 8 C por at 2 dias ou congelado a -20 C por at 3 meses. Os valores de referncia para os antioxidantes no enzimticos citados esto ilustrados na Tabela 8. Tabela 8. Valores de referncia para enzimas antioxidantes em eritrcito humano Enzimas antioxidantes Superxido Dismutase (SOD) Catalase (CAT) Glutationa Peroxidase (GPx) Glutationa Redutase (GR) Valores de Referncia (U/g Hb) 6.500 14.500 16.500 26.500 30 44 5,4 8,8

derivam da peroxidao lipdica. Eles so classificados em primrios (os hidroperxidos lipdicos) e secundrios, que derivam da ruptura dos hidroperxidos lipdicos. Malondialdedo (MDA) O malondialdedo um produto secundrio da peroxidao lipdica, derivado da -ruptura de endociclizao de cidos graxos polinsaturados com mais de duas duplas ligaes, tais como cido linolico, araquidnico e docosaexanico18,70-72. Atualmente, o MDA considerado um candidato potencial para ser escolhido como um biomarcador geral de dano oxidativo em plasma14. O MDA foi o foco de ateno da peroxidao lipdica durante muitos anos, pelo fato de poder ser medido livre, utilizando-se o cido tiobarbitrico (TBA). O MDA reage com TBA e forma um cromgeno de cor rosa fluorescente, cuja absoro ocorre em de 532 nm e fluorescncia em 553 nm26 (Figura 6). Considerando-se que o teste no especfico para MDA, pois outros aldedos participam da mesma reao, a tcnica utilizando HPLC com deteco no UV, recentemente desenvolvida por Katepe61, em soro humano, revela-se mais especfica. Na tcnica de Katepe, o soro acidificado para liberar o MDA ligado ao grupo amino de protenas.

Obs: Se for adotado protocolo de kit, considerar o valor referncia do kit. p.ex., kit RANSOD, RANDOX para SOD, VR = 1102 -= 1601 U/g Hb. Fonte: Adaptado da ref. 49 Avaliao de dano oxidativo em componentes celulares As macromolculas reagem com ERO e ERN com a produo de diversos marcadores de dano oxidativo (Tabela 2), que podem ser identificados em sangue humano, entre outros fluidos biolgicos. A presente reviso dar nfase anlise de marcadores da peroxidao lipdica com ateno particular MDA, marcadores de oxidao de protenas, especificamente os derivados contendo grupos carbonila e se far um breve comentrio de marcadores de espcies reativas de nitrognio. Conforme mencionado13,14, h um esforo mundial para validao de biomarcadores de estresse oxidativo. No momento, no entanto, no h consenso sobre qual o mtodo mais til, mais confivel, mais acurado, ou especfico para os diferentes tipos de dano oxidativo. No h possibilidade de se fazer a comparao direta entre os mtodos, usando amostras idnticas, da, a extrema dificuldade de obteno de valores de referncia absolutos para marcadores especficos em sistemas vivos13,14. mister anotar que o balano redox de uma dada populao normal sofre influncias genticas (caractersticas tnicas), ambientais (ex., poluio atmosfrica), nutricionais (consumo de carnes e vegetais) e culturais (ex., hbitos de exerccio fsico intenso, alcoolismo, ou tabagismo), o que um complicador adicional. Enquanto os trabalhos de sistematizao prosseguem, til conhecer os principais marcadores e os mtodos mais utilizados para sua quantificao. Marcadores de peroxidao lipdica A importncia do dano oxidativo causado por ERO e ERN em lipdios motivo de discusses na busca do melhor marcador em fluidos biolgicos, uma vez que produtos numerosos e complexos
Figura 6. Reao utilizada para deteco de malondialdedo (MDA) em plasma humano. Ao plasma adicionado cido tiobarbitrico (TBA), que reage com MDA e forma um cromgeno que absorve a 532 nm

Hidroxinonenal (HNE) O HNE o produto majoritrio da oxidao de cidos graxos polinsaturados. Vrias tcnicas foram desenvolvidas para sua determinao em amostras biolgicas, em sua forma livre, pois a recuperao de HNE do plasma muito baixa e, como acontece com todos os aldedos, h necessidade de sua derivatizao para anlise em HPLC 18,26,70-72. A derivatizao com 2,4-dinitrofenilidrazina (DNFH), seguida de cromatografia em camada delgada e HPLC, com deteco por espectrofotometria no UV, consome um tempo considervel. Neste sentido, foi proposto um mtodo utilizando-se 1,3-cicloexanodiona, que forma um derivado que pode ser detectado por fluorescncia73. A seletividade do mtodo pode ser aumentada por utilizao de tetraidrofurano ao invs de cinco outros solventes, porm a recuperao de HNE muito baixa (cerca de 8%)74. Mais recentemente, a quantificao de HNE em plasma passou a ser realizada com pentafluorobenzil-hidroxilamina para formar o derivado pentafluorobenziloxima (Figura 7), que analisado por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas com ionizao qumica negativa (GC/NICI-MS) usando HNE deuterado como padro interno26. Nesse mtodo, apesar de haver um aumento significativo na recuperao de HNE do plasma (60 a 80% versus 8%), sua concentrao permanece, ainda, mais baixa do que a de outros aldedos marcadores de peroxidao lipdica, devido, provavelmente, ligao aos grupos sulfidrila ou amina de protenas26.

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1335

de reao que forma os AGEs (Advanced Glycation End products), denominada reao de Maillard 72,78.

Figura 7. Esquema reacional para a determinao de hidroxinonenal (HNE)

Isoprostano (8-epi-prostaglandina 2,8epi-PGF2) Os isoprostanos pertencem famlia dos eicosanides, de origem no enzimtica e so produzidos pela oxidao do cido araquidnico. Inicialmente, so formados nos fosfolipdios da membrana celular e depois liberados para os fluidos biolgicos pela fosfolipase26,72. Ao contrrio do que ocorre com os hidroperxidos lipdicos (produtos primrios da peroxidao lipdica - PL), que se decompem rapidamente nos fluidos e tecidos humanos, F2-isoprostanos so produtos secundrios da peroxidao lipdica quimicamente estveis podendo, inclusive, ser dosados na urina. Essa estabilidade a razo pela qual a sua quantificao desperta interesse, com o aparecimento de muitos protocolos para sua anlise. Alm disso, so produtos especficos da PL, esto presentes em quantidades detectveis em todos os fluidos biolgicos e tecidos, sua formao aumenta drasticamente em modelos animais de dano oxidativo e modulada pelo estado antioxidante e seus nveis no so afetados pelo contedo de lipdios da dieta75. Como MDA, ele , tambm, considerado um candidato potencial para ser escolhido como um biomarcador geral de dano oxidativo em plasma14. O mtodo mais adequado para anlise de isoprostanos a cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas com ionizao qumica negativa (GC/NICI-MS), contudo, devido aos altos custos financeiro e operacional, os mtodos radiomtricos e imunolgicos so mais utilizados26,71,72. Marcadores de oxidao de protenas Grupos carbonila em protenas A modificao de protenas pode ser induzida por ERO, por ctions metlicos (Fe2+, Cu+), por endobiticos (GSH), por HOCl e HOBr, no processo da fagocitose, por irradiao, por perxidos lipdicos, por oxidorredutases, por frmacos etc. (Tabela 2). Todos os aminocidos so susceptveis oxidao, principalmente os aromticos, que so os alvos preferidos de ataque. Existem, portanto, muitos mecanismos para oxidao de protenas e, ao mesmo tempo, muitas substncias passveis de tal modificao26,76. A oxidao direta de lisina, arginina, prolina e treonina fornece derivados carbonlicos (Figura 8). Alm disso, grupos carbonila podem ser introduzidos em protenas via reao com aldedos derivados da peroxidao lipdica (MDA, HNE) ou gerados a partir da reao de reduo de acar (p.ex., glicose) ou produtos de sua oxidao com resduos de lisina (reaes de glicao e de glicoxidao formando carboximetil-lisina) 69,76,77. Vale salientar que, segundo o Joint Commission on Biochemical Nomenclature, o termo glicao difere de glicosilao. Esta ltima constitui o processo ps-traducional catalisado enzimaticamente. A glicao um processo no enzimtico a que esto sujeitas todas as protenas e consiste de 2 etapas: a glicose e o grupo amino de lisina reagem e formam frutoselisina (FL); FL sofre desidratao, rearranjo e ciclizao, seguida

Figura 8. Exemplos de processos de formao de grupos carbonila por oxidao de aminocidos. Adaptado da ref. 18

O contedo carbonlico de protenas amplamente utilizado como marcador de dano oxidativo em protenas, sob condies de estresse oxidativo. necessrio, porm, identificar a natureza do grupo carbonila, i.e, qual dos resduos de aminocido sofreu o dano. A ligao de certos aldedos a protenas (ex. MDA e HNE) pode gerar carbonilas por glicoxidao, de modo que a presena de grupo carbonila no , necessariamente, indicativa de oxidao de aminocidos. H diversas tcnicas para se medir a presena de grupo carbonila em protenas, sendo imprescindvel uma preparao adequada da amostra79. Por isso, tal anlise em plasma humano requer uma exaustiva seqncia de procedimentos para separar as protenas. O mtodo mais conveniente o espectrofotomtrico, baseado na reao de DTNB com o grupo carbonila, que forma a hidrazona da protena, cuja leitura de absorbncia feita a 370 nm72,76,79,80. A unidade mais utilizada para carbonila nmol/g de protena, por isso preciso quantificar a protena total da amostra utilizando-se o mtodo de Bradford81 ou outros. A Tabela 9 mostra valores de referncia de alguns marcadores de dano oxidativo em macromolculas analisados em sangue humano, embora haja muita controvrsia na literatura13,14. Tabela 9. Valores de referncia para antioxidantes no enzimticos em sangue humano Antioxidantes Glutationa GSH (plasma) Glutationa GSH (eritrcito) Coenzima Q CoQ (plasma) cido rico ou Urato (soro) Vit. E ou Tocoferol (plasma) Vit. C ou Ascorbato (plasma) -Caroteno (plasma) Transferrina (soro) Ceruloplasmina (soro) Valores de referncia 1 3 M 1 3 M 0,4 1,0 M 0,2 0,4 mM 20 M 30 100 M 0,3 0,6 M 200 360 mg/dL 15 60 mg/dL

Fonte: Adaptada das refs. 18 e 98 e kit analtico Spinreact. Marcadores de espcies reativas de nitrognio (ERN) O xido ntrico (NO) rapidamente metabolizado a produtos estveis, ou seja, nitrito e nitrato, na maioria dos fluidos do corpo, inclusive no plasma. Quando em presena de O2 forma ONOO,

1336

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

que promove diferentes efeitos biolgicos a partir de trs reaes: reao redox direta 82, reao com CO 2 formando CO 382, 83,84 e homlise de cido peroxinitroso82 (Tabela 1). O mtodo de determinao mais comumente utilizado baseiase na reao de diazotao (mtodo de Griess), especfico para nitrito e que no detecta nitrato. O tratamento da amostra com agentes redutores ou enzimas gera o total de produtos em termos de nitrito e nitrato, com deteco espectrofotomtrica26. Outros mtodos foram desenvolvidos, incluindo-se HPLC, eletroforese capilar e cromatografia de troca inica com deteco no ultravioleta, desde que em soro ou plasma frescos. Existem diversas limitaes para a determinao de nitrato e nitrito em sangue, destacando-se: sua meia vida no plasma de cerca de 1 h e 30 min sendo, a seguir, excretados pela urina; seus valores plasmticos so dependentes da integridade renal. Assim, o real valor de sua determinao precisa ainda ser estabelecido26. A combinao de NO com outras ERO gera reagentes (Tabela 1) que promovem a nitrao das biomolculas, incluindo resduos de tirosina e tocoferol localizados nas membranas. A 3-nitrotirosina (3-NO2-Tyr) e o 5--nitrotocoferol constituem os biomarcadores de oxidao NO-dependentes de tecidos biolgicos. Para ambos, HPLC com deteco eletroqumica a tcnica de escolha, pela sensibilidade e seletividade, pois necessrio separ-los de outros produtos de oxidao: 3,4-DOPA, 3-clorotirosina, 3,3-ditirosina, m-tirosina e o-tirosina, no caso de 3-NO2-Tyr e de outras formas de tocoferol (, , ) no caso de 5--nitrotocoferol26,85. Outros marcadores de dano em macromolculas Em sangue, o dano ao DNA detectado atravs do teste do cometa em leuccitos, (comet assay)86-89. Idealmente, a avaliao do dano em DNA deve reunir os marcadores excretados na urina, 8-hidroxi-desoxinucleotdeos (8-OH-dG) e suas bases livres (8-hidroxiguanina) e os marcadores medidos em sangue26,71,72. Associao de marcadores de balano redox a doenas A Tabela 3 ilustra exemplos de doenas cujo mecanismo fisiopatolgico tem a participao do estresse oxidativo, a Tabela 4 lista os marcadores de dano oxidativo associado com algumas doenas humanas e a Tabela 5 apresenta exemplos de biomarcadores utilizados para o diagnstico e/ou monitoramento de doenas7-10,12,90. A determinao de antioxidantes e marcadores de dano oxidativo com aplicao clnica para diagnstico, com excees, como o caso da ceruloplasmina na doena de Wilson, permanece em nvel de pesquisa, uma vez no foi possvel ainda sequer determinar se o fenmeno oxidativo observado causa ou conseqncia da doena. Muitos estudos permitiram verificar o fenmeno do estresse oxidativo em doenas. Em pacientes com hemocromatose, diminuio dos nveis de -tocoferol, ascorbato e retinol foram encontrados e positivamente correlacionados com o aumento de TBARS (substncias reativas do cido tiobarbitrico) no plasma91. Em pacientes com doena de Alzheimer, foram encontrados nveis eleva-

dos de GPx, CAT e SOD e positivamente correlacionados com o aumento de TBARS no tecido cerebral92. Diabticos no dependentes de insulina (tipo II) apresentaram queda significativa nos nveis de SOD, CAT, GSH, ascorbato e -tocoferol no plasma e eritrcitos, nos 2 primeiros anos de diagnstico, o que foi positivamente correlacionado com a durao da doena e com o desenvolvimento de complicaes93. Estudos recentes com hipertensos revelaram nveis mais baixos de SOD, CAT e GPx em eritrcitos94-97 e nveis elevados de MDA92. Esses so alguns dos muitos exemplos de estudos de estresse oxidativo em doenas j instaladas, utilizando marcadores obtidos em fluidos biolgicos, principalmente em sangue humano. CONSIDERAES FINAIS Como visto, muitos processos celulares so governados pelo balano redox. As substncias envolvidas no binmio antioxidante pr-oxidante e que configuram o ambiente redox biolgico podem ser quantificadas associando s tcnicas bioqumicas tradicionais, tcnicas cromatogrficas, espectrofotomtricas e eletroanalticas, selecionadas pela observao de critrios de sensibilidade, especificidade, acuracidade, facilidade de manipulao, rapidez, robustez, objetivo, tipo de amostra, preo, repetibilidade, eficincia, entre outros. A determinao dessas substncias revela-se de grande importncia, com perspectivas de aplicao clnica para diagnstico de doenas e do estado geral de sade do indivduo. Alm disso, o entendimento dos mecanismos utilizados pelas clulas para a manuteno do balano redox do meio fundamental na identificao de biomarcadores representativos para a avaliao do nvel de estresse oxidativo de diferentes indivduos. H interesse dos especialistas em cincias da sade, em cincias qumica e bioqumica, em nutrio, e, principalmente, do pblico em geral. H muita complexidade nas diversas reas envolvidas, muita informao e discusso. O nmero de artigos publicados quadruplicou na ltima dcada26. O presente trabalho procurou citar os mtodos de determinao analtica mais conhecidos e utilizados, aplicados em sangue/ou plasma/ou soro humano. A natureza nica do plasma humano, enquanto fonte no s de protenas clssicas j utilizadas no diagnstico de doenas (em concentraes de mg/ mL), mas em nvel de protemica (pg/mL at ng/mL), torna esse biofluido um desafiante meio de investigao e aponta para o desenvolvimento de tcnicas capazes de identificar biomarcadores mais especficos16, inclusive do ambiente redox. Apesar de reconhecido que os testes de diagnstico in vitro contribuem em 94% com os registros de dados clnicos e influenciam em 60 a 70% das decises clnicas97, o seu uso em nvel de protemica no est estabelecido e encontra-se em franco desenvolvimento. H enormes desafios que impedem ou pelo menos dificultam a sua aplicao para descobrir biomarcadores de maior sensibilidade e especificidade, entre outras caractersticas importantes11 para o fenmeno que est sendo investigado e, conseqentemente, a utilizao destes dados para inferir estado redox de indivduos e para auxiliar em terapia antioxidante. No h consenso. No momento, a

Tabela 10. Valores de referncia para alguns marcadores de dano oxidativo em macromolculas analisados em soro e plasma humanos Marcador de dano oxidativo Malondialdedo MDA (plasma) Isoprostano Carbonila em protenas Fonte: Adaptada das refs. 18, 76 e 99 Valores de referncia 1 3 M 35 6 pg/mL 0,4 1,0 nmol/g ptna Mtodo analtico Separao por HPLC de MDA de adutos TBA ou deteco fluorimtrica de TBARS Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas Espectrofotometria (Figura 8)

Vol. 30, No. 5

Espcies reativas de oxignio e de nitrognio, antioxidantes e marcadores de dano oxidativo

1337

despeito do forte interesse, desenvolvimento e plausibilidade biolgica, a hiptese de ligao direta entre estresse oxidativo e doenas ainda de difcil comprovao, uma vez que h inmeros fatores limitantes, tais como procedimentos de coleta e armazenamento; a tcnica analtica em si, em muitos casos, de elevado custo e de difcil operacionalizao, a falta de uniformidade nas unidades em que se exprimem os resultados, bem como os valores de referncia; a quantidade de fatores interferentes e, principalmente, questes ligadas variabilidade gentica. Apesar da existncia de vrios biomarcadores de balano redox em sangue (Tabela 6) e da listagem dos valores considerados normais ou de referncia18,49,76,98,99 (Tabelas 7 a 10), til salientar que no existem ainda valores de referncia universalmente aceitos/adotados, uma vez que os prprios mtodos de anlise e quantificao, alm de envolverem diferentes tcnicas, esto em processo de desenvolvimento e aperfeioamento. A validao dos mtodos encontra-se em curso13,14, com utilizao do modelo murino, tratado com injeo intra-peritoneal de CCl413,14. O desenvolvimento de outros modelos faz-se ainda necessrio para comparao. Nessa perspectiva, pesquisas aliando esses marcadores e novos desenvolvimentos de ferramentas e mtodos analticos que possibilitem uma avaliao de forma menos invasiva, sensvel, rpida e simples, com janelas de deteco cada vez menores, vm assumindo um papel relevante no avano da investigao. Estaremos, provavelmente, em condies de relacionar o ambiente redox avaliado em indivduos com diferentes aspectos demogrficos, clnicos e nutricionais, de entender os mecanismos do estresse oxidativo, bem como de prevenir ou minimizar os efeitos das doenas oriundas dos mesmos, realizando diagnsticos antecipados. AGRADECIMENTOS Aos rgos financiadores PADCT/CNPq/CTINFRA, MCT, MS, Fundao de Amparo Pesquisa de Alagoas (FAPEAL), Banco do Nordeste do Brasil (BNB), PPSUS/CNPq/SESAU/FAPEAL, CAPES/COFECUB, Instituto do Milnio-INOFAR e RENORBIO/ CNPq. Ao Prof. N. A. Soares, pela reviso da linguagem, ao Prof. E. J. H. Bechara pela cuidadosa reviso e constantes discusses na rea e aos revisores do presente artigo pelos valiosos comentrios. LISTA DE ABREVIAES AAPH: ABAP: ABTS: AGEs: AIDS: AMVN: AO: ATBC: AUC: CAT: CAOT: CARET: CCl4: (CHOH)n: DAC: 8-OH-dG: DNFH: DPOC: 2,2-Azobis(2-metilpropanoamidina) Dicloridrato do 2,2-azobis-(2-metilpropanoamidina) 2,2-Azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato, sal de diamnio Advanced Glycation End products. Produtos finais de glicao avanada. Sndrome de deficincia imunolgica adquirida 2,2-Azobis-2,4-pentanonitrila Antioxidante Alpha-Tocopherol and Beta- Carotene Lung Cancer Prevention Study Area-under-curve. rea sob a curva Catalase Capacidade Antioxidante Total Carotene and Retinol Efficacy Trial Tetracloreto de carbono Hidrocarboneto Doena Arterial Coronariana 8-hidroxi-desoxiguanosina Dinitrofenilidrazina Doena pulmonar obstrutiva crnica

DTNB: EDTA: ER: ERO: ERN: ESR:

5,5-Ditiobis (2-nitro-5-cido tiobenzico) cido etilenediaminotetra-actico Espcies Reativas Espcies Reativas de Oxignio Espcies Reativas de Nitrognio Electron Spin Resonance. Ressonncia de spin de eltron Fe3+-TPTZ: Ferritripiridiltriazina Fe2+-TPTZ: Ferrosotripiridiltriazina FL: Frutose-lisina FRAP: Ferric-Reducing Ability of Plasma Habilidade plasmtica de reduzir o sal frrico GC/NICI-MS: Gas chomatography/negative ion chemical ionization mass spectrometry: cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas com ionizao qumica negativa GPx: Glutationa Peroxidase GR: Glutationa Redutase GSH: Glutationa reduzida GSSG: Glutationa oxidada GT: Glutationa Transferase Hb: Hemoglobina HIV+: Pacientes soropositivos em relao ao HIV (Human Immunodeficiency Virus) HNE: Hidroxinonenal H 2O 2 : Perxido de hidrognio HPLC: High Performance Liquid Chromatography Cromatografia lquida de alta eficincia INT: 2-(4-Iodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol LH: cido graxo poli-insaturado MDA: Malondialdedo NEM: N-Etilmaleimidina ORAC: Oxygen Radical Absorbancy Capacity Capacidade de absorbncia do radical oxignio PE: Phycoerythrin- Ficoeritrina PhGPx: Fosfoidrolipdio glutationa peroxidase Ptna: Protena R: Radical RONS: Reactive oxygen and nitrogen species- Espcies reativas de oxignio e nitrognio SOD: Superxido dismutase TBA: cido tiobarbitrico TBARS: Thiobarbituric Reactive Substances - Substncias Reativas do cido Tiobarbitrico. t- BOOH: terc-Butil-hidroperxido TCNQ: Tetracianoquinodimetano TEAC: Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Capacidade antioxidante equivalente ao trolox TS: Transferrina srica TRAP: Total Radical - Trapping Antioxidant Parameter. Parmetro antioxidante relacionado captura total de radicais TROLOX: cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2carboxlico TTF: Tetratiofulvaleno XD: Xantina desidrogenase XO: Xantina oxidase REFERNCIAS
1. Schafer, F. Q.; Buettner, G. R.; Free Radical Biol. Med. 2001, 30, 1191. 2. Grow, A. J.; Ischiropoulos, H. J.; J. Cell. Physiol. 2001, 187, 277.

1338

Vasconcelos et al.

Quim. Nova

3. Finkel, T.; Holbrook, N. J.; Nature (London, U. K.) 2000, 408, 239. 4. Wiseman, H.; J. Nutr. Biochem. 1996, 7, 2. 5. Barreiros, A. L. B. S.; David, J. M.; David, J. P.; Quim. Nova 2006, 29, 113. 6. Halliwell, B.; Murcia, M. A.; Chirico, S.; Aruoma, O. I.; Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1995, 35, 7. 7. Guerra, E. J. I.; Anales Medicina Interna 2001, 18, 326. 8. Zwart, L. L. ; Meerman, J. H. N.; Commandeur, J. N. M.; Vermeulen, N. P. E.; Free Radical Biol. Med. 1999, 26, 202. 9. Gutteridge, J. M. C.; Free Radical Res. Comm. 1993, 19, 141. 10. Pagano, G.; Korkina, L. G.; Brunk, U. T.; Chessa, L.; Degan, P.; Del Principe, D.; Kelly, F. J.; Malorni, W.; Pallard, F.; Pasquier, C.; Scovassi, I.; Zaterralle, A.; Franceschi, C.; Medical Hypothesis 1998, 51, 253. 11. LaBaer, J.; J. Proteome Res. 2005, 4, 1053. 12. Hill, B.; Curr. Sep. 2005, 21, 45. 13. Kadiiska, M. B.; Gladen, B. C.; Baird, D. D.; Dikalova, A.E.; Sohal, R. S.; Hatch, G. E.; Jones, D. P.; Mason, R. P.; Barrett, J. C.; Free Radical Biol. Med. 2000, 28, 838. 14. Kadiiska, M. B.; Gladen, B. C.; Baird, D. D.;Germolec, D.; Graham, L. B.; Parker, C. E.; Nyska, A.; Wachsman, J. T.; Ames, B. N.; Basu, S.; Brot, N.; FitzGerald, G. A,; Floyd, R. A.; George, M.; Heinecke, J. W.; Hatch, G. E.; Hensley, K.; Lawson, J. A.; Marnett, L. J.; Morrow, J. D.; Murray, D. M.; Plastaras, J.; Roberts II, L. J.; Rokach, J.; Shigenaga, M. K.; Sohal, R. S.; Sun, J.; Tice, R. R.; van Thiel, D. H.; Wellner, D.; Walter, P. B.; Tomer, K. B.; Mason, R. P.; Barrett, J. C.; Free Radical Biol. Med. 2005, 38, 698. 15. Burtis, C. A.; Ashwood E. R.; Tietz/Fundamentos de qumica clnica, 4a. ed., Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 2002. 16. Jacobs, J. M.; Adkins, J. N.; Qian, W-J.; Liu, T.; Shen, Y.; Camp II, D. G.; Smith, R. D.; J. Proteome Res. 2005, 4, 1073. 17. Anderson, N. L.; Anderson, N. G.; Mol. Cell Proteom. 2002, 1, 845. 18. Halliwell, B.; Gutteridge, J. M. C.; Free Radical in Biology and Medicine, 3rd ed., Oxford University Press: Oxford, 2002; 4th ed., 2007. 19. Polidori, M. C.; Stahl, W.; Etchler, O.; Niestroj, I.; Sies, H.; Free Radical Biol. Med. 2001, 30, 456. 20. Ghiselli, A.; Serafini, M.; Natella, F.; Scaccini, C.; Free Radical Biol. Med. 2000, 29, 1106. 21. Prior, R. L.; Cao, G.; Free Radical Biol. Med. 1999, 27, 1173. 22. Cao, G.; Prior, R. L.; Clin. Chem.(Washington, DC, U. S.) 1998, 44, 1309. 23. Snchez-Moreno, C.; Food Sci. Tech. Int. 2002, 8, 121. 24. Janaszewska, A.; Bartosz, G.; Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2002, 62, 231. 25. Wayner, D. D. M.; Burton, G. W.; Ingold, K. U.; FEBS Lett. 1985, 187, 33. 26. Thrond, P.; Bonnefont-Rousselot, D.; Davit-Spraul, A.; Conti, M.; Legrand, A. ; Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2000, 3, 373. 27. Huang, D.; Ou, B.; Prior, R. L.; J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 1841. 28. Salvi, A.; Bbruhlmann, C.; Migliavacca, E.; Carrupt, P. A.; Hostettmann, K.; Testa, B.; Helv. Chim. Acta 2002, 85, 867. 29. Regoli, F.; Winston, G. W.; Toxicol. Appl. Pharmacol.1999, 156, 96. 30. Benzie, I. F. F.; Strain, J. J.; Anal. Biochem. 1996, 239, 70. 31. Prior, R. L.; Hoang, H.; Gu, L.; Wu, X.; Bacchiocca, M.; Howard, L.; Hampsch-Woodill, M.; Huang, D.; Ou, B.; Jacob, R.; J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 3273. 32. Ziyatdinova, G. K.; Voloshin, A. V.; Gilmutdinov, A. K.; Budnikov, H. C.; Ganeev, T. S.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2006, 40, 958. 33. Re, R.; Pelegrinni, N.; Protegentte, A.; Pannala, A.; Yang, M.; Rice-Evans, C.; Free Radical Biol Med. 1999, 26,1239. 34. Niki, E.; Yoshida, Y.; J. Med. Invest. 2005, 52 S., 228. 35. Bandy, B.; Bechara, E. J. H.; J. Bioenerg. Biomembr. 2001, 33, 269. 36. McCord, J.; Fridovich, I.; J Biol. Chem. 1972, 247, 3170. 37. Misha, H. P.; Fridovich, I.; J Biol. Chem. 1969, 244, 6049. 38. Netto, C. B.; Siqueira, I. R.; Portela, L. V.; Tavares, M. P.; Souza, D. O.; Giuliani, R.; Gonalves, C. A.; Clin. Biochem. 2004, 37, 134. 39. Gaeta, L. M.; Tozzi, G.; Pastore, A.; Federici, G.; Bertini, E.; Piemonte, F.; Clin. Chim. Acta 2002, 322, 117. 40. Aebi, H.; Meth. Enzimol. 1984, 105, 121. 41. Rayman, M. P.; Lancet 2000, 356, 233. 42. Czuczeiko, J.; Zachara, B. A.; Staubach-Topczewska, E.; Halota, W.; Kedziora, J.; Acta Biochim. Pol. 2003, 50, 1147. 43. Amaya-Farfan, J.; Domene, S. M. A.; Padovani, R. M.; Rev. Nutr. Campinas 2001, 14, 71. 44. Burk, R. F.; Levander, O. A. Em Tratado de Nutrio Moderna na Sade e na Doena; Shils, M. E.; Olson, J. A; Shike, M.; Ross, A C., eds.; 9 ed., Manole: So Paulo, 2002, vol. I., cap. 14. 45. Mills, G. C.; J. Biol. Chem. 1957, 229, 189. 46. Mills, G. C.; J. Biol. Chem. 1958, 589, 189. 47. Paglia, D. E.; Valentine, W. N.; J. Lab. Clin. Med. 1967, 70, 158.

48. Pinto, R. E.; Bartley W.; Biochem. J. 1969, 11, 67. 49. Armstrong, D.; Free Radical and Antioxidant Protocols, Humana Press: New Jersey, 1998, vol. 108. 50. Alves, A.; Macedo, D. V.; Kubota, L. T.; Anal. Biochem. 2003, 323, 33. 51. Rover Jr., L.; Hehr, N. F.; Vellasco, A. P.; Kubota, L. T.; Quim. Nova 2001, 24, 112. 52. Sies, H.; Free Radical Biol. Med. 1999, 27, 916. 53. Arkeoobom, T. P. M.; Sies H.; Meth. Enzymol. 1981, 77, 373. 54. Tietze, F.; Anal. Biochem. 1965, 27, 502. 55. Calvo-Marzal, P.; Chumbimuni-Torres, K. Y.; Hoehr, N. F.; Neto, G. D.; Kubota, L. T.; Sens. Actuators, B 2004, 100, 333. 56. Gandra, P. G.; Alves, A. A.; Macedo, D. V.; Kubota, L. T.; Quim. Nova 2004, 17, 980. 57. Turunen, M.; Olsson, J.; Dallner, G.; Biochem. Biphys. Acta 2004, 1660, 171. 58. Tang, P. H.; Miles, M. V.; De Grauw, A.; Hershey, A.; Pesce, A.; Clin. Chem.(Washington, DC, U.S.) 2001, 47, 256. 59. Theriault, A.; Chao, J-T.; Wang, Q.; Gapor, A.; Adeli, K.; Clin. Biochem. 1999, 32, 309. 60. Buettner, G. R.; Arch. Biochem. Biophys. 1993, 300, 535. 61. Katepe, M.; LCGC North Am. 2004, 22, 362. 62. El-Agamey, A.; Arch. Biochem. Biophys. 2004, 430, 37. 63. Omenn, G. S.; Goodman, G. E.; Thornquist, M. D.; Balmes, J.; Cullen, M. R.; Glass, A.; Keogh, J. P.; Meyskens, F. L.; Valanis, B.; Williams, J. H. ; Barnhart, S.; Hammar, S.; N. Engl. J. Med. 1996, 334, 1150. 64. Rapola, J. M.; Virtamo, J.; Ripatti, S.; Huttunen, J. K.; Albanes, D.; Taylor, P. R.; Heinonen, O. P.; Lancet 1997, 349, 1715 65. Nirenberg, D. W.; J. Chromatogr. 1985, 339, 273. 66. Turnlund, J. R. Em ref. 44, vol. I., cap. 12. 67. Vasconcelos, S. M. L.; Avaliao Nutricional de Enfermos nas Diversas Etapas da Vida, 2 ed., EDUFAL: Macei, 2003. 68. Fox, P. L.; Mukhopadhayay, C.; Ehrenwald, E.; Life Sci. 1995, 56, 1749. 69. Akaike, T.; Free Radical Res. 2000, 33, 461. 70. Petersen, D. R.; Doorn, J. A.; Free Radical Biol. Med. 2004, 37, 937. 71. Giammarioli, S.; Filesi, C.; Sanzini, E.; Ann. Ist. Super. Sanit 1999, 35, 563. 72. McCall, M. R.; Balz, F.; Free Radical Biol. Med. 1999, 26,1034. 73. Yoshina, K.; Matsuura, T.; Sano, M.; Saito, S.; Tomita, I. F.; Chem. Pharm. Bull. 1986, 34, 1694. 74. Holley, A. E.; Walker, M. K.; Free Radical Biol. Med. 1993, 15, 281. 75. Roberts, L. J.; Morrow, J. D.; Free Radical Biol. Med. 2000, 28, 505. 76. Shacter, E.; Drug Metab. Res. 2000, 32, 307. 77. Berlett, B. S.; Stadtman, E. R. E.; J. Biol.Chem. 1997, 272, 20313. 78. Sobal, G.; Menzel, J.; Sinzinger, H.; Prostaglandins, Leukotrienes Essent. Fatty-Acids 2000, 63, 177. 79. Levine, R. L.; Meth. Enzymol. 1990, 186, 464. 80. Levine, R. L.; Free Radical Biol. Med. 2002, 32, 790. 81. Bradford, M. M.; Anal. Biochem. 1976, 72, 248. 82. Radi, R.; Peluffo, G.; Alvarez, M. N.; Naviliat, M.; Cayota, A.; Free Radical Biol. Med. 2001, 30, 463. 83. Bonini, M. G.; Radi, R.; Ferrer-Sueta, G.; Ferreira, A. M. C.; Augusto, O.; J. Biol. Chem. 1999, 274, 108092. 84. Trujillo, M.; Folkes, L.; Bartesaghi, S.; Kalyanaraman, B.; Wardman, P.; Radi, R.; Free Radical Biol. Med. 2005, 39, 279. 85. Hensley, K.; Williamson, K. S.; Floyd, R. A.; Free Radical Biol. Med. 2000, 28, 520. 86. Rojas, E.; Lopez, M. C.; Valverde, M.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 1999, 722, 225. 87. Fairbain, D. W.; Olive, P. L.; ONeil, K. L.; Mutat. Res. 1995, 339, 37. 88. McKelvey-Martin, V. J.; Green, M. H. L.; Schemezer, P.; Pool-Zobel, B. L.; De Mo, M. P.; Collins, A.; Mutat. Res. 1993, 288, 47. 89. Houtgraaf, J. H.; Vermissen, J.; Vander Giessen, W. J.; Cardiovasc. Revasc. Med. 2006, 7, 165. 90. Valko, M.; Leibfritz, D.; Moncol, J.; Cronin, M. T. D.; Mazur, M.; Telser, J.; Int. J. Biochem. Cell Biol. 2007, 39, 44. 91. Young, I. S.; Free Radical Biol. Med. 1994, 16, 397. 92. Lovell, M. A.; Neurology 1995, 45, 1594. 93. Sundaram, R. K.; Cli. Sci. 1996, 90, 255. 94. Pedro-Botet, J.; Covas, M. I.; Martin, S.; Rubies-Prat, J.; Hypertension 2000, 14, 343. 95. Rdon, J.; Oliva, M. R.; Tormos, C.; Giner, V.; Chaves, J.; Iradi, A.; Sez, T.; Hypertension 2003, 41, 1096. 96. Khullar, J. Relan, V.; Sherawat, B. S.; Hypertension 2004, 43, 7. 97. Vitzthum, F.; Behrens, F.; Anderson, N. L.; Shaw, J. H.; J. Proteome Res. 2005, 4, 1086. 98. Frei, B.; Crit. Rev. Food Sci. Nutr.1995, 35, 83. 99. Abuja, P. M.; Albertini, R.; Clin. Chim. Acta 2001, 306, 7.