Mtodos luminiscentes

Tema 4

METODOS LUMINISCENTES
Cuando una especie qumica absorbe radiacin electromagntica ultravioleta o visible pasa a un estado electrnico excitado. Muchas sustancias en dicho estado disipan el exceso de energa en forma de calor, mediante colisiones con tomos o molculas vecinas, como ocurre en la espectrofotometra de absorcin. Sin embargo, un cierto nmero de especies pierde solo una parte de este exceso de energa en forma de calor, y emite la energa remanente en forma de radiacin electromagntica, de distinta frecuencia que la absorbida, y que puede utilizarse con fines analticos.

X + CALOR X + h X* X + calor + h ' absorcin (espectrofotometra) emisin (fotoluminiscencia)

El proceso de emisin de radiacin como consecuencia de la desactivacin de una molcula se denomina genricamente luminiscencia, mientras que el trmino fotoluminiscencia se refiere al caso particular en el que la excitacin tenga lugar por absorcin de fotones. Cuando la energa de excitacin es de otro tipo, se originan otras modalidades de luminiscencia: as, la quimio-luminiscencia es un fenmeno anlogo a la fluorescencia, excepto en el hecho de que la energa de excitacin proviene de una reaccin qumica. Cuando la quimio-luminiscencia tiene lugar en un ser vivo, como por ejemplo, en la lucirnaga, recibe el nombre de bioluminiscencia. Por otra parte, la tribo-luminiscencia (del Griegro, tribo = frotar) se produce al liberarse la energa almacenada en ciertas sustancias cristalinas, como azcar, y como consecuencia de su rotura. La fotoluminiscencia puede clasificarse, en principio, en fluorescencia y fosforescencia, segn el mecanismo mediante el cual la sustancia vuelve al estado fundamental, si bien, una distincin desde el punto de vista prctico se basa en el tiempo transcurrido entre la absorcin y la emisin.

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El contenido de este captulo se enfoca fundamentalmente hacia la fluorescencia, pues la fosforescencia se aplica en escala mucho ms limitada. As mismo, al final del captulo se indican brevemente algunas caractersticas y aplicaciones de la quicioluminiscencia. La luminiscencia puede considerarse como una de las tcnicas analticas ms antiguas, pues su descubrimiento data del siglo XVI, cuando el fsico y botnico espaol Nicolas Monardes observ, en 1565, un misterioso matiz azulado en el agua almacenada en un recipiente construido con madera de la especie "Lignum nifriticum". Sin embargo, no fue hasta el siglo XIX en que el fsico ingls George Stokes estableci las bases de su utilidad analtica al describir los primitivos mecanismos de absorcin y emisin.

FUNDAMENTO DE LA FOTOLUMINISCENCIA
Para que una sustancia origine emisin foto-luminiscente es necesario que previamente tenga lugar la absorcin de radiacin electromagntica. En la figura 3.6. del tema anterior se han representado las transiciones electrnicas ms comunes que pueden tener lugar cuando una molcula orgnica absorbe radiacin. De todas ellas, las que tienen lugar entre los orbitales enlazantes y antienlazantes (>*) son las de mayor inters en los procesos luminiscentes. A continuacin se ampliarn algunos conceptos relacionados con los procesos de absorcin y emisin de forma general, pero que son aplicables a las mencionadas transiciones >*. La multiplicidad molecular, M, se define como: M = 2S + 1 donde S es el nmero cuntico de espn de la molcula, y es la suma de los espines de cada uno de sus electrones. Muchas molculas orgnicas tienen un nmero par de electrones, por lo que S=0 y M=1. A dicho estado se le denomina singulete. El estado energtico ms bajo (estado fundamental) deber ser uno en el cual todos los electrones estn apareados, y a dicho estado se le denomina estado singulete fundamental (figura 4.1.a.) Cuando un electrn pasa a un nivel energtico superior, (por ejemplo, pasa de a *) puede ocurrir que conserve su espn, o que se produzca cambio de ste. En el

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primer caso se tiene un estado singulete excitado (figura 4.1.b.) y en el segundo, un 1 1 S=+ + = 1. 2 2 estado triplete, ya que, en estas condiciones, M=3, debido a que Las transiciones desde el estado singulete fundamental hasta el estado triplete son muy poco probables; normalmente es necesario pasar a travs del estado singulete excitado*.

a singulete fundamental

b singulete excitado

c triplete excitado

Figura 4.1. Estados singulete y triplete.

En la figura 4.2. se han representado parcialmente diferentes niveles de energa para una molcula fotoluminiscente.
Relajacin vibracional

v2 v1 v0

Conversin interna

S1

Cruzamiento entre sistemas

..

Fluorescencia

Absorcin

desactivacin no radiante

v2 T v1 1 v0

Fosforescencia

So 2 1 3 4

v2 v1 v0

Figura 4.2. Niveles de energa de un sistema fotoluminiscente.

* Las molculas con electrones desapareados (nmero impar de electrones) constituyen un estado doblete y

es el caso, por ejemplo, de radicales libres orgnicos.

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El nivel So representa el estado singulete fundamental, mientras que S1 y S2 estados singulete excitados, y T1 el estado triplete. Por otra parte, superpuestos a cada nivel de energa electrnico hay una serie de niveles de energa vibracionales estrechamente espaciados, representados en la figura por vo, v1, v2, etc. Los niveles rotacionales no se han incluido porque no pueden resolverse con los espectrmetros convencionales. Cuando una molcula absorbe radiacin se produce el paso desde el estado electrnico y vibracional fundamental a un estado electrnico excitado y cualquiera de los posibles estados vibracionales excitados. Este proceso de excitacin tiene lugar en un tiempo del orden de los 1015 segundos. En sistemas condensados, como cuando se opera en disolucin, el exceso de energa vibracional se pierde inmediatamente, como consecuencia de los choques entre las molculas excitadas y el disolvente. Este proceso recibe el nombre de relajacin vibracional. Adems, puede ocurrir que se pase a un estado electrnico de ms baja energa sin emisin de radiacin (S2 a S1). Este proceso, denominado conversin interna, se produce cuando dos niveles de energa electrnicos estn suficientemente prximos para que haya un solpamiento de los niveles de energa vibracionales. Los procesos de conversin interna y de relajacin vibracional transcurren en un tiempo muy pequeo (del orden de los 1012 seg.) El proceso de emisin de un fotn desde S1 a So recibe el nombre de fluorescencia, y ocurre inmediatamente despus de la excitacin (en aproximadamente 109 a 107 segundos), por lo cual, no es posible percibir visualmente la emisin de fluorescencia una vez eliminada la fuente de excitacin. Por otra parte, debido a la conversin interna y a los procesos de relajacin vibracional, la emisin de fotones fluorescentes desde estados electrnicos excitados superiores al primero son procesos muy poco probables. As, en relacin con la figura 4.2., la excitacin por radiacin a la longitud de onda 2 normalmente provoca fluorescencia de una longitud de onda 3, con exclusin de la transicin que resultara entre S2 y So. La desactivacin de un estado electrnico excitado por prdida de energa no radiante puede tener lugar mediante unos procesos de conversin interna, si los niveles vibracionales del estado fundamental se solapan con los del primer estado excitado, o por conversin externa, lo cual implica interaccin y transferencia de energa entre la molcula excitada y el disolvente u otros solutos. Como se coment anteriormente, mientras una molcula est en un estado excitado, puede tener lugar un cambio de espn en un electrn, con lo que se adquiere

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el estado triplete. Este proceso de transformacin de un estado singulete a un estado triplete se denomina cruzamiento entre sistemas, y la probabilidad de que esto suceda aumenta si los niveles vibracionales se solapan. Una vez adquirido el estado triplete, la molcula puede llegar al nivel vibracional inferior mediante procesos de relajacin vibracional, y posteriormente emitir un fotn para retornar finalmente al estado fundamental. Esta emisin se denomina fosforescencia. Debido a que las transiciones entre estados de diferentes multiplicidades estn "prohibidas", la emisin fosforescente se produce con un cierto retraso respecto a la absorcin (entre 103 y 10 segundos). Por ello, con frecuencia, puede ser observada a simple vista despus de cesar la radiacin de excitacin. Sin embargo, como consecuencia del mayor tiempo de vida del estado triplete, los procesos de desactivacin en forma de energa no radiante pueden competir ms eficazmente con la fosforescencia que con la fluorescencia. Por esta razn, la fosforescencia casi nunca se observa a temperatura ambiente, siendo necesario operar en condiciones criognicas para que se reduzca la probabilidad de desactivacin por choques*. A modo de resumen, puede decirse que los procesos de desactivacin de una especie en forma de energa no radiante son los ms probables, seguidos de la emisin fluorescente, y los menos probables son los correspondientes a la fosforescencia. Esto hace que los mtodos absorciomtricos sean ms numerosos que los fluorimtricos, y stos, a su vez, ms que los basados en el empleo de la fosforescencia.

FACTORES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA

La emisin fluorescente observada en una determinada especie est condicionada por la propia estructura molecular de la sustancia y por otros factores dependientes del medio en que se trabaje.

Influencia de la estructura molecular sobre la fluorescencia

El primer requisito para que exista florescencia (o fosforescencia) es que la molcula posea una estructura capaz de absorber radiacin ultravioleta o visible, esto es, puedan tener lugar transiciones >* y n>*. Sin embargo,

muestra se incorpora a una matriz slida.

* En poca relativamente reciente, ha sido posible observar fosforescencia a temperatura ambiente cuando la

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experimentalmente se ha observado que el comportamiento fluorescente se presenta con ms frecuencia en compuestos en los que la transicin es >* y no en aquellos en los que es n>*. Esta condicin elimina virtualmente los compuestos orgnicos saturados, mientras que los compuestos conteniendo dobles enlaces conjugados, especialmente aquellos con un alto grado de estabilizacin por resonancia sern muy prometedores. As, suelen presentar fluorescencia muchos hidrocarburos aromticos, particularmente si tienen gran rigidez y estructuras multi-cclicas. Las caractersticas de la emisin fluorescente (longitud de onda de mxima emisin y su intensidad) de una molcula orgnica aromtica suele estar muy influida por los sustituyentes en el anillo bencnico. As, por ejemplo, cuando los sustituyentes son halgenos, se observa una disminucin de la fluorescencia al aumentar el peso atmico del halgeno, lo cual parece debido al llamado efecto del tomo pesado. Este efecto aumenta la probabilidad de que se produzca el cruzamiento entre sistemas, con el consiguiente aumento de la fosforescencia. Por otra parte, la presencia de un cido carboxlico en un anillo aromtico hace que tengan lugar transiciones n>* con menos energa que >*, lo cual generalmente inhibe la fluorescencia. Un factor estructural importante es la rigidez. Experimentalmente se observa que la fluorescencia est particularmente favorecida en molculas que poseen estructuras rgidas. As, la intensidad de la fluorescencia del fluoreno es unas cinco veces mayor que la del bifenilo.
. . CH 2 fluoreno bifenilo

La diferencia parece ser debida a la rigidez que proporciona el grupo metileno del fluoreno. Asimismo, la fluorescena presenta una intensa fluorescencia en disolucin lquida y, sin embargo, la fenolftalena no, a pesar de su similitud estructural.
O

COO

COO

fluorescena

fenolftalena

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En ambos ejemplos, la forma rgida (fluoreno y fluorescena) presenta mayor fluorescencia. Este efecto se debe a que las estructuras ms rgidas limitan las vibraciones, lo cual minimiza la degradacin por colisiones y el cruzamiento de sistemas. El aumento de fluorescencia de ciertos agentes orgnicos cuando forman quelatos con iones metlicos parece debido tambin a producirse un incremento en la rigidez del sistema. As, por ejemplo, el colorante pontacromo BBR no es fluorescente, pero s lo es su quelato con Al3+.
H 2O Al
3+

H2O HO N=N SO 3 Na

OH

HO
SO 3 Na

N=N

Pontacrom o BBR

Pontacrom o BBRAl 3+

La formacin del quelato aumenta considerablemente la rigidez molecular, al impedir que la molcula gire alrededor del grupo azo. Otros factores de tipo estructural que influyen sobre el comportamiento luminiscente son: * La presencia de grupos donadores de electrones, como NH2 y OH favorecen la fluorescencia, puesto que aumentan la probabilidad de transicin entre el estado singulete de menor energa vibracional y el estado fundamental. * La introduccin de un tomo de nmero atmico elevado en un sistema de electrones suele aumentar la fosforescencia, en detrimento de la fluorescencia. * Los grupos aceptores de electrones, como COOH, NO2, N=N y X disminuyen y, en ocasiones inhiben la fluorescencia.

Influencia de otros factores medioambientales sobre la fluorescencia

El "ambiente" en el que se encuentre la especie fluorescente constituye un parmetro importante que puede usarse en anlisis para incrementar la sensibilidad y la selectividad de la fluorescencia, ya que existen varios factores medioambientales

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que pueden influir fuertemente sobre el comportamiento fluorescente de molculas poliatmicas. Influencia del disolvente. En muchas ocasiones se observa que al aumentar la polaridad del disolvente se produce un desplazamiento en el espectro de fluorescencia hacia mayores longitudes de onda. Este hecho puede explicarse de la forma siguiente: Las transiciones electrnicas entre diferentes niveles energticos ocurren muy rpidamente, de forma que cuando una molcula en estado fundamental absorbe un fotn, pasa a un estado excitado meta-estable (estado excitado FranckCondon), en el cual la geometra molecular y la configuracin del disolvente son todava las caractersticas del estado fundamental (figura 4.3.). La reorientacin del disolvente tiene lugar aproximadamente 10111012 segundos despus de la excitacin, originando un estado excitado de "equilibrio", en el cual la configuracin del disolvente es ptima para la geometra y configuracin electrnica de la molcula. La emisin ocurre desde ese estado excitado de "equilibrio", hasta un estado fundamental meta-estable, teniendo lugar posteriormente la relajacin del disolvente, para conducir hasta el verdadero estado fundamental. En la mayora de las molculas polares el estado excitado es ms polar que el estado fundamental; por ello, al aumentar la polaridad del disolvente se tiende hacia una estabilizacin del estado excitado, en mayor grado que lo hace el estado fundamental (figura 4.3.A, B y C). En consecuencia, al aumentar la polaridad del disolvente tiene lugar un desplazamiento hacia mayores longitudes de onda (menor energa).

Figura 4.3. Influencia de la polaridad del disolvente sobre la emisin de fluorescencia.

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Respecto a la constitucin del disolvente hay que hacer notar lo siguiente: anteriormente se ha mencionado que la introduccin de tomos pesados como sustituyentes en molculas aromticas produce un incremento en la fosforescencia a expensas de la fluorescencia. Este efecto se observa frecuentemente incluso cuando el elemento en cuestin no forma parte de la molcula luminiscente. As, disolventes conteniendo tomos pesados, normalmente dan lugar a una disminucin de la fluorescencia. Este comportamiento puede justificarse en algunos casos: concretamente cuando se trata de disolventes halogenados, por formacin de complejos 1:1 en los que interviene el estado excitado del soluto fluorescente, pues la reactividad de los estados excitados es normalmente diferente a la que presenta la molcula en estado fundamental. Influencia del pH. El espectro de fluorescencia de muchos compuestos aromticos conteniendo grupos funcionales cidos o bsicos es sensible al pH. Los cambios en la emisin de los compuestos de este tipo proviene del nmero de especies resonantes diferentes que estn asociadas con las formas cidas o bsicas de las molculas. As, por ejemplo, la anilina, en medio neutro y alcalino presenta fluorescencia en la regin visible, pero dicha fluorescencia desaparece en medio cido. La razn est en que el ion anilinio (forma cida) tiene las mismas formas resonantes que el benceno y solo presenta fluorescencia, como l, en la regin ultravioleta, mientras que la anilina tiene tres estructuras resonantes adicionales. H H H H H H+ H N(+) H + H N: N N
.

ion anilinio

anilina

Estas formas resonantes adicionales proporcionan una mayor estabilidad al primer estado excitado, y la consecuencia es una emisin fluorescente a mayor longitud de onda. La fluorescencia de ciertos compuestos en funcin del pH ha sido utilizada para la deteccin de puntos finales en volumetras cidobase. Sin embargo, es realmente curioso el hecho de que el cambio de comportamiento espectral se produzca a un pH diferente del que puede predecirse de su constante de disociacin. As, el pKa del 2naftol es 9.5, por lo que la fluorescencia de la forma aninica solo debera observarse a valores de pH superiores a 9.5, mientras que en la prctica, se percibe a pH muy inferiores a ese valor. La explicacin de este hecho reside en que la molcula excitada

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(el primer estado singulete excitado) posee un carcter cido diferente del estado fundamental. Algo parecido sucede con los estados triplete, si bien, en menor medida. Influencia del oxgeno disuelto. El efecto del oxgeno disuelto es uno de los problemas ms molestos de la fluorimetra, ya que a menudo reduce la intensidad de emisin de una disolucin fluorescente. Normalmente, el oxgeno presente en concentracin 103 M reduce la emisin fluorescente del orden del 20%. Por ello, es necesario desairear las disoluciones antes de llevar a cabo la medida. El papel que juega el oxgeno en la atenuacin de la fluorescencia se debe fundamentalmente a sus propiedades oxidantes y a sus caractersticas paramagnticas. As, frente a especies reductoras, el oxgeno puede llevar a cabo la oxidacin inducida foto-qumicamente de las especies fluorescentes, si bien, con mayor frecuencia, la atenuacin de la fluorescencia se produce debido a que el paramagnetismo del oxgeno molecular favorece el cruzamiento entre sistemas, lo cual conduce hasta el estado triplete. Al parecer, el cruce entre sistemas se produce mediante colisiones con especies excitadas y por formacin transitoria de complejos de transferencia de carga. Por otra parte, el que la presencia de oxgeno favorezca el cruzamiento entre sistemas en muchas molculas fluorescentes no significa que aumente la fosforescencia, pues el O2 es tambin un efectivo atenuador de estados tripletes. Debido a que el estado triplete tiene una vida ms larga que el singulete, le hace mucho ms susceptible para colisionar con impurezas, tales como el propio oxgeno, u otras producidas por foto-descomposicin del soluto. En cualquier caso, la capacidad del oxgeno para inhibir la fotoluminiscencia puede ser utilizada para su determinacin en disolucin. Otros gases paramagnticos, como el xido ntrico, se comportan de forma similar, as como iones paramagnticos de los metales de transicin. Influencia de la temperatura. La temperatura es una variable importante en fluorimetra analtica, observndose una disminucin de la fluorescencia al aumentar aquella. El cambio en la fluorescencia es normalmente del 1 % por C, si bien, en algunos compuestos, como el triptofano o la rodamina B puede ser hasta del 5 %. La disminucin de la emisin fluorescente con la temperatura se debe a que el aumento de la frecuencia de choques a temperatura elevada incrementa la probabilidad de desactivacin en forma de energa no radiante. Por otra parte, el aumento de

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temperatura hace disminuir la viscosidad del disolvente, lo cual, tambin aumenta la probabilidad de desactivacin mediante colisiones.

RELACION ENTRE INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA Y CONCENTRACION

La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la concentracin, C, de la sustancia absorbente, pero solo a concentraciones relativamente bajas, lo cual puede demostrarse como sigue: la fraccin de radiacin transmitida, segn la Ley de Beer, es:

T=

P bC = 10 Po

donde, Po=potencia del haz incidente P=potencia del haz transmitido =absortividad b=espesor de la cubeta (camino ptico) C=concentracin La fraccin de radiacin absorbida es:

P bC = 1 10 Po

y la cantidad de radiacin absorbida es: Po P = Po (1 10bC) La intensidad de la radiacin fluorescente, If, est relacionada con la cantidad de radiacin absorbida de la forma siguiente: If = k f (PoP) donde k es una constante de proporcionalidad, que depende de parmetros instrumentales (eficacia del sistema detector y geometra) y f es el rendimiento cuntico de la fluorescencia (relacin entre el nmero de fotones emitidos y los absorbidos por unidad de tiempo). El trmino 110bC puede desarrollarse como una serie de McLaren, 1 10bC = 1 e2.3bC

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2 3

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1 10

bC

2.3 bC = 1 1 2.3 bC + 2! 2.3 bC = 2.3 bC 2!

2

2.3 bC 3!
3

+ =

2.3 bC + 3!
2

de donde, If = k f Po

2.3 bC 2.3 bC 2!

2.3 bC + 3!

[I ]

Para bajas concentraciones, cuando el trmino bC sea menor que aproximadamente 0.05, todos los trminos de la ecuacin [I], excepto el primero, son muy pequeos, y la expresin se reduce a If = k f Po 2.3 b C As, para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia ser directamente proporcional a la concentracin: If = K C En la figura 4.4. se muestra una representacin grfica de la variacin de la intensidad de fluorescencia con la concentracin.
K Po If
fluorescencia no uniforme

fluorescencia uniforme

C
Figura 4.4. Relacin entre la intensidad de fluorescencia y la concentracin.

A concentraciones relativamente altas, los trminos de mayor orden de la ecuacin [I] pueden ser lo suficientemente importantes para que se pierda la linealidad, como ya se coment anteriormente. Sin embargo, existen otras causas para la no linealidad a concentraciones altas. Son las siguientes:

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* Autoatenuacin. Se produce como consecuencia del choque entre molculas excitadas, lo cual origina una desactivacin en forma de energa no radiante. Lgicamente, al aumentar la concentracin, aumentar la probabilidad de que se produzcan esas colisiones. * Autoabsorcin. En este caso, la fluorescencia de una molcula es absorbida por otra molcula del mismo soluto en estado fundamental, y la probabilidad de tales eventos crece al aumentar la concentracin. La auto-absorcin reduce la intensidad de fluorescencia, salvo que f sea la unidad. Por ello, la representacin grfica de If frente a C puede hacerse incluso descendente para altos valores de C. * Como ya se vio, If es proporcional a la absortividad molar: a mayor absorcin, mayor fluorescencia. Sin embargo, cuando la absorcin es demasiado grande y la disolucin bastante concentrada, la porcin de la disolucin ms prxima a la fuente luminosa absorbe mucha radiacin, de forma que queda muy poca disponible para el resto. Si la concentracin es tan grande que toda la radiacin incidente es absorbida, If = k f (Po P) = k f Po, en cuyo caso, If tiende al valor de k Po (ver figura 4.4.). * Muchas molculas aromticas (especialmente aquellas con grupos funcionales capaces de unirse por enlaces de hidrgeno) forman dmeros u otros agregados en disolucin. Esta tendencia, lgicamente ser mayor a altas concentraciones de soluto. Considerando que, con frecuencia, los dmeros son menos fluorescentes que el correspondiente monmero, se observar un descenso de If como consecuencia de la formacin de estas especies dmeras. Por otra parte, ciertos compuestos en estado singulete excitado tienen tendencia a formar asociaciones con molculas de su misma especie en estado fundamental. El espectro de emisin de estas asociaciones suele estar desplazado hacia mayores longitudes de onda respecto al del correspondiente monmero.

INSTRUMENTACION
Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los mtodos espectroscpicos, los componentes principales de un fluormetro son: una fuente de radiacin, un sistema selector de longitudes de onda (filtro o monocromador), una clula conteniendo la muestra, y un detector. Sin embargo, una diferencia importante entre la fluorimetra (tambin la fosforimetra) y los dems mtodos

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espectroscpicos es la presencia de dos filtros (o dos monocromadores); uno para seleccionar la longitud de onda de excitacin y otro para la de emisin. En la figura 4.4. se han representado los componentes bsicos de un fluormetro. En espectrmetros de luminiscencia se necesitan fuentes de radiacin ms intensas que las lmparas de volframio o de deuterio que se utilizan en las medidas de absorcin. Anteriormente se indic que la intensidad de fluorescencia es directamente proporcional a la potencia del haz incidente. La lmpara de arco de xenn presenta un espectro esencialmente continuo que se extiende por las regiones ultravioleta y visible, siendo muy utilizada en espectrofluormetros de red. Por otra parte, en los fluormetros de filtro, suele utilizarse la lmpara de arco de mercurio, la cual emite un intenso espectro de lneas sobre un fondo continuo. El uso de esta fuente puede implicar una mayor sensibilidad, debido a la alta intensidad de las lneas del mercurio.

Muestra Fuente de radiacin . monocromador de excitacin

(o filtro)

Medidor o registro

monocromador Detector .
(o filtro)

de emisin

Figura 4.4. Componentes bsicos de un fluormetro.

Los sistemas para seleccionar la longitud de onda ms empleados en instrumentos de luminiscencia son filtros y redes. De hecho, los instrumentos se clasifican en flormetros de filtro y espectrofluormetros de red. De los primeros, los ms utilizados son los filtros de interferencia, por proporcionar pequeas anchuras de banda. Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolucin uniforme y dispersin lineal a todas las longitudes de onda. El mayor inconveniente es que pasan varios rdenes espectrales, lo cual puede evitarse usando filtros en el camino ptico.

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Los prismas se usan poco en instrumentos para luminiscencia, porque, aunque proporcionan una gran dispersin en el ultravioleta, es en el visible donde se realizan muchas medidas, y, adems, para obtener una sensibilidad adecuada se necesitara un prisma muy grande, lo cual no es econmico. Las cubetas utilizadas para contener la muestra suelen ser de cuarzo, para permitir el paso de la radiacin ultravioleta. Las ms tpicas son de 1 cm de espesor, como las utilizadas para medidas de absorcin, excepto que todas las caras son transparentes a la radiacin (estn pulidas), ya que generalmente las medidas de fluorescencia se realizan en un ngulo de 90 respecto a la radiacin incidente; a otros ngulos, la dispersin por la disolucin y las propias paredes de la cubeta puede originar mayor ruido de fondo. En cuanto a los detectores, la mayor parte de los fluormetros y espectrofluormetros actuales usan tubos fotomultiplicadores como sistemas para detectar la radiacin de fluorescencia. Finalmente, mencionar que mientras que los ms precisos espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible utilizan un dispositivo de doble haz, esta operacin no es prctica en instrumentos de luminiscencia. Por ello, hay que tener en cuenta siempre los problemas inherentes al empleo de haz sencillo.

ESPECTROS DE EXCITACION Y EMISION

Debido a la presencia de dos monocromadores, pueden registrarse dos tipos de espectros: el espectro de excitacin (intensidad de fluorescencia observada en funcin de la longitud de onda de excitacin a una determinada longitud de onda de emisin) y el espectro de emisin (intensidad de la emisin fluorescente en funcin de la longitud de onda de emisin, a longitud de onda de excitacin fija). Esto es, si se fija la ex y se mide la radiacin emitida a las diferentes em se obtiene el espectro de emisin. En cambio, si se mantiene constante la em y se van variando las ex , se obtiene el espectro de excitacin. Este es ligeramente diferente del espectro de absorcin, pero muy semejante a l.

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.

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Excitacin - absorcin . .

Fluorescencia
300 350 400 450

Figura 4.5. Espectros de excitacin y de emisin.

, nm

El espectro de emisin aparece, evidentemente, a longitudes de onda ms largas que el de excitacin (absorcin) (figura 4.5.). Solamente las bandas de mayor longitud de onda del espectro de absorcin suelen estar superpuestas con las bandas de menores longitudes de onda de la emisin*. Adems, debido a que los espaciados entre los niveles vibracionales son similares en el estado fundamental y en el primer estado singulete excitado, el espectro de fluorescencia es aproximadamente una imagen especular del espectro de absorcin. Para aplicaciones analticas se usa el espectro de emisin, aunque corrientemente, cuando se trabaja con un espectrofluormetro, se obtiene primero un espectro de excitacin, con objeto de confirmar la identidad de la sustancia y seleccionar la longitud de onda ptima de excitacin.

entre niveles vibracionales cero de los estados fundamentales y primer estado singulete excitado.

* Estas bandas, ordinariamente llamadas "transiciones 00" se producen como consecuencia de transiciones

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Espectro verdadero y aparente

Debido a que los espectrmetros de luminiscencia suelen ser de haz sencillo, todos los problemas inherentes a esta forma de operar (fluctuaciones de la fuente de radiacin, inestabilidad del detector, etc.) estn potencialmente presentes. Hay dos problemas particularmente molestos y son, que tanto la intensidad de la fuente de radiacin como la sensibilidad de cualquier detector pueden variar con la longitud de onda. Cuando se obtienen espectros que dependen de las caractersticas del instrumento utilizado se denominan aparentes (tanto de excitacin como de emisin, si bien, las distorsiones debidas a parmetros instrumentales se ponen de manifiesto fundamentalmente en el espectro de excitacin). Cuando es posible corregir el espectro aparente considerando las caractersticas de la fuente y del detector se obtiene el espectro verdadero o corregido. La correccin puede hacerse de forma manual si se conocen las caractersticas de la fuente y del detector, si bien, existen instrumentos especialmente diseados para llevar a cabo la correccin de forma automtica.

APLICACIONES
Antes de describir algunas aplicaciones de los mtodos fluorescentes, es interesante comparar la sensibilidad y la selectividad de los mtodos luminiscentes en relacin con los absorciomtricos. Sensibilidad. Los mtodos fluorimtricos son ms sensibles que los absorciomtricos. Esto se debe, sobre todo, a que en estos mtodos el detector debe distinguir una pequea diferencia entre dos seales grandes (Po y P), cada una de las cuales lleva su correspondiente ruido de fondo, mientras que en fluorimetra, el detector solo necesita poner de manifiesto una pequea seal positiva frente a un ruido de fondo pequeo. De hecho, la sensibilidad en fluorimetra puede mejorarse aumentando Po, mientras que en absorciometra, al aumentar Po aumenta tambin P, no afectando a la absorbancia. En general, los mtodos fluorimtricos suelen ser entre 10 y 100 veces ms sensibles que los espectrofotomtricos.

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Selectividad. La selectividad de los mtodos luminiscentes suele ser mayor que la de los absorciomtricos. De hecho, hay muchas especies capaces de absorber radiacin, pero el nmero de ellas que pueden re-emitir es mucho menor. Adems, en los mtodos de fluorescencia, tanto la longitud de onda de excitacin, como la de emisin, pueden seleccionarse para minimizar interferencias, mientras que en espectrofotometra solo la longitud de onda de absorcin es seleccionable. Por tanto, si dos materiales fluorescentes difieren en el espectro de excitacin o de emisin, es factible analizar uno selectivamente en presencia del otro. En cuanto a las aplicaciones de los mtodos fluorimtricos, y ante la imposibilidad de dar cuenta de todas ellas, se citarn algunos ejemplos especficos, dentro de los grupos que se relacionan seguidamente.

Sustancias inorgnicas
Las sustancias inorgnicas pueden determinarse por los mtodos siguientes: a) Anlisis directo. Aunque bastantes especies inorgnicas presentan fluorescencia en estado slido, pocos son los sistemas de este tipo aplicables analticamente. En disolucin, tampoco son demasiado numerosas las determinaciones directas; prcticamente se circunscriben a compuestos de uranilo (las sales de uranio tetravalente y los uranatos no son fluorescentes), algunos elementos pertenecientes a las tierras raras [Ce(III), Eu(III), Tb(III), Dy(III)] y Tl(I). Este ltimo, en presencia de cloruro (TlCl43) muestra una intensa emisin fluorescente a 450 nm. Un ensayo cualitativo para Tl(I) se basa en su fluorescencia violeta en presencia de KCl. b) Formacin de quelatos fluorescentes. La formacin de quelatos fluorescentes por combinacin de un in metlico con un ligando orgnico proporciona uno de los mtodos ms sensibles y selectivos para la determinacin de muchos elementos. En la tabla 4.1. se muestran algunos ejemplos. La mayor parte de las aplicaciones inorgnicas de la fluorimetra se han desarrollado para elementos que no son de transicin, pues aunque muchos iones metlicos de transicin forman quelatos muy estables y complejos con ligandos aromticos, un nmero relativamente pequeo de ellos son fluorescentes. Ello se debe a lo siguiente: en primer lugar, muchos iones de transicin son paramagnticos, lo cual favorece el cruzamiento entre sistemas y, en consecuencia, disminuye la probabilidad de desactivacin por fluorescencia. Adems, muchos complejos de metales de

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transicin poseen una gran cantidad de niveles energticos poco espaciados, lo cual aumenta la probabilidad de desactivacin por conversin interna.
Tabla 4.1. Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas

Especie Ag+ Al3+ Al3+ Cu2+ Li+ Sn4+

Quelatos fluorescentes Sensibilidad Reactivo ( g/mL) 0.01 0.05 0.007 0.1 0.2 0.1

Butilrodamina S Morina Rojo de alizarina R Luminocupferrn 8-hidroxiquinolena Flavonol

Especie Cl F PO43

Determinaciones indirectas Sensibilidad Reactivo ( g/mL) Nitrato de uranilo Almorina Almorina 1.0 0.2 0.05

c) Determinaciones indirectas. Algunos aniones, tales como F o CN pueden determinarse indirectamente por medida de la disminucin de la intensidad de fluorescencia de un determinado quelato (tabla 4.1.). As, por ejemplo, el fluoruro puede determinarse indirectamente mediante el descenso de la fluorescencia que su presencia ejerce sobre la fluorescencia del complejo aluminiomorina, con un lmite de deteccin de 0.2 g/mL. En otros casos tiene lugar la liberacin de un ligando y la formacin posterior de un quelato fluorescente con otra especie. As, es posible la determinacin de cianuro mediante el proceso siguiente:
SO
2
3K

SO
+ 4 CN

3K

+ Pd(CN)

N
O
Pd/2

O
SO
3K

2 4

Mg

2+

N
O
Mg/2
fluorescente

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Sustancias orgnicas
Existe una amplia variedad de compuestos orgnicos que pueden determinarse por mtodos fluorimtricos a niveles inferiores a 1 p.p.m. (g/mL), y algunas de las especies ms fluorescentes, tales como la fluoerescena o la quinina a niveles considerablemente inferiores. Hay que recordar que, en principio, presentarn fluorescencia molecular especies altamente absorbentes, como compuestos no aromticos altamente conjugados, aromticos y heterocclicos. Por eso, gran cantidad de hidrocarburos, colorantes, cidos, aldehdos, alcoholes, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, pesticidas, porfirinas, esteroides, frmacos, etc. son susceptibles de ser detectados o determinados por mtodos fluorimtricos. A modo de ejemplo, puede citarse la determinacin de vitaminas, interesante desde el punto de vista histrico, por ser uno de los primeros grupos de compuestos biolgicamente activos para los que se describieron mtodos fluorimtricos. Muchos de estos compuestos tienen estructuras que presentan fluorescencia nativa, mientras que otros pueden convertirse en fluorforos por procedimientos sencillos (tabla 4.2.)
Tabla 4.2. Determinacin fluorimtrica de vitaminas

Vitamina A B1 B2 B6 B12 C D2 D3 E K

Reactivo fluorescencia nativa + ferricianuro fluorescencia nativa +KMnO4 fluorescencia nativa ac. dehidroascrbico + o-fenilendiamina + ac. tricloroactico fluorescencia nativa

ex 340 365 370 350 275 350 390 270

em 480 445 440 450 305 430 480 370

Mtodos luminiscentes

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La vitamina A puede determinarse aprovechando la fluorescencia nativa que presenta, midiendo la radiacin emitida a 480 nm.

CH3
.

CH3

CH3

CH3

CH3 CH2 OH

CH3
Vitamina A
Dentro del grupo de vitaminas B, las hay que presentan fluorescencia nativa, como la B2 (riboflavina) y la B12 (cianocobalamina), mientras que otras, como la B1 (tiamina) y la B6 (piridoxina) necesitan una transformacin previa, lo cual se consigue por oxidacin con ferricianuro y permanganato rspectivamente. La vitamina C requiere la transformacin previa en cido dehidroascrbico y posterior condensacin con o-fenilendiamina, para originar un fluorforo azul. Por su parte, las vitaminas D2 y D3 dan productos altamente fluorescentes cuando se tratan con cido tricloroactico y otros cidos. El tocoferol (vitamina E) puede determinarse fluorimtricamente haciendo uso de su fluorescencia nativa, o bien, puede condensarse con o-fenilendiamina, despus de oxidacin para dar un derivado fluorescente de fenacina. Para la vitamina K no se han descrito mtodos fluorescentes debido a que sufre descomposicin a la luz ultravioleta. Dentro de este epgrafe general en el que se trata de las aplicaciones de la fluorimetra a la deteccin y determinacin de compuestos orgnicos, se indican seguidamente algunas aplicaciones dentro de campos concretos.

Qumica clnica. La ms extensa aplicacin de los mtodos fluorimtricos, en trminos de nmero de anlisis realizados por dia, tiene lugar, probablemente, en qumica clnica. Muchas determinaciones clnicas importantes se realizan rutinariamente por estos mtodos en muchos laboratorios. La alta sensibilidad, simplicidad y bajo coste de la instalacin son factores importantes en la adopcin de estos mtodos. De los centenares de mtodos descritos para decenas de compuestos diferentes, se citan, a modo de ejemplo, y como curiosidad algunos de ellos.

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La determinacin de fenilalanina es posible fluorimtricamente usando solamente 25 L de suero. Es importante esta determinacin para la prevencin de ciertos tipos de subnormalidad, ya que, la incapacidad para metabolizar este aminocido hace que tenga lugar su acumulacin en los tejidos, originando daos en el cerebro y retraso mental progresivo. Asimismo, pueden determinarse estrgenos en orina, en concentraciones del orden de 0.05 g/mL, corticosteroides, de gran importancia para evaluar la funcin de las glndulas suprarrenales, catecolaminas, importantes por su influencia sobre el sistema vascular, porfirinas en orina, que pueden servir para indicar defectos en la mdula sea, trastornos hepticos e incluso envenenamiento por plomo, as como otras especies de gran importancia prctica en muchos casos de inters clnico. La fluorimetra tambin se utiliza con xito en anlisis bioqumico. As, por ejemplo, es posible la determinacin de la secuencia de nucletidos en el ADN con marcas fluorescentes, lo cual es fundamental para la elaboracin de los cdigos genticos. La forma de proceder consiste en "marcar" las unidades fundamentales de terminacin de cadena con grupos fluorescentes que emitan a longitudes de onda determinadas. Anlisis forense. La gran sensibilidad de muchos mtodos fluorimtricos hace que sean particularmente adecuados en muchas determinaciones relacionadas con anlisis forense. Como ejemplo se muestra seguidamente la forma de detectar huellas digitales latentes por fluorescencia producida por lser*
Cuando un dedo presiona sobre una superficie, aproximadamente 0.1 mg de material permanece adherido a ella. De l, el 98-99 % es agua, que se evapora, quedando un residuo del orden de 1 g. Aproximadamente, la mitad son sustancias inorgnicas (por ejemplo, NaCl) y el resto una mezcla de sustancias orgnicas (aminocidos, lpidos, vitaminas). La deteccin de los restos de aminocidos se lleva a cabo por tratamiento con ninhidrina (I), la cual reacciona con ellos originando un producto prpura (II), no fluorescente, invisible si la cantidad es muy pequea.

* Anal. Chem. 61, 557 A (1989).

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O
.

O
OH OH

N=
O
[II]

O
[I]

Posteriormente, por tratamiento con cloruro de cinc, se forma un producto fluorescente (III) que se pone de manifiesto mediante su fluorescencia inducida por lser.

O
N

Zn

O
H2 O

H2 O Cl [III]

Frmacos y drogas. La fluorimetra tambin encuentra amplia aplicacin en el anlisis de frmacos y drogas. Su importancia se basa en la gran sensibilidad y selectividad de las tcnicas fluorimtricas. Hay que considerar que la farmacologa requiere mtodos analticos capaces de distinguir entre varios medicamentos y sus productos metablicos. Debido a que muchos frmacos se administran en dosis muy pequeas, con frecuencia inferiores a 100 g diarios, los mtodos analticos deben ser altamente sensibles, sensibilidad que debe ser suficiente para detectar las pequeas cantidades expulsadas del organismo.

En la tabla 4.3. se muestran algunos ejemplos de determinaciones fluorimtricas para este tipo de sustancias.

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Tabla 4.3. Determinacin fluorimtrica de frmacos y drogas

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Sustancia Adrenalina Ac. saliclico Ampicilina Aspirina Atropina Codeina Digital Estreptomicina LSD Morfina Pentotal Quinina

Condiciones pH 1 pH 11 hidrlisis HAcCHCl3 eosina pH 1 HCl-glicerina pH 13 pH 7 pH 1 pH 13 pH 1

ex (nm) 295 310 346 280 365 245,285 350 366 325 285 315 350

em (nm) 335 435 422 335 556 350 465 445 365 350 530 450

Sensibilidad (g/mL) 0.1 0.1 0.05 0.01 1.0 0.1 0.1 0.1 0.002 0.1 0.1 0.002

En Qumica Agroalimentaria tambin se utilizan las tcnicas luminiscentes con cierta extensin. As, por ejemplo, los antioxidantes son sustancias que se aaden a los alimentos que contienen grasas o aceites para evitar su degradacin durante el proceso de elaboracin. Una de las sustancias empleadas es el hidroxianisol butilado (BHA). Esta sustancia est permitida por la legislacin vigente y puede separarse por destilacin con arrastre en corriente de vapor y determinarla directamente en el destilado por espectrofluorimetra (ex=293 nm; em=323 nm). Contaminacin ambiental. Muchas aplicaciones de los mtodos fluorimtricos en relacin con la contaminacin atmosfrica se refieren a la determinacin de hidrocarburos aromticos polinucleares, muchos de los cuales son cancergenos. En ocasiones, pueden cuantificarse productos no fluorescentes mediante una reaccin

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previa que origine un fluorforo y en combinacin con tcnicas de separacin cromatogrfica. As, por ejemplo, se han encontrado isocianatos alifticos (muy perjudiciales para la salud) en el aire de lugares de trabajo donde se emplean espumas de poliuretano. El procedimiento consiste en tratar con 1-naftil-metilamina para formar derivados fluorescentes que pueden separarse por cromatografa lquida.

. NH 2 NCO . NCO diisocianato + 2 NHCNHCH 2 derivado fluorescente . NHCNHCH 2

Respecto a la contaminacin de aguas, se encuentra un interesante ejemplo en el uso del espectro de fluorescencia casi como "huella digital" para la identificacin de crudos y otros materiales petrolferos procedentes de vertidos. La tcnica, relativamente moderna, proporciona unos resultados tan dignos de confianza, al menos, como los obtenidos por procedimientos de identificacin convencionales, habiendo sido adoptada por los servicios de guarda costas de algunos pases.

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FOSFORESCENCIA
Las medidas de fosforescencia se llevan a cabo de forma anloga a las de fluorescencia, excepto en lo siguiente: la muestra normalmente se mide a la temperatura del nitrgeno lquido (77K) para minimizar la desactivacin por colisiones, y la excitacin debe ser interrumpida un cierto tiempo para observar la emisin de fosforescencia en ausencia de la emisin fluorescente. Para ello se utilizan dispositivos como el representado en la figura 4.6.
cubeta con la muestra vaso Dewar con N
2

lquido

.
Figura 4.6. Medida de fosforescencia.

En cuanto a las aplicaciones, la fosforimetra no ha tenido una utilizacin tan amplia como la fluorimetra, debido probablemente a la necesidad de trabajar a bajas temperaturas y a la poca precisin de las medidas. Sin embargo, la gran selectividad que potencialmente presenta esta tcnica la hace particularmente adecuada para algunas determinaciones. As, por ejemplo, de entre las muchas sustancias que normalmente se encuentran en la sangre, solo el triptofano presenta una cierta fosforescencia. Ello hace que la sangre normal muestre muy poca fosforescencia, lo cual hace posible la determinacin de un cierto nmero de frmacos fosforescentes presentes a nivel de trazas. Las medidas de fosforescencia a temperatura ambiente pueden llevarse a cabo en ocasiones sobre compuestos adsorbidos en un soporte rgido, como papel de filtro, lo cual minimiza la desactivacin del estado triplete en forma no radiante.

Mtodos luminiscentes

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QUIMIOLUMINISCENCIA
La quicio-luminiscencia se origina cuando se produce una especie excitada como consecuencia de una reaccin qumica. A + B > X* X* > X + h El nmero de reacciones qumicas que dan lugar a productos luminiscentes es muy escaso, lo cual limita las posibilidades de uso de esta tcnica. Sin embargo se observan ciertas ventajas en orden a su alta selectividad, simplicidad y gran sensibilidad. La instrumentacin necesaria para llevar a cabo medidas quicio-luminiscentes es muy simple; nicamente es necesario un recipiente donde tenga lugar la reaccin y un tubo fotomultiplicador para detectar la radiacin emitida. No suele ser necesario dispositivo alguno para seleccionar la longitud de onda, ya que la nica fuente de radiacin es la reaccin qumica. La mayor parte de las aplicaciones analticas de la quicio-luminiscencia en fase lquida se basan en la medida de la luminiscencia producida por ciertos reactivos, como luminol [I] y lucigenina [II] en presencia de oxidantes y en medio alcalino.
CH N
+

NH
.

O
NH NH
O
N+
.

CH
[II]

[I]

La oxidacin del luminol da lugar a una luminiscencia azul con un mximo de emisin a 425 nm, originada en un proceso del tipo siguiente:

NH 2 .

O NH NH O + OH + O 2

NH 2 COO

+ N 2 + 2 H2 O + h COO

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La intensidad de la luminiscencia producida por el luminol y la lucigenina se modifica frecuentemente por la presencia de ciertos iones metlicos, lo cual proporciona un mtodo muy sensible para su determinacin. En muchos casos se observa una exaltacin de la intensidad de la radiacin emitida, y en algunos se produce una inhibicin de la luminiscencia. En la tabla 4.4. se muestran algunos ejemplos de determinaciones de iones metlicos por este procedimiento.
Tabla 4.4. Determinacin quimioluminiscente de metales

Especie Co(II) Cu(II) Fe(II) Hg(II) Hg(II) V(IV) Ti(IV)

Reactivo luminol + H2O2 luminol + H2O2 luminol + H2O2 luminol + H2O2 lumniol+H2O2+Cu2++CN luminol + O2 + P2O74 luminol + H2O2 + Cu2+

Sensibilidad 109 M 109 M 109 M 0.2 g/mL 0.002* g/mL 0.002 g/mL 0.02* g/mL

*Atenuacin de la quimioluminiscencia

En muchos casos, los iones metlicos ejercen un efecto cataltico sobre la oxidacin del reactivo. Algunos sistemas de este tipo, basados en la oxidacin del luminol catalizada por iones metlicos, se han adaptado para el anlisis de oxidantes, tales como H2O2, ClO, Br2, I2, Fe(CN)63 y MnO4, obtenindose lmites de deteccin del orden de 109 a 1010 M. Asimismo, determinadas especies orgnicas presentan tambin un efecto cataltico o inhibidor sobre la reaccin del luminol con el perxido de hidrgeno o con el oxgeno, haciendo posible su determinacin. As, por ejemplo, el efecto cataltico de la hemoglobina sobre la oxidacin del luminol permite detectar la presencia de sangre en diluciones de 1 en 107. La quicio-luminiscencia tambin se utiliza para el anlisis de gases, siendo particularmente importantes los mtodos desarrollados para ciertos contaminantes atmosfricos. As, los analizadores automticos para el NO se basan en la reaccin quicio-luminiscente entre dicha especie y ozono: NO + O3(reactivo) > NO2* + O2 NO2* > NO2 + h

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La respuesta es lineal entre 1 ppb y 10000 ppm. Esta reaccin se utiliza tambin para la determinacin de NO2 en muestras de inters ambiental. En este caso, es necesaria una reduccin previa de NO2 a NO, lo cual se lleva a cabo operando a 800 en presencia de radiacin ultravioleta.

NO 2

UV 800

NO
+O 3

NO 2 * O 2 + NO 2 + h

El propio ozono puede ser determinado midiendo la luminiscencia producida por reaccin con rodamina B adsorbida en la superficie de gel de slice. Otro ejemplo de proceso quimioluminiscente es el basado en la reaccin de un oxidante, como el flor, con especies orgnicas que contengan el grupo tio: RSR + fluor > Productos + h Esta reaccin es la base del detector quicio-luminiscente utilizado en cromatografa, especfico para esos compuestos orgnicos.