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ESTIMACIN DE LA DENSIDAD POBLACIONAL La determinacin de la densidad poblacional de un medio lquido puede realizarse aplicando mtodos directos e indirectos. Las tcnicas directas utilizan mtodos de recuento de clulas totales al microscopio, tanto vivas como muertas. Estas tcnicas permiten estimar el nmero de clulas viables mediante la asociacin con una tcnica de tincin vital. Por su parte, los mtodos indirectos requieren de una siembra en placas, con su correspondiente periodo de incubacin para permitir el crecimiento de colonias. Recuento directo por microscopa Cuando la prontitud en la obtencin de los resultados resulta crucial, por ejemplo en muestras de una lnea de embotellado o para realizar el seguimiento de un proceso de fermentacin, las tcnicas de plaqueo resultan inadecuadas debido a la demora con que entregan sus resultados. En el caso de la mayora de las levaduras se necesitan 72 horas de incubacin, pero en el caso de levaduras de lento crecimiento (Brettanomyces), se debe esperar una semana y ms. Para satisfacer el requisito anterior se hace necesario utilizar tcnicas de recuento que entreguen resultados de forma inmediata y para este propsito, el examen microscpico directo se muestra como insustituible. Sin embargo, esta tcnica est limitada por los valores de densidad poblacional con que se debe trabajar. El bajo volumen de muestra que se utiliza en estos procedimientos de recuento, crea una dilucin inicial de 10.000 veces, por ello si se trabaja con una poblacin de 100.000 cel/mL slo se tiene la probabilidad de encontrar 10 clulas en las 400 cuadrculas que componen la cmara de recuento y por ello en muchas de ellas no se presentar ninguna clula. Lo anterior determina que estas tcnicas sean adecuadas para el seguimiento de procesos fermentativos. Adicionalmente la discriminacin entre clulas viables y muertas presenta problemas y dificultades de interpretacin. Principio. La tcnica se basa en la determinacin de los microorganismos presentes en un volumen conocido de medio lquido, los dispositivos para medir este volumen son los hemacitmetros o cmaras cuenta clulas. Estas cmaras poseen una superficie determinada y delimitada por un cuadriculado, que recubierto por una lamina gruesa y plana retiene un volumen perfectamente conocido.

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Existen diversos cuenta clulas pero el de mayor difusin en el campo enolgico es el de Neubauer. Este cuenta clulas est estructurado de una cavidad central de 0,1 mm de profundidad y de una superficie de 1 mm2. Trabajo prctico La reproducibilidad de la muestra es un factor fundamental para poder conseguir que el valor de recuento obtenido, reproduzca las condiciones poblacionales del conjunto del producto que se desea caracterizar. Para conseguir una reproducibilidad adecuada, la muestra se deber colectar de una zona representativa del total del volumen o mejor an, colectar submuestras de distintas zonas de la vasija y formar con ellas una muestra compuesta. Antes de realizar el recuento la muestra debe ser profusamente agitada de manera de garantizar su total homogeneidad. Depositar una gota de muestra homognea en el centro de la cmara, evitando los desbordamientos. Recubrir la cmara con un cubreobjeto grueso evitando las burbujas de aire, dejar reposar unos minutos para permitir que cese el movimiento que hace difcil el recuento. La concentracin debe ser la apropiada, para permitir un recuento seguro y fiable cuando se trata de poblaciones muy densas se debe utilizar una serie de diluciones decimales escogiendo aquellas que resulte ms cmoda, por el contrario, cuando el nmero de clulas es bajo, se debe concentrar mediante una centrifugacin. Se deben contar con la ayuda del microscopio los microorganismos al azar, de manera que el total este comprendido entre 200 y 500 clulas. Evidentemente se debe evitar contar dos veces la misma clula. Con la finalidad de tener un resultado representativo se debe hacer el recuento en sitios diferentes. Por ejemplo se pueden contar 5 cuadrados grandes situados en diagonal o, 1 en el centro y los cuatro restantes, uno en cada esquina de la superficie cuadriculada. Es recomendable hacer el recuento dos veces y calcular una media aritmtica de los recuentos, multiplicando por 104 para expresar la poblacin en clulas por mililitro. Si eventualmente ha sido necesario hacer diluciones o concentraciones por centrifugacin, se debe tener en cuenta el factor de dilucin o concentracin respectivo.

Tincin con Azul de Metileno La tincin con azul de metileno de muy fcil realizacin que permite tener una primera informacin sobre la viabilidad de una poblacin de levaduras.

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Las propiedades cromticas de este compuesto se presentan en dos formas, que dependen del estado de oxido reduccin. Una forma incolora conocida leuco-compuesto, que se forma en condiciones reductoras. Esto determina que cuando el compuesto penetra en clulas viables, es reducido y en consecuencia las clulas viables se presentan incoloras contra un fondo azul. En contraste, al ingresar el compuesto en clulas muertas, que han perdido sus condiciones reductivas, permanece en forma coloreada mostrando estas mismas una coloracin azul oscura. A pesar de la gran utilidad que posee esta tincin vital, se debe destacar que el azul de metileno se hace rpidamente txico para los microorganismos; por ello las preparaciones deben ser examinadas dentro de los diez minutos siguientes de contacto del compuesto con las clulas. Trabajo Prctico 1. Realizar 6 diluciones a partir de un mosto en fermentacin. 2. Realizar un recuento de levaduras totales y viables en cmara de Neubauer. Para esto coloque sobre la cmara una gota de la dilucin que estime conveniente, y agregue una gota de solucin de azul de metileno. Cubra la muestra y observe al microscopio.

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TCNICAS DE CULTIVO EN PLACA Un microorganismo en presencia de un medio nutritivo y condiciones ambientales adecuadas crece, se reproduce y multiplica la poblacin de manera geomtrica. El conjunto de clulas, compuestos qumicos del medio y las nuevas sustancias producidas por el microorganismo constituyen el cultivo microbiano. Este puede ser natural (mosto) o producido en el laboratorio, cultivo puro o mixto, segn sea uno o varios los microorganismos que conviven y desarrollan simultneamente. En el laboratorio, para obtener cultivos, hay que preparar previamente los llamados medios de cultivo, que segn su estado pueden ser slidos, lquidos o semilquidos. Los medios de cultivo tambin se pueden agrupar en diferentes categoras segn la finalidad para la cual se aplican. As, por ejemplo, sern medios de aislamiento si se aplican a la separacin de las distintas especies de microorganismos existentes en un determinado ambiente. Estos medios son de amplio espectro nutritivo. Medios de enriquecimiento, si se aplican para favorecer el desarrollo de una determinada especie. Para obtener cultivos microbianos en el laboratorio en las condiciones ms favorables y correctas es necesario que los medios aplicados renan las tres condiciones siguientes: Condicin nutricional, composicin qumica del medio adecuada a las exigencias del microorganismo que se desea cultivar. Condicin de esterilidad, ausencia en el medio de todo microorganismo ajeno al que se desea cultivar. Condicin ambiental, condiciones fsicas como temperatura, actividad de agua, potencial redox, y pH para que el desarrollo del microorganismo sea ptimo. La variedad de medios de cultivo posibles en la prctica es casi infinita, debido a la enorme diversidad de materiales existentes y las combinaciones factibles. No obstante, en las distintas especialidades de la microbiologa se adoptan medios concretos que se aplican con mayor frecuencia. En microbiologa enolgica son, en lneas generales, los siguientes: mosto de uva, vino, Agar YPG, agar extracto de malta, gelatina de uva y agar mosto de uva, medio Elliker, medio Rogosa, medio Sharpe, suero de leche, caldo de carne glucosado, agar Gorodkowa, agar patata, etc. En la esterilizacin de medios de cultivo, envases y utensilios en contacto con ellos se recurre preferentemente al calor, y slo en casos particulares a desinfectantes qumicos y a la filtracin amicrbica.
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Los microorganismos que una vez estudiados y experimentados resultan tiles en los procesos productivos industriales hay que conservarlos. Para la conservacin de los microorganismos se utilizan medios especiales y tecnologas muy avanzadas, entre las cuales hay que destacar la liofilizacin. Consiste en someter a deshidratacin una suspensin de un cultivo puro de la especie que se quiere conservar. Esta operacin se hace mediante congelacin del preparado y posteriormente sublimacin del congelado a travs de un alto vaco. El sistema resulta muy til en la conservacin de bacterias, pero es problemtico en levaduras. Las levaduras se suelen conservar en medio fresco de agar-malta, adicionado de carbonato de calcio que neutraliza la acidez que algunas especies producen en alto porcentaje, terminando por inhibir su propio desarrollo. Metodologa El uso del azul de metileno es el mtodo ms rpido para un recuento de clulas vivas, pero falto de precisin por el problema de la coloracin visto anteriormente. Para lograr datos ms precisos y objetivos, es necesario hacer recuento sobre placa. La dilucin de la muestra debe ser tal que en la placa se tengan 50 a 100 UFC, porque si la cantidad es mayor puede suceder que en el crecimiento se produzca agregacin de colonias que haran difcil el recuento; por otra parte una cantidad menor aumentara el error experimental. Como ejemplo si en un mosto en fermentacin existen 1000 millones de clulas de levaduras, para lograr 100 clulas por ml se deber realizar una dilucin 1:10 millones. Luego de sembrar las placas con 1 ml de la dilucin correspondiente, se le agrega el medio en estado lquido Se incuban las placas a 25- 27C durante 3-4- das. La cantidad de colonias que crecen sobre la placa es igual a la cantidad UFC/ml de la muestra analizada, teniendo en cuenta la dilucin. La cantidad de UFC no corresponde con exactitud a la cantidad de clulas vivas: de hecho los agregados celulares o las levaduras en avanzado estado de gemacin forma una sola colonia y dan una sola unidad formadora de colonia.

Trabajo Prctico 1. Realizar 5 diluciones del mosto. 2. 3. Sembrar por homogeneizacin 5 placas de distintas diluciones, con agar extracto de malta. Incubar a 25C por 48 horas. Realizar el recuento.
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MTODOS DE FILTRACIN POR MEMBRANAS Si la poblacin microbiana de un lquido que se desea analizar es baja como para permitir la dispersin y el desarrollo sobre medio slido, se puede desarrollar sobre una membrana filtrante. Esta tcnica permite tanto realizar esterilizaciones en fro, como determinar la cantidad de microorganismos en un lquido con bajas poblaciones microbianas. Esta tcnica de conteo poblacional que se aplica cuando las poblaciones microbianas son pequeas, sirve por ejemplo para realizar recuentos en vinos terminados. Se efecta una concentracin de microorganismos que son retenidos sobre la membrana filtrante de una porosidad conveniente, cuando se pasa a travs de ella un volumen dado de muestra. Materiales Bomba de vaco o dispositivo equivalente. Equipo de filtracin (porta membrana y vaso muestreador) para membrana de 47 mm de dimetro, puede ser de acero inoxidable o plstico autoclavable. Membranas filtrantes de ster de celulosa de 47 mm de dimetro con bordes hidrfobos preferentemente blancas , cuadriculadas en 0,3 mm y de 0,45 mm de tamao de poro, cuando se desea estudiar bacterias o de 0,8 mm cuando se trata de levaduras. Es preferible que las membranas que se utilicen estn en embalajes individuales, de lo contrario se debern esterilizar en autoclave durante 10 minutos a 121C. Placas de Petri de vidrio estriles de 60 mm. Procedimiento operatorio Preparar un nmero de placas de Petri con un medio de cultivo apropiado. La membrana filtrante puede ser depositada sobre la superficie de un medio slido o bien sobre un soporte slido (tampn absorbente embebido en un medio lquido adecuado). Placas de Petri con medio slido: Para la preparacin de las placas, se vierten 6 ml de medio lquido y se deja enfriar hasta unos 45C, dejar solidificar sobre una superficie plana. Se podr tener las placas preparadas con antelacin a condicin que mantengan su esterilidad y no se hallan secado.

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Placas de Petri con medio lquido adecuado: Si se desea utilizar un medio nutritivo lquido, la membrana se deposita sobre un tampn absorvente que est embebido en medio nutritivo. Para la preparacin de estas placas se esteriliza la placa con un tapn en su interior (existen en el comercio ya preparadas; posteriormente se embebe el tampn con unos 2 ml de medio nutritivo estril, (tambin se cuenta en el comercio con ampollas de medio lquido estril).

Filtracin de las muestras Cuando se comience una serie de filtraciones deben utilizar dispositivos de filtracin esterilizables en autoclave. Entre las filtraciones, las unidades de acero o vidrio se deben rociar con etanol y pasar por la llama de un mechero, alternativamente se pueden sumergir por 5 minutos en agua hirviendo. Para los dispositivos de plstico se puedan utilizar medios de esterilizacin alternativos, como las radiaciones UV exponiendo a ellas durante 2 minutos u otros agentes qumicos adecuados. Adaptar una trampa entre el matraz y la bomba de vaco. Adaptar el aparato de filtracin a la bomba de vaco. Fijar el porta filtro mediante la pinza de fijacin. Retirar de su embalaje mediante una pinza flameada y fra, la membrana de porosidad adaptada a la finalidad requerida. Situarla sobre la base del porta filtro de manera que quede centrada y la cara cuadriculada hacia arriba. Introducir algunos mililitros de agua estril para provocar un buena adherencia de la membrana al soporte del filtro y hacer vaco para se escurra totalmente. Introducir en el embudo un volumen de muestra homogneo y dependiente de la poblacin que se estime en el vino a analizar. El nmero de colonias que se considera va entre las 20 y las 200. De todas formas, el ideal esta comprendido entre las 40 y 80 colonias a fin de poder diferenciarlas perfectamente. Hacer el vaco hasta que todo el lquido pase a travs de la membrana, romper el vaco cuidadosamente para evitar que el reflujo. El volumen de filtracin varia generalmente entre 25 y 500 mL y es necesario procesar un volumen perfectamente conocido. Si el volumen debe ser menor a los 20 mL se debe agregar sobre el porta membrana un volumen de agua estril y sobre este el volumen de muestra, otra alternativa es diluir el volumen de muestra con un volumen de agua estril y luego proceder a filtrar.

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Abrir el embudo y retirar la membrana con la ayuda de un pinza flameada y previamente enfriada. Depositar la membrana en una placa de Petri que contenga un medio adecuado al crecimiento de los microorganismos que se desea evaluar. La cara cuadriculada de la membrana debe quedar hacia arriba. Se debe tener la precaucin que no queden burbujas de aire entre la membrana y superficie del medio nutritivo, la ocurrencia de este fenmeno afectara el crecimiento de las clulas de microorganismos al no tener un contacto intimo con la fuente nutritiva. La placa se incuba por un tiempo y temperatura dependiente de las condiciones ptimas a los microorganismos que se desea detectar. Condiciones para levaduras. Utilizar membranas filtrantes de 0,45 m de porosidad, el medio de cultivo apropiada puede ser el YEPD agarizado y las condiciones de incubacin recomendadas son: una temperatura de 20 a 25 C por 3 a 5 das. Es necesario sealar que para el conteo de levaduras, la incubacin por tres das es normalmente suficiente. Si se sospecha la presencia de levaduras de los gneros Brettanomyces o Dekkera, debido a su crecimiento mas lento, la incubacin se debe prolongar por unos 7 a 10 das. Condiciones para bacterias lcticas. Utilizar membranas filtrantes de 0,2 o 0,45 m de porosidad, un medio de cultivo agarizado entre los que se pueden escoger el medio y las condiciones de incubacin deben considerar un medio microaerfilo, una temperatura de 25 C un periodo de unos 10 das. Condiciones para bacterias acticas. Utilizar membranas filtrantes de 0,2 m o 0,45 m de porosidad, un medio de cultivo y la incubacin debe ser realizada a una temperatura de 25 a 30C durante 2 a 4 das. El conteo se debe realizar con la ayuda de una lupa o en un contador de colonias. Si se tienen dudas se debera conformar la identidad (bacterias o levaduras) con la ayuda de un microscopio. Para probar la esterilidad de las membranas, para cada uno de las series de ensayos, se debera realizar un ensayo en blanco procesando de igual manera que las muestras, con un volumen de agua estril.

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Resultados Expresar los resultados en unidades formadoras de colonias por mL (UFC/mL) en lugar de numero de microorganismos ya que cada colonia puede resultar de un collar clulas de un agrupamiento, hecho particularmente posible en el caso de microorganismos aglomerantes. Cuando se ha filtrado un gran volumen de vino y se presentan un numero reducido de colonias, los resultados se pueden expresar relativo al volumen de muestra filtrado. Si no existe desarrollo de colonias y se tiene la certeza de que no existe presencia de sustancias inhibidoras, los resultado se deben expresar como <1.0 UFC para el total del volumen filtrado. Cuando al contar las colonias se presentan 1 o 2 por cada cuadrado y el nmero se hace excesivo, se puede repetir el ensayo filtrando un volumen menor de muestra o diluyndola con agua estril. Si lo anterior no es posible el resultado se expresa como muy numerosas para contarlas.

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