UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC Programa de Ps-Graduao em Biossistemas

Apresentao de Artigo Cientfico

Fronteiras Interdisciplinares em Biossistemas

Prof. Dr. Sergio Kisaki

Aluna: Priscila dos Santos Pazini RA: 13004511

Santo Andr 2011

Introduo Molculas pequenas so comumente utilizadas como agentes teraputicos em diversos tratamentos clnicos, porm, a reduzida especificidade, a dificuldade em alcanar os alvos e a consequente necessidade de altas doses, so algumas das limitaes apresentadas por essas molculas. Essas limitaes impulsionaram estudos de mtodos alternativos e descobriu-se ento que molculas maiores como peptdeos, protenas e oligonucleotdeos, apresentam excelente potencial teraputico, alm de alta especificidade por seus alvos. Embora essas molculas maiores apresentem bons resultados, notou-se certa dificuldade na internalizao das mesmas, o que dificulta sua utilizao. A soluo apresentada para melhorar a absoro intracelular dessas molculas a utilizao de cell-penetrating peptides (CPPs). Os CPPs so pequenos peptdeos contendo entre 10 e 30 aminocidos , geralmente anfipticos, que auxiliam na distribuio intracelular de molculas e faciltam sua internalizao. Os CPPs podem ser derivados de protenas, como o caso do pAntp-(43-58) e o Tat-(48-60) ou de sequncias quimricas como o caso do Transpotan e do MAP (model amphipatic peptide). Estudos acerca dos mecanismos de atuao dos CPPs relatam que eles so capazes de formar poros na camada lipdica das membranas e que para isso necessrio uma estrutura cclica estabilizada por ligaes dissulfeto. Esse mecanismo descrito para os peptdeos antimicrobiais Protegrina-1, que possuem estrutura anfiptica, cclica, estabilizada por duas pontes dissulfeto e com grande quantidade de cargas positivas. A utilizao de dois anlogos SynB1 e SynB3 sem os resduos de cistena, mas com as cargas positivas encontradas na Protegrina-1, mostrou que eles tambm so capazes de se internalizar nas clulas, promover o transporte de drogas atravs da barreira hematoenceflica e tudo isso sem romper a membrana celular, mostrando que a atuao dos CPPs no dependente de estrutura cclica. Alm disso, relatou-se que a internalizao dos CPPs ocorre de maneira temperatura e energia-independente, em um processo no endocittico e que no depende de um receptor quiral. Para justificar esses relatos, tem sido proposto que a hidrofobicidade e a anfipaticidade dos CPPs conferem a eles a capacidade de interagir e passar atravs da matriz lipdica da membrana plasmtica. O artigo aqui mencionado realizou testes com CPPs diferentes em termos de hidrofobicidade e anfipaticidade, visando identificar se as caractersticas fsico-qumicas apresentadas conferem a eles mecanismos especficos. Alm disso, avaliou a influncia de inibidores metablicos e de endocitose na internalizao dos CPPs em cultura celular, visando identificar se o mecanismo de internalizao era endocittico ou no. As caractersticas dos CPPs utilizados encontram-se na figura abaixo, uma tabela retirada do artigo em questo.

Metodologia e resultados - Tempo de percurso: Clulas de linhagem K562 incubadas com os peptdeos SynB1, SynB3, SynB5 e pAntp-(43-58) durante um perodo de tempo de 0 120min. A quantidade de peptdeo internalizado foi determinada atravs do ensaio NBD/dithionite.

- Localizao peptdica: As clulas de linhagem K562 foram incubadas com peptdeos SynB1, SynB3, SynB5 e pAntp-(43-58) - marcados com TAMRA. Para confirmar a presena dos peptdeos na clula, sua absoro e localizao foram examinadas atravs de microscopia confocal.

- Inibio metablica e de endocitose: O teste foi realizado utilizando clulas incubadas com SynB3 e pAntp-(43-58) a 37 C com e sem diminuio de ATP e a 4 C. A reduo de ATP foi causada pela incubao em meio contendo azida de sdio e 2-deoxiD-glicose. Os controles foram realizados utilizando transferina (Tf) internalizada via endocitose receptor mediada e Lucifer Yellow (LY) internalizado via endocitose de fase fluida.

- Internalizao na presena de inibidores de endocitose: Para investigar se a internalizao dos CPPs ocorre atravs de um mecanismo de endocitose, clulas associadas a vrios tipos de inibidores Vinblastina, Nocodazol, Citocalasina D, NEM, NH4Cl, Cloroquina, Bafilomicina A1 e Nistatina foram testadas juntamente com o SynB3.

Concluses Os autores comprovaram, atravs do ensaio de tempo de percurso, que todos os CPPs eram capazes de ser internalizados e que a diferena entre a quantidade internalizada estava associada hidrofobicidade dos mesmos. Alm disso, comprovou-se atravs da internalizao dos D-enantimeros de SynB3 e SynB1, que esses vetores no requerem um receptor estreo-especfico. O ensaio de localizao peptdica mostra que os CPPs so internalizados principalmente na regio perinuclear, sugerindo que eles so seqestrados dentro de vesculas endocitticas. Alm disso, na presena de inibidores de endocitose, a quantidade de CPPs internalizada reduzida em relao ao controle, o que tambm ocorre quando esses so privados de ATP e submetidos a baixas temperaturas. Atravs desses ensaios, e de outros no citados aqui, os autores descrevem que o mecanismo de internalizao dos CPPs depende de um processo celular relacionado endocitose e que temperatura e energia dependente, ao contrrio do que era descrito em estudos anteriores.