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DETECO DE BACTRIAS REDUTORAS DE SULFATO EM EFLUENTE E SEDIMENTO DE MINA DE URNIO

Sheila Knia de Almeida

Dissertao apresentada como parte dos requisitos para obteno do Grau de Mestre em Cincia e Tecnologia das Radiaes, Minerais e Materiais;

ORIENTADORA: Dra. JEANETH DOS SANTOS BENEDETTO CO-ORIENTADORA: Dra. HELIANA DE AZEVEDO GOMES

Belo Horizonte 2005

Comisso Nacional de Energia Nuclear CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia das Radiaes, Minerais e Materiais

DETECO DE BACTRIAS REDUTORAS DE SULFATO EM EFLUENTE E SEDIMENTO DE MINA DE URNIO

Sheila Knia de Almeida

Dissertao apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia das Radiaes, Minerais e Materiais, como requisito parcial obteno do Grau de Mestre

rea de concentrao: Cincia e Tecnologia dos Materiais e Metalognese

Orientadora: Dra. Jeaneth dos Santos Benedetto Co-orientadora: Dra. Heliana de Azevedo Gomes

Belo Horizonte 2005

minha famlia, Maria Jos, Francisco, Rodrigo, Rafael e Jlia, meu apoio, meu consolo, meu rumo, minha motivao.

AGRADECIMENTOS

Professora Dra. Jeaneth dos Santos Benedetto, orientadora dessa dissertao, pela pacincia e motivao.

Professora Dra. Heliana de Azevedo Gomes, co-orientadora deste trabalho, pelo estmulo e ensinamentos.

Ao CDTN/CNEN, pela bolsa, e pela utilizao das instalaes.

Ao COLAB/CNEN/Poos de Caldas, pelas instalaes.

FAPEMIG, pela aprovao do projeto Jovem Doutor que possibilitou a montagem da bancada de anaerbios.

INB, por permitir a realizao do trabalho experimental e por ajudar nos gastos com hospedagem.

s professoras Dra. Rosana Filomena Vazoller e Dra. Vivian Helena Pellizari por permitir e orientar a realizao de um estgio no laboratrio de Microbiologia Ambiental na USP.

Dra. Cristina Rossi Nakayama e Ana Carolina Arajo, pelos socorros providenciais.

Maria Aparecida Cardoso Chaves e Maria Rego Monteiro Gomes, pelo apoio, pela acolhida amiga e segura nas horas de incertezas.

Ao tcnico Antnio Edicleto Gomes Soares, pela montagem do sistema de gases.

Ao tcnico der Anderson S. de Oliveira, pelo auxlio na confeco de grficos e esquemas.

Aos tcnicos Armando Bruschi, Cludio Roque e Osvaldo Teles da Costa, pelo auxlio nas coletas e trabalho experimental, e pela agradvel rotina de trabalho no laboratrio.

A todos os familiares e amigos, pela convivncia e incentivo.

RESUMO Um dos graves problemas ambientais oriundos da indstria de minerao a drenagem cida de mina que ocorre quando a pirita e outros minerais sulfetados so oxidados devido presena de oxignio e gua, produzindo cido sulfrico que solubiliza metais presentes no solo/rocha. Em uma planta das Indstrias Nucleares do Brasil INB, na Unidade de Tratamento de Minrios (UTM) este problema tem se pronunciado de forma preocupante levando a dissoluo de espcies radioativas e metlicas presentes. O tratamento da gua cida usando bactrias redutoras de sulfato, proporciona decrscimo da acidez que decorrente da reduo do sulfato a sulfito e precipitao dos metais como sulfetos. Nesse contexto, o presente estudo foi realizado visando a caracterizar sazonalmente e espacialmente populaes de bactrias redutoras de sulfato (BRS) nos efluentes lquidos e amostras de sedimento da cava da mina (CM) e nos bota-foras 4 e 8 (BF4 e BF8) coletadas na UTM. Tais informaes podero permitir posteriormente, estudar mecanismos de biomanipulao a fim de remediar situaes impactantes. Menores valores de pH , abaixo de 3,5, foram medidos no perodo de maro a abril em amostras de gua da cava da mina e a maior populao de BRS (2,8 NMP. mL-1) foi observada em fevereiro em amostras do BF8. Os valores encontrados para matria orgnica na gua foram menores do que aqueles encontrados no sedimento. A concentrao de oxignio dissolvido na gua variou de 0,65 g/L a 13,3 g/L. As amostras de sedimento apresentaram maiores valores de BRS (10,2 NMP/mL), quando comparadas com amostras de gua (0,63 NMP/mL). Tais resultados eram esperados uma vez que, nas amostras de gua coletadas prximas ao sedimento foram observadas menores concentraes de oxignio dissolvido (7,10g/L) e maiores concentraes de matria orgnica disponvel (17,0 mg/L) quando os resultados foram comparados com aqueles obtidos para amostras de gua coletadas na superfcie (0,004mg/L). Os resultados mostram, portanto, que o efluente cido gerado apresenta altos teores de metais estveis e radioativos, sulfato, baixo pH e presena de bactrias redutoras de sulfato.

ABSTRACT

One of the most serious environmental problems created by the mining industry is acid mine drainage. In one plant of Nuclear Industries of Brazil - INB, this problem is a matter of concern. The presence of iron sulfites, such as pyrite, generates water with acidity above the levels allowed by the legislation and therefore, inappropriate for releasing straight into the environment. The industry maintain a high cost treatment in acid water from mines and waste disposal which consists in neutralizing and precipitating heavy metals. The treatment of acid water using SRB (sulfate-reducing bacteria) has been used in other countries with quite good technical results as well as economical advantages and thus, the object of this research. The use Sulfate Reducing Bacteria takes to a decreasing of the acidity by reducing sulfate to sulfite and precipitating the stable metals as sulfides. A seasonal study was carried out on the sulfate-reducing bacteria present in the liquid effluent discharged from two wastes disposal of the uranium mine, in phase of decommission, in Caldas/MG. This study shows the presence of SRB in the analyzed environmental, as well as some factors that are related with the amount of SRB presents, such as: dissolved oxygen, pH and organic matter. SRB was presented in water samples with high concentrations of heavy metals and low pH values, as well as in samples with high oxygen levels. The sediment samples were the preferential place for SRB occurrence and site BF8 presented the highest values of SRB.

Lista de figuras Pgina Figura 1 Planalto de Poos de Caldas...................................................................... Figura 2 Fotos da cava da mina............................................................................... Figura 3 Ponto BF8.................................................................................................. Figura 4 Ponto BF4................................................................................................. Figura 5 Detalhes Geogrficos do Planalto de Poos de Caldas e Localizao do UTM CIPC......................................................................................... Figura 6 Arranjo Fsico do Complexo Mnero-Industrial do Planalto de Poos de Caldas.................................................................................................... Figura 7 Nmero de bactrias e BRS observadas nos trs pontos amostrados....... Figura 8 Valores de pH e contagem de BRS nas amostras coletadas..................... Figura 9 Presena de BRS relacionada ao oxignio dissolvido, em amostras da cava da mina. ............................................................................................ Figura 10 Valores de BRS em amostras de sedimento............................................ Figura 11 Matria orgnica e presena de BRS nas amostras de sedimento........... 39 40 40 30 37 38 18 15 16 17 17

Lista de tabelas Pgina

Tabela 1 Composio do meio de cultura Postgate B............................................ Tabela 2 - Caracterizao radiolgica das amostras dos pontos CM, BF8 e BF4..... Tabela 3 - Anlises qumicas das amostras dos pontos CM, BF8 e BF4................... Tabela 4 Slido em suspenso e dureza da gua cida dos trs pontos coletados..

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Lista de abreviaturas e siglas

AO Acridine Orange BF4 Bota-fora 4 BF8 Bota-fora 8 BRS Bactria redutora de sulfato CM Cava da mina CONAMA Conselho nacional do meio ambiente DAM Drenagem cida de mina NMP Nmero mais provvel UTM Unidade de tratamento de minrios

SUMRIO Pgina

Dedicatria Agradecimentos Resumo Abstract Lista de Figuras Lista de Tabelas Lista de abreviaturas e siglas Sumrio 1. Introduo.................................................................................................................. 2. Reviso Bibliogrfica................................................................................................ 2.1. Caracterizao ambiental............................................................................ 2.2. Drenagem cida......................................................................................... 2.2.1 Bioremediao.............................................................................. 2.3. Bactrias sulfato redutoras ......................................................................... 2.3.1. Classificao e caractersticas gerais ........................................... 2.3.2. Aspectos Metablicos.................................................................. 2.3.3. Produo de H2S.......................................................................... 3. Objetivos................................................................................................................... 4. Materiais e mtodos................................................................................................... 4.1. Amostras.................................................................................................... 4.2. Anlises microbiolgicas........................................................................... 4.2.1. Bactrias redutoras de sulfato..................................................... 4.2.2. Contagem total de bactrias........................................................ 4.3. Anlise fsico-qumicas............................................................................. 4.3.1. Temperatura da gua, pH e Oxignio Dissolvido na gua....... 12 14 14 19 21 23 23 26 28 29 29 30 31 31 31 32 32

4.3.2. Material em Suspenso e Matria Orgnica............................... 4.4. Anlises Qumicas e Radioqumicas......................................................... 4.5. ndice de estado trfico............................................................................. 5. Resultados e Discusso............................................................................................ 5.1. Caracterizao radiolgica e qumica ........................................................ 5.2. Anlises microbiolgicas........................................................................... 6. Concluses................................................................................................................ 7. Contribuies Tcnicas............................................................................................ 8. Trabalhos Futuros..................................................................................................... 9. Bibliografia............................................................................................................... 10. Anexos.....................................................................................................................

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1) INTRODUO A instalao de um empreendimento mineral proporciona comunidade localizada em sua rea de influncia o aumento da oferta de emprego e renda, da disponibilidade de bens e servios, da arrecadao de impostos e a melhoria da qualidade de vida. Em contrapartida pode tambm significar alteraes indesejveis na paisagem e nas condies ambientais. A superao da contradio representada pelos benefcios e custos ambientais associados instalao de um empreendimento mineral um dos desafios mais importantes a serem solucionados no incio do sculo XXI. A incorporao dos princpios do desenvolvimento sustentvel ao projeto, instalao, operao e descomissionamento destes empreendimentos certamente faz parte da soluo. Dentre estes princpios, devem ser privilegiados mtodos de produo mais limpa, de minimizao do consumo de materiais e energia e gerao de efluentes, alm da maximizao de benefcios sociais. A minerao, de um modo geral, tem sido fonte de severo impacto ambiental, dentre os quais, a Drenagem cida de Mina (DAM), que resultado da oxidao natural de minerais sulfetados quando expostos ao combinada de gua e oxignio, podendo ser acelerada na presena de alguns microrganismos. Efluentes de DAM so geralmente caracterizados pela elevada acidez e por conter metais e sulfatos. Quando no controlada, a drenagem cida pode fluir at os corpos dgua adjacentes causando mudanas substanciais no ecossistema aqutico, constituindo-se em uma fonte difusa de poluio. A DAM considerada um dos problemas ambientais mais graves associados extrao mineral, estando geralmente relacionada com as atividades de minerao de carvo, lignita e de sulfetos polimetlicos ou de metais e minerais radioativos que tenham sulfetos associados. Considerando a importncia ambiental da DAM, atualmente deve-se buscar estratgias de preveno, para que esta no venha a ocorrer, e remediao, quando o problema j est pronunciado. As alternativas mais comuns para o tratamento dos efluentes cidos caractersticos de uma DAM envolvem a neutralizao da acidez e conseqente precipitao e imobilizao das espcies dissolvidas.

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Nesses sistemas, os agentes neutralizantes mais largamente utilizados so o calcrio (CaCO3), a cal virgem (CaO) ou a hidratada (Ca(OH)2) e a soda custica (hidrxido de sdio NaOH) s vezes de forma combinada. A principal desvantagem do mtodo reside no fato de que a lama resultante da precipitao tem alto teor de metais e, em caso de redissoluo, os metais anteriormente imobilizados podem ser transportados contaminando o meio ambiente. Existem tratamentos passivos biticos que podem ser realizados em reas inundadas classificadas em aerbias e anaerbias. As reas inundadas aerbias so caracterizadas por grandes superfcies e pequena lmina dgua onde atuam predominantemente bactrias aerbias. A pequena profundidade favorece a oxidao e os metais podem ser precipitados na forma de hidrxidos, quando o pH do efluente a ser tratado fracamente cido. As reas inundadas anaerbias so caracterizadas por grandes superfcies com substrato orgnico recoberto com uma lmina dgua de espessura superior das reas aerbias. O substrato redutor favorece os processos qumicos e microbiolgicos que geram alcalinidade e elevam o pH, ao mesmo tempo que consomem oxignio e reduzem a quantidade de sulfato. Nesse processo tem forte atuao de bactrias redutoras de sulfato.

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2) REVISO BIBLIOGRFICA 2.1) Caracterizao ambiental At por volta da segunda metade do sculo passado, as atividades de minerao eram realizadas sem a devida preocupao com a preservao do meio ambiente e da sade humana. Os rejeitos e estreis eram descartados ou abandonados sem que fossem considerados os possveis efeitos impactantes, uma vez que no havia uma legislao especfica, e consequentemente uma fiscalizao eficaz (NASCIMENTO, 1998). Atualmente busca-se minimizar os impactos oriundos das atividades de minerao de forma a promover o desenvolvimento sustentvel. Pesquisas, desenvolvimento de novos processos e aplicao de tecnologias mais modernas esto sendo realizadas com a finalidade de reduzir ou tratar os rejeitos produzidos nas atividades atuais, bem como naquelas j finalizadas. Juntamente com o desenvolvimento de novas tecnologias, observa-se um maior cumprimento da legislao por parte daqueles que exploram o ambiente, diminuindo possveis danos irreversveis. Segundo Nascimento (1998) a alta concentrao de cido sulfrico no solo torna-se uma barreira para o crescimento de vegetais, responsveis pela cobertura do solo, propiciando um processo de eroso deste e possvel acidificao do lenol fretico. Um outro problema igualmente impactante a lixiviao sulfrica de metais pesados presentes nos minerais da regio, contaminando os mananciais da superfcie. A Unidade de Tratamento de Minrios (UTM) foi o primeiro empreendimento de lavra e tratamento do minrio de urnio a operar no Brasil. Atualmente, o complexo pertence s Indstrias Nucleares do Brasil S.A. (INB). constitudo de mina a cu aberto e suas reas de bota-foras, bacia de rejeitos e instalaes de tratamento fsico e qumico de minrio, utilizadas no passado para extrao de urnio por processo hidrometalrgico, alm das instalaes de utilidades administrativas (CIPRIANI, 2002). A UTM est localizada no Planalto de Poos de Caldas, em um local denominado Campo do Cercado. A altitude da regio varia entre 1300 e 1600m e o clima tropical de altitude, com duas estaes bem marcadas. Uma quente e mida, entre os meses de outubro a maro e a

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outra, entre os meses de abril a setembro, caracterizada pela estiagem e temperaturas mais baixas. O ndice pluviomtrico mdio de 1700 mm/ano. A vegetao natural da regio basicamente formada por campos de altitude constitudos de gramneas rsticas e por vegetao arbrea e arbustiva disseminada em pequenas manchas ao longo das vertentes (CIPRIANI, 2002). Na rea de influncia da instalao h duas bacias hidrogrficas: a bacia do ribeiro das Antas e a bacia do rio Verde. A UTM est localizada no divisor de guas das duas bacias.

Bacia do Rio Verde Bacia do Ribeiro das Antas

Figura 1.: Planalto de Poos de Caldas; Fonte: Cipriani, 2002.

O local de coleta de amostras, denominado de Unidade de Tratamento de Minrios, consiste de uma mina de urnio a cu aberto que deu origem cava da mina Osamu Utsumi (ponto

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CM Figura 2) e uma planta qumica, localizadas no municpio de Caldas (no planalto de Poos de Caldas), no estado de Minas Gerais, ocupando rea em torno de 15 km2 (SOUZA, 1995).

Figura 2 - Fotos da cava da mina Do material retirado da cava da mina devido minerao, parte foi destinada ao processamento fsico e qumico. O restante permanece estocado principalmente no bota-fora 4 (BF4) e bota-fora 8 (BF8). As pilhas de minrio estril que constituem o BF4 e o BF8 foram estabelecidas, respectivamente, em cima da vertente do Crrego da Consulta e do Crrego Soberbo (Amaral et al., 1988 e Fernandes et al., 1995), desviando-se o curso desses crregos por canais. Nesses bota-foras existe drenagem de gua cida (pontos BF4 e BF8).

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Figura 3- Ponto BF8

Figura 4- Ponto BF4

Na UTM/INB o minrio de urnio foi processado at 1995 gerando uma grande quantidade de estril, com teor de urnio abaixo de 200 ppm. Esse estril foi depositado em extensas reas em torno da regio minerada, denominadas de bota-foras. Segundo Nascimento (1998) a UTM/INB havia processado 2.111.920 toneladas de minrio, base seca, que resultou na gerao de 44.560.000 m3 de estril de minerao. Na figura 5 so mostrados os detalhes geogrficos do Planalto de Poos de Caldas e Localizao da UTM.

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Figura 5.:Detalhes Geogrficos do Planalto de Poos de Caldas e Localizao do UTM. Fonte: Cipriani, 2002

Segundo Cipriani, 2002 os bota-foras foram construdos sem qualquer preparao dos terrenos. Os bota-foras 4 e 8, onde foram depositados o estril de minrio de baixo teor de urnio, foram constitudos sobre o vale e leito do crrego do Consulta e do crrego do Cercado, respectivamente. No incio da operao da UTM/INB, o rejeito lquido da mina era transferido por bombeamento at um canal construdo no bota-fora 8 e atravs desse era lanado no crrego do Cercado, sem nenhum tratamento. A presena de minerais sulfetados, inclusive pirita gerou uma gua com acidez e concentraes de radionucldeos (urnio, trio

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e rdio) e elementos estveis (mangans, zinco, fluoreto, ferro, etc.), acima dos valores permitidos pela legislao (Resoluo CONAMA, 2005), imprpria para o lanamento direto no ambiente. Quando a Comisso Nacional de Energia Nuclear (CNEN) constatou o problema, exigiu a construo de bacias de captao das guas da mina e dos bota-foras, o tratamento destas guas para neutralizar a acidez e precipitar os radionucldeos e metais pesados. Atualmente o lanamento da gua no meio ambiente se d aps a decantao dos slidos em suspenso. Anlises das guas cidas tratadas mostraram que, qualquer interrupo do tratamento atual provoca imediato aumento da concentrao de poluentes lanados para o meio ambiente aqutico. A UTM est localizada numa regio de tradio mineira e tem, devido ao tipo de mineralizao (xidos de urnio contendo sulfetos metlicos) e ao mtodo de lavra e tratamento usado, um cenrio ambiental bastante complexo, que inclui: mina com drenagem cida e a conseqente dissoluo das espcies radioativas e metlicas, dificultando a deciso sobre o que fazer com as guas e a cava aps o fechamento; bota-foras colocados em talvegues, que tambm apresentam drenagem cida e dissoluo de espcies radioativas e metlicas; uso de cido sulfrico para a dissoluo de urnio, o que gerou rejeitos slidos e lquidos que foram neutralizados e o rejeito slido produzido foi deposto em bacia de rejeitos; uso de solventes orgnicos na etapa de concentrao; instalaes e equipamentos que devem ser descontaminados caso forem utilizadas para outros fins; e, finalmente, a necessidade de monitorao do local ao longo do tempo (CIPRIANI, 2002). 2.2) Drenagem cida Um dos problemas ambientais graves originados da atuao da indstria de minerao a drenagem cida de mina. As principais fontes de drenagens cidas so as minas a cu aberto ou subterrneas, bacia de rejeitos, pilhas do estril e de estocagem do minrio que contenham sulfetos associados. Nestas fontes so distinguidas duas zonas envolvidas na gerao de cido e metais dissolvidos. A parte mais prxima da superfcie, que est em contato com o oxignio atmosfrico, conhecida como zona oxidante; abaixo est a zona redutora onde reaes qumicas ocorrem na ausncia de oxignio. A zona redutora influenciada pelas interaes biogeoqumicas e produtos que percolam da zona oxigenada. (NASCIMENTO, 1998)

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Em muitos pases existem minas j desativadas ou temporariamente fechadas, onde a drenagem cida procedente de rejeito e estril apresenta caractersticas de acidez bastante pronunciada. No Brasil, na regio carbonfera ao sul do pas e na Unidade de Tratamento de Minrios Indstrias Nucleares do Brasil UTM/INB, o problema da drenagem cida de mina tem se destacado (QUINELATO et al., 2002). Em Santa Catarina, os resduos produzidos na minerao do carvo e acumulados desde os anos 60 (cerca de 200 milhes de toneladas), contm altos teores de enxofre, principalmente pirita. A gua cida gerada polui cerca de dois teros dos cursos de gua da regio. (NASCIMENTO, 1998). A drenagem cida de mina acontece quando a pirita (Fe2S) e outros minerais sulfetados so oxidados espontaneamente, devido a presena de oxignio e gua, produzindo cido sulfrico que dissolve metais presentes no solo/rocha. (NORDWICK et al., 2003). Minerais como a pirita (FeS2 o mais abundante de todos os minerais sulfetados) so quimicamente e biologicamente estveis em situaes onde os teores de gua e oxignio so mnimos. A primeira etapa do processo de oxidao dado pela reao abaixo : FeS2 + 6Fe+3 + 3H2O 7Fe+2 + S2O3-2 + 6H+ (1)

A oxidao do mineral sulfetado pode ocorrer de forma abitica, mas a velocidade da reao pode ser muito aumentada na presena de certos procariotos litotrficos. Esses microrganismos aceleram a oxidao do mineral pela gerao do on frrico, dado pela reao abaixo: 4Fe+2 + O2 + 4H+ 4Fe+3 + 2H2O (2)

A formao do tiossulfato (reao 1) abitica e pode ocorrer em ambientes anaerbios, mas favorecida no ambientes aerbios. No entanto a reao 2 requer oxignio fundamentalmente biolgico, isto , produzido por seres vivos, neste caso microrganismos e pH < 4 (JOHNSON & HALLBERG, 2003). Algumas espcies dos grupos Eubacteria e Archaea podem oxidar o tiossulfato (produto da oxidao da pirita), assim como outros compostos inorgnicos de enxofre e enxofre elementar, produzindo cido sulfrico. S2O3-2 + 2O2 + H2O 2H+ + 2SO4-2 (3)

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Ento, essa acidez resulta na hidrlise do ferro: Fe+3 + 3H2O Fe(OH)3 + 3H+ (4)

guas drenadas de minas so portanto, cidas, e freqentemente contm elevadas concentraes de metais pesados dissolvidos. Esses metais originam dos sulfetos e outros minerais associados e so mantidos em soluo devido grande solubilidade do licor cido (JOHNSON & HALLBERG, 2003). O tratamento convencional utilizado para elevao do pH a adio de Ca(OH)2 e CaO, onde estes reagem com o sulfato presente na gua cida formando CaSO4.2H2O, que precipita. Esse processo caro e produz rejeitos e hidrxidos metlicos. No sul da Austrlia, cal utilizada no tratamento das guas cidas em uma mina descomissionada de Pirita em Brukunga, localizada aproximadamente a 50 km de Adelaide. O custo deste tratamento estava estimado em $250000,00/ano em 1988 (ELLIOT et al., 1998). Na UTM, o volume mdio tratado cerca de 1.971.065m3/ano (2002-2004), sendo consumidos cerca de 2710 t /ano de cal, resultando num custo mdio total de R$ 1.117.681,00/ano (dados registrados nos boletins internos da INB). 2.2.1) Bioremediao

Uma alternativa possvel para o tratamento qumico destes efluentes a bioremediao usando BRS, apresentando a vantagem desses microrganismos crescerem em ambiente de mina. De fato, algumas BRS tm sido isoladas do fundo de lagoas de rejeitos de minerao. Do mesmo modo tm sido provado que ecossistemas aquticos contaminados por guas cidas tm sido capazes de recuperar naturalmente a situao inicial graas a presena de espcies com a capacidade para regenerar o meio (GARCIA et al., 2001). Processos biolgicos utilizando bactrias redutoras de sulfato (BRS) tm sido descritos como tratamentos eficientes e economicamente viveis (HERRERA et al., 1997; CORK et al.,1978; ECCLES H., 1999), sendo de interesse industrial, tanto em processos de descontaminao ambiental como na produo de enxofre ou compostos de enxofre de alto valor comercial.

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Segundo os estudos, em escala piloto, realizados na Austrlia por Jong & Parry (2003) o tratamento de gua cida em um bioreator de coluna anaerbia contendo bactrias sulfato redutoras bastante eficaz, alterando o pH de 4,0 para cerca de 7,2, com remoo de mais de 80% do sulfato, alm de remover mais de 97,5% de Cu, Zn e Ni, e mais de 82% de Fe. Alm disso esse processo apresentou menores custos se comparado ao anteriormente usado: neutralizao por adio de uma substncia alcalina. Uma outra proposta de tratamento das guas cidas utilizando bactrias sulfato redutoras o uso de reas alagadas (wetland). Uma planta em operao desde 1993 em uma mina de estanho, em Cornwall, UK, consiste em trs sistemas separados que compreendem cinco cmaras aerbicas, uma clula anaerbica e uma rocha associada a algas. Nas clulas aerbicas ocorre a precipitao de alguns metais, no caso do experimento, o Ferro. Na clula anaerbica feita a correo do pH devido a presena das bactrias sulfato redutoras, e inicia-se a precipitao do Mn, que termina na terceira clula. Essa ltima, contm alga associada a um tipo de rocha e sua funo filtrar, retendo metais pesados (HALLBERG & JOHNSON, 2001). Outro tipo de bioreator utilizado para o tratamento de guas cidas consiste de um processo, onde a gua cida submetida um pr-tratamento com adio de uma rocha calcria, pois, segundo os autores, esse pr-tratamento induz uma variao no pH que passa de ~3,0 para prximo da neutralidade, cerca de 6,0, aumentando a eficincia das bactrias sulfato redutoras. Alm disso verificou-se que se a gua da alimentao do terceiro bioreator fosse fria ou gelada, no havia alterao na populao, nem na atividade das bactrias sulfato redutoras. (NORDWICK et al., 2003) Elliot et al., 1998 realizaram testes para o tratamento de guas cidas utilizando um bioreator de coluna de fluxo contnuo. Nesse estudo, o bioreator foi preparado com a adio de meio de cultivo Postgate B (POSTGATE, 1979), sem a adio de sulfato de ferro para impedir a precipitao de sulfeto de ferro. O pH do efluente era reduzido progressivamente e eram medidos o pH final e a concentrao de sulfeto de hidrognio produzido. Aps um perodo de adaptao do consrcio de BRS presente no bioreator, verificou-se que o pH do efluente estava maior (4,5-6,1; 4,0-6,24; 3,5-5,63; 3,25-5,82), bem como uma produo de

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sulfeto de hidrognio decorrente da reduo do sulfato dissolvido. Outros autores tambm realizaram estudos com bioreatores de coluna obtendo resultados satisfatrios de reduo de sulfato e aumento de pH (TSUKAMOTO et al., 2004; CHANG et al., 2000; CHRISTENSEN et al., 1996) 2.3) Bactrias sulfato redutoras 2.3.1) Classificao e caractersticas gerais O nome bactria redutora de sulfato convencionalmente reservado para microrganismos que conduzem a reduo dissimilatria do sulfato. Nesse processo o on sulfato atua como um agente oxidante para a dissimilao da matria orgnica. O sulfato utilizado como aceptor final de eltrons e o sulfeto de hidrognio formado excretado (GOTTSCHALK, 1979). O enxofre pode existir em diversos estados de oxidao. Em ambientes aerbios o sulfato termodinamicamente estvel e em ambientes reduzidos o sulfeto mais estvel. No entanto a reduo de sulfato a sulfeto no ocorre espontaneamente nas condies fsicas da atmosfera, e requer uma mediao cataltica por atividade biolgica. A reduo biolgica do sulfato pode ser: Reduo assimilatria O enxofre necessrio para a biossntese de componentes citoplasmticos, sendo incorporado pelos organismos, compe as estruturas qumicas de aminocidos, cidos nuclicos e em alguns co-fatores, tais como biotina e cido pantotenico (POSTGATE, 1979). Ele est presente no citoplasma como nion HS-, em que o enxofre est no seu estado mais reduzido, correspondendo ao sulfeto (em condies de anaerobiose). Reduo dissimilatria Sob condies anaerbias, as BRS podem utilizar sulfato como aceptor final de eltrons no sistema de transporte de eltrons. Essas bactrias so geralmente organotrficas e oxidam compostos orgnicos de baixo peso molecular e simultaneamente reduzem sulfato a sulfeto (NEDWELL, 1982).

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Bactrias redutoras de sulfato so um grupo diverso de procariotas que podem ser divididas em quatro subgrupos formados na anlise das seqncias de 16S rRNA: BRS mesoflicas Gram-negativas; BRS Gram-positivas formadoras de esporos; BRS bactrias termoflicas ; e BRS archaeas termoflicas. Todos esses grupos se caracterizam por usar o sulfato como aceptor final de eltrons durante a respirao anaerbica (CASTRO et al., 2000). As bactrias redutoras de sulfato contribuem para uma variedade de funes essenciais em muitos ambientes anaerbios. Em adio a essa importncia bvia para o ciclo do enxofre, BRS so importantes reguladores de uma variedade de processos em wetlands, inclusive no aproveitamento da matria orgnica, biodegradao de poluentes aromticos clorados em solos anaerbios e sedimentos e na metilao do mercrio (CASTRO et al., 2000). Segundo Corts (2005) os processos biolgicos tm por principal caracterstica a realizao de reaes qumicas complexas, que normalmente ocorreriam temperatura e presso ambientais, em contraste com os processos qumicos que precisam de energia, presso e catalisadores para realizar a reao. Eles utilizam enzimas que so capazes de diminuir a energia de ativao da reao, gerando um produto com uma eficincia de 100% sem gerao de resduos. Todavia as BRS requerem certos ambientes especficos: um ambiente anaerbio com um potencial redox abaixo de -100mV e um pH acima de 5.5. Ambos os fatores podem limitar o tratamento da DAM. Em contraste com esse fato, em alguns casos, foi observada atividade biolgica em "wetlands" e sedimentos de lagos, com presena de BRS em pH por volta de 3. Outro aspecto questionvel se essas bactrias podem crescer na presena de altas concentraes de metais e alm disso qual txico para elas. As BRS so anaerbios estritos, tm crescimento relativamente lento comparado aos demais organismos presentes no solo e na gua, mas podem sobreviver em ambientes terrestres e aquticos. As BRS compe-se de espcies mesoflicas que crescem melhor em temperatura por volta de 30oC, mas tolerando at 42oC, e espcies termoflicas capazes de crescer em temperaturas entre 50oC e 70oC. Alguns acreditavam que as espcies que toleram altas temperaturas eram variedades adaptadas de alguns organismos mesoflicos. (POSTGATE, 1979).

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Campbelll et al., 1956 mostraram conclusivamente que os tipos mesoflicos isolados e avaliados com diferentes colees, eram espcies completamente diferentes. Hoje as interconverses so consideradas equivocadas. Dois gneros foram conhecidos por muito tempo (Desulfovibrio e Desulfotomaculum), mas recentemente novos gneros foram identificados (Desulfobacter, Desulfonema,

Desulfobulbus etc.). Fora a capacidade para reduzir sulfato, esses outros gneros parecem ser biologicamente muito diferentes dos dois primeiros, exceto o gnero Desulfomonas que muito semelhante a Desulfovibrio. O Gnero Desulfovibrio mais conhecido porque seus membros so relativamente fceis de isolar e purificar; so usualmente mesoflicos e podem ser haloflicos, no formam esporos e so gram-negativos. O gnero Desulfotomaculum apresenta indivduos mesoflicos ou termoflicos, mas ocorrncias naturais de espcies haloflicas so raras. Todos os membros formam esporos. (POSTGATE, 1979). Pfennig et al. (1981) sugeriu que todas as BRS envolvidas no processo dissimilatrio fossem classificados em um nico grupo ecofisilgico. Morfologicamente a maioria das espcies de Desulfovibrio so curvadas ou sigmides, mas desvios da regra existem. So propensos ao pleomorfismo em culturas velhas ou em ambiente insatisfatoriamente favorvel: eles tendem a formar variedades espiraladas. A morfologia, na verdade no um bom critrio para identificao de BRS, porque de incio os trabalhos podem ter obtido uma idia exagerada do pleomorfismo como resultado de estudos com culturas impuras. E mesmo culturas puras, podem apresentar inmeras formas devido ao pleomorfismo acarretado pelo ambiente desfavorvel. (POSTGATE, 1979). Para comparaes morfolgicas aconselhvel a padronizao das condies de crescimento. A morfologia flagelar um bom critrio taxonmico O flagelo de Desulfotomaculum usualmente peritricoso e aparece originado lateralmente. No entanto o flagelo facilmente perdido durante a manipulao e semelhante a formas monotricosas podem ser observadas. A formao de esporos provavelmente umas das principais distines entre Desulfotomaculum e as outras BRS, ainda que a esporulao por Desulfotomaculum no seja um evento previsvel (POSTGATE, 1979).

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As BRS so microrganismos quimiolitotrficos anaerbios estritos, que podem ser divididos em quatro grupos: bactrias gram-negativas mesoflicas, bactrias gram-positivas formadoras de esporos, bactrias termoflicas, e arqueabactrias. Elas se caracterizam por respirar sulfato e utilizar hidrognio como fonte de energia, gerando rapidamente H2S (BANDZIONG et al., 1978; KREKELER et al., 1995; CIPIONKA et al., 1998). A espcie tpica de BRS, representada por Desulfovibrio desulfuricans, podendo reduzir sulfato autotroficamente (ausncia de fonte de carbono orgnico) com hidrognio e

heterotroficamente usando lactato como doador de eltrons (CHANG et al., 2000; NAGPAL et al., 2000) O grupo das hidrognio-lactato compreende principalmente espcies de Desulfovibrio e Desulfotomaculum que utilizam cidos lctico, pirvico, succnico, fumrico e mlico, em adio ao etanol, formato e glicerol. Alguns organismos com este metabolismo padro podem utilizar hidrognio como doador de eltrons na presena de CO2, acetato ou outra fonte carbnica. Esta habilidade tem sido utilizada em reatores em escala laboratorial para produo de gs, o qual contem uma substancial proporo de hidrognio, como um substrato para BRS para remover sulfato industrial. BRS deste padro metablico apresentam crescimento relativamente rpido (DU PREEZ et al., 1992; HANSEN, 1993). Espcies de Desulfobacter so capazes de oxidar o acetato a CO2. Embora algumas espcies podem utilizar lactato ou etanol, a gama de substncias geralmente muito limitada e este grupo no capaz de utilizar H2 como doador de eltron. O crescimento lento (POSTGATE, 1979). 2.3.2) Aspectos Metablicos BRS utilizam os produtos finais de outras fermentaes, tais como lactato, malato e etanol como doadores de H+: esses compostos so oxidados a acetato e CO2. A energia gerada empregada na reduo do sulfato a sulfeto. O sulfeto pode reagir com metais dissolvidos formando sulfeto metlico que precipita. 2C3H6O3 + 2H2O SO4-2 + 8H+ 2 C2H4O2 + 2CO2 + 8H+ S-2 + 4H2O (6) (5)

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H2S + M+

MS + 2H+, onde M=metal

(7)

BRS obtm o carbono e a energia necessrios para o crescimento de vrias rotas metablicas. O crescimento quimiorganotrfico pode ser realizado atravs de compostos da carbono simples, tais como lactato. Alternativamente, as fontes de carbono e energia podem estar separadas, e os compostos de carbono orgnico que no so assimilados para crescimento, tais como formato e isobutanol, podem servir como doadores de eltrons para gerao de energia enquanto outros compostos da carbono so assimilados para crescimento. Este modelo de crescimento tem sido chamado de mixotrfico (POSTGATE, 1979). Hidrognio pode ser utilizado como um doador de eltron e essa situao extrema de crescimento pode ser chamada de quimiolitotrofia, tambm chamado de crescimento autotrfico (PFENNIG et al., 1981). O processo utiliza sulfato ou enxofre como receptor de eltrons, hidrognio (ou etanol, lactato) como fonte de energia e CO2 (ou etanol, lactato) como fonte de carbono, gerando como produto o sulfeto de hidrognio (H2S), H2O e biomassa, de acordo com as reaes descritas abaixo: H2SO4 + 4H2
Desulfovibrio desulfuricans

H2S + 4H2O (8) 2CH3COOH + H2S + 2H2O (9)

H2SO4 + 2C2H5OH 2C3H5O3Na + MgSO4

Desulfovibrio desulfuricans

Desulfovibrio desulfuricans

2CH3COONa + MgCO3 + H2S + H2O (10) 4H2S + 3H2CO3 + CO2 + 7H2O (11) 6 H2S + 2 CO2 (12)

4H2SO4 + 2C2H5OH + 4H2 6S + C2H5OH + 3 H2O

Desulfovibrio desulfuricans

Desulfovibrio desulfuricans

Estas reaes ocorrem em pH 7,0 e 30oC em anaerobiose. No meio ambiente natural, as bactrias redutoras de sulfato concorrem com as bactrias metanognicas por substratos comuns que so hidrognio, formiato e acetato. Esta caracterstica justifica a utilizao de culturas mistas na reduo de sulfato e produo de H2S em biorreatores (OUDE ELFERINK et al., 1994), desde que as condies favorveis s

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BRS sejam estabelecidas. Em sistemas reais, a proporo entre sulfato e carbono a que origina a prevalncia das metanognicas ou as sulfetognicas (excluso biocompetitiva). 2.3.3) Produo de H2S O H2S, produto do metabolismo das BRS, pode reagir com os metais pesados presentes no efluente, formando sulfetos insolveis. A produo de sulfeto metlico se d sem a utilizao de outro insumo no processo. Independentemente da origem (biolgica ou no) do on sulfeto, a sua utilizao para precipitar os metais pesados, se comparada precipitao com leite de cal, apresenta as seguintes vantagens: A solubilidade dos sulfetos muito menor do que a dos correspondentes hidrxidos; Os sulfetos podem ser precipitados seletivamente; Existe a possibilidade de recuperao dos metais de interesse comercial a partir dos sulfetos metlicos; Apresenta uma alta reatividade sob uma ampla faixa de pH (FOUCHER et al., 2001; GLOMBITZA, 2001). A solubilidade dos sulfetos metlicos diminui medida que se aumenta o pH, sendo possvel uma precipitao seletiva. Em comparao, os hidrxidos so insolveis em pH mais elevados do que aqueles observados para os sulfetos (CORTS, 2005). As bactrias redutoras de sulfato apresentam caractersticas bioqumicas particulares. Segundo as vias metablicas, para a gerao de sulfeto de hidrognio (H2S) a principal fonte de energia (doador de eltrons) o hidrognio. Vias alternativas, utilizando compostos orgnicos, usam a oxidao destes e os eltrons para produzir hidrognio via hidrogenases presentes no citoplasma (hidrogenase Fe). O metanol, por exemplo, transformado em CO2 liberando prtons e eltrons que so utilizados na gerao de hidrognio no citoplasma. O hidrognio sai do citoplasma para o espao periplasmtico e interage com a hidrogenase presente na membrana plasmtica (hidrogenase Ni-Fe) gerando novamente eltrons e prtons. Os eltrons so transferidos pelo citocromo c3 a diferentes enzimas de oxirreduo

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(adenosina fosfossulfato redutase, desulfoviridina, tritionato redutase, tiosulfato redutase) permitindo a reduo do sulfato at sulfeto ou de enxofre at sulfeto, que sai da clula como sulfeto de hidrognio. Os prtons formados geram um gradiente eletroqumico permitindo gerar ATP via ATPase. No caso do enxofre como substrato e etanol (como fonte de energia) ele transformado at chegar a piruvato que entra no ciclo dos cidos tricarboxlicos. Os eltrons so transferidos para molculas redutoras que finalmente os transferem ao sulfito via ferredoxina, gerando H2S (CHOI et al., 1994). Como fonte de carbono muitas BRS fixam CO2 utilizando uma via alternativa (rota do monxido de carbono desidrogenase). A eficincia do processo vai depender de vrios fatores, dentre eles a transferncia gslquido para o caso do hidrognio, da disponibilidade da fonte de eltrons como orgnicos e sua transformao at hidrognio e a eficincia das diferentes rotas metablicas. Processos de reduo de metais podem ser teis quando acoplados a reduo de sulfato, sendo este ltimo um aceptor final de eltrons, produzindo sulfeto. Eles dissimilam carbono via mecanismos respiratrios A gama de fontes de carbono utilizadas pelas BRS como um todo so muito variadas e inclui lcoois, cidos orgnicos e hidrocarbonetos. No entanto, espcies individuais so capazes de metabolizar uma quantidade limitada desses substratos e as preferncias tm sido utilizadas para dividir as BRS em grupos diferentes com importantes aspectos de crescimento (CORTS, 2005). 3) OBJETIVOS Avaliao sazonal e espacial (fizemos superfcie, fundo e sedimento) da presena de Bactrias Redutoras de Sulfato(BRS) e caracterizao qumica do efluente lquido oriundo da cava da mina e pilha de estreis de mina de urnio em fase de descomissionamento. 4) MATERIAIS E MTODOS Este trabalho seguiu um planejamento de coleta de amostras, no perodo de fevereiro a dezembro de 2004, de conforme procedimentos detalhados abaixo. Foi feita uma

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atualizao e treinamento nos procedimentos analticos para utilizao no desenvolvimento do trabalho experimental do projeto global. 4.1) Amostras Amostras de gua e sedimento foram coletadas nos efluentes lquidos da cava da mina e dos bota-foras 4 e 8. Estas amostras foram coletadas em diferentes nveis de profundidade e periodicamente para realizao de um estudo sazonal, durante o perodo de fevereiro a dezembro de 2004. Para cada amostra coletada foram realizadas determinaes microbiolgicas e fsico-qumicas. As amostras de gua foram coletadas em frascos de vidro esterilizados, escuros, cheios at a borda e fechados imediatamente. As amostras de sedimento da cava da mina foram coletadas com coletor de sedimento tipo core. Nos pontos BF4 e BF8 a coleta de sedimento foi realizada com coletor tipo draga e em seguida, as amostras foram acondicionadas em sacos plsticos e conduzidos ao laboratrio para as anlises. Os inculos eram feitos no dia da coleta, e quando isto no era possvel as amostras eram armazenadas em geladeira at o dia seguinte, de forma garantir sua preservao.

Figura 6.: Arranjo Fsico do Complexo Mnero-Industrial do Planalto de Poos de Caldas. Fonte: Cipriani, 2002.

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4.2) Anlises microbiolgicas 4.2.1) Bactrias redutoras de sulfato A determinao da ocorrncia de bactrias redutoras de sulfato em amostras de gua e de sedimento foi realizada usando-se o meio de cultivo Postgate B pelo mtodo dos tubos mltiplos (srie de cinco tubos). O nmero mais provvel por grama (NMP.g-1 ou mL-1) de bactrias redutoras de sulfato foi determinado por meio de tabela de nmero mais provvel, apropriada s diluies inoculadas (Postgate, 1979). TABELA 1 Composio do meio de culura Postgate B Composio do meio B (Postgate, 1979) KH2PO4 NH4Cl CaSO4 MgSO4.7H2O Lactato de sdio Extrato de levedura cido ascrbico cido Tiogliclico FeSO4.2H2O gua destilada 0,5 g 1,0 g 1,0 g 2,0 g 3,5 g 1,0 g 0,1 g 0,1 g 0,5g q.s.p. 1000mL

Dissolva os reagentes na ordem descrita, ajuste o pH entre 7,0 e 7,5. Este meio sempre contm um precipitado.

4.2.2) Contagem total de bactrias Alquotas de cada amostra de gua previamente fixadas com formaldedo (concentrao final de 2 %) foram coradas com soluo aquosa de corante laranja de acridina na concentrao de 1,0 g/L. Aps 5 minutos de contato da amostra com a soluo corante, a amostra foi filtrada em membrana de policarbonato (Millipore, coradas com Sudam Black), com poro de 0,22 m. (Anexo II). A membrana foi em seguida colocada sobre lmina fina e analisada sob microscpio de epi-fluorescncia (Microscpio Zeiss-Axioplan 2, filtro UV

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450 - 490, FT 510, LP 520, lmpada de mercrio HBO 50 W e objetiva neofluor 100 X /1,30). Foram contados 50 campos microscpicos, de modo que a rea de cada campo foi de 625 mm2. Frmula para o clculo do nmero de bactrias/mL de amostra: N = g.A.D a.V Onde: N = n de bactrias /mL; g = mdia do n de bactrias/50campos; A = rea de filtrao; D = fator de diluio; a = rea do campo; V = volume filtrado. 4.3) Anlise fsico-qumicas 4.3.1) Temperatura da gua, pH e Oxignio Dissolvido na gua A temperatura da gua e as determinaes de pH foram feitas no campo com o auxlio de um Eletrodo de pH Combinado WTW - 320. As determinaes de oxignio dissolvido na gua foram realizadas por titulometria, segundo Eaton, (1995). 4.3.2) Material em Suspenso e Matria Orgnica O material em suspenso (total, orgnico e inorgnico) foi determinado usando-se filtros Millipore (microfibra de vidro) com 47 mm de dimetro previamente secos (110 C/ 1 h.) e pesados. Filtrou-se 1000 ml da amostra em Conjunto Millipore; retirou-se o filtro com a amostra secando-a a 110 C por 2 horas. Pesou-se novamente, transferindo-se a amostra para um cadinho de porcelana previamente tarado, colocando-o em mufla a 150 C por 30 minutos. Em seguida a temperatura foi elevada em 50 C de hora em hora at alcanar 450 C, permanecendo nesta temperatura por 2 horas. (13)

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A matria orgnica no sedimento foi determinada atravs da perda por ignio. Amostras de sedimento de peso e volume conhecidos foram secos a 110 C at peso constante. Em seguida pesadas e recolocadas em mufla a 450 C por 5 horas. Os resultados obtidos para as amostras de gua e de sedimento foram expressos em porcentagem de matria orgnica. 4.4) Anlises Qumicas e Radioqumicas As anlises de dureza (clcio e magnsio), mangans e zinco foram realizados por espectrometria de absoro atmica por plasma acoplado indutivamente. O fosfato foi analisado atravs de espectrofotometria vil, com molibdato. O sulfato foi analisado por espectrofotometria com cloreto de brio e o fluoreto por potenciometria com eletrodo seletivo (Nascimento et al., 1988). O urnio e o trio foram analisados por espectrofotometria com arsenazo III segundo Fukuma et al., 2001. O mtodo utilizado para determinao de Ra-226, Ra-228 e Pb-210 foi a coprecipitao com sulfato e cromato respectivamente, seguida da contagem alfa e beta dos seus filhos, ou seja: Rn-222 no caso do Ra-226, Ac-228 para o Ra-228 e Bi-210 no caso do Pb-210, aps equilbrio radiativo, em contador de ultra- baixo background. Para o Po-210, foi usado o mtodo deposio direta em meio redutor em plaquetas de prata e a determinao realizada em espectrmetro alfa usando detetor de barreira de superfcie. 4.5) ndice de estado trfico A clorofila a foi determinada conforme recomendada por Marker et al, 1980, usando etanol 90% quente como solvente para extrao. As concentraes de clorofila foram calculadas pelas equaes de Lorenzen, 1967. O ndice de estado trfico foi calculado pela metodologia de Carlson, 1977, baseada no parmetro clorofila a, tal equao est mostrada abaixo: TSI (Chl) = 10(6 - 2,04 - 0,68 LnChl) / Ln2 (14)

Onde: TSI = Trophic state index (ndice de Estado Trfico), Chl = clorofila

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5) RESULTADOS E DISCUSSO A relevncia apresentada neste trabalho concentra em grande parte na implementao de metodologias mais confiveis para quantificao das bactrias sulfato redutoras, objeto desta linha de pesquisa, nos laboratrios da CNEN de Poos de Caldas, uma vez que no Brasil, poucos grupos de pesquisa na rea de microbiologia ambiental dispem destas metodologias de caracterizao e desenvolvimento de processos com microrganismos anaerbicos. A complementao de tcnicas e instalaes do Laboratrio de Radioecologia da COLAB/CNEN - Poos de Caldas com suporte dos pesquisadores da USP e recursos da FAPEMIG, significou um avano importante para esta linha de trabalho no mbito da CNEN. Os valores mdios de temperatura observados nos pontos CM (superfcie), CM (12,5 m de profundidade), BF8 e BF4, foram, respectivamente: 22 0C, 19 0C, 22 0C e 21 0C. 5.1) Caracterizao radiolgica e qumica Na tabela 2 apresentada a caracterizao radiolgica das amostras de gua e sedimento coletadas nos pontos CM (cava da mina), BF8 e BF4. Os elementos analisados foram: Urnio, Trio, Rdio, Chumbo e Polnio. Tabela 2. Caracterizao radiolgica das amostras dos pontos CM, BF8 e BF4
Pontos U (mg.L-1) 5,84 12,08 9,25 0,02* U (%) 0,396 0,02 0,03 Th (mg.L-1) 0,22 0,19 0,25 Th (%) 0,02 0,01 0,03 Ra-226 (Bq.L-1) gua CM BF8 BF4 Limite 1,09 0,57 0,53 1,0** Sedimento Pontos CM BF8 BF4 Ra-226 (Bq.Kg-1) 830+60 430+40 Ra-228 (Bq.Kg-1) 430+50 620+60 Pb-210 (Bq.Kg-1) 820+120 580+80 Po-210 (Bq.Kg-1) 0,02 0,60 0,36 0,1*** 0,28 1,1 1,2 0,1*** 0,049 0,16 0,20 0,1*** Ra-228 (Bq.L-1) Pb-210 (Bq.L-1) Po-210 (Bq.L-1)

* Limite estabelecido pela Resoluo CONAMA, 2005 para guas doces classe 3; ** Limite adotado pela INB; *** Limite estabelecido pela CNEN.

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Como pode ser observado os valores apresentados na tabela 2 para gua referente ao Urnio, ao Rdio 228, ao Chumbo e ao Polnio esto acima dos permitidos pela legislao. Em alguns casos, como por exemplo o efluente gerado no ponto BF8, a concentrao de urnio 600 vezes maior que o aceito pela legislao ambiental. De acordo com Nascimento, 1998 o rigor das normas ambientais com respeito ao urnio no ambiente se deve mais s conseqncias de sua toxicidade qumica do que a radiolgica. O urnio precipita protenas e reduz a atividade de algumas enzimas em rgos como os rins, onde as concentraes de ons uranilo livre ocorre por ingesto. Isso acarreta um mal funcionamento do rgo, e em casos extremos, uremia letal. De acordo com Ronqui et al.,2004 a bacia das Antas, que recebe os efluentes tratados da UTM, apresenta qualidade de gua classe III. De acordo com Resoluo CONAMA, 2005 foi verificado que os efluentes estocados na cava da mina, BF8 e BF4 apresentam valores de metais (zinco e mangans) que excedem os limites mximos recomendados para efluente, como mostrado na tabela 3. O tratamento desse efluente utilizando bactrias redutoras de sulfato que promovem a reduo do on sulfato a sulfeto, poder levar a diminuio da concentrao dos metais atravs da precipitao dos sulfetos metlicos e, consequentemente, o decrscimo da concentrao de sulfato. Tabela 3. Anlises qumicas das amostras dos pontos CM, BF8 e BF4.
Pontos CM BF8 BF4 Limite permitido CM BF8 F -1 70,95 116,81 121,44 10,0 4,16 0,06 PO4 3 gua 4,60 < 0,03 < 0,03 Sedimento 0,137+0,006 0,217+0,006 4,94+0,03 0,24 0,935+0,001 0,06 0,04 12,10 2,91 0,43 97,66 137,61 107,38 1,0 16,83 22,59 17,95 5,0 1385,50 1548,75 1247,14 Mn Zn (SO4) -2-

BF4 0,04 0,254+0,006 1,14 Concentraes das espcies na gua - mg.L-1 e (%) no sedimento

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Garcia et al., 2001 verificaram que a gua cida da uma mina pirtica da Espanha mostrou valores de sulfato entre 1800 e 2000 ppm e concentrao de zinco entre 30 e 50 ppm. Esses nveis so mais altos que os encontrados nesse trabalho (Tabela 3).

Na tabela 4 so apresentados os valores referentes slido em suspenso e dureza da gua cida coletada nos trs pontos analisados. TABELA 4 Slido em suspenso e dureza da gua cida dos trs pontos coletados Slido em suspenso (g/L) CM FEV MAR ABR AGO SET OUT NOV DEZ 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 0,006 BF8 0,006 0,007 0,005 0,005 0,005 0,006 0,005 0,006 BF4 0,004 0,009 0,007 0,005 0,006 0,004 0,005 0,006 CM 1035,77 1155,50 1066,67 1118,50 1267,50 1144,50 1193,00 1211,00 Dureza (mg/L) BF8 377,00 473,00 491,40 547,00 517,00 496,00 586,00 545,00 BF4 283,00 309,00 308,50 283,00 237,00 230,00 318,00 267,00

5.2) Anlises microbiolgicas Em relao a ocorrncia de bactria nas amostras de gua, o ponto BF8 apresentou a maior capacidade para crescimento bacteriano, sendo o maior valor de contagem total de bactria (13,3.105 bactria.mL-1) observado em fevereiro neste ponto. Os valores mdios encontrados so: ponto BF8 (1,1.106 bactria.mL-1), ponto CM (3,5.105 bactria.mL-1) e ponto BF4 (3,4.105 bactria.mL-1). Frmmichen et al., 2004 realizou estudos de microcosmos simulando um pequeno lago com gua cida de mina (pH=2,6). A contagem total de bactrias obtida na coluna dgua por esses autores variaram entre 105 a 106 bactria.mL-1, estando de acordo com os valores obtidos neste trabalho Figura 7.

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14 AO (Num. de Bact./mL) 1,0E+05


BF8

14 12 10 8
CM

12 10 8 6 4 2 0
A go O ut N ov fe v M ar A br Se ez t
BF4

6 4

CM

BF4

BF8

2 0

Ms
Figura 7 Nmero de bactrias e BRS observadas em amostras de gua nos trs pontos amostrados. AO: Acridine orange (Laranja de acridina); BRS: Bactrias redutoras de sulfato; BF4: Bota-fora 4; BF8: Bota-fora 8; CM: Cava da mina.

De acordo com os ndices de estado trfico calculados conforme Carlson, 1977, os trs pontos amostrados podem ser considerados eutrficos (ndices trficos BF8 =57,7, BF4=58,4 and CM=53,8). O valor mdio de bactrias no ponto BF8 (1,1.106 bacteria.mL-1) foi similar ao encontrado por Ferrari, 2002 em lago oligotrfico, 1.2.106 bactria.mL-1. No entanto no pontos BF4 e CM o nmero de bactrias/mL foi menor que as medidas de Ferrari. Estes resultados podem estar associados com as altas concentraes de metais na gua cida e aos baixos valores de pH (cerca de 3,8), que podem estar interferindo no crescimento bacteriano. O maior valor de BRS (2,8 MPN.mL-1) foi observado tambm em Fevereiro no ponto BF8 (Figura 7). Os valores mdios de BRS observados nas amostras de gua analisadas no presente estudo foram baixos: BF8= 1.95 MPN.mL-1, BF4= 0.65 MPN.mL-1 e CM = 0.2 MPN.mL-1 ,e so similares aos resultados obtidos em outros estudos realizados com amostras de gua cida de mina (Frmmichen et al., 2004, Garcia et al., 2001). Alguns

BRS (NmP/mL)

38

trabalhos tm mostrado que as altas concentraes de metais pesados e o baixo pH ( 3.0 3.5) so fatores limitantes que influenciam o crescimento de BRS em guas cidas de mina (Garcia et al., 2001).O perodo estudado mostrou baixos nveis de BRS, conforme mostrado anteriormente.
6
CM BF4

BF8

2
BF4 BF8

0
CM

A go

O ut

M ar

A br

Fe

Se

ov

Ms
Figura 8 Valores de pH e contagem de BRS nas amostras de gua coletadas. BRS: Bactrias redutoras de sulfato; BF4: Bota-fora 4; BF8: Bota-fora 8; CM: Cava da mina.

Os valores de pH medidos nas amostras de gua para os trs pontos estudados apresentaram baixos valores, durante todo o perodo de anlise. O menor valor de pH, abaixo de 3,5, foi medido entre os meses de maro e abril no ponto CM. O maior valor de BRS foi detectado em Fevereiro no ponto BF8, 2,8 NMP.mL-1, como pode ser observado na Figura 8, quando o pH da gua tambm apresentou maiores valores, cerca de 5.2. Estudos com reatores anaerbicos para remoo de metais e sulfatos da gua cida de mina tm mostrado alto crescimento bacteriano, cerca de 4.0.107 to 8.0.108 bacteria.mL-1 em meio cido, devido ao acrscimo de matria orgnica nesses sistemas, Elliot et al.,1998; Jong & Parry, 2003.

ez

BRS (NmP/mL)

pH

39

14 12 10 8 O2 (mg/L)6 4 2 0
CM S CM F CM S CM F

20 18 16 14 12 10 BRS 8 (NmP 6 mL) 4 2 0

Fev

Mar

Abr

Ago

Set Ms

Out

Nov

Dez

Figura 9 Presena de BRS relacionada ao oxignio dissolvido, em amostras de gua da cava da mina. S: amostra de superfcie; F:amostra do fundo

De acordo com os resultados esperados, Figura 9 mostra que os maiores valores de BRS foram detectados no perodo entre fevereiro e Agosto em amostras de gua coletadas a 12,5m de profundidade na Cava da mina, onde foi detectado tambm a mais baixa concentrao de oxignio dissolvido ao longo de todo perodo estudado. Os valores de oxignio dissolvido nas amostras de sedimento no lago de mina (UTM) variaram de 4,0 a 10,1 mg O2.L-1 e foram similares aos valores obtidos por Meier et al., (2004) usando amostras da interface sedimento/gua de gua cida da Lusatia (Alemanha). As Figuras 10 e 11 mostram os valores de BRS bem como a maior ocorrncia destas nas amostras de sedimento nos trs pontos amostrados em comparao com as amostras de gua. Este resultado era esperado uma vez que as concentraes de oxignio dissolvido so menores no sedimento e este apresenta uma maior quantidade de matria orgnica. Estes resultados esto de acordo com diferentes estudos realizados com guas cidas de mina, Frmmichen et al., 2004; Mier et al., 2004, Garca et al., 2001, Benner et al., 2000.

40

120 100 BRS (NmP/mL) 80 60 40 20


CM B BF4 B BF8 B

0
go Se t A br Fe M O ov A N D ez ar ut v

Ms
Figura 10 Valores de BRS em amostras de sedimento. BRS: Bactrias redutoras de sulfato; BF4: Bota-fora 4; BF8: Bota-fora 8; CM: Cava da mina.

24 22 20 18 16 MO (mg/L) 14 12 10 8 6 4 2 0
go Se t A br Fe M O ov N D ez ar ut v
BRS S MO S BRS B MO B

40 36 32 BRS (NmP/mL) 28 24 20 16 12 8 4 0
A

Ms
Figura 11 Matria orgnica e presena de BRS nas amostras de gua e sedimento. BRS: Bactrias redutoras de sulfato; MO: Matria orgnica. S: Superfcie; B: sedimento.

41

6) CONCLUSES

Os resultados obtidos nos trabalhos experimentais mostram que o efluente cido gerado apresenta altos teores de metais estveis e radioativos, sulfato e baixo pH. As BRS esto presentes nos trs pontos analisados, principalmente no sedimento do BF8, fato bastante interessante considerando as caractersticas cidas desses efluentes. Este trabalho subsdio para trabalhos futuros, uma vez que ainda no havia sido realizada uma caracterizao microbiolgica destes efluentes.

42

7) CONTRIBUIES TCNICAS Trabalhos tecnolgicos com aplicao tcnica de bioremediao utilizando bactrias sulfato redutoras so relativamente novos se compararmos com as tcnicas convencionais. No Brasil trabalhos prticos nessa rea so extremamente limitados, quase que direcionados para instalaes piloto. Neste aspecto o conhecimento produzido representa uma inovao tecnolgica de grande importncia, desde que poder levar a implantao de novas tecnologias at ento no disponveis a nvel nacional. O desenvolvimento desta pesquisa de mestrado resultou em outros aspectos relevantes para o projeto global onde ela est inserida que merecem ser destacados, dentre eles, citam se: Estgio no laboratrio de Microbiologia Ambiental da USP:. O Estgio foi realizado durante um perodo de trinta dias sob orientao das professoras Dra. Vivian Helena Pellizari e Dra. Rosana Filomena Vazoller. Este estgio possibilitou o aprendizado de tcnicas de microbiologia aplicada a organismos anaerbios e algumas tcnicas de biologia molecular, tal como FISH (Fluorescent in situ hibridization). Para isso foram feitos estudos intensos de reviso bibliogrfica e trabalhos experimentais utilizando toda a infra estrutura laboratorial da USP. Foi feito um relatrio de estgio, com descrio das diversas metodologias aplicadas no setor. (Anexo A). Projeto de pesquisa aprovado pela FAPEMIG Considerando a alta relevncia do tema, a FAPEMIG aprovou a proposta submetida no incio dos trabalhos o que possibilitou a liberao dos recursos utilizados na realizao deste projeto de pesquisa. Alm disso, o trabalho proporcionou uma interao tcnica altamente qualificada entre as equipes do CDTN, COLAB (Laboratrio de Poos de Caldas) e Laboratrio USP, sendo os dois ltimos reconhecidos por sua atuao na rea de microbiologia aplicada. (Anexo B)

43

Montagem do sistema laboratorial para ensaios com microrganismos Os conhecimentos adquiridos na USP foram fundamentais para instalao da bancada para trabalho com anaerbios no Laboratrio de de Microbiologia Poos de Caldas e para a implantao da tcnica de FISH, fundamental para contagem das bactrias sulfato redutoras. Este laboratrio muito bem equipado, e a implementao de mais esta tcnica ir favorecer ainda mais as pesquisas com as bactrias sulfato redutoras. Publicao de trabalhos Alguns resultados dessa pesquisa j foram apresentados em Congresso internacional: Biohydro International Conference, em Cape Town, maio/2005 e uma technical note relativa esta apresentao ser publicada na revista Minerals Engineering. alm destes, foi apresentado em congresso internacional: International Nuclear Atlantic Conference (INAC 2005), agosto 2005. (Anexos C e D).

44

8) TRABALHOS FUTUROS

A meta final almejada consiste da definio de um processo de bioremediao alternativo ao processo convencional atualmente aplicado ao tratamento do efluente lquido gerado na mina em fase de descomissionamento de urnio, em Poos de Caldas. Nesta primeira fase da pesquisa identificaram-se as bactrias sulfato redutoras passveis de serem isoladas do prprio local para desenvolvimento do processo de bioremediao. Para continuidade do trabalho, sugerem-se algumas linhas de desenvolvimento, fundamentais para se atingir o objetivo final deste grande projeto, quais sejam: Adaptao das BRS a valores de pH menores. As BRS apresentam bom crescimento em pH 7, no entanto essa pesquisa comprovou a ocorrncia existncia da mesma em valores de pH cido. Sendo assim, para uma futura utilizao dessas bactrias na remediao da DAM, deve-se inicialmente preparar linhagens resistentes pH mais baixos, o mais prximo possvel daqueles encontrados no local pesquisado. Testes de reduo Realizar testes de bancada verificando a eficincia no processo de reduo, em diversos valores de pH, principalmente naqueles semelhantes ao ambiente de DAM. Montagem do Bioreator em escala de bancada Construo de um bioreator em escala laboratorial, para realizao de testes de reduo em um reator de fluxo contnuo. Implementao das tcnicas moleculares (FISH). Realizao de experimentos utilizando as tcnicas moleculares, que foram objeto de treinamento no laboratrio de Microbiologia da USP e que devem ser repassados aos tcnicos da CNEN, para controle dos processos a serem desenvolvidos.

45

8) BIBLIOGRAFIA

AMARAL, E.C.S. Modificao da exposio radiao natural devido a atividades

agrcolas e industriais numa rea de radioatividade natural elevada no Brasil, UFRJ, Rio de Janeiro, 130p. (Tese de Doutorado). 1992. AMARAL, E.C.S., Azevedo, H.P.L. & Mendona, A.H. Pre-operational survey at the

uranium mine and mill site, Poos de Caldas, M.G., Brasil. Science Total Environment, 42: 257-66, 1985. AMARAL, E.C.S., Godoy, J.M., Rochedo, F.R.R., Vasconcelos, L.M.H. & Pires do Rio,

M.A. The environmental impact of the uranium industry: is the waste rock a significant contributor? Radiation Protection Dosimetry, 22(3): 165-71, 1988. BANDZIONG, W., THAUER, R.K. and ZEIKUS, J.G. Isolation and characterization of

Desulfovibrio growing on hydrogen plus sulfate as the sole energy source. Arch. Microbiol. 116: 41-49, 1978. CAMPBELL, L.L., FRANK,H.A., HALL, E.R. Studies on thermofilic sulfate reducing

bacteria. In: Identification of Sporovibrio desulfuricans as Clostridium nigrificans, j. Bact., 73, 516-521, 1956. CARLSON, R.E. 1977. A trophic state index for lakes. Limnol. Oceanogr., 22: 361-380. CASTRO, H.F., WILLIAMS, N.H., OGRAM, A. Phylogeny of sulfate-reducing

bacteria. Microbiology Ecology, 31: 1-9, 2000. CHANG, I.S., SHIN, P.K., KIM,B.H. Biological treatment of acid mine drainage under

sulphate-reducing conditions with solid waste materials as substrate. Water Research, 34(4): 1269-1277, 2000.

46

CHOI, S.C., CHASE, T., BARTHA, R., Metabolic Pathways Leading to Mercury

Methylation in Desulfovibrio desulfuricans LS, Applied ans Environmental Microbiology, 4072-4077,1994. CHRISTENSEN, B.; LAAKE, M.; LIEN, T. Treatment of acid mine water by sulfate-

reducing bacteria; results from a bench scale experiment. Water Research, 30(7), pp. 16171624, 1996. CIPIONKA, H. SMOCK,A.M., BOTTCHER,M.E. Acombined pathway of slfur

compound disproportionations in Desulfovibrio desulfuricans. FEMS microbiology letters, 166, 181-186, 1998. CIPRIANI, M. Mitigao dos impactos sociais e ambientais decorrentes do fechamento

definitivo de minas de urnio. Tese de doutorado. Instituto de Geocincias, Universidade Estadual de Campinas, Campinas/SP, 2002. CORK, D.J., CUSANOVISH, M.A. Sulfate decomposition: A microbial Process

Metallurgical Application of Bacteria Leaching and related Microbial Phenomena. In: L.E. Mun, A.E. Arma, J.A. Brierly, Ed. New York: Academic Press, 1978. CORTS, O.E.J. Avaliao tcnica da utilizao de H2S no tratamento de efluentes

lquidos cidos contendo metais pesados. Dissertao de mestrado. Escola Politcnica, Universidade Federal da Bahia, Salvador/BA, 2005. DU PREEZ, L.A., ODENDAAL, J.P.,MAREE, J.P., PONSONBY, M. Biological

removal of sulfate from industrial effleunts using producer gas as energy source. Environmental Technology, 13, 875-882, 1992. EATON, A.D., CLESCERI, L.S., GREENBERG, A. E. (1995) Standard Methods for

the Examination of Water and Wastewater. 19ed. United Book Press, Inc., Baltimore. 4 98 p. ECCLES, H. Treatment of metal-contaminated wasted: why select a biological process?,

Tibtech, 17, 462-465, 1999.

47

EDWARDS, K.J., Gihring, T.M. & Banfield, J.F. Seasonal variations in microbial

populations and environmental conditions in an extreme acid mine drainage environment. Applied Environmental Microbiology, 65(8): 3627-3632, 1999. ELLIOT, P.; RAGUSA, S.; CATCHESIDE, D. Growth of sulfate-reducing bacteria

under acidic conditions in na upflow anaerobic bioreactor as a treatment system for acid mine drainage. Water Research; 32(12):3724-30, 1998. FERNANDES, H.M., Veiga, L.H.S., Franklin, M.R., Prado, U.C.S. & Taddei, J.F.

Environmental impact assessment of uranium mining and milling facilities: a study case at the Poos de Caldas uranium mining and milling site, Brazil. Journal Geochemical Exploration, 52: 161-73, 1995. FOUCHER, S., BATTAGLIA-BROUNET, F., IGNATIADIS, I., MORIN, D. Treatment

by sulphate-reducing bacteria of Chessy acid-mine drainage and metals recovery, Chemical Engineering Science, 56, 1639-1645, 2001. FRMMICHEN, R., WENDT-POTTHOFF, K., FRIESE, K., FISCHER, R. 2004.

Microcosm studies for neutralization of hypolimnic acid mine pit lake water (pH 2,6). Environ. Sci. Technol., 38: 1877-1887. FUKUMA, H. T., DE NADAI FERNANDES, E. A., NASCIMENTO, M. P.,

QUINELATO, A. L.: Separation and spectrophotometric determination of thorium contained in uranium concentrates. Journal of radioanalytical and nuclear chemistry, 2001. GARCIA, C; MORENO, D.A.; BALLESTER, A.; BLZQUEZ, M.L.; GONZLEZ, F.

Bioremediation of an industrial acid mine water by metal-tolerant sulphate-reducing bacteria. Minerals Engineering, v. 14, no 9, pp. 997-1008, 2001. GLOMBITZA, F. Treatment of acid lignite mine flooding water by means of microbial

sulfate reduction, Waste Management, 197-203, 2001. GOTTSCHALK, G. Bacterial Metabolism. Springer-Verlag New York Inc. New York,

USA, 1979.

48

GRIFFITHS, A.J.F. et al. Introduo gentica. 6a edio. Editora Guanabara Koogan

S.A. Rio de Janeiro/RJ, 1996. HALLBERG, K.B. & JOHNSON, D.B. Novel acidophiles isolated from a constructed receiving acid mine drainage. In Proceedings of Biohydrometallurgy:

wetland

Fundamentals, Tecnology and Sustaintable Development, Part A, Ed. Ciminelli, V.S.T. e Garcia, O. Ouro Preto/MG, 2001. HANSEN, T.A. Carbon metabolism in sulfate-reducing bacteria. In: J. M. Odom & R.

Singleton (Eds), The sulfate-reducing Bacteria: Conteporary Perspectives (pp. 20-41). New York: Springer-Verlag, 1993. HERRERA, L., HERNNDEZ, J., BRAVO, L.,ROMO, L., VERA, L. Biological

Process for Sulfate and Metals Abatement from Mine Effluents. Environ. Toxicol. Water Qual., 12, 101-107, 1997. JOHNSON, D.B & HALLBERG, K.B. The microbiology of acidic mine waters.

Research in Microbiology, 154: 466-473, 2003. JONG, T. & PARRY, D.L. Removal of sulfate and heavy metals by sulfate reducing

bacteria in short-term bench scale upflow anaerobic packed bed reactor runs. Water Research;37(14):3379-89, 2003. KNAPP, R.A. The biogeochemistry of acid generation in sulphide tailings and waste

rock. In: Acid mine drainage seminar, Environment Canada Proceedings, p. 47-65, 1987. KREKELER, D., CIPIONKA, H. The preferred electron acceptor od Desulfovibrio

desulfuricans CSN. FEMS microbiology ecology, 17, 271-278, 1995. LORENZEN, C.J. Determination of chlorophyll and phaeopigments:

spectrophotometric equations. Limnol. Oceanogr. 12: 343-346, 1967. MARKER, A.F.H.; NUSCH, E.A.; RAI, H. & RIEMANN, B. The measurement of

photosynthetic pigments in freshwaters and standardization of methods: conclusions and recommendations. Arch. Hvdrobiol. Beih. Ergebn. Limnol. 14: 91-106p, 1980.

49

NAGPAL S., CHUICHULCHERM, S., LIVINGSTON, A., PEEVA, L. Ethanol

utilization by sulfate-reducing bacteria: an experimental and modeling study. Biotechnol. Bioeng., 5, 533-543, 2000. NASCIMENTO, M.R.L. Remoo e recuperao de urnio de guas cidas de mina por

resina de troca inica. Dissertao de mestrado. Departamento de Qumica, Universidade Federal de So Carlos, So Carlos/SP, 1998. NASCIMENTO, M. R. L., FUKUMA, H. T., HORTELLANI, M. A.: Projeto Itataia

Controle de processo na produo de cidos fosfrico e urnio. in: Manual de Mtodos e Anlises Qumicas, 143p, INB, Poos de Caldas/MG, 1988. NEDWELL, D.B. The cycling of sulfur in marine and freshwater sediments. In:

Nedwell, D.B. % Brown, C.M. (Eds), Sediment Microbiology (pp.73-106). Great Britiain: Academic Press, 1982. NORDWICK, S. et al. Development of SRB treatment systems for acid mine drainage.

In Proceedings of Hydrometallurgy 2003 Fifth International Conference in Honor of Professor Ian Ritchie V.2: Electrometallurgy and Environmental Hydrometallurgy, Edited by Young, A.M. et al. Vancouver, Canad, 2003. OKABE, S., NIELSEN, P., CHARACKLIS, W. Factor affecting microbial sulfate

reduction by Desulfovibrio desulfuricans in continuous culture: limiting nutrients and sulfide concentration, Biotechnol. Bioeng., 40: 725-734, 1992. OUDE ELFERINK, S.J.W.H., VISSER, A., HULSHOFF, L.W., STAM, A.J.M. Sulfate

reducion in methanogenic bioreactors. FEMS Microbiology Reviews, 15, 119-136, 1994. PFENNIG, N., BIEBL, H. The dissimilatory sulphur-reducing bacteria. The

prokaryotesm Handbook on Habitats, Isolation na Identification of Bacteria. Eds. Shapton, D.A. & Gould, G.W., Belows, A. & Achelegel, H.G., Vol 1, pp. 941-947, Berlim: SpringerVerlag, 1981. POSTGATE, J.R. The sulphate-reducing bacteria. 2a edio Cambridge University

Press, New York, 1979.

50

QUINELATO, A.L. et al. Removal of radionuclides and heavy metals from acid mine

waters by retention on adsorbing materials. Progress Report. IAEA Research Contract No: 11569/Regular Budget Fund, Poos de Caldas/MG, 2002. Resoluo CONAMA, no 357, de 17 de maro de 2005. SAND, W., Rohde, K., Sobotke, B. & Zenneck, C. Evaluation of Leptospirillum

ferrooxidans for leaching. Applied Environmental Microbiology, 58(1): 85-92, 1992. SCHIPPERS, A., Hallmann, R., Wentzien, S. & Sand, W. Microbial diversity in

uranium mine waste heaps. Applied Environmental Microbiology, 61(8): 2930-35, 1995. SCHIPPERS, A., Hallmann, R., Wentzien, S. & Sand, W. Microbial diversity in

uranium mine waste heaps. Applied Environmental Microbiology, 61(8): 2930-35, 1995. SCHIPPERS, A., Von-Rge, H. & Sand, W. Impact of microbial and sulfur chemistry on

safeguarding sulfidic mine waste. Minerals Engineering, 9(10): 1069-1079, 1996. SOUZA, P.V. Drenagens cidas do estril piritoso da mina de urnio de Poos de

Caldas: interpretao e implicaes ambientais, USP, So Paulo, 141p. (Dissertao de mestrado). 1995. TSUKAMOTO, T. K., KILLION, H.A., MILLER, G.C. Column experiments for

microbial treatment of acid mine drainage: low-tmperature, low-ph and matrix investigations. Water research, 38: 1405-1418, 2004. WIDDEL, F. Microbiology and ecology of sulfate- and- sulfur-reducing bacteria. In.

A.B. Zehnder (Ed.), Biology of Anaerobic Micro-organisms (pp. 469-585). New York: John Wiley,1988.

51

ANEXO A RELATRIO DO ESTGIO NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL DA USP.

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RELATRIO DAS ATIVIDADES REALIZADAS NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL DA USP

SHEILA KENIA DE ALMEIDA ORIENTAO: Dra. ROSANA VAZOLLER JUL/AGO 2004

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1) INTRODUO O PRESENTE RELATRIO APRESENTA AS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL DO ICB/USP, NO PERODO DE 22/07/2004 AT 20/08/2004, SOB ORIENTAO DA PROFESSORA DRA ROSANA FILOMENA VAZOLLER. Este estgio visava o aprendizado e treinamento de tcnicas especficas para o desenvolvimento do trabalho na rea de microbiologia e biologia molecular. 2) MATERIAIS E MTODOS 2.1) Reunies tcnicas No perodo de realizao do estgio foram realizadas algumas reunies tcnicas, onde era discutido os resultados obtidos e, a partir deles direcionar os prximos passos a serem realizados. Reunio do dia 22/07/2004 DISCUSSO COM ROSANA, ANA, SANDRA E SHEILA SOBRE AS CONDIES IDEAIS PARA O DESENVOLVIMENTO DE TRABALHOS COM ORGANISMOS ANAERBIOS. Baixo potencial de oxi-reduo; Maior disponibilidade de eltrons; -100 mV resazurina Indicador (pH e potencial de oxi-reduo) azul oxidada incolor reduzida rosa ponto de viragem melhor indicador NO TXICO Gases melhores White Martins Agar Oxignio do Brasil (no recomendado) Eliminar O2 (Mtodo qumico) Sulfeto de sdio L cistena Tiosulfato (aumenta potencial oxi-reduo) Ditionito de sdio Na reunio com a Rosana ficou decidido que enquanto as amostras de Poos no chegassem, realizaramos os testes e o processo de treinamento com uma amostra coletada no Rio Madeira em Rondnia. Aps a discusso iniciou-se a elaborao dos protocolos que deveriam ser utilizados no procedimento experimental. Reunio do dia 03/08/2004 Reunio de resultados onde estvam presentes: Rosana, Sandra, Michelle, Cristina e Sheila. Nessa reunio ficou decidido que eu iria acompanhar a Cristina na realizao do FISH. As amostras seriam as da Cristina, as do Amazonas e Poos de Caldas. Reunio do dia 06/08/2004 Reunio com Rosana, Ana e Sheila. Nessa reunio foi discutido a possibilidade de troca de meio para realizao dos testes de potencial de redutoras de sulfato. Ao final da reunio prosseguimos com o protocolo de FISH. 2.2) Instalaes Antes de iniciar o trabalho experimental, todo o laboratrio foi mostrado, onde puderam ser identificadas as bancadas, o armrio de reagentes, o armrio de vidraria, geladeiras, freezers, alguns

54

equipamentos, estufas e principalmente todo o sistema de distribuio simultnea de gases, utilizado para o trabalho com microorganismos anaerbios. O sistema de distribuio simultnea de gases consiste numa srie de cilindros com gases especficos (N2, N2/CO2 e H2/CO2), uma coluna redutora (que tem funo de retirar algum O2 que ainda esteja presente nos gases), tubulaes para 4 sadas desses gases e uma bomba de vcuo, utilizada para troca de atmosferas nos frascos com solues anaerbias. A coluna redutora apresenta um cilindro preenchido com limalha de nquel. Este quando aquecido captura os traos de oxignio presentes nos gases utilizados. Esta coluna fica saturada com o constante uso e deve ser recondicionada, processo realizado pela passagem de H2 pela coluna por cerca de oito horas.

Coluna redutora

Bomba de vcuo

Vlvula de gs

Sada de gases

Figura 1 Bancada para trabalho com organismos anaerbios

Figura 2 Detalhe da sada de gases

Figura 3 Detalhe da vlvula de gases

55

Figuras 4 e 5 Detalhe da ligao dos cilindros

Figura 6 Esquema da conexo do cilindro ao sistema de distribuio de gs. 2.3) MTODOS ANALTICOS PROTOCOLOS 1. Preparo de Meio e Solues Estoque

56

Tabela 1: Soluo Anaerbia de Diluio (Giaj-Levra, 1991) Reagente Soluo de resazurina 0,1% m/v KHCO3 Tris hidroximetilaminometano gua Milli-Q Quantidade 2,0 mL 3,98 g 6,6 g q.s.p. 1000 mL

Modo de Preparo - ferver, por 5 minutos, 1200 mL de gua Milli-Q em um erlenmeyer de 2000 mL; - transferir 500 mL da gua para uma proveta e fluxionar a gua dos dois recipientes com N2/CO2 (70:30) por 15 minutos ou at esfriar a 40C. - Dissolver os reagentes no volume de gua da proveta, segundo a ordem descrita acima. - Acertar o pH para 7 com KOH 3N ou HCl. - Completar o volume at 1000 ml com a gua que estava sob fluxo no erlenmeyer. - Fluxionar a soluo pronta com N2/CO2 (70:30) por 30 minutos. - Distribuir a soluo em alquotas de 8,9 mL em frascos de antibitico, sob fluxo de N2/CO2. - FECHAR OS FRASCOS COM TAMPAS DE BORRACHA SOB FLUXO DO GS, IMPEDINDO A ENTRADA DE OXIGNIO; LACRAR. - Autoclavar por 20 minutos a 121C e 15 psi. - Armazenar temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Pode ser estocado por cerca de 6 meses. OBS: Antes de utilizar a soluo anaerbia de diluio, para que o volume atinja 9 mL, adicionar 0,1 mL de cistena-HCl Tabela 2: Composio do Meio Basal (Zinder et al.) Reagente NH4Cl KH2PO4 MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O Soluo de resarzurina 0,1% m/v Soluo trao de metais Zinder gua Milli-Q Quantidade 0,5 g 0,4 g 0,1 g 0,05 g 1,0 mL 10,0 mL q.s.p. 1000 mL

Modo de Preparo - ferver, por 5 minutos, 1200 mL de gua Milli-Q em um erlenmeyer de 2000 mL; - transferir 500 mL da gua para uma proveta e fluxionar a gua dos dois recipientes com N2 puro por 15 minutos ou at esfriar a 40C. - Dissolver os reagentes no volume de gua da proveta, segundo a ordem descrita acima, inclusive para as solues de resarzurina e trao de metais; - completar o volume at 1000 ml com a gua que estava sob fluxo no erlenmeyer. - Fluxionar o meio pronto com N2 puro por mais 15 minutos. - Distribuir o meio para os frascos de cultivo no volume desejado, sempre sob fluxo de N2. - FECHAR OS FRASCOS COM TAMPAS DE BORRACHA SOB FLUXO DO GS, IMPEDINDO A ENTRADA DE OXIGNIO; LACRAR. - Autoclavar por 20 minutos a 121C e 15 psi. - Armazenar temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Pode ser estocado por cerca de 6 meses. - Antes de adicionar as solues desejadas e inocular os meio de cultivo, deve-se proceder a troca da atmosfera do frasco para a mistura gasosa N2CO2 70:30% (v/v).

57 Tabela 3: Soluo indicadora de resarzurina 0,1% (m/v) Reagente Quantidade Resarzurina gua Milli-Q 0,1 g 100 mL

Modo de preparo - Dissolver o reagente no volume de gua indicado; - transferir para um frasco mbar; - armazenar em geladeira.

Tabela 4: Soluo trao de metais Reagentes cido nitrilotriactico (NTA) FeSO4.7H2O MnSO4.H2O CoCl2.6H2O* ZnSO4.7H2O H3BO3 NiCl2.6H2O* Na2MoO4.2H2O gua Milli-Q

Quantidades 4,5 g 0,556 g 0,086 g 0,17 g 0,21 g 0,19 g 0,02 g 0,01 g q.s.p. 1000 mL

- Modo de preparo - Ferver 1200 ml de gua por 5 minutos. - Pesar os reagentes. Aqueles marcados com * no podem ser pesados em papel alumnio. O NTA deve ser pesado em recipiente de vidro. - Transferir 200 mL da gua para uma proveta e fluxionar a gua dos dois recipientes com N2 puro por 15 minutos ou at esfriar a 40C. - Dissolver o NTA nos 200 mL de gua da proveta. - Para a soluo elaborada por Vazoller, dissolver os demais sais na ordem apresentada na tabela. Na soluo elaborada por Zinder, seguir a ordem numrica que aparece entre parnteses, ao lado das quantidades. - Acertar para pH 7. - Completar o volume para 1000 mL com a gua mantida sob fluxo. - Esterilizar a soluo por filtrao em membrana. - Fluxionar a soluo estril com N2 puro por 20 minutos. - Distribuir a soluo sob fluxo de N2 puro para frascos estreis. - Fechar o frasco com batoques estreis e lacra-los, impedindo a entrada de oxignio. - Envolver o frasco em papel alumnio e armazenar em geladeira por at um ano. OBS: Alguns dos sais utilizados nessas solues podem demorar a se dissolver, mesmo com o uso de NTA, que um agente quelante. Para facilitar a dissoluo, recomendado adicionar um sal apenas depois que o reagente anterior estiver totalmente dissolvido.

58 Tabela 5: Soluo de Vitaminas Reagentes Biotina (vitamina H)* cido flico (B9) Tiamina.HCl (B1)* Riboflavina (B2)* cido Nicotnico (Niacina) Pantetonato de Clcio (B5) Piridoxina.HCl (B6) Cianocobalamina (B12)* cido Lipico gua Milli-Q cido 4-aminobenzico Modo de preparo - Ferver 1200 ml de gua por 5 minutos. - Pesar os reagentes. Aqueles marcados com * so armazenados em geladeira. - Transferir 200 mL da gua para uma proveta e fluxionar a gua dos dois recipientes com N2 puro por 15 minutos ou at esfriar a 40C. - Dissolver os reagentes na ordem descrita acima. - Completar o volume para 1000 mL com a gua mantida sob fluxo de N2. - Esterilizar a soluo por filtrao em membrana. - Fluxionar a soluo estril com N2 puro por 20 minutos. - Distribuir a soluo sob fluxo de N2 puro em frascos estreis. - Fechar o frasco com batoques estreis e lacra-los, impedindo a entrada de oxignio. - Envolver o frasco em papel alumnio e armazenar em geladeira por at um ano. Tabela 6: Soluo de bicarbonato de sdio 10% m/v Reagentes NaHCO3 gua Milli-Q 10 g q.s.p. 100 mL Quantidade 0,002 g 0,002 g 0,005 g 0,005 g 0,005 g 0,005 g 0,01 g 0,0001 g 0,005 g q.s.p. 1000 mL Quantidade

Modo de preparo - Ferver 200 ml de gua por 5 minutos. - Pesar o reagente em um bquer. - Fluxionar a gua com N2 puro por 15 minutos ou at esfriar a 40C. - Transferir 40 mL da gua para o bquer a fim de dissolver o sal. Inserir fluxo de N2 puro na soluo. - Caso a dissoluo esteja difcil, pode-se aquecer um pouco a mistura, mas sem deixar ferver, pois o bicarbonato de sdio precipitaria. - Transferir a soluo para uma proveta mantida sob fluxo de N2 e acertar o volume para 100 mL com o restante da gua mantida sob fluxo. - Esterilizar a soluo por filtrao em membrana, pois o bicarbonato precipita caso a soluo seja fervida. - Fluxionar a soluo estril com N2 puro por 20 minutos. - Mantendo a soluo filtrada sob fluxo, distribu-la em frascos estreis. - Envolver o frasco em papel alumnio e armazenar em temperatura ambiente e ao abrigo da luz por at 6 meses.

59 Tabela 7: Soluo redutora de cistena 0,2 M Reagentes Cistena.HCl (PM = 175,63) gua Milli-Q Quantidade 3,51 g q.s.p. 100 mL

Modo de preparo - Ferver 200 ml de gua por 5 minutos. - Pesar o reagente em um copinho plstico. - Transferir 40 mL da gua para uma proveta. - Fluxionar a gua da proveta e o restante com N2 puro por 15 minutos ou at esfriar a 40C. - Dissolver o reagente no volume de gua da proveta. - Completar o volume para 100 mL com a gua mantida sob fluxo. - Fluxionar a soluo com N2 puro por 20 minutos. - Distribuir a soluo. - Autoclavar os frascos a 121C por 20 minutos. - Envolver os frascos em papel alumnio e armazenar em temperatura ambiente e ao abrigo da luz, por at 6 meses. OBS: Essa soluo fraca como agente redutor, e pode levar at cerca de 20 minutos para que o meio se torne incolor. Esse processo acelerado quando essa soluo adicionada a meios mantidos em banho-maria com temperatura entre 40 e 50C. A vantagem de seu uso que, por ser composta por um aminocido, no h nveis txicos dessa soluo. Caso depois de 20 minutos o meio no se torne incolor, pode ser adicionada uma nova alquota da soluo, e ento observar-se o mesmo intervalo de tempo. Tabela 8: Preparo de solues por neutralizao de cidos - Preparar uma soluo do cido desejado em uma concentrao duas vezes maior que aquela da soluo final: - Ferver o volume de gua Milli-Q desejado por pelo menos 5 minutos depois de iniciada a fervura. - Fluxionar a gua fervida com N2 puro por pelo menos 15 minutos ou at a gua esfriar a 40C. - Diluir um volume de cido nessa gua a fim se obter uma soluo com concentrao dobrada em relao quela da soluo de sal. - Preparar uma soluo de uma base cuja concentrao seja a mesma daquela soluo de cido: - Ferver o volume de gua Milli-Q desejado por pelo menos 5 minutos depois de iniciada a fervura. - Fluxionar a gua fervida com N2 puro por pelo menos 15 minutos ou at a gua esfriar a 40C. - Pesar e diluir a base na gua fervida a fim de se obter a concentrao desejada. - As duas solues devem ser mantidas sob fluxo de N2 durante todo processo. - Misturar, sob fluxo de N2, volumes idnticos das duas solues. - Ajustar o pH dessa mistura para 7 utilizando uma soluo da base 1M. - Fluxionar a soluo resultante com N2 puro por 15 minutos. - Distribuir a soluo e fechar os frascos. - Esterilizar em autoclave por 20 minutos a 121C. Exemplo: Soluo de lactato de sdio 2M Uma soluo de lactato de sdio deve ser preparada empregando a neutralizao do cido ltico por hidrxido de sdio. A seguinte reao deve ocorrer: CH3CHOHCOOH + NaOH --> CH3CHOHCOONa + H2O cido ltico + hidrxido de sdio --> lactato de sdio + gua Como exemplo, vamos preparar 500 mL de uma soluo 2 M de lactato de sdio. Como mencionado na tabela acima, precisaremos preparar uma soluo de cada reagente para depois mistur-las. importante lembrar que ser necessrio preparar as solues do cido e da base numa concentrao duas vezes maior do que a concentrao desejada para o sal. Isso ocorre porque iremos juntar as duas solues, e portanto o volume final ser o dobro do volume em que as solues foram preparadas. Em nosso exemplo queremos uma soluo de sal cuja concentrao final 2M e para tanto precisaremos que as solues do cido e da base estejam a uma concentrao de 4 M. Inicialmente precisaremos saber as caractersticas fsico-qumicas dos reagentes para calcular corretamente as concentraes:

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cido ltico empregado: pureza: 88% peso molecular : 90,05 g/L densidade: 1,21 kg/L = g/mL

Hidrxido de sdio empregado: pureza: 100% peso molecular: 40 g/L

Com os dados referentes ao cido ltico possvel calcular a massa necessria do cido para produzir uma soluo com a molaridade desejada. Considere que iremos preparar 200 mL de uma soluo 4 M. 1M ----> 90,05 g ----> 1000 mL 4M ----> x ----> 1000 mL 4M ----> 360,2 g ----> 1000 mL 4M ----> y ----> 200 mL 4M ----> 72,04 g ----> 200 mL Precisarei de 72,04 g de cido ltico para ter 200 mL de uma soluo 4M de cido ltico. No entanto, o cido utilizado tem uma pureza de 88%, o que significa que se pegarmos 72,04 g desse reagente, apenas 88% dessa massa ser o cido, o restante sendo impurezas. Portanto preciso calcular, atravs de uma regra de trs inversa, a massa que preciso desse reagente para ter um equivalente e 72,04 g de cido 100% puro: 72,04 g ----> 100% x ----> 88% x ----> 81,86 g Em 81,86 g do regente utilizado, terei 72,04 g de cido ltico puro. Mas ainda preciso um terceiro clculo, j que o cido um reagente lquido e sua densidade diferente de 1. necessrio saber qual o volume lquido que corresponde a esses 81,86 g. 1 mL ----> 1,21 g x ----> 81,86 g x ----> 67,65 mL Finalmente sabemos que para o preparo de 200 mL de uma soluo 4M de cido ltico devemos diluir 67,65 mL do cido em um volume de gua Milli-Q suficiente para completar 200 mL. Para o preparo dessa soluo deve-se transferir 67,65 mL do cido para uma proveta e completar o volume at 200 mL com gua Milli-Q fervida e fluxionada como indicado na tabela. A soluo deve ser mantida sob fluxo de N2 at que possa ser neutralizada. Para essa neutralizao precisaremos de 200 mL de uma soluo tambm 4 M de NaOH. Sabendo os dados referentes a esse reagente utilizado, podemos calcular o peso necessrio para se chegar a essa molaridade: 1M ----> 40 g ----> 1000 mL 4M ----> x ----> 1000 mL 4M ----> 160 g ----> 1000 mL 4M ----> y ----> 200 mL 4M ----> 32 g ----> 200 mL Diluindo 32 g desse reagente em quantidade de gua suficiente para completar 200 mL, obtm-se uma soluo 4M. Para o preparo deve-se pesar a quantidade de NaOH desejada em um bquer e transferir para um erlenmeyer em que o volume final de 200 mL esteja marcado. Deve-se ento completar o volume at 200 mL utilizando a gua Milli-Q fervida e fluxionada. A soluo pode ser agitada para dissoluo mais rpida do NaOH, mas deve-se manter o fluxo de nitrognio no erlenmeyer. Finalmente, para o preparo da soluo de lactato de sdio, deve-se verter a soluo de cido sobre a soluo de base, mantendo-as sob fluxo de N2. Para garantir que todo o cido esteja neutralizado, deve-se acertar o pH da soluo para 7 empregando uma soluo de NaOH 1M., previamente preparada. A soluo deve ento ser fluxionada com N2 por 10 minutos e ento distribuda em frascos de antibitico. Autoclavar por 15 minutos a 121C. Armazenar em temperatura ambiente e ao abrigo da luz.

61 Tabela 9: Soluo de sulfato de sdio 2,96M Reagentes Na2SO4 gua Milli-Q 42,01 g q.s.p. 100 mL Quantidade

Modo de preparo - Ferver 200 ml de gua por 5 minutos. - Pesar o reagente em um bquer. - Transferir 40 mL da gua para uma proveta e fluxionar a gua dos dois recipientes com N2 puro por 15 minutos ou at esfriar a 40C. - Dissolver o reagente pesado na gua contida na proveta. - Completar o volume da soluo at 100 mL, utilizando a gua restante. - Mantendo a soluo sob fluxo, distribu-la em frascos de antibitico. - Esterilizar os frascos por autoclavao por 20 minutos a 120C. - Armazenar em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Tabela 10: Solues Acrescidas ao Meio Solues Bicarbonato de sdio 10% Soluo de Vitaminas Lactato de sdio 2M Sulfato de sdio Cistena Inculo Volume de meio Volume final Volumes 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 1,0 mL 8,5 mL 10 mL

2. Homogeneizao da amostra - Pesar 6 g de prolas de vidro mdias e reservar. - Abrir o frasco contendo a amostra e inserir fluxo de N2. - Com uma pipeta invertida, transferir 1 g da amostra para um tubo de ensaio com tampa. - Transferir as prolas para o frasco com a amostra. - Fechar e lacrar o frasco sob fluxo de N2. - Agitar o frasco manualmente por 30 minutos. 3. Diluio da amostra - Separar 5 frascos contendo soluo anaerbia de diluio. - Adicionar 0,1 mL da soluo estoque de cistena.HCl cada um. Deixar em banho-maria (40C) at se tornarem incolor. - Etiquetar cada frasco com a soluo acima, representando as diluies que sero feitas (10-1, 10-2 etc). - Transferir 1 mL da amostra homogeneizada para o frasco de diluio 10-1. - Homogeneizar o frasco manualmente e transferir 1 mL desse para o frasco de diluio 10-2. Proceder dessa forma at a ltima diluio desejada (nesse caso, 10-6). 4. Inoculao - Separar 25 frascos contendo o meio de cultivo basal. - Trocar a atmosfera desses frascos para a mistura gasosa N2/CO2 (70:30); submetendo os frascos a 30s de vcuo e 30s de fluxo do gs, por 3 vezes, alternadamente. - Despressurizar os frascos.

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Manter os frascos em banho-maria (40C) durante as adies. Adicionar os volumes de soluo estoque indicados, na ordem apresentada na tabela 10. Aps adio da cistena.HCl aguardar at os frascos se tornarem incolor. Inocular 5 rplicas de cada diluio. Incubar a 30C, sem agitao.

5. Avaliao do crescimento - Aps 15 e 30 dias, avaliar o crescimento de clulas empregando a soluo de subacetato de chumbo preparada conforme descrito na tabela 11. Tabela 11: Soluo de subacetato de chumbo (Morita, 1972 modificado) Reagentes Subacetato de chumbo cido actico gua Milli-Q q.s.p. 18 mL Quantidade 2,0 g

Modo de preparo - Dissolver o subacetato ou acetato de chumbo na gua. - Caso haja turvao branca, adicionar cido actico at atingir transparncia completa. OBS: Foi recomendada a utilizao de acetato de chumbo; no entanto, Sakamoto (1996) empregou subacetato de chumbo. Aplicao do teste com acetato de chumbo - Embeber fita de papel filtro na soluo de acetato de chumbo. - Disp-las em uma placa de Petri e secar em estufa. - Pingar uma gota do meio de cultivo sobre o papel filtro seco, considerando como positivos aquelas que apresentarem colorao marrom. - Aplicar o teste estatstico do NMP. 26/07/2004 PREPARO DE SOLUES Lactato de sdio 2,0 M; Na2SO4 1,48 M * Cistena HCl 0,2 M * O protocolo recomenda a soluo 2,96 M, mas no conseguiu a diluio. Por isso o volume do solvente foi duplicado. Meio Zinder (distribudo em frascos de antibitico, 8,4ml em cada); Soluo anaerbia de diluio (distribuda em frascos de antibitico, 8,9ml em cada); As solues foram preparadas conforme descrito no protocolo montado. Os frascos de antibitico citados possuem capacidade mxima para 30,0ml. O volume de meio Zinder adicionado acrescido de outras solues que compem o meio e do inculo, totalizando 10,0ml. O meio Zinder e a soluo anerbia de diluio foram autoclavada por 20 min a uma presso se 120 psi. 28/07/2004 Os frascos com o meio Zinder e a soluo anaerbia de diluio, preparados anteriormente, foram armazenados em temperatura ambiente e protegidos da luz. Antes de adicionarmos as solues ao meio Zinder (seguindo a ordem da tabela 10 do protocolo), fizemos uma troca de atmosfera para N2/CO2, alternando vcuo e gs, por 3 minutos, a intervalos de 30

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segundos para cada. Aps a troca de atmosfera, os frascos contendo meio de cultura foram mantidos em banhomaria a 45oC, e voltaram a esse banho logo aps a adio de cistena. Nos frascos da soluo de diluio foi adicionado 0,1ml de cistena e os mesmos foram mantidos em banho-maria. Aps um certo tempo alguns frascos contendo meio Zinder que estavam no banho-maria ficaram reduzidos, no entanto, os frascos contendo soluo anaerbia de diluio e os outros de meio Zinder no se reduziram. (Primeiro problema de reduo. No sabemos se foi devido a pr reduo da soluo que no foi boa ou se o problema se deu com a cistena que aparentemente demora mais tempo a reduzir). Para promover a reduo do meio Zinder, naqueles frascos que ainda estavam rosa retiramos uma alquota de 0,1ml dos frascos contendo esse meio e adicionamos mais 0,1ml de cistena. Aps essa adio os frascos voltaram ao banho-maria. (Esses frascos foram marcados). Na soluo anaerbia de diluio retiramos uma alquota de 0,2ml dos frascos e adicionamos 0,2ml de cistena, e retornamos ao banho-maria. No houve quase nenhuma alterao na cor da soluo. parte testamos reduzir um frasco da soluo anaerbia de diluio com cis-Na2S (fizemos para testar se a soluo ficava incolor mesmo). Sua cor passou de azul para rosa. Como a reduo no foi obtida em todos os frascos de meio Zinder e nos frascos de diluio, todos, inclusive os de Zinder j reduzidos, foram armazenados em temperatura ambiente e ao abrigo da luz. 29/07/2004 Os frascos com soluo de diluio ainda no tinham sofrido alterao na cor. Alm disso, alguns frascos com meio Zinder sofreram oxidao, fato que pode ter ocorrido devido qualidade dos batoques. No havia sido realizada a troca de atmosfera nesses frascos, pois os mesmos j foram preparados com gs N2CO2, no entanto, como a reduo no foi totalmente alcanada, foi realizada a troca de atmosfera para N2/CO2, durante 5 minutos, alternando vcuo e fluxo de gs por 30 segundos cada, nos frascos com soluo anaerbia de diluio. Os frascos foram ento mantidos em banho-maria a 50oC, e a soluo passou de azul escuro para azul claro e ento ficaram incolores, no passando pela tonalidade rosa. Antes de iniciarmos a inoculao, preparamos um vidro de antibitico, onde pesamos 6,0 gramas de prolas de vidro, fechamos, lacramos e autoclavamos por 20 minutos a 120 psi. Para preparar o inculo, adicionou-se 15 gramas de sedimento para 6 gramas de prolas, pois a adio recomendada de sedimento (1 grama) no seria suficiente para retirar 1 ml do mesmo aps a agitao. O inculo havia sido agitado no dia anterior por 30 minutos com prolas de vidro, mas como a inoculao no foi realizada, este ficou armazenado em geladeira. Antes de inocular, a amostra foi novamente agitada por 30 minutos. A primeira e segunda diluio, bem como os frascos de cultivo 10-2 1 a 4 foram inoculados utilizando agulha rosa (mais espessa). As demais diluies e inoculaes foram feitas com agulha preta para minimizar os danos ao batoque e porque no se observou a presena de grandes grumos de clulas. Os frascos de cultivo da diluio 10-2 ficaram oxidados aps a inoculao. Para tentar reverter isso, os frascos foram colocados em banho-maria a 40oC. Os frascos 10-2 2, 4 e 5 apresentaram menor oxidao aps o banho-maria sendo que o frasco 4 reduziu. Aps a inoculao os frascos foram incubados em estufa escura a 37oC. Decorridos os primeiros 15 dias ser feito uma contagem NMP por turbidez e aps 21 dias por acetato de chumbo. FISH Mesmo eu no tendo realizado todo esse procedimento, pois o laboratrio de microbiologia ambiental j conta com uma infraestrutura preparada para realizao do FISH, estou anexando os protocolos para quem vai montar um experimento pela primeira vez no laboratrio Tratamento das lminas novas 1. Mergulhar as lminas em lcool etlico e enxaguar com gua destilada. (A Cris falou que no adianta muito apenas mergulhar, mas que devo esfregar de leve com papel toalha ou papel higinico); 2. Preparar em um tubo Falcon 50 mL de soluo 0,1% de gelatina MARCA: DIFCO - em gua destilada (aquecer a gua a aproximadamente 60C, para dissolver a gelatina) e acrescentar alguns cristais de sulfato de cromo e potssio (concentrao recomendada: 0,01%). A adio do sulfato de cromo e potssio deve ser feita na hora do uso. 3. Mergulhar as lminas lavadas e secas na soluo de gelatina e colocar para secar em p.

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SOLUES ESTOQUE 1. Tris.HCl 1M pH 7,2 (PM 157,64) 2 amino 2 (hidroximetil) 1, 3 propanodiol hidroclordrico C4H11NO3. HCl PM 156,57 MARCA: BOEHRINGER Dissolver 15,76g de Tris HCl em 80,0 mL de gua; Ajustar o pH para 7,2 com NaOH (4M) e completar o volume com gua destilada; Dividir o volume e autoclavar; OPO: 12,1g Tris base, 80,0mL de gua, 7,0mL HCl conc.,checar pH e completar para 100,0mL. EDTA 0,5M (PM 372,24) MARCA: FISCHER (adicionar direto) Colocar 18,61g de EDTA em 80,0mL de gua destilada e agitar vigorosamente em agitador magntico; Ajustar o pH para 8,0 com pastilhas de NaOH (Maniatis 2,0g; lab cerca de 2,6g) Dividir em alquotas e autoclavar OBS.: O EDTA s solubiliza quando o pH ajustado para 8; SDS 20% (Dodecil sulfato de sdio CH3(CH2)11SO4Na PM: 288,38 MARCA: USB Dissolver 10,0g em 40,0mL de gua destilada; Aquecer a 68C para dissolver; Ajustar o pH para 7,2 adicionando algumas gotas de HCl concentrado; Completar o volume para 50,0mL; OBS.: Usar mscara ao pesar o SDS e limpar bem a rea de trabalho aps a pesagem. No necessrio autoclavar o SDS nessa concentrao; NaCl 5M (PM 58,44) Dissolver 116,88g de NaCl em 400,0mL de gua destilada Colocar em frasco Duran de 500,0mL e autoclavar

2.

3.

4.

TAMPES PARA HIBRIDIZAO E LAVAGEM Para a preparao dos tampes de lavagem e hibridizao, seguir as frmulas abaixo: Reagentes Tampo de Hibridizao Tampo de lavagem NaCl 47,34g 52,60g 26,30g --Tris.HCl 1M 18,0mL 20,0mL 10,0mL 18,0mL 20,0mL SDS 20% 0,45mL 0,5mL 5,0 mL (1%) 0,45mL 0,5mL EDTA 0,25M 36,0mL 40,0mL 20,0mL 36,0mL 40,0mL -NaCl 2,5M --Varivel(2) Varivel(2) Formamida Varivel(1) Varivel(1) Varivel(1) --gua destilada q. s. p. 900mL q. s. p. 1000mL q. s. p. 500mL q. s. p. 900mL q. s. p. 1000mL (1) A quantidade varia para cada sonda consultar a tabela do protocolo do Eawag (Juliana); (2)- Proporcional quantidade de formamida - MARCA: PLUS ONE (HCONH2) adicionada ao tampo de hibridizao consultar tabela do protocolo Eawag; OBS.: tanto a formamida quanto o NaCl aumentam a especificidade da sonda. Assim, as quantidades adicionadas de cada um so inversamente proporcionais Tampo fosfato salino PBS Dissolver na ordem em que so citados os seguintes reagentes a fim de se obter a concentrao final indicada. Reagentes Concentrao Final NaCl 130 mM Na2HPO4 7 mM NaH2PO4 3 mM Acertar o pH para 7,2

65 SOLUO DE DAPI (100,0 NG/L) Dissolver 1,0mg de DAPI em 10,0mL de gua destilada; Colocar alquotas de aproximadamente 1,0mL em eppendorfs cobertos com papel alumnio; Guardar em geladeira at o momento do uso. OBS.: o DAPI um composto mutagnico e deve ser manuseado com cuidado. PORCENTAGEM DE FORMAMIDA UTILIZADA PARA HIBRIDIZAO % formamida no Lavando a 35C (HRP labeled probes) Lavando a 48C (DIG, fluorescent probes) tampo de hibridizao(*) [NaCl] in mM L of 5M NaCl [NaCl] in mM L of 5M NaCl(**) 0 900 8900 5 636 6260 10 450 4400 15 318 3080 20 145 1350 225 2150 25 105 950 159 1490 30 74 640 112 1020 35 52 420 80 700 40 37 270 56 460 45 26 160 40 300 50 19 90 28 180 55 13 30 20 100 60 9 0 14 40 65 7 0 0 70 5 0 0 (*)tampo de hibridizao: 20mM Tris/HCl, pH 8,0; 5,0 mM Na2EDTA; 0,01% SDS. (**)em 50,0mL de TL PREPARO DE MATERIAL PARA FIXAR AMOSTRAS PARA FISH TAMPO DE FIXAO Tubo falcon Micropipeta Banho-maria Pipeta estril Pipeta Pasteur Fita pH (pH 7,0) Conjunto de filtrao estril

Figuras 7,8 e 9 Conjunto de filtrao gua destilada estril (60oC/50ml) 2,0 g de paraformaldedo 150 L NaOH 1 N

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5 ml PBS 10x HCl Preparo Aquecer a 60oC, 40 ml de gua destilada estril em falcon (banho-maria) Pesar 2,0 gramas de paraformaldedo em falcon. Verter a gua aquecida no falcon com paraformaldedo. Adicionar 150 L de NaOH 1N e agitar manualmente. Aps dissolver, adicionar 5 ml de PBS 10x. Adicionar uma gota de HCl e verificar se o pH 7. Acertar o volume para 50ml com gua destilada estril, na marcao do falcon. Filtrar o tampo e guardar em geladeira. Vlido por 2 dias. 04/08/2004 PREPARO DE FRASCOS E INOCULAO DA AMOSTRA DE CAVA DA MINA (SEDIMENTO) Inculo: Frasco de antibitico com 6,0g de prolas, lacrado e autoclavado. Depois o frasco foi aberto sob fluxo de gs, adicionamos cerca de 9,0g de sedimento e lacramos novamente. Agitao manual deste frasco por 30 minutos. Meio e soluo de diluio: Utilizamos aqueles que foram preparados no dia 26/07/2004 e que estavam armazenados no escuro. Trocamos a atmosfera do meio de cultura por 3,0 minutos, alterando vcuo e gs, por 30,0 segundos cada. A soluo de diluio teve sua atmosfera trocada por 5,0 minutos, tambm alterando vcuo e gs, por 30,0 segundos cada. Alguns frascos de meio no se reduziram, mesmo em banho-maria 50C. Procedeu-se ento uma nova troca de atmosfera por 5,0 minutos, alterando vcuo e gs por 30,0 segundos cada. Nos frascos que mesmo depois de certo tempo permaneceram oxidados, foi retirada uma alquota de 0,1mL e adicionado mais 0,1mL de cistena.HCl. Obs.: Alguns frascos de meio ficaram rosa aps a adio de cistena, mas ficaram azuis aps certo tempo de banho-maria. 05/08/2004 FIXAO Alm das amostras fixadas para a Cristina, foram fixadas as seguintes amostras: 1 Diluio 10-2 1 do Rio Madeira 2 Cultivo em Postgate D3 3 Cultivo em Postgate 75 4 Cultivo em Postgate Cava da Mina (CM) 5 Sedimento da cava da mina (CM) homogeneizado com prolas 6 Sedimento da cava da mina (CM) no homogeneizado. Para as amostras de sedimento da cava da mina, fez-se diluio 1:2 em PBS 1x. A amostra foi ento homogeneizada manualmente e ento procedeu a uma centrifugao a 300 rpm por 1 minuto. Esse procedimento foi realizado a fim de separar (peletar) o sedimento e no as clulas. O sobrenadante dessa centrifugao foi fixado. Retirar 1,5 ml de amostra de dispensar em eppendorfs (epps); Centrifugar por 3 minutos a 12500 rpm; Dispensar sobrenadante e ressuspender com 200 L PBS 1x (agitador pouca coisa para no destruir clulas); Adicionar 600 L do tampo de fixao; Agitar vigorosamente e manter em gelo por duas horas; Centrifugar, dispensar, adicionar 800 L PBS 1x, ressuspender e repetir isso mais duas vezes;

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Na ltima vez, aps dispensar sobrenadante, adicionar 300 L PBS 1x, ressuspender e adicionar 300 L de etanol gelado e ressuspender de novo; Guardar em freezer (-20C) at o momento do uso. DAPI Observamos a amostra fresca do sedimento da cava da mina (CM), mas no conseguimos diferenciar clulas. Ento decidimos preparar uma colorao DAPI para facilitar a observao. Antes da aplicao do DAPI a amostra foi diluda 1:2 e ento uma segunda diluio de 1:10. PARA APLICAO DO DAPI, COLOCAMOS 3,0L DE CADA AMOSTRA EM POCINHOS E DEIXAMOS SECAR EM ESTUFA. SOBRE A AMOSTRA SECA, APLICAMOS 9,0L DE GUA E 1,0L DE DAPI. HOMOGENEIZAMOS UTILIZANDO A PIPETA E ESPALHAMOS COM A PONTEIRA. COLOCAMOS SOBRE OS POOS UMA LAMNULA E LEVAMOS AO MICROSCPIO.

Figuras 10 e 11 Lminas para FISH HIBRIDIZAO Fiz duas lminas para anlise do FISH. Lmina 1 Bactria Sonda EUB 338 Identificao pocinhos/amostra 1 Rio Madeira 10-2 1 Mad 10-2 1 (3 L) 2 Cava da Mina amostra natural CM A. Nat (5 L) 3 Cava da mina amostra agitada CM Agit. (5 L) 4 E. coli - controle positivo para bactria (2 L) 6 Cava da mina cultivada no Postgate B CM (P) (3L) 7 D3 cultivada no Postgate B D3 (P) (3L) 8 75 cultivado no Postgate B 75 (P) (3 L) 9 Levedura controle negativo para bactria (1 L) Lmina 2 BRS Sonda SRB 385 Identificao pocinhos/amostra 1 Rio Madeira 10-2 1 Mad 10-2 1 (3 L) 2 Cava da Mina amostra natural CM A. Nat (5 L) 3 Cava da mina amostra agitada CM Agit. (5 L) 4 E. coli - controle negativo para BRS (2 L) 6 Cava da mina cultivada no Postgate B CM (P) (3L) 7 D3 cultivada no Postgate B D3 (P) (3L) 8 75 cultivado no Postgate B 75 (P) (3 L) 9 D. vulgaris controle positivo para BRS (2 L) Como hibridizar:

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1 Colocar alquotas de 1 ou 2 L nos pocinhos da lmina, distribuindo por todo o pocinho com a ponteira. (os volumes adicionados esto descritos acima) 2 Colocar a lmina em estufa a 45C, por 20 minutos, para secar (a temperatura mais alta aumenta a quantidade de clulas que se aderem lmina). 3 - Passar a lmina por banhos de lcool 50%, 70% e 100%, em tubos de centrfuga de 50 mL (3 minutos por banho). Usar uma pina para transferir a lmina de um banho para outro. 4 Secar a lmina ao ar livre. 5 Enquanto a lmina seca, colocar um pedao de papel filtro ou toalha em um tubo de centrfuga de 50 mL, revestido por fora com papel alumnio, embeber o filtro com 2 mL de tampo de hibridizao (com concentrao de formamida de acordo com a sonda a ser utilizada), tampar e deixar em estufa a 45C at o momento do uso ( importante deixar pelo menos uns 5 minutos para criar uma atmosfera mida no interior do tubo. OBS.: esse procedimento feito uma vez. A mesma cmara pode ser usada para vrias hibridizaes. Deve-se checar somente se o papel est bem embebido no tampo, para garantir que a atmosfera ficar devidamente saturada. 6 Depois de seca a lmina, colocar am cada pocinho 9 L de tampo de hibridizao e 1 L de sonda (concentrao de 25 a 50 ng/L). Aps acrescentar a sonda, misturar os dois delicadamente, utilizando a aspirao da pipeta. Usando a ponteira em posio horizontal, espalhar bem a mistura de tampo e sonda pelo pocinho, sem arranhar a gelatina (lembrar de trocar as ponteiras entre pocinhos para no haver contaminao). 7 Colocar a lmina no tubo embebido em tampo e deixar em estufa por 2 horas a 45C para ocorrer a hibridizao. CUIDADO PARA NO DEIXAR O TUBO ROLAR! Assim podemos evitar que as amostras escorram para fora dos pocinhos. IMPORTANTE: as gotas no podem secar, por isso devem ser colocadas no tubo com o papel (cmara mida). 8 Passado o tempo de hibridizao, lavar delicadamente a lmina com 800L de soluo de lavagem (usar micropipeta). Em seguida, mergulhar a lmina em um tubo falcon contendo o mesmo tampo e manter em estufa a 48C por 20 minutos (geralmente utiliza-se 15 a 20 minutos para a lavagem. O mnimo que se deve deixar na soluo 10 minutos). (Realizar o procedimento com o mnimo de luz possvel!) 9 Enxaguar a lmina gentilmente com gua destilada para retirar os sais e o SDS (no deixar cair gua diretamente sobre os pocinhos e esperar secar temperatura ambiente e no escuro). 10/08/2004 TESTE PARA AVALIAR O POTENCIAL DE REDUTORAS DE SULFATO PREPARO DO MEIO Optamos por utilizar o meio descrito por Widdel and Pfennig in HURST et al, 1997. No entanto, no adicionamos o sulfato de sdio e trabalhamos melhor a pr-reduo mecnica da soluo. Meio (Widdel and Pfennig, 1997) Meio WP Substncia Quantidade KH2SO4 0,2 g NH4Cl 0,25 g NaCl 1,0 g MgCl2.6H2O 0,4 g KCl 0,5 g CaCl2.2H2O 0,1 g Resazurina (0,1%) 1,0 mL gua destilada q. s. p. 1000mL

69 Modo de Preparo - em um erlenmeyer ou balo de fundo chato de 2000 mL, com volume previamente definido e marcado no frasco de 1000 mL, dispensar 1000 mL de gua Mili-Q no frasco e introduzir um fluxo de N2. - Aquecer o volume de gua empregando-se uma placa de aquecimento magntica, permitir a fervura por 5 minutos; manter a gua fervida sob fluxo de gs; - Retirar da gua fervida e resfriada a 40Cm cerca de 300 mL em volume; dispensar o volume em um frasco, tambm sob fluxo de N2. - Dissolver nesse volume cada reagente; acrescer a mistura no volume final da soluo, mantida sob fluxo de gs; (ou ento dissolver os reagentes diretamente no frasco com a marcao de 1000 mL); - Completar o volume q. s. p. 1000 mL com gua Mili-Q; - Manter a soluo sob fluxo de N2 por 30 minutos; - Distribuir o meio para os frascos de cultivo no volume desejado, sob fluxo de N2. - Fechar os frascos com tampas de borracha de butila e lacre de alumnio; - Autoclavar por 30 minutos a 121C e 15 psi; - Armazenar temperatura ambiente e ao abrigo da luz; a soluo pode ser estocada at 6 meses. - Antes de adicionar as solues desejadas e inocular os meios de cultivo, deve-se proceder a troca da atmosfera do frasco para a mistura gasosa N2/CO2 70:30% (v/v); OBSERVAES MICROSCPICAS 1 Lmina s com DAPI Amostra CM sedimento diluda 1:2 Poucas clulas: cocos bem pequenos, bacilos com esporo ou diplococos, bacilos curvos pequenos.

Figuras 12 e 13 Colorao DAPI Amostra CM Amostra CM sedimento diluda 1:2 e ento 1:10. No h diferena no tipo nem na quantidade de clulas, quando comparada amostra que foi diluda apenas 1:2. 2 Lmina FISH Sonda EUB 338 Controle DAPI

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Figura14 Contr. positivo EUB338E. coli-DAPI Amostra 75 (P) Amostra D3 (P)

Figura 15 Colorao DAPI ponto D3(P)

Figura 16FISH(SondaEUB338)pontoD3(P) Amostra CM (P)

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Figura 17 DAPI CM(P)

Figura 18 FISH(Sonda EUB338) CM(P) Amostra CM A.Nat Cocos predominantemente, alguns bacilos. O sedimento impede a visualizao de clulas hibridizadas. Amostra CM Agit. Cocos minsculos, poucos bacilos. No DAPI o sedimento est corado de vermelho. Amostra Rio Madeira 10-2 1 Cocos minsculos e alguns bacilos dando um sinalzinho meia boca, so bacilos pequenos, curvos. 3 Lmina FISH Sonda SRB 385 Controle Positivo SRB 385

Figura 19 Contr. Positivo Sonda SRB385 FISH Amostra CM (P) Presena de grande nmero de clulas, bacilos curvos e sarcinas que no coram com DAPI (ser autoflorescncia?)

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Figura 20 DAPI CM(P)a

Figura 21 FISH (Sonda SRB385) CM(P)a

Figura 22 DAPI CM(P)b

Figura 23 FISH (Sonda SRB385) CM(P)b Amostra D3 (P) No havia muitas clulas, apenas um bacilo deu sinal.

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Figura 24 DAPI D3(P)

Figura 25 FISH (Sonda SRB385) D3(P) Amostra 75 (P) Presena de uma quantidade razovel de clulas, predominantemente cocos, que no hibridizaram. Presena de bacilos finos, mdios que hibridizaram, mas alguns no so visveis com DAPI.

Figura 26 DAPI 75(P)a

Figura 27 FISH (SondaSRB385) 75(P)a

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Figura 28 DAPI 75(P)b

Figura 29 FISH(SondaSRB385) 75(P)b Amostra CM Agit. Poucas clulas, cocos minsculos e alguns cocos maiores. Tambm ocorre bacilos e alguns microorganismos so semelhantes a diplococos ou bacilos com esporos. O sedimento ficou vermelho, impossibilitando a visualizao de clulas hibridizadas.

Figura 30 DAPI CMAgit. Amostra CM A. Nat. Cocos predominantemente, alguns bacilos. O sedimento est vermelho, impossibilitando a visualizao de clulas hibridizadas.

75

Figura 31 DAPI CMANat. Amostra Rio Madeira 10-2 1 Presena se uma colnia de cocos bem ntida, no entanto nem todos coraram com a rodamina.

Figura 32 DAPI Mad

Figura 33 FISH (SondaSRB385)Mad. 11/08/2004 INOCULAO DAS AMOSTRAS PARA O TESTE DE POTENCIAL DE BRS Iniciamos trocando a atmosfera para N2/CO2 por 3 minutos, alternando entre vcuo e gs, 30 segundos para cada. Adicionamos as solues complementares do meio. Aps adicionar todas as solues, inclusive a cistena, percebemos que a soluo trao de metais no havia sido adicionada, pois esta no estava descrito no protocolo do WP.

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Para garantirmos anaerobiose da soluo trao, tomamos uma alquota da mesma que foi tranferida assepticamente para um frasco que foi fluxionado com N2 por 30 minutos. O frasco foi ento lacrado e transferiu-se para os meios 0,1 mL da mesma forma que foi feita a adio das outras solues. Oxidao Aps a adio da cistena, os frascos foram mantidos em banho-maria por muito tempo e mesmo assim apenas 1/3 deles reduziu. A adio da soluo trao ainda oxidou um pouco mais todos os frascos. Retiramos 0,1 mL do meio e adicionamos o mesmo volume de cistena. deixamos os frascos passarem a noite em banho-maria a 40-45C. pela manh estavam reduzidos. S ento procedeu-se a inoculao. 12/08/2004 Amostras de gua e cultivos em Postgate B Empregou-se seringa de 5,0 mL com agulhas pretas lavadas com N2. Os frascos contendo as amostras foram homogeneizados manualmente e fluxionados com N2 quando abertos. O fluxo foi inserido com pipeta invertida estril. Nos frascos de cultivo em Postgate B, o fluxo de g no foi inserido, mas mantido prximo superfcie atravs de uma agulha ligada a um acrodisc.

Figuras 34, 35 e 36 Inoculao de amostras j cultivadas Amostras de sedimento Ponto 75 Como o sedimento era muito grosso, espesso, tivemos que abrir os frascos de cultura para inocular os mesmos. Os frascos foram abertos sob fluxo de N2, em condies de assepsia. Os frascos contendo as amostras foram agitados manualmente e inseriu-se fluxo de N2 atravs de pipeta invertida. A transferncia do inculo foi feita usando pipeta invertida de 1 mL. Utilizou-se uma seringa para acertar o volume. A anaerobiose desse sedimento inoculado no foi mantida. Ponto D3 Esse sedimento menos espesso que o 75, mas foi necessrio usar pipeta. Usamos pipeta invertida de 5,0 mL, que permitiu observar o volume inoculado. Nesse caso a anaerobiose foi mantida. Adicionamos 2,0 mL de inculo em cada frasco. A adio de algumas amostras oxidaram alguns meios. 13/08/2004 CONTAGEM RIO MADEIRA Hoje fizemos uma avaliao do crescimento das amostras de sedimento do Rio Madeira, que foi inoculado a 15 dias (29/08/2004). Tambm avaliamos o crescimento das amostras da cava da mina que foi inoculado a 9 dias (04/08/2004). Fizemos essa anlise por turbidez. Dia 19/08/2004 faremos a avaliao do crescimento da amostra do Rio Madeira por turbidez e por reao com acetato de chumbo. Da cava da mina apenas por turbidez, novamente. Os resultados sero apresentados nos quadros abaixo:

77 NMP Rio Madeira / 15 dias de incubao Avaliao de turbidez 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 1 Incolor Incolor Incolor Incolor Azul Pouco precipitado Turvo, com nuvem C/ pouco Turvo Pouco precipitado escuro + precipitado + Turvo + 2 Incolor Incolor Incolor Azul-Cinza Incolor Precipitado preto fino Crescimento em flocos Crescimento em Turvo Turvo + fiapos + + + 3 Incolor Incolor Incolor Incolor Incolor Precipitado preto fino Turvo com fiapos C/ pouco Crescimento Precipitado parecido Turvo + precipitado branco com areia + + 4 Incolor Incolor Incolor Incolor Roxo Precipitado preto em Turvo Precipitado ou Pouqussimo grumos grandes (parece + crescimento em precipitado biofilme) nuvem Turvo + 5 Incolor Incolor Incolor Incolor Azul C/ pouco precipitado Turvo e c/ alguns fiapos C/ pouco C/ pouco C/ pouco precipitado escuro. + precipitado em precipitado Turvo nuvem + NMP Cava da Mina / 9 dias de incubao Avaliao de turbidez 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 1 Incolor Incolor Incolor Roxo Azul Pouco precipitado Pouco precipitado C/ pouqussimo ou crescimento precipitado 2 Azul-cinza Azul Rosa claro Azul bem claro Incolor Pouqussimo Pouqussimo precipitado precipitado 3 Incolor Azul-cinza Rosa Rosa Azul Pouco precipitado Pouco precipitado C/ artrpode(?!) ou crescimento 4 Incolor Azul-cinza Roxo Azul bem claro Azul 5 Incolor Azul bem claro Roxo Roxo Azul C/ precipitado escuro parecido com areia. -

78

19/08/2004 CONTAGEM BRS RIO MADEIRA TURBIDEZ 21 DIAS 10-3 Turvo com pouco precipitado escuro + Bem turvo e Turvo com bem preto precipitado. + Crescimento branco em pequenos grumos + Turvo. Turvo com Precipitado crescimento. preto Parece filme + + Turvo. Turvo com Precipitado crescimento preto em grumos + + Turvo. Turvo. Precipitado Precipitado marrom preto + + 10-2 Turvo. Precipitado preto + 10-4 Incolor 10-5 Bem turvo + 10-6 Pouco precipitado + Turvo +

Incolor +

Azulado -

Incolor +

Turvo com grumos brancos + Turvo com nuvem + Pouco precipitado +

Pouco precipitado + Azulado -

Incolor +

Precipitado nuvem e turvo +

Azulado. Pouco precipitado +

Rio Madeira Acetato de Chumbo 21 dias 10-2 10-3 1 + 2 + 3 + + 4 + 5 + Contagem Cava da Mina turbidez 15 dias 10-2 Pouco precipitado + Pouqussimo precipitado Artrpode Pouco precipitado + Precipitado semelhante a areia 10-3 Pouco precipitado + Pouqussimo precipitado Pouqussimo precipitado Pouco precipitado + Turvo +

10-4 -

10-5 -

10-6 -

10-4 Pouco precipitado + Lils Azul Azul Azul -

10-5 Azul Pouco precipitado + Azul Pouco precipitado + Azul -

10-6 Azulado. Pouco precipitado + Pouco precipitado + Lils. Pouco precipitado + Lils. Pouco precipitado. + Lils. Pouco precipitado +

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Teste potencial BRS 7 dias Acetato de chumbo 1 + + + + + + + 2 + + + + + + + -

gua CM(P) gua CM gua Cma SED 75 SED 75a gua 75(P) gua 75 gua 75 a SED D3 SED D3a gua D3(P) gua D3 gua D3a 20/08/2004

TAMBM REALIZEI, JUNTAMENTE COM A ANA CAROLINA, UMA PEQUENA REVISO BIBLIOGRFICA, E SELECIONEI ALGUNS ALGUNS ARTIGOS QUE PRETENDO IMPRIMIR E LER EM BH. SEPARAMOS INICIALMENTE 10 ARTIGOS E DE UM DELES A ROSANA DETERMINOU ALGUNS QUE EU DEVO BUSCAR NO CDTN E NA BASE DE PERIDICOS. Os artigos separados so os seguintes: - Tsukamoto, TK, Killion, HA, Miller, GC. Column experiments for microbiological treatment of acid mine drainage: low-temperature, low-pH and matrix investigations. WATER RES 38 (6): 1405-1418 MAR 2004 - Labrenz, M, Banfield, JF. Sulfate-reducing bacteria-dominated biofilms that precipitate ZnS in a subsurface circumneutral-pH mine drainage system. MICROBIAL ECOL 47 (3): 205-217 APR 2004 - Tabak, HH, Scharp, R, Burckle, J, et al. Advances in biotreatment of acid mine drainage and biorecovery of metals: 1. Metal precipitation for recovery and recycle. BIODEGRADATION 14 (6): 423-436 DEC 2003 - Tabak, HH, Govind, R. Advances in biotreatment of acid mine drainage and biorecovery of metals: 2. Membrane bioreactor system for sulfate reduction. BIODEGRADATION 14 (6): 437-452 DEC 2003 - Garcia, C, Moreno, DA, Ballester, A, et al. Bioremediation of an industrial acid mine water by metal-tolerant sulphate-reducing bacteria. MINER ENG 14 (9): 997-1008 SEP 2001 - Kolmert, A, Johnson, DB. Remediation of acidic waste waters using immobilised, acidophilic sulfatereducing bacteria. J CHEM TECHNOL BIOT 76 (8): 836-843 AUG 2001 - Benner, SG, Gould, WD, Blowes, DW. Microbial populations associated with the generation and treatment of acid mine drainage. CHEM GEOL 169 (3-4): 435-448 SEP 1 2000 - Jalali, K, Baldwin, SG. The role of sulphate reducing bacteria in copper removal from aqueous sulphate solutions. WATER RES 34 (3): 797-806 FEB 2000

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ANEXO B TERMO DE OUTORGA E ACEITAO DE AUXLIO

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ANEXO C - TECHNICAL NOTE QUE SER PUBLICADA NA REVISTA MINERALS ENGINEERING

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MONITORING OF SULFATE-REDUCING BACTERIA IN ACID WATER FROM URANIUM MINES


Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear CDTN/CNEN, R. Prof. Mrio Werneck s/n, Campus da UFMG, Pampulha, 30123-970 BH, MG. Brazil. J. S. Benedetto, jsb@cdtn.br, S. K. de Almeida ska@cdtn.br, H. A. Gomes hgomes@cnen.gov.br, R. F. Vazoller, vazoller@uol.com.br, A. C. Q. Ladeira acql@cdtn.br

INTRODUCTION
One of the most serious environmental problems created by the mining industry is acid mine drainage. In one plant of Nuclear Industries of Brazil - INB, this problem is a matter of concern. In that unit the uranium ore was processed until 1995 and generated a big amount of barren ore with U3O8 lower than 200ppm. These barren ores were deposited in large neighboring areas from the mining region, in waste rock piles The sulfite minerals present in these areas, including pyrite, generated high acidity water with radionuclides elements (uranium, thorium and radium) and stable elements (Manganese, zinc, fluorite , iron, etc). The level of these elements were above the environmental legislation content (Resolution CONAMA 2005). Actually the treatment involves chemical precipitation and any interruption leads to an increasing pollution on the aquatic system (Cipriani, 2002). The treatment of acid water using sulfate-reducing bacteria - SRB have been used in other countries with quite good technical as well as economical results. SRB are useful to abate Acid Mine Drainage - AMD due to two fundamental reasons. Firstly because of their capacity to reduce sulfate to sulfite. These sulfites react additionally with certain metals dissolved in the contaminated waters, such as copper, iron and zinc, forming insoluble precipitates. On the other hand, the system acidity is reduced by their own action of sulfate reductions and by the carbon metabolism of the bacteria. (Garcia et al., 2001). In this context the objective of this study consisted in seasonal diagnostic of the sulfate-reducing bacteria present in the aquifer system of the INB Industry Complex in Caldas. Brazil.

METHODOLOGY
1. Sampling Water and sediment samples were collected in liquid effluents from the Pit mine (PM) and from the waste rocks 4 (WR4) and 8 (WR8) in different depth and periodically for the seasonal study between February and December 2004. 2. Microbiological analysis The determination of the occurrence of SRB in water samples and sediment was accomplished with cultivation medium - Postgate B using the method of the multiple tubes, series of five tubes (Postgate, 1979). For the Total bacteria counting aqueous solution of coloring acridine orange was added to the water samples previously conditioned with formaldehyde, used to fix the microorganisms. After a 5 minute contact the sample was filtered in polycarbonate membrane placed on sheet dies and analyzed under epi-fluorescence microscope. 3. Physical and chemical analyses The water pH was measured during the sample collection. The determination of dissolved oxygen in water was carried out by titrimetry (Eaton, 1995). The material in suspension (organic and inorganic) was measured according to Teixeira et al, 1965.

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The analyses of Manganese and Zinc were performed by spectrometry of atomic emission with coupled plasma. The phosphate and sulfate were analyzed by spectrophotometry and the fluoride by potentiometry with selective electrode.

RESULTS AND DISCUSSION Table 1 shows the chemical analysis of the water and sediment samples collected in the sites PM, WR8 and WR4. Garcia et al, 2001 verified that the acid water from the Spanish pyrite showed sulfate values between 1800 a 2000 ppm and zinc grade between 30 e 50 ppm. These levels were higher than the experimental values found in this study. Table 2 shows the pH and O2 measures and biological analysis for samples collected from WR8. The highest value of total bacteria counting (13,3.105 bacteria.mL-1) was observed in February in this site.
Table 1. Chemical Analysis of samples from the points PM, WR8 and WR4.

Siitte S e

2 F 22--F

2 PO4422--PO4

Mn Mn Watterr Wa e

Zn Zn

2 SO4422--SO4

PM PM WR8 WR8 WR4 WR4 PM PM WR8 WR8 WR4 WR4

70..95 70 95 116..81 116 81 121..44 121 44 4..16 4 16 0..06 0 06 0..04 0 04

4..60 4 60 < 0,,03 < 0 03 < 0,,03 < 0 03 0,,137+0,,006 0 137+0 006 0,,217+0,,006 0 217+0 006 0,,254+0,,006 0 254+0 006

97..66 97 66 137..61 137 61 107..38 107 38 Sediimentt Sed men 4,,94+0,,03 4 94+0 03 0..24 0 24 1..14 1 14

16..83 16 83 22..59 22 59 17..95 17 95 0,,935+0,,001 0 935+0 001 0..06 0 06 0..04 0 04

1385..50 1385 50 1548..75 154 8 75 1247..14 124 7 14 12..10 12 10 2..91 2 91 0..43 0 43

Concentrations of the species in water - mg.L-1 and (%) in sediment

Frmmichen et al., 2004 carried out studies of microcosm simulating of small pond role mine with acid water (pH = 2,6). The bacteria total counting in the water column obtained by these authors changed from 105 to 106 bacteria mL-1, according to the medium values of total bacteria obtained in that work in the WR8 ( 1,1.106 bacteria mL-1), PM ( 3,5.105 bacteria mL-1) and WR4 ( 3,4.105 bacteria mL-1) points.

Table 2 Biological analyses, pH and O2 measures in samples from WR8 site


WATER SEDIMENT

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pH Month Feb. Mar. April Aug. Sep. Oct. Nov. 5,15 3,38 3,50 3,35 3,51 3,45 3,52

SRB MPN/mL 2,8 1,1 0 0 0 0 0

Total bacteria Bact./mL 13,29x105 11,58x105 12,16x105 8,84x10


5 5

O2 (mg/L) 5,69 1,58 0,65 1,60 1,62 1,62 13,34 11,24

Organic matter (mg/L) 0,005 0,006 0,004 0,004 0,004 0,005 0,004 0,005

SRB MPN/mL 1,4 1,2 1,4 15 0,7 2 12 110

Organic matter (mg/L) 16,60 15,90 19,30 22,70 14,90 24,70 20,50 11,90

10,74x10

11,59x105 13,00x105 -

0 Dec. 3,87 MPN/mL- most probable number/mL

The medium values of SBR in water samples were low as we can see in table 2. Some studies showed that high concentrations of heavy metals and low pH values ( 3.0 - 3.5) are limiting factors that influence the SRB increasing acid water from mine (Frmmichen et al. 2004, Garcia et al., 2001). The lowest pH value (bellow 3,5) was measured during the months of March and April and higher number of SRB (2,8 MPN. mL-1) was detected in February in WR8 site when the water pH was higher( 5,2). Anaerobic reactors studies for the metals and sulfites removing from mine acid water have shown high SRB increasing, from 4.0.107 to 8.0.108 bacteria mL-1 on acid medium mainly due to organic matter enrichment in these systems ( Jong and Parry, 2003). According to expected results, the highest values of SRB were detected in the period between February and August in water samples collected 12,5 m of depth in the PM, where it was also detected the lowest oxygen concentrations along the period. The dissolved oxygen values measured in bottom samples of the mine lake (UTM) changed from 4,0 to 10,1 mg O2 L-1 and were according to the values obtained by Meier et al. (2004) using sediment/water interface samples of acid water from Lusatia (Germany). The values of SRB as well as most of its occurrences in the sediment samples in the three sampling sites were higher if compared with water samples along the year. This was expected as lower concentrations of dissolved oxygen were found in the sediment and higher concentrations of available organic matter for the populations of SRB were found in the sediment samples. These results are on a par with different studies conducted with acid water from mine. Conclusion
The results obtained from the microbiological variables presented seasonal variation in the three points evaluated. The results showed that SRB was present in water samples presenting low pH values and high

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concentrations of heavy metals, as well as in samples with high oxygen levels. The sediment was the preferential place for SRB occurrence and WR8 site presented the highest values of SRB detected in that experimental study.

ACKNOWLEDGMENTS
The authors are grateful to FAPEMIG ( Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais) for the financial support.

REFERENCES
Cipriani, M., Mitigao dos impactos sociais e ambientais decorrentes do fechamento definitivo de minas de urnio. Doctor Thesis; Instituto de Geocincias, Universidade Estadual de Campinas, Campinas/SP Brazil,, 2002. Frmmichen, R., Wendt-Potthoff, K., Friese, K., Fischer, R. Microcosm studies for neutralization of hypolimnic acid mine pit lake water (pH 2,6). Environ. Sci. Technol., 38, 2004; pp. 1877-1887. Garcia, C; Moreno, D.A.; Ballester, A.; Blzquez, M.L.; Gonzlez, F.; Bioremediation of an industrial acid mine water by metal-tolerant sulfate-reducing bacteria. Minerals Engineering, v. 14, No 9, 2001, pp. 9971008. Jong, T. & Parry, D.L.; Removal of sulfate and heavy metals by sulfate reducing bacteria in short-term bench scale upflow anaerobic packed bed reactor runs. Water Research 37(14), 2003, pp. 3379-3389. Meier, J. P.; Baben Zien, H. D.; Wendat Potthoff, K.; Microbial Cycling of Iron and Sulfur in Sediments of Acidic and pH Neutral Mining Lakes in Lusatia ( Brandenburg, Germany), Biogeochemistry, vol. 67; 2004; pp. 135-156;. Postgate, J.R.; The sulphate-reducing bacteria. 2a edition; Cambridge University Press, New York; 1979. Resoluo CONAMA, no 357, March 17, 2005. Teixeira, C; Tundisi, J.G.; Kutner, M.B.; Plankton studies in a mangrove II. The standing stock and some ecological factors. Bolm. Institute. Of Oceanography . So Paulo, Brazil. v.24, 1965; pp. 23-41.

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ANEXO D ARTIGO APRESENTADO NO INTERNATIONAL NUCLEAR ATLANTIC CONFERENCE (INAC 2005),

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