Procedimientos para la Validacion de la Prueba de Endotoxina Bacteriana (Prueba LAL).

Parte 2 y ltima Sandra Meneses Nolte

Solubilidad La prueba de endotoxina es considerada un sistema acuoso. Para productos no solventes al agua, es importante diluir el producto en una solucion de agua y solvente para luego realizar diluciones donde la concentracin del producto sea soluble y la deteccin de endotoxina se facilite. Por ejemplo el reactivo del LAL puede tolerar un 5% (v/v) de etanol en agua y un 1% (v/v) de una mezcla de agua/dimetilsulfoxide. Se puede disolver el producto en solventes orgnicos o inorgnicos con el propsito de formar sales solubles. El pH se debe confirmar. Perfiles de Compatibilidad entre los mtodos de Gelatificacion y Cintico (Kinetic). Dilucin de la muestra con reactivo acuoso del LAL (LWR) es la mejor manera de eliminar interferencias. Algunos otros tratamientos como filtracin o calentamiento, requieren una serie de estudios para demostrar que la endoxina que pueda estar presente se puede recobrar y detectar. El mejor mtodo para determinar la compatibilidad del LAL con el nuevo producto es realizar estudios de recobro de endotoxina en bajas concentraciones del material de estudio. En el caso de interferencia, se debe realizar una serie de diluciones con el producto nuevo, todas ellas en tubos de poliestireno o tubos de vidrio depirogenizados; con el fin de identificar el rango de concentracin compatible al ensayo. Este rango se define como el rango de concentracin que permite el recobro de endotoxina de un control positivo del Producto (PPC). Para productos altamente solubles, se recomienda realizar diluciones (1:2) con LWR para luego conducir estudios de recobro sobre un rango de 8 a 0.1 mg/mL .Otros rangos pueden ser usados dependiendo de la solubilidad y/o dosis estimada del producto. Para producto menos solubles se deben realizar estudios similares. Idealmente una concentracin compatible es identificada usando el mtodo de gelatificacion y es confirmada por el mtodo Cintico (kinetic). Algunas agencias requieren ver ambos estudios. Se requiere de un solo lote para ambos estudios. Ejemplo 5: Un antibitico X fue diluido con acido sulfrico diluido para obtener sales de sulfato (solubles en agua). Luego fue diluido a 8 mg/mL. Diluciones del producto con LRW fueron preparadas en un rango de 8 a 0.1 mg/mL. Todas las diluciones hechas con LRW fueron negativas, indicando que no haba endotoxina en la

muestra a nivel de 1 mg/mL, fue el primer recobro de PPC. A 1mg/mL, el mtodo de gelatificacion fue positivo, pero el mtodo cintico, recobro constantemente el PPC a 0.5 mg/mL y a niveles mas bajos. La ltima concentracin fue propuesta para hacer mas estudios de recobro. El termino concentracin no inhibitoria es decisiva, porque la concentracin mas alta de recobro a 2 PPC con el mtodo de gelatinizacin se puede alcanzar solamente con el 50% de recobro. Tabla de Resultados Potencia 8 (mg/mL) LRW/ Estudio con el mtodo de gelatificacion -con el nuevo producto 2 Recobros -de PPC % Recobros 22 8 PPC LAL/pH 5.8

0.5

0.25

0.1

--

--

--

--

--

--

-52 6.1

-+ 69 6.5

++ 89 6.8

++ 103 6.9

++ 98 6.9

++

6.9

Estudios de calificacin de muestra se pueden hacer diluyendo una serie de tubos con LWR y otros con 2 solucin. Inocule 4 tubos con cada concentracin del producto, y finalmente adicione 10L de un tubo Spike de 20- a dos PCC tubos en cada serie.Un recobro de al menos 75% es necesario para asegurar la reproducibilidad con el mtodo Cintico (kinetic). Efecto del pH El pH tiene un efecto grandsimo en el recobro de endotoxina en el producto. Si el pH es fuera del rango entre 6.5 y 8.0, el ensayo puede fallar. Ajustes se deben hacer con una adicin de HCL 0.1 normal o NaOH. El mejor mtodo de ajuste es usar un tris-buffer dentro de lo posible. Estudios de efecto del pH en estos recobros es usualmente requerido por la FDA. Prueba de Sensibilidad La sensibilidad de la concentracin compatible con el LAL (LAL-CC), se debe comparar con el lmite de endotoxina para determinar si las condiciones de la prueba fueron lo suficientemente sensitivas. En el caso de que la informacin de la dosis no este disponible, el lmite de endotoxina debe ser asignado a 1mg/mL. La sensibilidad de la prueba se define as: Sensibilidad=/Concentracin de la Prueba

Una significante inhibicin, requiere que haya una metodologa ms sensitiva. Nivel de Alerta de Endotoxina El nivel de alerta de endotoxina es una especificacin interna para el Ingrediente Farmacutico Activo (API). Este nivel es 4-5 veces ms estricto que el del producto final. Un nivel de alerta que represente un 25% de reduccin en los lmites del producto final es prudente para productos que son producidos por fermentacin o tecnologa recombinante, llenados aspticamente y administrados intravenosamente. Reporte de Validacin El reporte debe incluir toda la informacin obtenida con 3 lotes del producto. Este reporte debe incluir: Detallada descripcin de los materiales, equipos, software y mtodos. Calculaciones de cmo se determinaron los limites de endotoxina, niveles de alerta, sensibilidad, etc. Resultados experimentales y problemas encontrados durante estos estudios. Descripcin de la preparacin de la muestra y estrategia para determinar reproducibilidad. Conclusin de que el mtodo seleccionado no presenta interferencia a un pH neutro.