MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Katedra Technologii Polimerw

ANALITYKA PROCESOWA wiczenie laboratoryjne MIKROSKOPIA OPTYCZNA

Przemysaw Sielicki Pokj 107 Chemia C
Waciwoci falowe wiata wiato jest niosc energi fal, zoon z pl: elektrycznego i magnetycznego. Fale wietlne stanowi niewielki fragment widma promieniowania elektromagnetycznego w przedziale czstotliwoci midzy 4,31014 a 71014 drga na sekund. Najwiksz czstotliwo rejestrowan przez oko ludzkie ma wiato fioletowe, natomiast najmniejsz czerwone. Dugoci fal odpowiadajce temu zakresowi barw zawieraj si w przedziale 400-750 nm. Fale wietlne rozchodz si w prni ze sta prdkoci c, rwn 3108 m/s. Wektory drga natenia pola elektrycznego E, le w paszczynie prostopadej wzgldem paszczyzny wyznaczonej przez wektory natenia pola magnetycznego M (rys. 1). Wektory drga E i M maj kierunki prostopade do kierunku wektora prdkoci rozchodzenia si fali, a zatem fala wietlna jest fal poprzeczn. Obecnie uwaa si, e wiato ma natur dwoist: falow i korpuskularn (kwantow). W niektrych zjawiskach ujawnia sw natur falow (dyfrakcja, interferencja, dyspersja, polaryzacja, zaamanie i odbicie wiata), natomiast w innych korpuskularn (zewntrzny efekt fotochemiczny).

1|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Rys. 1 Wzajemne prostopade uoenie wektorw drga natenia pola elektrycznego (E) i magnetycznego (M) fali elektromagnetycznej. Wektory maj kierunek prostopady do kierunku rozchodzenia si fali

Polaryzacja wiata Wektor drga natenia pola elektrycznego (E) i magnetycznego (M) fal wietlnych le w rnych paszczyznach, ale pozostaj stale pod ktem prostym wzgldem siebie oraz wzgldem kierunku rozchodzenia si fal. Liczba moliwych paszczyzn drga jest nieograniczona. Jeeli aden kierunek drga nie jest wyrniony, to fala jest niespolaryzowana. Jednak fale wietlne s falami poprzecznymi i jako takie mog zosta spolaryzowane. Jeli wektory drga E le tylko w jednej paszczynie (i towarzysz im wektory drga M wtedy take w jednej paszczynie, prostopadej do paszczyzny wektorw drga E), to fala taka jest spolaryzowana liniowo (rys. 2). Za paszczyzn polaryzacji przyjmuje si paszczyzn wektora drga E.

Rys. 2 Polaryzacja wiata. W wietle niespolaryzowanym liczba moliwych paszczyzn wektora drga pola elektrycznego jest nieograniczona (dla uproszczenia przedstawiono tylko dwie paszczyzny drga wektorw natenia pola elektrycznego: poziom i pionow). Po przejciu przez polaryzator drgania zachodz tylko w jednej paszczynie tu pionowej

Polaryzacj wiata mona uzyska, przepuszczajc fale wietlne przez polaryzator. Po przejciu przez polaryzator nastpuje uporzdkowanie kierunkw wektorw drga E i zachodz one ju tylko w jednej paszczynie. Rozszczepienie wiata

2|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Rozszczepienie wiata, czyli dyspersja, nastpuje podczas przechodzenia wiata zoonego przez orodki materialne (orodki przezroczyste). Przykadem wiata zoonego jest wiato biae, ktre przechodzc z jednego orodka do drugiego, o innym wspczynniku zaamania, ulega rozszczepieniu na barwy skadowe. Dzieje si tak dlatego, e tylko w prni fale o rnych dugociach (ktrym odpowiadaj rne barwy) poruszaj si z jednakow prdkoci c (w prni prdko rozchodzenia si fali nie zaley od jej czstotliwoci). Natomiast w orodkach materialnych prdko rozchodzenia si fali zaley od jej wietlnej zalenoci od jej dugoci (a tym samym od czstotliwoci) w ten sposb, e im mniejsza jest dugo fali tym wolniej si ona porusza w orodku materialnym. Rnic prdkoci fali wietlnej w orodku i prni wyraa si za pomoc wspczynnika zaamania n (rys. 3). Wspczynnik ten zaley od barwy wiata (czyli od dugoci fali wietlnej) przechodzcej przez orodek: wraz ze wzrostem dugoci fali wspczynnik zaamania maleje. Ciaa bezbarwne najsilniej zaamuj wiato fioletowe, a najsabiej czerwone.

Rys. 3 W przypadku zaamania fal kt padania jest wikszy od kta zaamania , jeeli prdko fali c1 w orodku 1 jest wikszy od prdkoci c2 w orodku 2.

Dyfrakcja i interferencja Falowa natura wiata ujawnia si podczas przechodzenia wiata przez niewielkie szczeliny, otwory lub jeli wiato natrafia na przeszkody. Gdy wiato pada na przeszkod, cz fali zostaje pochonita lub odbita, natomiast cz przechodzi przez otwr w przeszkodzie (rys. 4). Jeeli otwr jest odpowiednio duy w porwnaniu z dugoci fali, to przechodzce promienie wietlne w zasadzie rozchodz si prostoliniowo. W tym przypadku na ekranie powstaje cie, a granica midzy jasn i ciemn obrazu jest wyranie widoczna (rys. 4a) Kiedy promienie wietlne przechodz przez wsk szczelin (szeroko szczeliny jest tego samego rzdu wielkoci co dugo fali), uginaj si i wizka wiata si rozszerza. Wskutek tego ostra granica midzy jasnym i ciemnym obszarem obrazu ulega rozmyciu (rys. 4b). wiato rozprzestrzenia si dajc jasne koo, ktre przechodzi w obszar ciemny. W ten sposb wiato ulega ugiciu. Ugicie fal wietlnych nie jest zjawiskiem podanym, gdy chcemy oglda mae obiekty w mikroskopie. Jeli obiekt jest znaczco wikszy od dugoci fali, ugicie jest stosunkowo sabe. Natomiast, gdy wielkoci obiektw s rzdu dugoci fali padajcego na nie wiata, wtedy rozrnianie szczegw ich budowy staje si trudniejsze z powodu rozmywania si ich brzegw. Jeeli za obiekty s mniejsze od dugoci fali padajcego wiata, to nie mona w obiekcie dostrzec adnych szczegw. 3|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Rys. 4 Ugicie wiata podczas przechodzenia przez otwr: duy (a) i may (b) w porwnaniu z dugoci fali wiata. W pierwszym przypadku powstaje wyrany cie z niewielkim rozmyciem na brzegach. W drugim przypadku ugicie wiata jest wyranie widoczne, brzegi powstajcego cienia s bardziej rozmyte.

Interferencja fal wietlnych (nakadanie si fal o tej samej czstotliwoci) powoduje ich sumowanie. W wyniku tego nastpuje wzmocnienie fal w pewnych punktach przestrzeni (rys. 5a) oraz osabienie, bd wygaszenie, w innych (rys. 5b). Interferowa mog tylko fale spjne (koherentne), tzn. pochodzce z identycznych rde promieniowania, a wic o drganiach majcych ten sam lub podobny kierunek.

Rys. 5 Interferencja fal. Skrajne przypadki sumowania fal o zgodnych fazach (a) i fazach przesunitych wzgldem siebie o p dugoci fali (b).

4|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Zestawy soczewek, pozwalajce uzyskiwa znaczne powikszenia, znane byy holenderskim szlifierzom soczewek w kocu XVI wieku. W tym rodowisku powsta okoo 1590 roku pierwszy mikroskop. W marcu 1625 po raz pierwszy uyto sowa "mikroskop" -pojawio si ono w licie jednego z badaczy do woskiego ksicia Federiga Cesiego. Waciwy rozwj mikroskopu nastpi jednak dopiero w drugiej poowie XVII wieku. Wczesne mikroskopy daway niewielkie powikszenia (do 60 razy) z uwagi na wady wczesnych soczewek. Takim mikroskopem, powikszajcym zaledwie 40-krotnie, angielski uczony Robert Hooke odkry okoo 1665 roku komrkow budow organizmw ywych. Przyrodnik holenderski i kupiec bawatny Antony van Leeuwenhoek skonstruowa udoskonalony mikroskop stosujc nadzwyczaj dokadnie oszlifowane soczewki o bardzo krtkiej ogniskowej. Taki mikroskop dawa ju powikszenie 270krotne, chocia jego wysoko wynosia tylko 5 cm i zawiera tylko jedn soczewk. We wrzeniu 1674 roku donis Towarzystwu Krlewskiemu w Londynie, e za pomoc zbudowanego wasnorcznie mikroskopu udao mu si dostrzec "bardzo mae yjtka". Czowiek po raz pierwszy zobaczy bakterie. W drugiej poowie XVIII wieku mikroskop wyposaono w obiektywy achromatyczne skonstruowane przez Anglika, Johna Dollonda i Niemca, Josepha von Fraunhofera. W 1827 roku Woch Giovanni B. Amici wynalaz obiektyw immersyjny. W 1872 roku niemiecki fizyk Ernst Abbe wyposay mikroskop w przyrzd owietlajcy. Na pocztku XX wieku, mikroskop optyczny pozwala ju uzyskiwa powikszenia ok. 2000-krotne. W 1931 roku zesp fizykw niemieckich pod kierunkiem fizyka Ernsta Ruska (ktry otrzyma za to Nagrod Nobla), skonstruowa mikroskop elektronowy, ktrego wersj uyteczn zbudowaa w 1938 roku firma Siemens. Pozwala on uzyskiwa powikszenia rzdu 250 tys. razy. Mikroskop optyczny - przyrzd optyczny sucy do otrzymywania silnie powikszonych obrazw maych obiektw, okrelenia ich ksztatw i rozmiarw. Mikroskop skada si w najprostszym przypadku z obiektywu i okularu (s to 2 skupiajce ukady soczewek) oraz z ukadu owietlajcego. Powikszenie maksymalne uywanych zwykle mikroskopw wynosi 1350 razy, a przy zastosowaniu immersji do 2000 razy. Sposoby obserwacji przedmiotw w mikroskopii optycznej: - w wietle przechodzcym spolaryzowanym i niespolaryzowanym, - w wietle odbitym spolaryzowanym i niespolaryzowanym. Budowa mikroskopu W kadym mikroskopie wietlnym moemy wyrni czci mechaniczne i optyczne. Znajomo budowy mikroskopu (rys. 6) oraz znajomo biegu promieni wietlnych w mikroskopie (rys. 7) jest konieczna do prawidowego posugiwania si mikroskopem i wykorzystania w maksymalnym stopniu jego moliwoci.

5|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Rys. 6 Mikroskop i jego podstawowe czci mechaniczne i optyczne

Rys. 7 Schemat biegu fal wietlnych w mikroskopie wietlnym

6|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Rys. 8 Obiektyw i objanienia informacji na nich umieszczonych

Mikroskopia w wietle przechodzcym W wietle zwykym, niespolaryzowanym mona obserwowa formy ksztatw, a take dokonywa pomiarw wielkoci krysztaw, ziaren, lub ktw midzy ich cianami i krawdziami, ktw midzy szczelinami upliwoci, okrela wspczynniki zaamania wiata, itp. Mikroskopia w wietle odbitym Przy badaniu w wietle odbitym przedmiot owietla si od strony obiektywu, a obraz tworz promienie odbite wpadajce do obiektywu. Stosuje si dwie metody obserwacji: w jasnym i ciemnym polu. Pierwszy przypadek ma miejsce wtedy, gdy promienie padajce na preparat po odbiciu zwierciadlanym wpadaj do obiektywu, za drugi wymaga, aby promienie te nie wchodziy do obiektywu. Przy jasnym polu owietla si przedmiot przez obiektyw. wiato pada na preparat z kierunku obserwacji, a po regularnym odbiciu przechodzi ponownie przez obiektyw i wpada do oka obserwatora. Przy ciemnym polu przedmiot owietla si z boku, a do obiektywu wpadaj jedynie promienie rozproszone lub odbite dyfuzyjnie. Mikroskopia w wietle odbitym jest najstarsz metod bada mikroskopowych. Stosowana jest przede wszystkim do badania preparatw nieprzezroczystych takich jak: metale, (metalografia), mineray, materiay tekstylne itp. Ostatnio coraz wikszego znaczenia nabiera zastosowanie mikroskopii w wietle odbitym do bada w przemyle tworzyw sztucznych, naukach biologicznych i medycznych, a take w przemyle materiaw budowlanych i naukach rolniczych. Podstawowe pojci i wzory Apertura numeryczna obiektywu Apertura numeryczna (NA) obiektywu to kt zawarty midzy osi optyczn obiektywu a skrajnym promieniem wietlnym, ktry jeszcze wpada do soczewki czoowej obiektywu (rys. 9). Kt () ten zaley od wspczynnika zaamania wiata w rodowisku zawartym midzy preparatem a soczewk czoow obiektywu. Od apertury numerycznej zaley zdolno rozdzielcza mikroskopu oraz jasno obrazu mikroskopowego.

7|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

Rys. 9 Graficzne przedstawienie apertury numerycznej

Zdolno rozdzielcza mikroskopu Zdolno rozdzielcza mikroskopu to najmniejsza odlego midzy dwoma punktami, ktre dostrzegane s jeszcze oddzielnie; wyraa si wzorem:

d zdolno rozdzielcza mikroskopu, dugo fali wiata uytego do obserwacji, NA apertura numeryczna, n wspczynnik zaamania wiata, - kt aperturowy Najmniejsza odlego dwch punktw, ktre moemy jeszcze dostrzec jako oddzielne w mikroskopie, musi mie wymiar rwny co najmniej dugoci fali wiata, ktrym owietlamy preparat. W wietle widzialnym granica ta wynosi 0,5 m. Powikszenie mikroskopu Powikszenie mikroskopu to iloczyn powiksze okularu i obiektywu oraz ewentualnie powiksze porednich ukadw optycznych.

P powikszenie mikroskopu, Pob powikszenie obiektywu, Pok powikszenie okularu, l dugo optyczna tubusu w metrach, fob ogniskowa obiektywu, fok ogniskowa okularu

Rodzaje mikroskopw:
MIKROSKOP FAZOWO - KONTRASTOWY - metoda kontrastu fazowego polega na przeksztaceniu modulacji falowej wiata na zauwaalne dla oka zmiany natenia wiata, czyli zmiany amplitudowe. Uzyskanie kontrastu fazowego moliwe jest przez wprowadzenie w bieg promieni mikroskopu odpowiedniej pytki fazowej. Najodpowiedniejsze pytki s w ksztacie piercienia. Uwidocznienie obrazu przedmiotu w polu widzenia uzyska mona przez zrnicowanie natenia jasnoci obrazu przedmiotu i ta. Fala przechodzca przez obiekt fazowy jest w stosunku do fali przechodzcej przez rodowisko opniona, mamy zatem do czynienia z przesuniciem fazowym 8|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

ujemnym. Przy zastosowaniu pytki fazowej dodatniej uzyskamy ciemny obraz na jasnym tle, czyli kontrast dodatni. MIKROSKOP ANOPTRALNY mikroskop ten mia na celu usunicie wad mikroskopu fazowego. Mikroskopia anoptralna wprowadza piercienie fazowe zawierajce silnie absorbujce ciaa. Obiektywy anoptralne tworz obrazy o wikszym kontracie oraz plastycznoci, wskutek braku szkodliwych promieni odbitych. MIKROSKOP INTERFERENCYJNY - mikroskop optyczny umoliwiajcy obserwacj ksztatu lub struktury badanego przedmiotu dziki wykorzystaniu interferencji promieni wietlnych przechodzcych przez przedmiot (lub wizki wiata przechodzcej przez przedmiot i wizki odniesienia). Zjawisko interferencji zwiksza kontrast obrazw mikroskopowych. Stosowany w biologii (do badania ywych komrek i tkanek), w metalografii i fizyce wkien. MIKROSKOP POLARYZACYJNY - suy do badania dwuomnoci preparatw mikroskopowych, stosuje si zwykle ukad dwch elementw polaryzujcych wiato; s to polaryzator i analizator zwykle nakadany na okular w specjalnej oprawie. Suy do bada przedmiotw anizotropowych w wietle spolaryzowanym (kruszcw, mineraw, uli, preparatw biologicznych, i in.). MIKROSKOP INTERFERENCYJNO - POLARYZACYJNY - przeznaczony do obserwacji i pomiaru mikroobiektw fazowych (przezroczystych) i amplitudowych (pochaniajcych wiato). Pracuje w wietle przechodzcym wykorzystujc interferencj wiata spolaryzowanego do pomiaru rnic drg optycznych wystpujcych w preparacie. MIKROSKOP FLUORESCENCYJNY - mikroskop do obserwacji zjawisk fluorescencji w badanej substancji. Najprostszym wyposaeniem tego mikroskopu s dwa filtry: jeden przepuszczajcy krtkofalow cz widma wiata biaego umieszczonego na owietlaczu i drugi, nakadany na okular mikroskopu, odcinajcy wiato przepuszczone przez filtr pierwszy. MIKROSKOP KRUSZCOWY - jest to mikroskop polaryzacyjny, jest podstawowym narzdziem w petrografii kruszcw. Rni si od mikroskopu przeznaczonego do obserwacji w wietle przechodzcym. Jego czci charakterystyczn jest owietlacz boczny (opakiluminator) MIKROSKOP PROJEKCYJNY - mikroskop z wbudowanym ukadem projekcyjnym pozwalajcy rzutowa obraz przedmiotu na ekran (np. matwk). MIKROSKOP RENTGENOWSKI - przyrzd do otrzymywania obrazw maych przedmiotw przy uyciu promieni rentgenowskich. Otrzymuje si dziki niemu obrazy wewntrznej budowy przedmiotw nieprzeroczystych dla promieni wiata widzialnego i elektronw. Przy zastosowaniu krtkiego promieniowania rentgenowskiego uzyskuje si, w porwnaniu z mikroskopi w wietle widzialnym, wiksz rozdzielczo, a take wykorzystuje si rn zdolno absorpcyjn promienia rentgenowskiego przez obiekty. MIKROSKOP STEREOSKOPOWY - pozwala on, szczeglnie przy maych powikszeniach i stosunkowo duych obiektach, na osignicie znacznego wzrostu odczucia gbi, z pominiciem mudnego etapu specjalnej preparatyki. S to mikroskopy jednoobiektywowe z dwoma okularami. MIKROSKOP ULTRADWIKOWY - przyrzd pozwalajcy prowadzi obserwacj obiektw nieprzeroczystych dla wiata przy wykorzystaniu fal ultradwikowych. Stosowany m.in. w medycynie i biologii. 9|S tr o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

MIKROSKOP POMIAROWY - mikroskop umoliwiajcy mierzenie powikszonych obrazw przedmiotw (dugoci, ktw) ogldanych przez okular. MIKROSKOP JONOWY - mikroskop, w ktrym rol czynnika owietlajcego preparat obserwowany i tworzcego obraz powikszony, spenia strumie jonw np. protonw. Umoliwia uzyskanie powiksze do ok. 5 milionw razy oraz ma wiksz rozdzielczo ni mikroskop elektronowy. MIKROSKOP ZWIERCIADLANY - obiektywy zwierciadlane odznaczaj si doskona korekcj aberracji w zakresie od nadfioletu do podczerwieni. S one zupenie wolne od aberracji chromatycznej Przykadowe dziedziny zastosowa mikroskopii optycznej Biologia - obserwacja budowy anatomicznej mikroorganizmw - badanie fluorescencji biaek bakterii - monitorowanie wewntrznych struktur tkanek biologicznych - obserwacja efektw oddziaywania zwizkw chemicznych na organizmy Inynieria budowlana, materiaowa - badanie mikrostruktur rnych materiaw (metali, betonw, polimerw, kompozytw) - monitorowanie mikropkni w strukturach materiaw budowlanych - badanie procesw krystalizacji Analiza ywnoci - pomiar rozmieszczenia pcherzykw powietrza w produktach nabiaowych - badanie struktury ziaren zb, struktury ciast Ochrona rodowiska - badanie chloroorganicznych i fosforoorganicznych pestycydw w wodach powierzchniowych Medycyna - badanie fragmentw tkanek na obecno zmian chorobowych - oddziaywanie implant-tkanka Wykonanie wiczenia Cel wiczenia Celem wiczenia jest zapoznanie si z budow i dziaaniem mikroskopu optycznego oraz obserwacja i analiza rnych substancji z wykorzystaniem mikroskopii optycznej. Zakres i metodyka bada Analiza rnych substancji z wykorzystaniem mikroskopii optycznej. Zapoznanie si z preparatyk mikroskopow oraz z obsug mikroskopw optycznych z przystawk fotograficzn. Zapisy obrazw i ich analiza. Przebieg wiczenia 1. Przygotowanie prbek do bada mikroskopowych 2. Obserwacja prbki pod mikroskopem 3. Wykonanie zdj prbek 4. Sprawdzenie wiadomoci teoretycznych

10 | S t r o n a

MIKROSKOPIA OPTYCZNA

ANALITYKA PROCESOWA

TECHNIKA KORZYSTANIA Z MIKROSKOPU SWIETLNEGO 1. Ustawi mikroskop 15-20 cm od krawdzi stou 2. Sprawdzi czysto mikroskopu, optyczne czci (obiektyw, okular, lusterko) przetrze mikk, sucha ciereczk. 3. Wczy rdo wiata, otworzy przyson kondensorowa znajdujc sie pod stolikiem. 4. Przekrcajc rub makrometryczn podnie tubus tak, aby obiektywy znalazy sie 3 5 cm nad stolikiem. 5. Wczy w os optyczna mikroskopu obiektyw o najmniejszym powikszeniu. 6. Przygotowany preparat umieci na stoliku i docisn zaciskami. 7. Patrzc z boku zbliy maksymalnie stolik z preparatem do soczewki czoowej obiektywu. 8. Nastpnie bardzo wolno, patrzc w okular, przy uyciu ruby makrometrycznej, oddala stolik od obiektywu a do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostro obrazu nastawi za pomoc ruby mikrometrycznej. 8. Kolejno wcza w os optyczna mikroskopu obiektywy o coraz wikszej sile powikszajcej. Kadorazowo oddala stolik od obiektywu, a nastpnie patrzc z boku przestawi rewolwerem obiektyw i postpowa jak od punktu 6. 9. W przypadku mikroskopowania przy uyciu obiektyww immersyjnych naley najpierw znale obraz obiektywem suchym, a nastpnie podnie obiektyw do gry i na preparat nanie krople olejku immersyjnego. Patrzc z boku opuci obiektyw a do zanurzenia sie soczewki czoowej w olejku. Skorygowa wiato (podnie kondensor). Znale ostry obraz manipulujc rubami makro- i mikrometryczna. 10. Po zakoczeniu mikroskopowania obiektyw przemy ksylenem. 11. Zostawi mikroskop z obiektywem o najmniejszym powikszeniu w osi optycznej. Sprawozdanie Zajcia odbywa si bd w sali 107 w chemii C. wiczenia bd realizowane w podgrupach. Kada z podgrup wykonuje sprawozdanie niezalenie. Na pocztku sprawozdania prosz poda tytu wiczenia, nazwiska uczestnikw podgrupy i numer podgrupy. W sprawozdaniu naley opisa przebieg wiczenia, doczy obliczenia, porwna wyniki i przedstawi wnioski. Na oddanie sprawozdania jest 7 dni. Sprawozdanie moe by wykonane w formie elektronicznej. Prosz o przyniesienie na laboratorium pami USB (tzw. PenDrive) wystarczy jeden PenDrive na jedn podgrup. 11 | S t r o n a