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CARACTERIZAO DA BIOMASSA ISOLADA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS DE PRODUO DE ETANOL PARA USO COMO BIOCOMBUSTVEIS

*CLAUDIA. STECKELBERG, MARIA DA GRAA STUPIELLO. ANDRIETTA, SLVIO ROBERTO ANDRIETTA Universidade Estadual de Campinas CPQBA Diviso de Biotecnologia e Processos Caixa Postal 6171 CEP: 13082-970 Campinas/SP l:claudia@cpqba.unicamp.br

Resumo
Este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar linhagens de leveduras isoladas de diferentes processos de fermentao alcolica para produo de biocombustvel. O atributo estudado foi caracterstica fermentativa das linhagens. As leveduras isoladas foram ainda identificadas, utilizando metodologia de taxonomia numrica (GRIFFITHS, 1981). Os resultados mostraram que em relao s caractersticas fermentativas embora as cepas embora apresentem algumas diversidades de comportamento todos os isolados foram considerados apropriados para a produo de etanol. Todas as linhagens isoladas pertenc em ao gnero Saccharomyces. Dentro desse gnero foram encontradas representantes das seguintes espcies: chevalieri, coreanus cerevisiae. Se for considerada a classificao segundo BARNET (1992) todas as leveduras so representantes de S. cerevisae.

Abstract
This study has had the purpose of enhancing the knowledge on the dominant strains of ethanol fermentation process biomass to use as biofuel. The attributes studied were: numerical taxonomy (GRIFFITS, 1981) and fermentative performance. The results have showed that all strains have presented good fermentative characteristics. All strains have been classified as Saccharomyces. In this genus were found the follow species: chevalieri, coreanus cerevisiae. If the classification according BARNET (1992) is considered, all of them are representative of S. cerevisae.

Introduo
O Brasil possui uma frota expressiva de automveis movidos a lcool. Em 2003 o Brasil lanou o automvel flexfuel (opera com dois diferentes combustveis, o etanol e a gasolina). Em 2004 esse tipo de automvel representou 21,6 do total de carros vendidos. Para 2005 sero responsveis por 61,7% dos carros vendidos (ROSA, 2005). Com esse novo panorama as unidades do setor sucroalcooleiro privilegiam a produo de etanol e desapertam o interesse da comunidade cientfica no entendimento da microbiologia das dornas de fermentao. O acompanhamento da dinmica populacional das cepas de levedura em processos de fermentao alcolica pode fornecer informaes valiosas sobre o processo e conseqentemente sua otimizao. As informaes obtidas podem ser utilizadas na seleo de leveduras nativas com alto potencial fermentativo e na adequao dos processos s suas necessidades atravs da elaborao e melhoramento de projetos e tambm da correo de condutas operacionais inadequadas (STROPPA et al., 2000). As ferramentas utilizadas para a identificao de leveduras incluem desde as taxonomias clssicas (LODDER, 1970) e numricas (GRIFFITHS, 1981) at as anlises sofisticadas de cariotipagem (CARLE & OLSON, 1984; SCHWARTZ & CANTOR, 1984; CHU et al., 1986). Embora toda essas tcnicas tenham reconhecido valor como instrumento de estudo no fornecem informaes sobre o desempenho fermentativa da levedura. Segundo ANDRIETTA et al. (1999), o conhecimento da cintica essencial para o entendimento da dinmica de populao de leveduras nas dornas de fermentao.

Em uma unidade pode ocorrer queda no rendimento durante o processo, sem que o motivo seja conhecido. A deteco de leveduras ao longo do processo e a sua caracterizao fermentativa ser importante neste caso, pois fornecer subsdios para verificar se a diminuio do rendimento devido contaminao ou falhas de operao, ou m qualidade da matria-prima (RODRIGUES & ANDRIETTA, 1995). ANDRIETTA et al. (1995), propuseram uma diferenciao entre leveduras baseada em seu potencial fermentativo. Esta tcnica foi utilizada no desenvolvimento de um sistema de classificao, designado capacidade fermentativa (ANDRIETTA et al., 1999), que separa as leveduras em diferentes grupos de acordo com a associao de seis parmetros de produo especfica e caractersticas cinticas. Esse trabalho se prope a isolar e caracterizar, quanto s caractersticas fermentativas e descritas por ANDRIETTA et al, 1995 e identificao utilizando metodologia descrita por GRIFFITS, 1981, leveduras isoladas de processos de fermentao alcolica com caractersticas peculiares quando ao tipo de processo.

Material e mtodos
Isolamento das linhagens de leveduras: As linhagens de leveduras foram isoladas durante os anos de 1994 a 1998 de ambientes de dorna de fermentao das seguintes unidades produtoras de etanol brasileiras : Usina Alvorada Acar e lcool Ltda (MG); Unialco S.A. lcool e Acar (SP); Irmos Franceschi Ltda (SP); Diana Destilaria de lcool Nova A vanhandava (SP); Jalles Machado S.A. Acar e lcool (GO); Fundao Sinh Junqueira (SP); Goiasa (GO); Cia. Aucareira Vale do Rosrio (SP); Acareira Corona S.A. (SP); Usina Costa Pinto S.A. (SP); Acar Guarani (SP); Destilaria Andrade S.A. (SP); Destilaria de lcool Califrnia (Dacal) (SP); Dacalda Acar e lcool Ltda. (P R); Alcoeste Destilaria Fernandpolis S.A. (SP); Cooperativa Agropecuria Rolndia ltda. (P R); Mauri produo de fermento; Usina Barra Grande de Lenis (SP ); Usina S anta Cruz (RJ) e Clealco Acar e lcool (SP). Foram avaliados esses parmetros para duas leveduras comerciais (Y904 e Y167). O isolamento foi realizado utilizando tcnica de espalhamento em superfcie em WL nutrient medium o o (Difco 0424-17-9). As placas foram incubadas por r 7 dias a 32 C. by 7 days at 32 C As culturas o foram mantidas a 4 c em PDA (Difco 0549-17-9) coberto com leo mineral esteril. Essas leveduras fazem parte da coleo de cultura da Diviso de Biotecnologia e processos do CPQBA/UNICAMP. Obteno dos parmetros cinticos: Os parmetros cinticos obtidos para cada cepa foram: Yx/s = g massa celular produzida (massa seca)/g acar; VCS = g acar consumido/Lxh; NCO = % nvel de -1 converso de substrato; mx = velocidade especfica mxima de crescimento (h ); = g etanol produzido/Lxh; Yp/s = g etanol produzido/ g acar. Os parmetros foram obtidos a partir de fermentao conduzidos em frascos agitados (Erlenmeyers de 250 ml com 100 ml de meio de cultivo estril) a 32C, 150 rpm e 24 horas. O meio de cultivo utilizado foi composto de (g/l): 150g de glicose; 5g de KH2PO4; 5g de NH4 Cl; MgSO4.7H2O; 1g de KCl e 6g de extrato de levedura. Metodologia analtica: A analise de acar foi feito utilizando mtodo enzimtico da glicose oxidase (STECKELBERG, 2001), o etanol foi obtido mtodo colorimtrico (SALIK & POVH, 1993). A massa celular foi obtida por diferena de peso (RODRIGUES & ANDRIETTA, 1995) e o max atravs de crescimento celular medido por absorbncia (RODRIGUES & ANDRIETTA, 1995) . Taxonomia numrica: Segundo descrito por GRIFFITHS, 1981.

Resultado e Discusso
A Tabela apresenta os resultados para as 21 cepas de leveduras estudadas.

Tabela 1 Resultados obtidos para todas as leveduras isoladas quanto a: Yx/s = g massa celular produzida (massa seca)/g acar; VCS = g acar consumido/Lxh; NCO = % nvel de converso de -1 substrato; mx = velocidade especfica mxima de crescimento (h ); = g etanol produzido/Lxh; Yp/s = g etanol produzido/ g acar USINA Yx/s VCS NCO Yp/s Identificao max Alvorada Unialco Diamante Diana Jalles Machado Junqueira Goiasa Vale Rosrio Bonfim Costa Pinto Guarani Andrade Dacal Dacalda Alcoeste Corol Y-904 Y-167 Barra Grande Santa Cruz Clealco n.d. no identificado 0,0436 0,0401 0,0490 0,0409 0,0474 0,0401 0,0463 0,0391 0,0452 0,0469 0,0342 0,0404 0,0368 0,0489 0,0424 0,0466 0,0423 0,0414 0,0399 0,0450 0,0440 5,8128 5,4880 5,8885 6,5118 5,8823 5,8808 5,5473 5,5216 5,6389 5,5467 5,1921 5,5444 5,5467 5,5467 5,5615 6,5118 6,5118 6,1035 5,6500 6,5118 5,8000 98,31 96,58 99,59 99,64 99,48 99,46 99,64 99,17 99,24 99,63 93,26 99,59 99,63 99,63 97,88 99,64 99,64 93,39 99,58 99,64 99,50 0,5136 0,4867 0,3756 0,4172 0,4129 0,3809 0,4578 0,3537 0,5439 0,4994 0,5695 0,5694 0,6045 0,5985 0,5857 0,5640 0,5769 0,5658 0,5767 0,4316 0,5000 2,6487 2,3798 2,6528 2,8080 2,6102 2,6558 2,4686 2,3267 2,5122 2,3839 2,2160 2,4629 2,4898 2,5167 2,3967 2,8419 2,8413 2,6450 2,4332 2,8420 2,5000 0,4712 0,4512 0,4617 0,4502 0,4589 0,4719 0,4607 0,4399 0,4610 0,4466 0,4472 0,4608 0,4660 0,4721 0,4458 0,4563 0,4531 0,4574 0,4421 0,4563 0,4600 S. cerevisae S.coreanus S. cerevisae S.chevalieri S.coreanus S. cerevisae S.coreanus S. cerevisae S.chevalieri S. cerevisae S.chevalieri S.chevalieri S. cerevisae n.d. S.chevalieri S.coreanus S.chevalieri S.chevalieri n.d. S.chevalieri S.coreanus

Os valores apresentados na Tabela 1 confirmam uma expectativa no que diz respeito populao de leveduras presentes nas dornas de fermentao de unidades industriais. Embora com variaes previsveis, todas as leveduras apresentaram caracterstica fermentativas adequadas ao processo industrial. No que se refere identificao, os resultados tambm esto dentro do esperado para leveduras de ambientes de fermentao alcolica. C om exceo de duas delas (Dacalda e Barra Grande), as quais no foram identificadas, todas as leveduras isoladas so pertencentes ao gnero Saccharomyces. BARNET (1992) agrupou algumas das espcies pertencentes ao gnero Saccharomyces na espcie cerevisae. Esse gnero passou a contemplar apenas 10 espcies. Em funo disso as espcies coreanus chevalieri a partir de 1992 passam a fazer parte da espcie cerevisae . Partindo dessa nova classificao pode-se afirmar que todas as leveduras identificadas so denominadas Saccharomyces cerevisae. Avaliando a metodologia utilizada para descrever as caractersticas fermentativas possvel afirmar que embora as leveduras sejam classificadas como Saccharomyces cerevisae elas devem pertencer a diferentes strains. Os parmetros cinticos apresentados na Tabela 1 quando analisados de forma criteriosa so divididos em trs blocos. O primeiro construdo a partir dos valores de rendimento de biomassa (Y X/S) e em etanol (Y P/S), o segundo a velocidade de fermentao (NCO, VCS e ) e o terceiro com a velocidade de crescimento celular (max). Uma anlise em conjunto destes parmetros necessria para agrupar as leveduras que j em uma primeira analise apresentam as caractersticas fermentativas adequada para uso industrial. O principal parmetro a ser observado para que uma linhagem seja considerada adequada aplicao industrial o rendimento em etanol (Y P/S). Pelos resultados mostrados observa-se que as linhagens estudas apresentaram valores para este parmetro que variaram entre 0,4399 a 0,4712, enquanto os valores desejados so aqueles superiores a 0,46. Sendo assim, algumas linhagens estudadas, tais como as isoladas da Usina Barra Grande, Usina Guarani, Vale do Rosrio e outras, as quais apresentaram valores bem abaixo daquele de referncia. Destas trs linhagens a isolada da Usina Guarani apresenta valores de parmetros vinculados a velocidade de fermentao abaixo dos obtidos pelas outras cepas (NCO, VCS e ). J a isolada na Usina Vale d Rosrio apresenta o parmetro vinculado ao crescimento o microbiano abaixo daquele apresentado pelas outras linhagens. Das linhagens estudadas, as que merecem destaque so as isoladas da Dacalda, Dacal e Bonfim, por apresentarem valores dos trs grupos de parmetros satisfatrios, sendo estas linhagens classificada pela taxonomia numrica como sendo no identificada, S. cerevisae e S.chevalieri,

respectivamente. interessante ser observado que a linhagem de apresentou o melhor desempenho (Dacal) e desempenho mais inadequada (Vale do Rosrio) foram classificadas como pertencetentes a espcie cerevisae. O mesmo ocorre com as linhagens isoladas da Usina Guarani e Bonfim, uma vez que as duas linhagens foram classificadas como exemplares pertencentes a espcie chevalieri e apresentaram desempenhos antagnicos no que diz respeito a caracterstica fermentativa. Essas afirmaes reforam a hiptese expostas anteriormente que postula que todas as leveduras so exemplares de S. cerevisae , s que pertencentes a diferentes strains

Palavras chaves
Etanol, biomassa, levedura, fermentao alcolica, taxonomia numrica

Bibliografia
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