Universidad de Chile Facultad de Ciencias Depto.

Qumica

Cintica Enzimtica: Actividad enzimtica En Peroxidasa de Rbano

Autores: Muriel Andrade Katherine Soto Profesora: Mara Cecilia Rojas

Fecha: 10/06/10

Introduccin
En los organismos vivos, y en particular dentro de la clula, con requeridos distintos tipos de reacciones para poder llevar a cabo distintos tipos de procesos. Un tipo de reacciones son las REDOX que a modo general ocurren por la transferencia de electrones desde un Agente Reductor a un Agente Oxidante.

En particular estas reacciones de oxidorreduccin pueden ser catalizadas por un tipo especial de enzimas llamadas Oxidoreductasas, estas se clasifican de acuerdo al grupo sobre el cual actan, ya sea quitando o entregando electrones. De esta clasificacin se destacan las Deshidrogenasas, las Reductasas y las Peroxidasas. Las peroxidasas segn su clasificacin actan con un perxido como aceptor de los electrones y en su gran mayora corresponden a hemoprotenas. La Peroxidasa de Rbano (HRP), es una hemoproteina y acta sobre Perxido de hidrgeno como aceptor de los electrones siguiendo un mecanismo radicalario de acuerdo a las siguientes reacciones:
HRP + H 2 O 2 Complejo I + H 2 O Complejo I + AH 2 Complejo II + AH Complejo II + AH 2 HRP + AH + H 2 O 2AH 2 + H 2 O 2 2AH +2H 2 O

Donde AH2 representa a un sustrato que puede ser algn fenol u otro compuesto aromtico, en el caso particular de este trabajo, corresponde al Guayacol (2-metoxifenol) un derivado incoloro del Catecol (1,2-dihidroxibenceno) el cual al oxidarse por la combinacin de los radicales libres de los producto entre si, produce un compuesto de color rojo ladrillo.
2AH A + AH 2

En el presente informe, se muestra una serie de experimentos realizados para comprobar la accin de una enzima en la oxidacin del guayacol en presencia de peroxido de hidrogeno. Para esto se mide el tiempo de la reaccin catalizada por la enzima, luego se hacen controles variando la presencia de algunos de los dos sustratos o de la enzima misma, tambin se verific la actividad enzimtica con ensayos utilizando un inhibidor o variando las condiciones de reaccin como son la temperatura, el pH y concentracin de enzima

Objetivos Generales:
Determinacin cualitativa de las propiedades cinticas de la enzima Peroxidasa de rbano (HRP). Disear protocolos para demostrar que se trata de una reaccin enzimtica.

Desarrollo Experimental

Experimento 1: Preparacin del medio de incubacin, observacin y desarrollo de reacciones a modo de control. T = 16C. Objetivo: Comprobar que la reaccin corresponde a una reaccin enzimtica.

i- Preparacin del medio de incubacin. Tabla 1: Concentraciones de cada reactivo Compuesto Citrato de Sodio (pH 5) Guayacol H2O2 Extracto de Rbano H2O Volumen Total (mL) Concentracin Inicial (M) 0,5 0,05 8,82x10-4 (3%) Concentracin Final (M)* 0,05 5E-3 8,82x10-5 (0,3%) Volumen requerido (mL) 0,3 0,3 0,3 0,2 1,9 3

Tabla 2: Intensidad del color con respecto al tiempo. Tiempo (s) 0 (sin enzima) 3 20 63 110 170 240 300 480 600 Intensidad Relativa** 0 + ++ +++ ++++ +++++ ++++++ +++++++ ++++++++ +++++++++

ii- Controles.

Control:

1. Reaccin sin H2O2. 2. Reaccin sin Extracto de Rbano (Enzima). 3. Reaccin sin Guayacol 4. Reaccin con Extracto de Rbano hervido.

Tabla 3: Volmenes de los componentes para los diferentes controles realizados. Compuesto Control 1 Control 2 Control 3 Control 4 Citrato de sodio pH 5 (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 Guayacol
0,05 M (mL) 0,3

H2O2
(mL)

0,3 0,3

0,3 0,3 0,3

Extracto de Rbano (mL) 0,2 0,2 0,2

H2O
(mL)

2,2 2,1 2,2 1,9

Tabla 4: Resultados de los controles. Control 1 2 3 4 Observaciones No aparece coloracin. No aparece coloracin. No aparece coloracin. No aparece coloracin.

Experimento 2: Disear y realizar ensayos variando: concentracin de enzima, pH y en presencia de un inhibidor. T = 16C. Objetivo: Comprobar el efecto de las variaciones del medio sobre la cintica enzimtica.

a. Ensayo 1: Variacin del pH del medio de incubacin usando buffer de Citrato de sodio a pH 4, 5 y 6. Tabla 5: Volmenes utilizados. Volumen total 3 ml. Comp. Tubo Tubo Tubo Tampn pH 4 (mL) 0,3 Tampn pH 5 (mL) 0,3 Tampn pH 6 (mL) 0,3 Guayacol
0,05 M (mL) 0,3

H2O2
(mL)

Enzima
(mL)

H2O
(mL)

0,3 0,3

0,3 0,3 0,3

0,2 0,2 0,2

1,9 1,9 1,9

Tiempo (s) 320 400 510

b. Ensayo 2: Variacin de la concentracin de enzima Tabla 6: Volmenes usados. Volumen total 3 mL. Comp. Tubo Tubo Tubo Extracto de rbano (mL) 0,1 0,2 0,3 Tampn pH 5 (mL) 0,3 0,3 0,3 H2O2
(mL)

Guayacol 0,05
M (mL)

H2O
(mL)

0,3 0,3 0,3

0,3 0,3 0,3

2 1,9 1,8

Tiempo (s) 720 265 160

c. Ensayo 3: reaccin en presencia de un inhibidor Tabla 7: Volmenes usados. Volumen total 3 mL. Compuestos Tubo 1 Observaciones Guayacol
0,05 M (mL)

Ac. Ascrbico
0,05 M (mL)

Tampn
pH 5 (mL)

H2O2
(mL)

Enzima
(mL)

H2O
(mL)

0,3 0,3 No se produce coloracin.

0,3

0,3

0,2

1,6

*Clculos de concentraciones usando: Ci Vi = Cf Vf ** Intensidades interpretadas en una escala arbitraria desde 0 a 9 + siendo 0 la solucin incolora y 8 el mximo de intensidad alcanzado por la solucin en el perodo de observacin. *** Tiempo estimado en que el color deja de cambiar significativamente alcanzando la coloracin mxima.

Concusiones.

En la primera experiencia es posible apreciar la aparicin del compuesto de guayacol oxidado (tetraguayacol), compuesto que al ser coloreado servir de indicador de la reaccin, el tiempo que se midi hasta no observar mas cambio de color en la solucin. Este tiempo indica la velocidad de reaccin en las concisiones de incubacin utilizadas.

A partir de los resultados de los controles realizados, se puede afirmar que la oxidacin del guayacol en esta experiencia es una reaccin enzimtica, ya que al quitar alguno de los componentes no se produce la reaccin. De control 1 y 3 podemos extraer que la enzima necesita de ambos sustratos para catalizar la reaccin, el peroxido de hidrogeno no puede ser reemplazado por el oxigeno del aire, la enzima no tendr a quin entregar los electrones liberados de la reaccin. Adems al realizar la experiencia sin el guayacol se puede observar que no hay otro sustrato dentro del extracto de rbano que pueda reaccionar e interferir con los resultados de las otras experiencias. El control 2 indica que el guayacol y H2O2 no formarn el compuesto coloreado, al menos en un tiempo prudente y en las condiciones empladas. Del cuarto ensayo se puede observar que la enzima del extracto de rbano es una enzima proteica, ya que al hervirla, la protena se desnaturaliza y ya no puede catalizar reacciones.

Al variar entre los distintos valores de pH se pudo apreciar que la actividad de la enzima se vio potenciada a pH=4, lo que se tradujo en un menor tiempo para que se alcanzara la coloracin mxima, esto indica que a este pH la afinidad de la enzima por el sustrato es mayor debido principalmente a que los grupos ionizables ms cercanos al sitio activo le dan a este una conformacin ms afn con el sustrato. Segn nuestros resultados se podra esperar que el pH ptimo de la enzima se encuentre ms cerca de 4 que de 6.

A mayor volumen de extracto mayor concentracin de enzima, y a mayor concentracin de enzima menos tiempo tarda el sistema en alcanzar la coloracin mxima. Con este ensayo se comprueba que la reaccin ocurre ms rpido cuando hay ms enzima, es decir, la velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin de enzima. Esto ocurre porque cuando la concentracin de enzima es mayor hay ms sitios catalticos y ms sustrato puede ser llevado a producto en menos tiempo.

Al preparar un medio de reaccin en donde adems hubiera Acido Ascrbico no apareci coloracin, esto indica cierto tipo de inhibicin. El acido ascrbico es conocido por su efecto antioxidante y por se un atrapador radicalario, adems es sustrato de la HRP. segn esto, el efecto del acido ascrbico se puede manifestar de 3 formas: 1- Atrapando los radicales AH y evitando que estos formen el producto coloreado; 2- Compitiendo con el guayacol por el sitio activo de la enzima, es decir, tomando el rol de AH2 (inhibicin competitiva); y 3- Desactivando los complejos I y II.