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BIOTECNOLOGIA

(BIOLOGIA)

BIOTECNOLOGIA

Definio

1. O QUE BIOTECONOLOGIA?

A biotecnologia consiste na aplicao em grande escala dos avanos cientficos e tecnolgicos, a partir de organismos vivos (clulas e/ou molculas) para produo racionalizada de substncias, que resultam em produtos comercializveis. A biotecnologia encontra muitas aplicaes importantes em: Indstria (qumica, petroqumica, alimentos, farmacutica) Agricultura/Pecuria Sade Preservao do meio ambiente Embora a palavra biotecnologia tenha sido usada pela primeira vez em 1919 por um engenheiro agrcola da Hungria, o crescimento dessa rea somente ocorreu a partir da dcada de 70 com o desenvolvimento da tecnologia do cido desoxirribonuclico (DNA)recombinante.
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Definio

Interao da biotecnologia industrial com ramos do conhecimento

Biologia

Bioqumica Biologia molecular

Qumica

Biotecnologia Industrial
Engenharia Bioqumica Qumica Industria

Engenharia Engenharia Qumica


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Histria

2. EVOLUO DA BIOTECNOLOGIA As tcnicas de fermentao, que at o presente momento constituem os processos principais da biotecnologia, so conhecidos e utilizados desde a Antigidade, principalmente na produo de cervejas e vinhos. No oriente, os antigos j utilizavam bebidas fermentadas, da mesma forma de que, na Amrica pr-colombiana, tambm j se produziam bebidas com a utilizao de processos rudimentares de fermentao. H sculos que no Japo e na China se utilizam processos de produo de bebidas e alimentos pela tcnica de fermentao. O troglodita sabia que a carne deixada em repouso alguns dias era mais saborosa que aquela ingerida logo aps a matana; Sabia, tambm que bebidas intoxicantes poderiam ser feitas de gros e frutas. O envelhecimento da carne e a fabricao de bebidas alcolicas foram os primeiros usos de fermentao pelo homem; A fabricao de queijo e molho de soja na China e no Japo conhecida h milhares de anos; Foram encontrados pes nas pirmides egpcias construdas h milhares de anos;
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Histria

Quanto a usos medicinais da fermentao , os chineses h mais de 3000 anos utilizavam coalhada mofada de soja para curar infeces da pele ; os primitivos habitantes da Amrica Central empregavam fungos para o tratamento de feridas infeccionadas; As primeiras plantas industriais a utilizarem tecnologia de fermentao foram as fbricas de cerveja. No entanto, foi s no final do sculo XIX e incio do sculo XX que essa tecnologia passou a ser gradativamente utilizada, tanto na indstria de bebidas e alimentos, como na indstria qumica. A indstria qumica, no incio do sculo XX, iniciou a produo de solventes orgnicos. S no incio da I Guerra Mundial as necessidades de acetona na produo de explosivos estimularam substancialmente a pesquisa no potencial da tecnologia de fermentao. Em 1901 Rudolf Emmerich e Oscar Low, isolaram a piocinase, o primeiro antibitico do mundo. Problemas de padronizao do produto, no existiam tcnicas para garantir que cada partida produzida da substncia pudesse ser igualmente efetiva, causando insucesso em alguns casos , levou ao abandono deste; Em 1923 , Pfizer inaugurou a primeira fbrica para a produo de cido ctrico por via fermentativa. O processo envolvia uma fermentao utilizando o fungo 5 aspergillus niger, pelo qual acar era transformado em cido ctrico

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Histria

Uma descoberta casual: um funcionrio de um mercado encontrou um melo

embolorado por uma linhagem de Penicillium que podia prosperar quando cultivado em tanques fundos com aerao, e que produzia duzentas vezes mais penicilina que o bolor de Fleming cultivado em meio slido. Outros antibiticos apareceram rapidamente. O progresso da fermentao prossegue a passadas largas. A cada ano novos produtos so incorporados lista de produtos derivados da fermentao. Vrias vitaminas so produzidas pelo emprego de etapas de fermentao em sua sntese (B-2 riboflavina, B-12 cianocobalamina e C cido ascrbico). Alguns dos bioprocessos mais interessantes so as desidrogenaes e hidroxilaes especficas do ncleo esteride. Essas transformaes so vias econmicas utilizadas na obteno da cortisona antiartrtica e seus derivados. As snteses biotecnolgicas dos aminocidos L-lisina e L-cido glutmico esto sendo utilizadas comercialmente, assim como a produo de cidos nuclicos como compostos intensificadores de sabor.
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Bioprocessos

3. OS BIOPROCESSOS
Bioprocessos compreendem um conjunto de operaes que incluem o

tratamento da matria prima; preparo dos meios de propagao e produo; esterilizao e a transformao do substrato em produto(s); processos de produo; processos de separao e purificao de produto(s). A distino entre bioprocessos e processos qumicos est calcada na natureza dos catalisadores utilizados em suas reaes. Os bioprocessos so conduzidos mediante ao de: microrganismos; clulas animais ou vegetais; enzimas.

Esquema geral de um bioprocesso

Microrganismo selecionado

Matrias-primas

Meio de cultura selecionado Esterilizao

Preparo inoculo: etapa de laboratrio

Clulas Preparo inoculo: etapa industrial Ar Esterilizao do ar

Biorreator Industrial

Separao das clulas Caldo fermentado Recuperao Produto Produto Tratamento efluentes 8

Compressor

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Bioprocessos/Enzimas

4. BIOPROCESSOS CATALISADOS POR ENZIMAS ENZIMA uma protena sintetizada na clula viva que catalisa uma reao termodinamicamente possvel. As enzimas so de ocorrncia universal nos materiais biolgicos. Grande crescimento nos ltimos anos devido sua importncia nas reas : farmacologia, tecnologia de alimentos, toxicologia, medicina, engenharia qumica, biotecnologia, etc. As enzimas so hidrossolveis. A enzima no modifica a constante de equilbrio de uma reao pois atua em concentraes muito baixas que no guardam proporo com a mudana catalisada. Natureza de especificidade. Origens: Humana : pepsina (estmago), amilases (saliva), proteases, amilases, lipases ( pncreas ) renina ( estmago de ruminantes); Vegetal : papaina ( mamo ), bromelina ( abacaxi ), ficina ( figo ); Microbianas ( bactrias, leveduras, fungos ). Presena indesejvel : escurecimento de vegetais; clarificao; rancificao, etc.
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4.1 Cintica Do ponto de vista termodinmico, uma enzima um catalisador que acelera uma reao porque diminui a energia de ativao. Isto acontece porque a enzima aumenta o nmero de molculas ativas, capazes de reagir.

Ane
Coordenadas de energia

Ea para reao no enzimtica Ae Ea para reao enzimtica

dF de reao
Coordenadas de reao
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Influncia da Concentrao de enzima, Concentrao de substrato,Temperatura, pH, na cintica de reaes catalisadas por enzimas. (rever) 4.2 Extremozimas H cerca de 30 anos, os cientistas pensavam que s existia vida em um nmero muito limitado de habitats. Hoje, porm, no resta dvida de que at mesmo os ambientes mais extremos so colonizados por microorganismos especiais, muito bem adaptados a esses ninhos ecolgicos. Esses organismos, os extremfilos, esto presentes em bitipos onde outras criaturas no conseguem sobreviver. Os extremfilos so encontrados em altas temperaturas (termfilos), sob condies de frio extremo, como geleiras (organismos psicroflicos), em lagos de elevada salinidade (halfilos) e em ambientes extremamente cidos (acidfilos) ou alcalinos (alcalinfilos), nas altas presses do fundo do mar ou na abundncia de metais txicos (metalfilos) A descoberta de organismos extremfilos abre novas oportunidades para o desenvolvimento de enzimas que apresentam atividade sob as circunstncias extremas (as extremozimas), encontradas com freqncia em processos industriais.
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4.3 Classificao das enzimas OXIDO-REDUTASES : catalisam as reaes de xido-reduo. Os nomes comuns para muitas dessa enzimas so: desidrogenases, oxidases, peroxidades. HIDROLASES : catalisam as reaes de hidrlise. H um grande nmero dessas enzimas. TRANSFERASES : catalisam a transferncia de grupos. Alguns nomes comuns: transaminases quinases, transacetilases. ISOMERASES : catalisam diferentes tipos de isomerisao. So divididas em: racemases, epimerases, cis-trans isomerase, cetol isomerases intramoleculares, mutases ou transferases intramoleculares. LIGASES : catalisam reaes que unem duas molculas conjugadamente com o rompimento de uma ligao pirofosfrica. LIASES : catalisam reversivelmente a remoo de grupos do substrato no hidroliticamente. A fumarase catalisa a remoo de gua de malato de modo 12 reversvel dando fumarato.

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Vantagens Baixo consumo de energia ( temperatura tima de atividade ) Enzimas com alto grau de pureza Pequena produo de produtos colaterais ( especificidade ) Aproveitamento quase total da matria-prima Reaes de fcil controle Desvantagens Dificuldade de reutilizao de algumas enzimas Uso restringido de algumas enzimas pela necessidade de co-fator Reaes susceptveis ao de substncias inibidoras

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4.4 Hidrolases/Carbohidrases Alfa amilase: uma endoenzima que catalisa as reaes de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) do amido internamente, de forma desordenada. O produto da hidrlise so oligossacardeos de mdio P.M. (dextrinas). Origem das -amilases: suco pancretico, saliva; durante germinao de cereais; fngica ou bacteriana. Beta amilase: uma exoenzima que catalisa a reao de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) de duas em duas unidades de glicose a partir da extremidade no redutora das molculas do amido. Os produtos da hidrlise so maltose e beta limite dextrina. Origem das beta amilases: cereais como a cevada, soja, batata doce; microbiana bactrias. A batata doce crua tem gosto de amido. Aps cozimento tem sabor adocicado. Porque? Malteao da cevada para fabricao de cerveja e wisk. 14

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Amiloglicosidase: uma exoenzima que catalisa a reao de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) e -(1-6) de uma em uma unidade de glicose a partir da extremidade no redutora. O produto da hidrlise a glicose. Desramificantes: uma endoenzima que catalisa a reao de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-6). Transforma amilopectina em amilose. Ciclodextrina-glicosil-transferase ( CGTase): catalisa as reaes de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) e em seguida catalisa a ciclizao do oligossacardeo. O produto so ciclodextrinas formadas principalmente por seis unidades de glicose (-ciclodextrina); sete unidades de glicose (-ciclodextrinas) e oito unidades de glicose (-ciclodextrinas), podendo chegar a at 12 unidades. As ciclodextrinas possuem uma superfcie exterior polar e uma cavidade apolar. Dado o carter hidrfilo da superfcie exterior, as ciclodextrinas podem dissolver-se na gua, ao mesmo tempo que disponibilizam uma cavidade apolar (hidrfoba) capaz de formar complexos de incluso com vrios tipos de molculas hspedes. 15

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A -ciclodextrina a que apresenta menor solubilidade, em funo do elevado nmero de ligaes hidrognio intramolecular entre os grupos hidroxilo secundrios existentes na molcula. Na -ciclodextrina s quatro das suas seis possveis ligaes de hidrognio podem ser estabelecidas, em virtude de uma unidade de glicose se encontrar em posio distorcida. A -ciclodextrina por ser uma molcula de estrutura mais flexvel, a mais solvel das trs. As ciclodextrinas so usadas com finalidades muito diversas. Alm das aplicaes farmacuticas, so aplicadas em produtos alimentcios, cosmticos, pesticidas, produtos qumicos, qumica analtica. A incluso de um composto numa ciclodextrina podem levar s seguintes alteraes nas propriedades desse composto: - A solubilidade e velocidade de dissoluo de substncias pouco solveis podem ser significativamente aumentadas; - Muitas substncias podem ser protegidas contra hidrlise , oxidao, racemizao, isomerizao, foto-oxidao ou outros processos de decomposio;
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- Compostos volteis podem ser fixados, evitando-se a sua perda por evaporao; - Compostos lquidos podem ser transformados em ps, para posterior incorporao em formas slidas; - Compostos incompatveis podem ser misturados, quando um deles for complexado; - O sabor e odor desagradveis de algumas substncias podem ser mascarados; - Produtos facilmente solveis para preparaes injetveis, podem ser obtidos por liofilizao com ciclodextrinas; - Liberao controlada de frmacos - As ciclodextrinas e seus complexos so geralmente no higroscpicos, possibilitando a preparao de comprimidos com caractersticas melhores; - O efeito da complexao com ciclodextrinas, que aumenta a solubilidade ou a velocidade de dissoluo de uma substncia ativa, pode melhorar a respectiva 17 biodisponibilidade aps administrao oral.

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Dextram sacarase: Catalisa a reao de hidrlise da sacarose e em seguida catalisa a polimerizao das unidades de glicose atravs de ligaes glicosdicas -(1-6) e -(1-3). O polmero que se forma denominado de Dextrano. O dextrano reduz o rendimento industrial de sacarose porque: aumenta a viscosidade do caldo dificultando a clarificao deste; reduz a velocidade de cristalizao da sacarose; causa entupimento dos filtros; perda de sacarose que se transforma em dextrano. Na indstria farmacutica essa enzima empregada justamente para se obter o dextrano utilizado como substituto do plasma sanguneo. Nas indstrias qumica e de alimentos o dextrano utilizado como espessante em processos tecnolgicos. Invertase: Catalisa a reao de hidrlise da sacarose produzindo acar invertido glicose mais frutose. Glicose 70% da doura da sacarose Frutose 50% mais doce que a sacarose

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-galactosidase: Catalisa as reaes de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-6) dos oligossacardeos que possuem a galactose na estrutura molecular (rafinose, estaquiose). -galactosidase ou lactase: Catalisa as reaes de hidrlise das ligaes glicosdicas -(1-4) dos oligossacardeos que possuem a galactose na estrutura molecular. Os seres humanos sintetizam essa enzima, principalmente na infncia quando o consumo de lactose maior. A falta de lactase no organismo causa flatulncia e diarreia pois a lactose no pode ser hidrolisada e absorvida no trato digestivo, sendo fermentada por microorganismos. (Lactose um dissacardeo formado por galactose e glicose unidas por ligaes glicosdicas -(1-4). Celulases, hemicelulases e fenoloxidases: catalisam reaes de hidrlise da celulose, hemiclulose e lignina. Celulose: polissacardeo estrutural mais abundante na natureza formado por unidades de glicose unidas por ligaes glicosdicas -(1-4). O peso molecular varia de 200.000 a 2.000.000; hemicelulose (polioses): polmero heterogneo constitudos por galactose, xilose e arabinose principalmente, alm de outros monossacardeos e cido urnico.
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Lignina: composta basicamente de unidades de fenilpropano formando uma macromolcula tridimensional e amorfa, representando de 20 a 30% do total da madeira. A biodegradao da celulose feita pela ao de trs grupos de enzimas que atuam sinrgicamente: endo-glucanase; exoglucanase; -glucosidase. As endo-glucanases catalisam a hidrlise das molculas de celulose internamente, ao acaso, produzindo fragmentos de celulose denominados de oligmeros, que servem de substrato para as exo-glucanases que por sua vez catalisam externamente a hidrlise dessas molculas celobiose. As -glucosidases catalisam a hidrlise da celobiose at glicose. O grau de sinergismo das celulases bastante grande. A atividade relativa da cada grupo de enzimas atuando de maneira isolada bastante baixa, enquanto que, os trs grupos em conjunto, permitem a hidrlise total da celulose com rendimento superior a 100%.

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A biodegradao das polioses (hemicelulose) ocorre de maneira semelhante da celulose. A xilanases catalisam a hidrlise das ligaes glicosdicas entre unidades de xilose, as mananases atuam sobre ligaes glicosdicas entre molculas de manose e as glucuronidases sobre ligaes de cidos urnicos com molculas de acares. Assim como as celulases as hemicelulase so divididas em endo-hemicelulases e exohemicelulases. Um vasto grupo de enzimas est relacionado biodegradao da lignina agrupadas em: a) Fenoloxidases peroxidases (lignina peroxidase, mangans peroxidase); lacase. b) Enzimas produtoras de H2O2 (glicose oxidase, metanol oxidase)
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4.5 Processo de produo de dextrinas ( Liquefao do amido) A liquefao do amido consiste na obteno de suspenses com alta concentrao de oligossacardeos de pesos moleculares variados. Liquefao cida Liquefao enzimtica 4.6 Processo de produo de glicose,frutose,ciclodextrinas 4.7 Hidrolases/Pectinases Substncias pecticas: so polmeros do cido D-galacturnico unidos por ligaes glicosdicas -(1-4) e se constituem basicamente em protopectinas, cido pcticos, cido pctinicos e pectinas. Pectina: polmero de cido galacturnico interligados por ligaes glicosdicas -(1-4), metoxilados em diversos graus (baixo mdio e alto). Formam solues altamente viscosas mesmo em baixas concentraes. Formam gis com sacarose e cidos. Pectinas naturais possuem cerca de 50% dos grupos carboxilas metoxilados
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metil esteraze: catalisa a remoo de grupos metoxila esterificados nas substncias pcticas. Polimetil galacturanase: catalisa a hidrlise das ligaes glicosdicas dos cidos galacturnicos metoxilados. A forma endo catalisa a hidrlise de forma desordenada enquanto que a forma exo remove unidades a partir das extremidades. 4.8 Aplicaes das pectinases Extrao Clarificao

Pectina

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4.9 Hidrolases/Proteases Proteases ou enzimas proteolticas: catalisam reaes de hidrlise das ligaes peptdicas das protenas. Exopeptidases; catalisam as reaes de hidrlise dos aminocidos das extremidades das cadeias proticas. So encontradas as carboxipeptidases e as aminopeptidases Endopeptidases: catalisam as reaes de hidrlise das ligaes peptidicas internas s molculas de protenas. So encontradas as: Serina protease: no centro ativo da enzima h uma serina. SH protease: centro ativo contem grupo sulfidrila. Metalo protease: centro ativo contem metais - Mg, Zn, Co, Fe, Cu, Ni, Cd. Protease cida: possui pH timo de atividade em torno de 2 a 5. Em geral, seu centro ativo possui grupo carboxila.

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4.10 Aplicaes de proteases 4.11 Hidrolases/Lipases Lipases ou enzimas lipolticas: catalisam reaes de hidrlise de lipdeos a glicerol, mono ou diglicerdeos. So encontradas no pncreas, plasma sangneo, saliva, suco pancretico, leite e plantas oleaginosas. H vrios microorganismos produtores de lipases, fungos leveduras e bactrias. Tecnologicamente muito importante no apenas a funo cataltica de hidrlise mas tambm as funes catalticas em reverso em reaes de transesterificao e de esterificao, dependendo das condies de reao.

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4.12 Oxiredutases So enzimas que catalisam reaes de oxidao e de reduo. Dehidrogenases: catalisam reaes de oxidao provocando a eliminao de hidrognio do substrato. Oxigenases: catalisam reaes de oxidao, incorporando oxignio molecular ao substrato pela ativao do oxignio. Peroxidases: utilizam o perxido de hidrognio como oxidante para provocar a oxidao do substrato. Fenolases: catalisam a oxidao de compostos fenlicos. Principal enzima a polifenoloxidase. Catalase: catalisa especificamente a decomposio da gua oxigenada em oxignio molecular e gua. Lipoxigenase: encontrada apenas em vegetais, particularmente em leguminosas. Catalisam reaes de degradao e oxidao de cidos graxos insaturados, dando origem ao rano lipoltco-enzimtico. Os radicais livres originrios da degradao dos cidos graxos, destroem protenas e vitaminas. 26

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cido ascrbico oxidase: catalisa a reao de oxidao do cido L-ascrbico a L-dehidroascrbico. A reao pode ser revertida utilizando-se a enzima cido ascrbico redutase. 4.13 Isomerases Catalisam diferentes tipos de isomerisao. So divididas em: racemases, epimerases, cis-trans isomerase, cetol isomerases intramoleculares, mutases ou transferases intramoleculares. Glicose isomerase: catalisa a interconverso entre aldose e cetose. Glicose Xilose Frutose Xilulose Xilose isomerase: catalisa a interconverso entre aldose e cetose.

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4.14 Outras Aplicaes de Biocatalisadores lcool Etlico No Brasil o lcool combustvel produzido facilmente a partir de cana de acar, um substrato diretamente fermentvel que dispensa pr-tratamento e hidrlise. O lcool combustvel pode se obtido a partir de amido de milho, sendo um dos grandes objetivos da biotecnologia americana e de muitos pases europeus a viabilizao econmica do lcool de materiais lignocelulsicos e principalmente de resduos da agroindstria. A produo de etanol de mandioca e de resduos da agroindstria, chamados de biomassa, envolve a hidrlise destes materiais acares fermentveis. Rao animal As enzimas para rao animal, adicionadas rao de sunos e aves domsticas, destinam-se a reduzir a excreo de produtos residuais e melhorar a digestibilidade de matrias-primas. As xilanases e as fitases encontram-se entre as enzimas de rao animal mais conhecidas, sendo ambas produzidas por meio de microorganismos modificados pela 28 engenharia gentica.

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A xilanase hidrolisa as hemiceluloses presentes no trigo e no milho, facilitando a digesto de todos os nutrientes e reduzindo a excreo de estrume, nitrognio e fsforo. A fitase decompe o fitato, composto fosforoso presente nos gros de rao animal. Os animais requerem fosfatos para seu adequado crescimento esqueltico, mas no so capazes de digerir o fitato. Costuma-se, portanto, acrescentar fsforo (inorgnico) rao, o que leva excreo de grandes volumes de fsforo e poluio do meio ambiente. O fitato pode ser digerido pela adio de fitase rao animal. Reduz-se assim a necessidade de usar suplementos de fosfato inorgnico com vantagens econmicas e ambientais.

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Alimentos Cerveja Clarificao de cerveja Malteao Sucos de Frutas Extrao Clarificao Vinhos Extrao Panificao Proteases Amilases
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Carnes Amaciamento Leite Deslactao Sorvete/Doce de leite .........

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4.15 Reatores com clulas ou enzimas Imobilizadas Os sistemas com agentes imobilizados tm como principal caracterstica o uso de algumas estruturas fsicas de confinamento que obrigas os agentes do bioprocesso a permanecerem em uma regio particular do biorreator. A opo entre as formas solvel e imobilizada de uso de uma enzima ou clula depende da natureza do processo de converso e da estabilidade operacional das duas formas. No caso das clulas imobilizadas h que considerar dois tipos de bioprocessos. O primeiro aquele que utiliza uma ou algumas enzimas contidas nas clula, no havendo necessidade de coenzimas e vias anablicas presentes na replicao celular. As clulas no necessitam estar vivas quando imobilizadas; somente deve estar ativo o sistema enzimtico envolvido na converso bioqumica requerida. O segundo tipo de processo que utiliza clulas imobilizada aquele em que se impe a necessidade de manter a viabilidade celular, uma vez que os produtos a serem formados requerem mltiplos passos de transformaes, regenerao de coenzimas, presena de cadeia respiratria, vias metablicas geradoras de intermedirios e 32 outros mecanismos inerentes s clulas vivas.

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Bioprocessos/Enzimas

As principais vantagens da utilizao de agentes biotecnolgicos imobilizados so: - possibilidade de utilizao de altas concentraes do agente no volume reacional, implicando em maiores velocidades de processamento; - operao de sistemas contnuos vazo especfica de alimentao; - maior proteo ao sistema biolgico em relao ao estresse ambiental, ocasionado por elevadas concentraes de substrato, pH e cisalhamento; - reuso do agente de bioprocesso; - reduo do investimento fixo nas instalaes; - reduo do custo operacional. Processos que utilizam clulas imobilizadas Produo de cido actico (vinagre) Produo de etanol Produo de antibiticos Tratamento de resduos Produo de metablitos utilizando clulas animais ou vegetais
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Bioprocessos/Enzimas

Mtodos de Imobilizao de biocatalisadores

Enzimas Imobilizadas

Ligao a suporte *

Entrelaamento

Adsorso fsica

Ligao inica

Ligao covalente

matrizes

microcpsula

* Com ligao cruzada ou no


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Fermentaes

5. PROCESSOS FERMENTATIVOS 5.1 Substrato Uma grande variedade de matrias-primas, geralmente provenientes da agroindstria, so utilizadas como fonte(s) de substrato(s) e outros nutrientes. De uma forma geral, as matrias-primas de bioconverses podem ser agrupadas em funo da estrutura e da complexidade molecular dos substratos. A matria-prima um dos componentes mais relevantes nos custos de produo, havendo casos em que pode representar at 75% do custo total, sendo esta uma das razes pelo crescente interesse no aproveitamento de resduos agroindustriais. A escolha dos nutrientes adequados gerao do produto de interesse est relacionada atividade metablica desenvolvida pelos microrganismos. Nesse ponto, destaca-se a importncia das informaes obtidas sobre as exigncias nutricionais da populao microbiana envolvida no processo. Torna-se necessrio, ento, utilizar fontes adequadas, isto , que possuam os componentes necessrios ao bom desempenho do microrganismo. Assim, preciso fortificar a matria-prima com os componentes que faltam e retirar aqueles que inibem, de modo a permitir uma rpida 35 e eficiente converso do substrato em produto com o rendimento desejado.

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Fermentaes

As condies que permitem a produo mxima de massa molecular no so

necessariamente as mesmas que permitem a mxima produo de um determinado produto. Aspergillus niger , por exemplo , d melhores rendimentos de cido ctrico, quando seu crescimento restringido , por concentraes de semi-inanio de nitrognio, fsforo, porem com alta concentrao de acar. Agrupamento das fontes de substrato em funo da estrutura e da complexidade molecular dos substratos. Substratos solveis que podem ser facilmente extrados produto(s) como por exemplo, sacarose, glicose, frutose e lactose, provenientes de cana-de-acar, beterraba, melao, soro de leite, etc. Substratos insolveis, que precisam de tratamento moderado para solubilizao e hidrlise, antes da converso em produto(s) como por exemplo, amido de milho, mandioca, trigo, cevada, batata, etc. Substratos insolveis muito resistentes, que necessitam de prtratamento fsico, seguido de hidrlise qumica ou enzimtica para produzir substratos na forma monomrica a ser convertidos em produto(s) 36 como, por exemplo, celulose e hemicelulose.

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Fermentaes

5.1.1 Fonte de energia: A adenosina-trifosfato (ATP) o composto mais importante nas transformaes de energia das clulas. As bactrias e as algas fotossintticas podem utilizar a energia da luz para formao de ATP; as bactrias autotrficas podem gerar ATP pela oxidao de compostos inorgnicos; ao passo que as bactrias, leveduras e fungos heterotrficos formam ATP oxidando compostos orgnicos. Nas indstrias de fermentao, a fonte mais comum de energia amido ou melao. 5.1.2 Fonte de carbono: As necessidades de carbono so supridas com a fonte de energia, porm as bactrias autotrficas e fotossintticas utilizam dixido de carbono. A via pela qual os heterotrficos metabolizam carbono de substrato importante para se determinar a quantidade de carbono convertido em material celular. Verifica-se que os organismos facultativos incorporam cerca de 10% do carbono do substrato quando metabolizam anaerobiamente, porm 50 - 55% com metabolismo completamente aerbio. 5.1.3 Fonte de nitrognio: O nitrognio pode ser suprido maioria dos organismos industrialmente importantes por meio de amnia ou de seus sais, embora o crescimento seja mais rpido quando se utiliza nitrognio orgnico. Os compostos orgnicos nitrogenados mais utilizados industrialmente so: farelo de soja, farelo de amendoim, farinhas de peixe ou carne, as borras de cerveja, extrato de levedura, soro de leite. 5.1.4 Fonte de minerais: fsforo e magnsio so constituintes particularmente importantes no meio de cultura, pois so relacionados com todas as reaes de transferncia de energia envolvendo ATP. Tambm so indispensveis para o bom desenvolvimento da cultura, o clcio, 37 potssio, enxofre e sdio, assim como os micronutrientes: ferro, cobalto, cobre e zinco.

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Fermentaes

5.2 Esterilizao de equipamentos e substrato Esterilizao o processo fsico ou qumico que destri ou inativa todas as formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrganismos incluindo bactrias, fungos - tanto em suas formas vegetativas como esporuladas - e viros. O termo esterilizao possui um significado absoluto e no relativo, ou seja, uma substncia ou material no pode ser parcialmente estril. Um material estril totalmente isento de qualquer organismo ativo. Em alguns processos biotecnolgicos industriais, a eliminao parcial da populao microbiana dos equipamentos e meios de crescimento suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde inibidores de crescimento so produzidos (fermentao alcolica, produo de vinagre, cido lctico, antibiticos e outro biocidas), o teor de inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vrios microorganismos. Existem, tambm, bioprocessos em que se prescinde totalmente de assepsia, como o caso dos biotratamentos, nos quais a microbiota nativa, atuando de forma consorciada extremamente desejvel, para que haja reduo da carga orgnica poluidora. Na prtica, considera-se que uma esterilizao foi realizada com sucesso quando estiver 38 garantida a assepsia adequada.

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Fermentaes

A esterilizao pode ser pela destruio ou pela retirada dos microrganismos do meio A destruio feita pela aplicao de calor , produtos qumicos ou radiao . A retirada feita por processo de filtrao . 5.2.1 Calor: De todos os processos empregados para a destruio de microrganismo, o calor , sem dvida, o mais eficiente e econmico. Pode ser empregado de duas maneiras: seco ou mido. Calor seco age promovendo uma oxidao violenta de compostos do protoplasma. Sua eficincia relativamente baixa, pois tem pouca capacidade de penetrao. Nem todo tipo de material pode ser submetido s temperaturas necessrias para esterilizao pelo calor seco (160 a 180 oC) durante um tempo mnimo de uma ou duas horas. Calor mido muito mais eficiente. Age promovendo a destruio de protenas e dissoluo de lipdeos. Tem alta capacidade de penetrao e pode ser utilizado para uma grande variedade de materiais . A forma mais comum de emprego do calor mido consiste na utilizao de vapor de gua superaquecido sob presso. A esterilizao com calor pode ser descontnua (batelada) ou contnua. Nos dois casos, o aquecimento poder ser pela circulao de meio aquecedor como 39 vapor ou pela injeo direta de vapor no meio.

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Na esterilizao em batelada, o tempo total de esterilizao relativamente grande,

podendo dar origem a decomposio de nutrientes termo-sensveis, como vitaminas, ou provocar reaes indesejveis entre os constituintes do meio, como, por exemplo, reaes entre aminocidos e acares redutores (reao de Maillard). Esta modalidade de esterilizao vem sendo substituda, sempre que possvel, pela esterilizao contnua, na qual se preserva mais a integridade dos constituintes do meio, j que o aquecimento e o resfriamento so praticamente instantneos. Obviamente, a esterilizao contnua essencial para sistemas contnuos de fermentao. Esterilizao em batelada , com vapor (descontnua) - Todo contedo do biorreator esterilizado em uma s operao . Pode ser de duas maneiras : - em uma autoclave . Aquecimento da gua contida na autoclave . Injeo de vapor - no prprio biorreator . Circulao de vapor . Injeo direta de vapor

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Esterilizao em batelada , com vapor (descontnua)

120 100
Temperatura

50

Tempo aquecimento esterilizao resfriamento


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Esterilizao contnua com vapor - As vantagens com relao esterilizao

em batelada so : - Ciclos de esterilizao mais curtos; - Melhor utilizao de energia; - Reduo da perda de nutrientes; - Facilidade de conduo do processo; Esse tipo de esterilizao pode ser por injeo direta de vapor ou aquecimento indireto com vapor.

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5.2.2 Esterilizao qumica: um mtodo menos importante que os anteriores. utilizado para a esterilizao de superfcies. Para a esterilizao de equipamentos muito utilizado o xido de etileno. Ele destroe tanto clulas vegetativas, como esporos, mas s efetivo em presena de gua. utilizado em mistura com dixido de carbono ou nitrognio, na forma gasosa (2-50% de concentrao). Dois grupos: - Desinfetantes: so substncias que agem diretamente sobre estruturas microbianas, causando a morte do microrganismo. Agem tanto sobre microrganismos como sobre seres superiores. So portanto, txicos gerais, sem especificidade; - Agentes quimioterpicos: So substncias que interferem em determinadas vias metablicas. So portanto especficos aos microrganismos que possuem a via metablica sensvel. Podem ser sintticos como as sulfas e cloranfenicol ou naturais como os antibiticos. 5.2.3 Esterilizao por irradiao de luz ultravioleta: A radiao UV absorvida por muitas substncias celulares, mas de modo mais significativo por cidos nucleicos, onde geralmente ocorrem as leses. A regio do espectro de UV com ao esterilizaste de 220 a 300 nm, muitas vezes chamada de regio abitica.
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5.3 Esterilizao de ar A produo de grande quantidade de ar estril para bioprocessos aerbicos comum ao processos industriais. Apenas para se ter uma idia da importncia da esterilizao do ar, imagine-se a necessidade de fornecer ar esterilizado para um reator de 100 m3 razo especfica de 0,5/min. ou 0,5 v.v.m. (0,5 volume de ar por volume de meio por minuto). Portanto seria necessrio esterilizar 0,5 m3 ar/min. Admitindo-se uma contaminao do ar ambiental da ordem de 103 partculas/m3, caso no houvesse a esterilizao do ar , introduzir-se-ia no reator 5x104 partculas/min. Sabendo-se que um bioprocesso pode freqentemente ocorrer durante 100 horas, isto significaria introduzir um total de 3x108 partculas contendo microrganismos, ao longo de 100 horas de processo. 5.3.1 Esterilizao por Calor: deve-se utilizar temperaturas elevadas (218 segundos), pois as bactrias e esporos so resistentes ao calor seco;
o

C, em 24

5.3.2 Esterilizao por radiaes: apenas as radiaes ultravioleta encontram aplicao prtica. Em virtude de seu baixo poder de penetrao, h necessidade de tempos de exposio muito longos, dificultando seu uso em larga escala.A energia snica, os raios catdicos de alta energia e os raios gamas podem ser aplicados na esterilizao de ar. Na 44 prtica os custos de investimento inviabilizam o uso corrente.

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5.3.3 Filtrao mecnica: sem dvida a soluo mais adequada para a obteno de elevados volumes de ar esterilizado, em virtude do baixo custo desse processo, alm de se dispor de filtros bastante confiveis. Inicialmente, utilizava-se fibras de algodo, papel, carvo. substitudas pelas fibras de vidro. As fibras de vidro do uma queda mais baixa na presso de ar e so menos sujeitas humidificao e combusto. Atualmente, o material filtrante mais utilizado a membrana polimrica porosa (polietileno e silicone). Para o futuro se prev o emprego de membranas seletivas que alem de esterilizar o ar, proporciona o enriquecimento deste em oxignio. A prtica corrente de esterilizao de ar a combinao de calor com a filtragem mecnica.

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5.4 Agentes de fermentao: microrganismos O meio preparado e esterilizado deve sofrer a ao dos biocatalisadores, pela inoculao de uma suspenso suficientemente concentrada de clulas ativadas ou recicladas ao processo. - Bactrias: As bactrias so onipresentes na natureza, em ambientes aerbios e anaerbios contendo gua. Entre os gneros, as habilidades sintticas variam desde quelas das espcies autotrficas, que requerem apenas compostos inorgnicos para o crescimento, quelas das espcies heterotrficas. Igualmente h uma enorme amplitude de habilidade degradativa. Por causa dessas capacidades diversas, as bactrias tem sido exploradas industrialmente para acumular produtos intermedirios e finais do metabolismo. So uma rica fonte de produo de enzimas. - Vrus: Os vrus so os menores microrganismos. Os vrus parasitos de bactrias so denominados bacterifagos. A cultura de vrus para testar drogas antivirais e para a produo de vacinas um importante empreendimento 46 industrial.

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- Fungos: Os fungos so amplamente espalhados na natureza em ambientes de

umidade mais baixa do que aquela que favorece as bactrias. O metabolismo de fungos essencialmente aerbio. Do ponto de vista morfolgico os fungos so divididos em dois grandes grupos: os bolores e as leveduras. Bolores: caracterizam-se por formarem um miclio que um conjunto de estruturas filamentosas denominadas hifas. Leveduras: so fungos geralmente unicelulares de forma e tamanho muito variados, indo desde elementos esfricos at clulas elpticas, quase filamentosas. Para todos os microrganismos existem trs temperaturas cardeais: temperatura mnima abaixo da qual no h crescimento; temperatura mxima acima da qual no h crescimento; temperatura tima, onde o crescimento mximo. A temperatura tima de crescimento microbiano varia com o tipo de microrganismo . A faixa de crescimento mais comum situa-se entre 25 e 45 C . Termfilas: em torno de Crifilas: em torno de Mesfilas: entre 60 0C 10 0C 20 e 40 0C

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Fontes de microrganismos de interesse

Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos basicamente das seguintes formas: isolamento a partir de recursos naturais; compra em colees de cultura; obteno de mutantes naturais; obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais; obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de engenharia gentica. Caractersticas desejveis de microrganismos Para uma aplicao industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes caractersticas gerais: elevada eficincia na converso do substrato em produto; permitir o acmulo de produto no meio para se ter elevada concentrao do produto no substrato; no produzir substncias incompatveis com o produto; apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico; no ser patognico; no exigir condies de processo muito complexas; no exigir substratos dispendiosos; 48 permitir a rpida liberao do produto para o meio.

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5.4.2 Desenvolvimento dos agentes de bioprocessos e a exigncia de oxignio Muitas clulas vivas necessitam de oxignio para manuteno de seu metabolismo. Nos bioprocessos conduzidos com microrganismos aerbios, (Bioprocessos aerbicos) o oxignio suprido ao biorreator, via de regra, como bolhas de ar, atravs de um compressor, como ser visto mais adiante. Nos bioprocessos anaerbicos, os microrganismos obtm o oxignio metablico atravs de substncias que contm oxignio ligado molecularmente. Nos primeiros, o suprimento adequado de oxignio para atender a demanda da clula imperativo, assim como a manuteno de condies anaerbias estritas no segundo caso. Se essas exigncias no forem atendidas o processo ter seu potencial limitado, podendo haver desvios no metabolismo celular ou mesmo sua interrupo, com a conseqente morte da clula. Fungos algas e algumas bactrias so aerbicos obrigatrios ; Algumas bactrias so anaerbicas estritas ; Leveduras e muitas bactrias podem desenvolver-se em ambas as condies, so aerbicas facultativas.

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5.4.3 Desenvolvimento dos agentes de fermentao e estado fsico do substrato - Substrato lquido superfcie profundidade (submerso) - Substrato slido ou semi-slido. 5.4.3.1 Fermentao em estado lquido: o processo que se desenvolve na presena de grande quantidade de gua. O processo de fermentao conduzido em tanques de fermentao com grande variao no tamanho, tipo de material de construo, abertos ou fechados, etc. O surgimento desse processo permitiu o aumento de escala para muitos produtos limitados pelo processo de fermentao em meio slido. Vrios produtos so obtidos por esse processo: lcool etlico; bebidas alcolicas; antibiticos vitaminas; vacinas; enzimas; insulina e muitos outros. A fermentao lquida apresenta uma srie de vantagens operacionais fermentao em meio slido tais como: - medio e controle de pH, temperatura, oxignio, produto substrato; - separao e purificao do produto; - maior facilidade de se ter um processo contnuo e automatizado. sobre a

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5.4.3.2 Processos de fermentao em meio lquido e na superfcie So aqueles em que a biomassa situa-se na superfcie do meio lquido, em contato direto com o ar atmosfrico, que fornece o oxignio necessrio produo microbiana. A diminuio da concentrao de nutrientes nas camadas superficiais faz com que cheguem superfcie, por difuso, os nutrientes das camadas mais profundas.Tambm, por difuso, o(s) produto(s) do metabolismo se dispersa(m) no meio em fermentao. Portanto, a difuso e a relao entre a rea oferecida e o volume de meio desempenham papel importante em bioprocessos operados em superfcie. O meio de cultivo colocado em recipientes rasos, de modo a oferecer grande rea ao desenvolvimento do agente. Como as taxas de transferncia de massa de nutrientes so lentas, os tempos de fermentao so consideravelmente longos. Os processos em superfcie so de operao difcil e so considerados antieconmicos, devido ao alto custo de produo resultante da manipulao custosa da esterilizao (incluindo ambiente), enchimento, esvaziamento e limpeza das vrias bandejas necessrias a produo em larga escala. Este tipo de processo limita-se, via de regra, aos fungos filamentosos, que tendem a formar pelcula 51 micelial na superfcie do meio.

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5.4.3.3 Processos de fermentao em meio lquido submersos So aqueles em que o microrganismo produtor se desenvolve no interior do meio de fermentao, geralmente agitado. No caso de fermentaes aerbias, o oxignio necessrio populao em desenvolvimento suprido, atravs de um compressor, por borbulhamento de ar. A maioria das fermentaes industriais importantes realizada por processo submerso. Pode-se citar que uma determinante reduo no preo de muitos produtos, anteriormente obtidos por processos em superfcie, foi a possibilidade de adapt-los aos processos submersos. Comparados com os processos em superfcie, os processos submersos oferecem uma srie de vantagens: - pode-se manipular, com maior facilidade, maiores volumes de meio; - a massa de microrganismos responsveis pela transformao fica totalmente submersa no meio nutriente de maneira uniforme, o que pode ser ajustado para fornecer as condies ideais de crescimento e produo; - a absoro de nutrientes e excreo de metablitos so executadas com maior eficincia, levando a menores tempos de fermentao e, 52 consequentemente, melhor produtividade;

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5.4.3.4 Fermentao em estado slido Processo que refere-se a cultura de microrganismos sobre ou no interior de partculas em matriz slida, onde o contedo de lquido ligado a ela est a um nvel de atividade de gua que, assegure o crescimento e metabolismo das clulas e, por outro lado, no exceda a mxima capacidade de ligao da gua com a matriz slida.A fermentao em estado slido, tambm denominada de Fermentao em meio semi-slido, o mais antigo processo fermentativo.
Evoluo da fermentao semi-slida(estado slido) 2.600 a.C. 2.500 a.C. Sculo XVIII 1.900 -1920 1.920 -1940 1.940 -1.950 1.950 -1.960 1.960 -1980 1.990 -....

Produo de po pelos egpcios Produo de koji no Japo Produo de vinagre de polpas Produo de enzimas fngicas Enzimas fngicas, c.ctrico Produo de penicilina Produo de esteris Micotoxinas e alimentos enriquecidos Vrios outro produtos, enzimas, lcool 53

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Fermentao em estado slido remete idia de dois tipos de materiais insolveis em gua, sobre os quais os microrganismos iro crescer: quando o suporte slido atua ele prprio como fonte nutrientes e e no caso em que os nutrientes so solveis em gua e os microrganismos esto aderidos a uma matriz slida, inerte ou no, que ir absorver o meio de cultura lquido. A maioria dos processos utilizam o princpio em que o suporte slido atua tambm como fonte de nutrientes. Os Substratos tradicionalmente utilizados so produtos agrcolas como o arroz, o trigo, o paino, a cevada, o milho e a soja, alm de substratos no convencionais como os resduos agro-industriais e florestais, destacando-se: o bagao de cana-deacar, o sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz. O grande interesse nesses processos decorre do fato dessas matrias-primas no possurem custos de produo associados diretamente, sendo uma forma de se agregar valor a resduos que se formam em abundncia. Em linhas gerais, a operao dos bioprocessos em meios semi-slidos, pode ser realizada sem agitao mecnica, com agitao ocasional ou contnua em reatores dos tipos: bandeja; tambor rotativo; esteira rolante; reator tubular horizontal; tubular 54 vertical; sacos plsticos.

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A fermentao em meio slido apresenta as seguintes vantagens: - Simplicidade dos meios de fermentao. O substrato slido pode requerer somente adio de gua, embora outros nutrientes possam ser adicionados; - Ausncia de requerimentos de mquinas e equipamentos sofisticados; - Demanda reduzida de energia; - Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminao; - As condies de crescimento do microrganismo agente do bioprocesso so similares s encontradas em seu ambiente natural; - Ausncia de formao de espuma; Fatores limitantes: - Menor acessibilidade e disponibilidade de substrato; - Problemas de transferncia de massa (oxignio e nutrientes), calor; - Dificuldades no Controle de variveis fsico-qumicas: pH, temperatura, oxignio; - Dificuldades no aumento de escala.
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5.5 Cintica dos bioprocessos

A cintica de um bioprocesso consiste na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema produtivo, em funo do tempo do bioprocesso. Entende-se como componentes, o microrganismo 9biomassa), os produtos do processo (metablitos) e os nutrientes ou substratos que compe o meio de cultura.

X - Biomassa S - Substrato P - Produto

S P

Tempo

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Curva de crescimento do microrganismo em cultivo descontnuo representado em ordenadas semilogartmica

Fase de transio
Log,nmero de clulas

Fase estacionria Fase exponencial Fase de morte

Fase LAG Tempo [ h ] 57

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Fase LAG ( adaptao ) - As clulas que foram inoculadas se adaptam ao novo meio.
As clulas sintetizam as enzimas necessrias ao metabolismo dos componentes presentes no meio. No h reproduo celular. A durao dessa fase varia com a concentrao do inoculo, com a idade do microrganismo (tempo de pr cultivo) e com o seu estado fisiolgico. Fase exponencial ou logartmica - Caracterizada por uma grande velocidade de crescimento. A produo de biomassa atinge velocidade mxima. Fase de transio - A velocidade de crescimento comea a diminuir por motivos como: a) inibio por produtos da fermentao b) inibio pela alta [ ] de biomassa c) deficincia de oxignio d) inibio por produtos secundrios txicos Fase estacionria - A taxa de crescimento iguala-se taxa de morte de clulas. Fase de morte - Caso o processo seja continuado , observa-se uma fase decrescente na curva de desenvolvimento celular porque a taxa de morte de clulas passa a ser 58 maior do que a de crescimento.

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5.6 Biorreatores Denomina-se biorreatores, reatores bioqumicos, reatores biolgicos, os reatores qumicos nos quais ocorre uma srie de reaes qumicas catalisadas por biocatalisadores que podem ser enzimas, ou clulas vivas ( microbianas, animais ou vegetais). Classificao geral dos biorreatores I. Reatores em fase aquosa (bioprocesso submerso) I.1 Clulas/enzimas livres Reatores agitados mecanicamente Reatores agitados pneumaticamente Coluna de bolhas (bubble column) Reatores air-lift Reatores de fluxo pistonado (plug-flow) I.2 Clulas/enzimas imobilizadas em suporte Reatores com leito fixo Reatores com leito fluidizado Outras concepes I.3 Clulas/enzimas confinadas entre membranas Reatores com membranas planas Reatores de fibra oca (hollow-fiber)

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II. Reatores em fase no-aquosa (bioprocesso semi-slido) Reatores estticos (reatores com bandeja) Reatores com agitao (tambor rotativo) Reatores com leito fixo Reatores com leito fluidizado gs-slido Como se pode verificar, h uma grande variedade de configuraes possveis para os biorreatores, no entanto, os mais amplamente empregados so os reatores agitao mecnica (STR), conhecidos tambm com reatores de mistura, constituindo cerca de 80% do total de reatores utilizados industrialmente. A capacidade dos biorreatores bastante varivel, conforme o processo, podendo-se distinguir trs grandes grupos no que se refere a escala de produo industrial: Reatores da ordem de algumas centenas de litro at 1 a 2 m3 de capacidade so empregados no cultivo de microrganismos patognicos, ou para o crescimento de clulas animais e vegetais, em geral objetivando a produo de produtos ligados rea da sade. Isto particularmente importante para as companhias farmacuticas, pois diferentes substncias podem ser produzidas 60 no mesmo biorreator durante o seu tempo de vida til.

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Uma escala intermediria , na ordem de dezenas de metros cbicos at 100 a 200 m3 , especialmente empregados na produo de enzimas, antibiticos e vitaminas; Para processos que exigem poucos ou at mesmo nenhum cuidado de assepsia, como o caso da fermentao alcolica ou do tratamento biolgico de resduos pode-se atingir reatores com alguns milhares de metros cbicos da capacidade.

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5.6.1 Formas de conduo de bioprocessos Existem infinitas formas de se conduzir um reator biolgico, dependendo das caractersticas prprias do microrganismo, meio de cultivo, e dos objetivos especficos do processo que se pretende executar. Sero abordadas as formas mais gerais , entendendo tal estratgia permitir as particularizaes que se fizerem necessrias: Descontnuo com um inoculo por tanque com recirculao de clulas Semicontnuos sem recirculao de clulas com recirculao de clulas Descontnuo alimentado sem recirculao de clulas com recirculao de clulas Contnuo executado em um reator (com ou sem recirculao de clulas) executado em vrios reatores (com ou sem recirculao de clulas)

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Descontnuo simples O processo descontnuo simples, ou seja, aquele efetuado com um inoculo por tanque, consiste na preparao do substrato adequado ao desenvolvimento do microrganismo; colocar esse substrato em um biorreator ; adicionar o microrganismo responsvel pelo bioprocesso e aguardar que o processo ocorra. Aps o tempo necessrio de processo, retira-se o caldo do biorreator e executa-se as operaes unitrias necessrias para a recuperao e purificao do produto. No nvel de aplicaes prticas, para um bioprocesso razoavelmente evoludo, dificilmente ser conduzido como um reator descontnuo simples, havendo freqentemente alguma elaborao adicional. O descontnuo ser sempre a base para as comparaes de eficincias atingidas nessas elaboraes, mas a sua baixa eficincia estimula o surgimento das formas alternativas. O principal problema desta forma de operar bioprocessos decorrente de fenmenos de inibio pelo substrato, produto, ou outros metablitos. Concentraes elevadas de substrato inibem o agente biolgico. Este efeito est relacionado, em clulas vivas, a fenmenos osmticos que resultam em plasmlise celular. As possveis razes para o fenmeno so a represso na sntese de enzimas e a desidratao dos sistemas enzimticos, devida perda de gua da clula ou inibio63 do transporte de nutrientes para o seu interior.

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fato bem conhecido que a clula viva polui seu ambiente com produtos do seu metabolismo at fazer cessar o crescimento e, eventualmente, perder sua viabilidade, fenmeno conhecido como inibio pelo produto. Descontnuo com recirculao de clula Uma alternativa ao processo batelada simples a recirculao de clulas, ou seja, ao se encerrar a batelada efetua-se a separao das clulas por centrifugao ou mesmo sedimentao no interior do prprio biorreator, enviando apenas o lquido fermentado para a recuperao do produto. Com isso busca evitar o preparo de um novo inoculo para cada batelada, reduzindo custos e reduo de tempo para a obteno de altas concentraes de clula no reator. Esse processo tambm conhecido como batelada repetida. Contnuo No processo contnuo procura-se estabelecer um fluxo contnuo de lquido atravs do reator, ou reatores dispostos em srie. A operao de um sistema contnuo, constitudo por vrios reatores em srie, no qual a alimentao de um dado reator da srie o efluente do reator anterior, visa o estabelecimento de diferentes condies nos vrios biorreatores da srie. 64

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O reator contnuo permite o reciclo de clulas. O lquido bioprocessado, efluente de um dado biorreator, pode ser submetido a um sistema de separao dos microrganismos, os quis podem ser retornados ao volume de reao, sendo lquido enviado para recuperao do produto. Em se tratando de reatores em srie, essa operao pode ser efetuada em qualquer reator da srie, retornando-se o microrganismo para o fermentador mais adequado. Descontnuo alimentado (fed batch) aquele no qual inicialmente se introduz o inoculo, ocupando um uma frao do volume til da ordem de 10 a 20%, iniciando-se ento a alimentao com o meio de cultura, a uma vazo adequada, sem ocorrer a retirada de lquido processado. Essa operao prolonga-se at o preenchimento do volume til do reator, quando ento inicia-se a retirada do caldo processado para a recuperao do produto. Pode-se incluir a essas operaes o reciclo de clulas a fim de se iniciar um novo perodo de alimentao. A alimentao pode ser constante ou intermitente, com vazes constantes ou no. Como tambm, pode-se variar a composio do meio de alimentao. O processo descontnuo alimentado pode ser dividido em dois grupos, baseados no fato de a adio de substrato ser ou no controlada por um mecanismo de retroalimentao.
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No modo de operao com controle por retroalimentao, o fornecimento de substrato pode ser controlado em funo da concentrao deste no meio (controle direto) ou em funo de outros parmetros (controle indireto)tais como densidade ptica, pH, quociente respiratrio, e outros. Semicontnuo O sistema semicontnuo diferencia-se do descontnuo alimentado, pelo fato de se retirar o lquido processado e se proceder o preenchimento do reator a uma vazo muito elevada, de forma a se imaginar que o reator esteja sendo preenchido instantaneamente. Ao final do novo ciclo, procede-se novamente retirada de uma dada frao do volume, 30 a 60% e se preenche o reator instantaneamente. Na verdade, na prtica, para grandes volumes esse preenchimento contnuo no ocorre, recaindo no no reator descontnuo alimentado. De qualquer forma, trata-se de uma tcnica distinta, na qual est embutida a idia a operao por choques de carga de substrato. Alertamos sobre a possibilidade de uso de misturas de conceito (descontnuo, contnuo, descontnuo alimentado), a fim de se conseguir o mximo de desempenho de um dado sistema biolgico, reforando a idia sobre a enorme flexibilidade que dispe para a operao de um biorreator.
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Vantagens e desvantagens do processo contnuo em relao ao processo descontnuo As principais vantagens apresentadas pelo processo contnuo , em relao ao descontnuo, tradicional, so decorrentes da operao em estado estacionrio, podendose destacar: aumento da produtividade do processo, em virtude de uma reduo dos tempos mortos ou no produtivos; obteno de caldo bioprocessado uniforme, o que facilita o projeto das operaes unitrias de recuperao e purificao do produto de interesse (downstream); manuteno das clulas em um mesmo estado fisiolgico; possibilidade de associao com outras operaes contnuas na linha de produo; maior facilidade no emprego de controles avanados; menor necessidade de mo de obra.

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Entretanto, ao lado das inmeras vantagens apontadas, o processo contnuo apresenta tambm algumas desvantagens ou problemas prticos, os quais destacamos: maior investimento fixo na planta; possibilidade de ocorrncia de mutao gentica espontnea, resultando da seleo de mutantes menos produtivos; maior possibilidade de ocorrncia de contaminao, por se tratar de um sistema essencialmente aberto, necessitando de manuteno de condies de assepsia nos sistemas de alimentao e retirada de meio; dificuldade de manuteno de homogeneidade no reator, quando se trabalha com baixas vazes, ou quando o caldo adquire comportamento psedoplstico, como o caso do cultivo de fungos filamentosos; dificuldade de operao em estado estacionrio em determinadas situaes (formao de espuma, crescimento do microrganismo nas paredes de reator, ou ainda nos sistemas de entra e sada de lquido.
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7. PROCESSO DE OBTENO DE AGUARDENTE E LCOOL DE CANA DE ACAR 7.1 Extrao do caldo de cana: A extrao feita por moendas de ternos mltiplos com embebio do bagao para maior extrao do acar que chega a 96% ou mais. Nas unidades pequenas, onde a extrao feita em apenas um nico terno, um bom rendimento est em torno de 75%. 7.2 Preparo do mosto: Mosto todo lquido aucarado apto a fermentar. No seu preparo, a correo compreende todas as operaes tecnolgicas que visam transformar e corrigir a matria-prima em um lquido aucarado de fcil fermentao. Um mosto ideal deve ter as seguintes caractersticas: - concentrao de acares: a quantidade de acar no mosto calculada para se conseguir vinho com 7 a 8 0GL o que corresponde a 14 a 16% de de aucares fermentecveis.Na prtica industrial usa-se o grau Brix. - acidez: Os valores de acidez devem estar entre 2,5 a 3,0g/l. Uma outra medida importante o pH pois a levedura tem atividade tima em pH 4,0 a 4,5. - sais minerais: usa-se enriquecer o mosto de fermentao com 0,2g/l de diamino fosfato (DAP) que fornece o nitrognio e fosfato, indispensvel ao processo fermentativo. 69

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- vitaminas: a levedura alcolica tem a capacidade de sintetizar todas as vitaminas que necessita. Pode-se adicionar vitaminas do complexo B para estimular o processo, atravs da adio de farelo de arroz na proporo de 1g por litro de mosto. 7.3 Processo fermentativo: A fermentao alcolica um processo que resulta na transformao de acares solveis em etanol e gs carbnico, realizado, principalmente, pelas leveduras e descrita de modo geral pela equao: C6H12O6+ 2 ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + Energia (54,05 Kcal/Kg Substrato)

A equao mostra que 1 mol (180 g) de glicose produz 2 moles (92 g) de etanol, 2 moles de CO2 (88 g) e 2 moles de ATP que pode ser utilizados para a sntese de componentes celulares, alm de energia (57 Kcal/mol de glicose). Desta forma o rendimento terico de etanol a partir de glicose de 0,511 gramas de etanol produzido por grama de glicose consumida. De forma geral os rendimentos reais observados atingem somente 90-95% do rendimento terico uma vez que parte da glicose utilizada para sntese de material 70 celular e para reaes de manuteno do microrganismo.

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As leveduras mais utilizadas na fermentao alcolica so Saccharomyces cerevisae (panificao, cervejaria, usina de lcool), Saccharomyces cerevisae var. ellipsoides (vinho) e S. carlsbergensis (cervejaria). A cultura pura de levedura adquirida de laboratrios especializados na forma liofilizada e no momento do uso deve-se proceder a ativao das clulas. Aps a reativao tem-se a cultura na forma de repique em tubos de cultura. O processo de multiplicao das clulas de levedura feito em duas etapas: (1) laboratorial e (2) industrial.

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Fermentaes

Laboratrio

Tubo de cultura

100ml mosto 5 B + sais

500ml mosto 7 B + sais

2,5l mosto 9 B + sais

12,5l mosto 11 B + sais

Vaso A
200 l

Planta industrial

Vaso B Ar
1.000 l

Pr-fermentador

Vapor

Dornas 72 50.000 l

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Descrio do processo de multiplicao das clulas para incio da operao de fermentao 1. Cultura em tubo de cultura, reativada a partir da cultura liofilizada adquirida de laboratrio especializado; 2. Inocula-se a massa de clulas de um tubo de cultura em frasco cnico de 500mL, contendo 100 mL do mosto a 5 0Brix, enriquecido com minerais e esterilizado em autoclave a 121 0C durante 20 minutos. Incuba-se o frasco a 28-30 0C por cerca de 24 horas, sob agitao; 3. Na etapa seguinte, o contedo do frasco transferido para frasco maior de 2L, contendo 500 mL do mosto a 7 0Brix, enriquecido e esterilizado. A incubao por 24 horas a 28-30 0C; 4. Na nova transferncia usa-se um balo de 6l contendo 2,5 L do mosto com 9 0Brix enriquecido e esterilizado. Incubao a 28-30 0C por 24 horas com agitao peridica para evitar a deposio das clulas;
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5. A ltima transferncia de laboratrio feita para uma bombona de 20 a 30L contendo 12,5L de mosto a 11 0Brix enriquecido. A esterilizao feita em autoclave grande. A incubao feita a 28-30 0C por 24 a 48 horas; 6. Admite-se o mosto no vaso A at atingir cerca de metade de seu volume e adiciona-se os minerais. A esterilizao feita por injeo direta de vapor sob presso de 1g/cm por 30 minutos. O resfriamento feito por circulao de gua externa at atingir 30 0C. Inocula-se assepticamente com o fermento proveniente do laboratrio. A incubao feita por 24 horas, arejando-se continuamente com ar esterilizado. A temperatura mantida a 28-30 0C atravs da circulao de gua. Quando a concentrao dos acares se reduzir a metade da inicial, transfere-se todo o contedo para o vaso B; 7. O vaso B prepara da mesma forma que o vaso. A esterilizao feita por injeo de vapor fluente e no sob presso por 1 hora. A transferncia de fermento do vaso A para o vaso B feita por meio de presso de ar exercida naquele vaso. A fermentao conduzida sob aerao e resfriamento;Terminada a fermentao o contedo pode ser transferido para fermentador industrial ou para um prfermentador se necessitar mais uma etapa de multiplicao.
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7.4 Fases da fermentao alcolica: O processo fermentativo inicia logo que a levedura entra em contato com o mosto, e pode ser dividido em trs fases: Fermentao preliminar Compreende o perodo entre a adio do mosto no p-de-cuba e o incio do desprendimento de gs carbnico. H uma intensa atividade das leveduras para formao de novas clulas. Como conseqncia h um considervel consumo de acar, com pouca ou quase nem uma produo de lcool. Cerca de 1,5 a 2,0 g de sacarose so consumidos para cada grama de massa seca de levedura produzida. O processo conduzido a temperatura de 30 0C sob aerao por um perodo de cerca de 4 a 6 horas. Esse perodo pode ser abreviado pelo uso de elevada concentrao de levedura no p-de-cuba ou pelo uso de processo contnuo com recirculao de clulas. Fermentao principal Inicia-se com o desprendimento intenso de gs carbnico e formao rpida de lcool. H tambm grande desprendimento de calor e responsvel pela maior parte do lcool produzido. Com o desprendimento do gs carbnico h formao de espuma necessitando a adio de anti-espumante. Paralelamente ao desprendimento de gs carbnico h reduo da densidade do mosto e elevao de 75 acidez por causa de alguns sub-produtos formados.

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O desprendimento intenso de gs carbnico, na presena de substncias gomosas, bagacilhos e outros componente, aumenta a reteno de gs, fazendo o volume aparente do lquido aumentar de 50 a 60%. Isso provoca o transbordamento das dornas, reduzindo a produtividade e o rendimento do processo. A atividade bioqumica intensa nessa fase causa um desprendimento intenso de calor que deve ser removido. Nas dornas pequenas, at 30.000 L essa remoo feita pela troca de calor atravs da parede pelo escoamento externo de gua resfriada (dornas de ferro ou ao). Em dornas maiores ou dornas de madeira ou alvenaria h a necessidade do uso de serpentinas internas ou acoplamento de trocador de calor tubular ou placas para resfriamento do mosto. O final da fermentao principal caracterizado pela reduo do desprendimento de gs carbnico, abaixamento da formao de calor, e diminuio na movimentao superficial do mosto. O perodo dessa fase da fermentao de 12 a 16 horas. Fermentao complementar ou ps-fermentao Essa fase inicia-se com a diminuio rpida da atividade fermentativa observada pela reduo do gs carbnico desprendido; diminuio no movimento superficial; desaparecimento da espuma; reduo da temperatura; aumento da acidez; formao 76 de lcoois superiores.

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Essa fase termina com a parada completa de desprendimento de gs carbnico, devendo ser a mais curta possvel para se evitar contaminao do vinho por bactrias. Toda vez que duas ou trs leituras consecutivas de Brix do vinho a cada duas horas apresentarem resultados iguais, o vinho deve ser enviado para destilao.

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7.5

Processos alternativos para produo de etanol via fermentativa

A fermentao alcolica pode ser conduzida atravs de trs processos distintos: batelada, batelada alimentada e contnuo. As destilarias mais recentes utilizam o processo contnuo. Vantagens e inconvenientes dos processos contnuos e descontnuos de fermentao alcolica; Processo Descontnuo (batelada e batelada alimentada) Vantagens - maior controle sobre contaminao - maior produtividade - tempos de residncia reduzidos - maior adaptabilidade ao controle automtico - inibio pela concentrao de acar e etanol - tempo de residncia longo - baixa produtividade - contaminao e mutao - menor flexibilidade 78 Processo Contnuo

Inconvenientes

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7.6 Destilao do vinho Os componentes lquidos so representados por gua e lcool. O lcool representa de 5 a 10% em volume, dependendo da natureza do mosto. Esto ainda presentes os cidos actico, succnico e lctico, lcoois superiores como amlico, isoamlico, proplico, isoproplico, butlico, isobutlico e glicerol, furfural, aldeidos e steres. Os componentes slidos podem estar em suspenso ou em soluo. A qualidade da aguardente determinada principalmente pela qualidade e quantidade das impurezas formadas pelos aldedos, cidos, steres, lcoois superiores. A qualidade final depende da qualidade do vinho e do equipamento e processo de destilao. Os componentes volteis possuem diferentes graus de volatilidade, sendo possvel a separao por processo de destilao. Os componentes mais volteis so recolhidos na primeira frao do condensado denominada de cabea e os menos volteis nas fraes finais cauda. A poro intermediria denominada corao. Essas trs pores constituem o flegma. Flegma de baixo teor alcolico entre 55 e65 GL. Flegma de alto grau entre 90 e 95 GL. A vinhaa ou vinhoto ou restilo, constitui a frao no voltil.

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Na prtica h dois processos de destilao: o simples ou intermitente e o sistemtico ou contnuo. Destilao simples Conduzida no equipamento conhecido como alambique. de construo simples e utilizado normalmente por pequenos produtores. Se o projeto obedece as condies essenciais e a operao executada de forma adequada o produto pode ser de boa qualidade. Os alambiques podem ser de corpo simples ou de trs corpos. O alambique simples no permite um bom esgotamento do vinho e em condies normais de operao pode produzir aguardente rica em compostos secundrios. A qualidade da aguardente pode ser melhorada separando-se as fraes de cabea e cauda, mas pode ser antieconmico. O ciclo desse aparelho longo havendo maior consumo de combustvel e gua. O produto obtido em alambique de trs corpos de qualidade superior. mais econmico com consumo menor de gua de resfriamento e menor consumo de 80 energia.

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Destilao contnua o processo utilizado em destilarias de mdio e grande porte. O equipamento utilizado bastante flexvel podendo-se obter produtos de variado grau alcolico. A coluna de destilao empregada nesse processo. A coluna de destilao consiste de uma srie de caldeiras de destilao superpostas denominadas de pratos ou bandejas. Os pratos, geralmente circulares, so sobrepostos formando um cilindro vertical denominado tronco de destilao. A coluna usada na fabricao de aguardente de baixo grau, possui de 15 a 20 pratos e produz flegma de 35 a 65 GL.

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8. PROCESSO PARA PRODUO DE ANTIBITICO POR FERMENTAO 8.1 Procura e isolamento de microrganismos produtores de antibiticos Ao se procurar isolar um microrganismo para fins industriais, deve-se ter em mente as caractersticas que dever apresentar, quais sejam: - crescimento rpido em substrato econmico; - produo das substncias desejadas em quantidades e condies econmicas; - conservao das caractersticas biosintticas sem grandes riscos de variao; - baixa produo de substncias que interfiram com a extrao do antibitico; - ausncia de patogenicidade, etc. cada vez mais difcil encontrar microrganismos capazes de produzir antibiticos novos. De 10.000 amostras de actinomicetos isolados de amostras de terra diferentes, isolam-se 2.500 tipos capazes de produzir antibitico. Destes, apenas 10 fornecem novos antibiticos. E, desses, apenas 1 mostra por suas propriedades, ter utilidade clnica. 8.2 Conservao da cepa produtora Congelamento e liofilizao so as duas tcnicas usadas preferencialmente na conservao de 85 estoques industriais.

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8.3 Processo industrial de produo de penicilina O primeiro antibitico produzido industrialmente foi a penicilina. De incio, sua produo era feita em superfcie, sendo o meio de cultura esterilizado em camadas delgadas em frascos, garrafas ou bandejas. Ao meio esterilizado inoculava-se uma suspenso de esporos de Penicillium. Os meios inoculados eram incubados a 24 - 28 0C, sem agitao. As desvantagens do mtodo eram: - deficincia na penetrao de oxignio no meio; - parte area do miclio tinha pouco acesso aos nutrientes; - problemas de contaminao constantes; - dificuldades de extrao do antibitico do meio. Selecionando-se amostras de Penicillium, reformulando-se o meio de fermentao, e adaptandose o microrganismo para o desenvolvimento em profundidade em caldo aerado, possvel produzir o antibitico em larga escala economicamente. 8.3.1 controles operacionais: A produo de espuma reduz a capacidade til do equipamento, dificulta as trocas gasosas entre o meio de fermentao e o ar e pode causar, por efeito de flotao, exausto de alguns dos componentes do meio de fermentao. No caso de antibiticos produzidos por meio de 86 bactrias, poderia ocasionar concentrao de clulas na espuma.

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Controle fisiolgico No caso de produo de penicilina o pH deve ser mantido em limites estreitos. Por isso,o meio de produo contm Ca, Mg e fosfato como tampo; alm disso, cido sulfurico e hidrxido de sdio devem ser adicionados durante a fermentao para se manter o pH prximo a neutralidade. Alm do pH, controla-se as quantidades de acares e de nitrognio, afim de se manterem condies que favoream as atividades metablicas desejveis do microrganismo. Caldos fermentados contendo fungos e actomicetos apresentam caractersticas no-newtonianas de fluxo. Comportam-se normalmente como pseudoplsticos. A medida que o caldo apresenta caractersticas no-newtonianas, torna-se difcil dispersar homogeneamente nutrientes no meio e fornecer oxignio s clulas. O aumento da viscosidade do caldo, no decorrer da fermentao, acarreta diminuio da disponibilidade de oxignio. Uma diluio apropriada do meio causa diminuio da viscosidade sem prejudicar a capacidade de produo. Meios de cultura Bons rendimentos de antibitico ocorrem quando quantidades relativamente grandes de C e de N so fornecidas para as atividades metablicas do microrganismo. 87

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O meio de cultura , alm de fornecer nutrientes, em condies adequadas para o desenvolvimento do microrganismo e formao do antibitico, deve: - ter capacidade de tamponamento; - permitir o mnimo de formao de espuma; - dificultar o crescimento de contaminantes; - contribuir para a estabilidade gentica do agente de fermentao; - permitir aerao e agitao vigorosa; - permitir fcil recuperao do produto; - ser passvel de esterilizao; - conter precursores necessrios formao do antibitico; - ser economicamente exeqvel. As fontes de energia e carbono mais utilizadas so o melao, o acar e o amido de milho e leos vegetais, particularmente os de milho, girassol e soja. A gua de milho, subproduto da fabricao de amido de milho, a fonte de nitrognio muito utilizada em indstrias de fermentao, por exemplo na produo de penicilina. Alm de nitrognio, a gua de milho fornece cido lctico, glicose, aminocidos e vitaminas. Tambm se utiliza industrialmente como fonte de N, o levedo de cerveja, que alm de fornecer N orgnico fonte de vitaminas e fatores de crescimento, a torta de amendoim, a farinha de peixe, extratos de carne, casena, etc. 88

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8.3.2 Extrao de antibiticos aps a fermentao Retirada de slidos

Caldo fermentado

Miclios Clulas Resduos slidos

Fracionamento ou Extrao

Recuperao de solvente

Concentrao Antibitico bruto

Purificao do Antibitico

A extrao de antibitico dificultada pela baixa concentrao de produto (1 a 2%), sensibilidade ao pH, temperatura, e a presena de diferentes materiais dissolvidos ou em suspenso no caldo fermentado. 89

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- Retirada dos slidos no caldo fermentado A primeira dificuldade na retirada de slidos de um caldo fermentado deve-se presena de partculas em suspenso coloidal. Essa dificuldade pode ser superada: a) variando-se o pH. b) adicionando-se agentes floculantes. c) usando-se colides de carga contrria. d) usando-se enzimas clarificantes. e) controlando-se as condies de fermentao. - Processos de extrao Na extrao de antibiticos, os processos mais empregados so: a precipitao, a extrao com solventes e a adsorso por meio de resinas de troca inica A precipitao pode ser usada para recuperao de vrios antibiticos ou ainda na concentrao e purificao dos mesmos. No caso de tetraciclinas, pode-se fazer a precipitao com gua de cal e separar o produto por filtrao ou centrifugao.

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A extrao por solventes feita, pelo menos, em duas etapas: mistura do solvente com o caldo, e separao das fases aquosa e orgnica. A mistura deve ser feita em alta turbulncia, permitindo o maior contato possvel entre o caldo e o solvente. O tempo de contato deve ser suficiente para permitir o estabelecimento de equilbrio na partio do antibitico entre o caldo e o solvente. O pH e a temperatura devem ser ajustados de modo a favorecerem a transferncia do antibitico da fase aquosa para o solvente. As duas fases, aquosa e orgnica, so normalmente separadas por centrifugao. - Concentrao e Purificao de antibiticos Depois que o antibitico extrado do caldo, pode ser ressolubilizado . submetido ento a uma cristalizao (controlando-se pH e temperatura), precipitao ou reextrao com um solvente aquoso, como se faz com a penicilina. Na purificao da penicilina por exemplo, pode-se depois de filtrado o caldo, resfri-lo e acertar o pH a 2,2 +/- 0,2, com cido sulfrico ou fosfrico. Faz-se a extrao com hidrocarbonetos. Elevase o pH a 6,7 +/- 0,2 e reextrai com tampo aquoso. O processo repetido, de modo a se obter uma purificao do antibitico, que submetido, finalmente a um processo de cristalizao ou liofilizao. A concentrao e purificao de antibiticos pode ser ainda por: Resinas lquidas; Membranas. 91

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9. PROCESSO BIOTECNOLGICO DE OBTENO DE VITAMINAS: CIDO ASCRBICO Trata-se da vitamina que se obtm em maior quantidade biotecnologicamente. O processo completo inclui uma sntese mista qumica-biotecnolgica: 1. D-glicose se transforma por reduo cataltica em D-sorbitol; 2. Em processo fermentativo com Acetobacter suboxidan o C2 do sorbitol oxidado originando L-sorbosa com rendimento quase estequiomtrico; 3. Por tratamento com hidrxido sdico obtem-se o sal de sdio na forma enlica do cido 2-oxo-L-glucnico, que se transforma por acidificao diretamente em cido Lascrbico. A transformao biotecnolgica de D-sorbitol em L-sorbosa ocorre em tanques de fermentao com cultivo de Acetobacter suboxidans. Condies do processo fermentativo: Substrato Soluo de D-sorbitol a 20% e 0,5% de extrato de levedura ou 0,3% de extrato de gros de milho. 92

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Inoculo O inoculo Acetobacter suboxidan representa 3% do substrato. Fermentao A fermentao transcorre a 30-35 0C com aerao e agitao termina aps 2 a 3 dias. vigorosas e

O processo ento interrompido elevando-se a temperatura a 50 0C. Separao purificao e concentrao A soluo contendo L-sorbosa separada das clulas mediante sucessivas filtraes. A descolorao do filtrado se processa em filtros de carvo ativo e a concentrao feita lentamente at que ocorra a cristalizao. Assim procedendo se consegue cristais de L-sorbosa muito puros que aps transformao qumica se obtm o cido L-ascrbico.
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9.1. PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA OBTENO DE COBALAMINA (Vit. B12) Em um tanque de mistura os componentes do substrato so misturados com gua, esterilizado e resfriado. O substrato esterilizado adicionado asceticamente ao fermentador que est esterilizado e aerado em maior ou menor grau dependendo da espcie de bactria a ser utilizada. Se inocula e incuba a temperatura de 18 a 21 0C. A durao do processo de fermentao depende do microrganismo. As bactrias do cido propinico fermentam primeiramente 3 dias anaerobicamente, depois 3-4 dias aerobicamente e assim se obtm rendimento de 19 a 23 mg/L. As fermentaes com Bacillus megaterium, Pseudomonas denitrificans e Streptomices olivaceus duram 6 horas, 2, 3 e 4 dias respectivamente com uma produo de 15 mg/L Ao final da fermentao o caldo de cultivo pode ser empregado para a obteno de concentrado ou cristais de vitamina B12 O concentrado obtido por evaporao. Para a obteno de preparados puros se acidifica o caldo de cultivo com H2SO4 e Na2 SO3 a um pH 5,0 para estabilizar a cobalamina e separ-la das clulas. Depois a soluo filtrada e se purifica a soluo com carvo ativo. O passo seguinte consiste na concentrao por evaporao seguido da adio de solventes orgnicos, cristalizao e purificao. 94

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10. PROCESSO BIOTECNOLGICO PARA OBTENO DE POLISSACARDEOS: DEXTRANA As dextranas que se utiliza como substitutos do plasma tem que ter um peso molecular mdio de 40.000 a 80.000. Uma soluo 6% de dextrano com esse peso molecular, tem a viscosidade e presso osmtica muito prximas ao plasma sangneo. Na maioria das vezes os dextranos se formam com peso molecular elevado. Com o cultivo bacteriano ou solues enzimticas obtem-se dextranos de elevado peso molecular e a partir destes por hidrlise o peso molecular desejado. O melhor estabelecer as condies de processo de modo a se obter dextranos de peso molecular na faixa desejada. Os substratos preparados com sais inorgnicos, 2% de extrato de milho, 10% de sacarose e pH de 6,5 a 7,0 filtrado, esterilizado, resfriado, adicionado ao fermentador sob agitao e inoculado com Leuconostoc ou Xanthomonas. Aps 2-4 dias a 25 0C o processo est concludo com a formao de uma massa gelatinosa com o pH baixando para 4,0 devido formao de cido lctico. O contedo do fermentador ento bombeado tanques de precipitao e resfriado a 1,0 0C. Os dextranos se precipitam pela adio de metanol que se recupera por destilao apartir da soluo resultante. A frao precipitada de elevado peso molecular hidrolisada com cido clordrico a 100 0C, controlando se a viscosidade e se resfria gradativamente at se obter as cadeias de PM desejada, e se neutraliza com NaOH. 95