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TURVAO DA CERVEJA A FRIO MECANISMOS E PREVENO POR MEIO DE PROTEASES ESPECFICAS PARA PROLINA

L. Edens, J.M. van der Laan e H.D. Craig DSM Food Specialties, Delft, Holanda O entendimento das reaes qumicas envolvidas no processo de turvao da cerveja, durante o armazenamento a frio, levou ao desenvolvimento de uma soluo enzimtica indita capaz de aumentar a estabilidade coloidal da cerveja. Nessa abordagem, protenas ricas em prolina, responsveis pela formao de turbidez, so seletivamente degradadas por meio de uma protease especfica para prolina. Estudos por modelos de computador sugerem que os peptdeos de baixo peso molecular, formados durante essa hidrlise, so incapazes de se ligar aos polifenis presentes, prevenindo a formao de redes coloidais. A confiabilidade do novo mtodo foi confirmada em uma srie de experimentos, realizados com uma verso grau alimentcio da enzima especfica para prolina. Conforme esperado, as cervejas processadas com esta enzima (atualmente comercializada como Brewers Clarex) mostraram excelente estabilidade coloidal. Alm disso, efeitos adversos sobre a estabilidade da espuma so minimizados devido alta seletividade da enzima. A aplicao industrial dessa nova enzima vai simplificar enormemente o processo de produo de cerveja, e oferecer vantagens significativas nos custos eliminando o uso de materiais em p, tais como polivinilpolipirrolidona (PVPP) e slica hidrogel, tornando desnecessria a utilizao de equipamentos caros para dosagem e regenerao, e evitando problemas de manipulao, estocagem e descarte. Protenas na turvao a frio Durante a fermentao e a maturao da cerveja, formam-se redes coloidais que podem precipitar, e ocasionar a turvao da cerveja engarrafada, durante o armazenamento a frio. Esses precipitados coloidais consistem de agregados de protenas e polifenis, extrados do malte e do lpulo. No processo de fabricao da cerveja, a maioria desses precipitados se forma durante a fase de maturao a frio. Os polifenis e as protenas remanescentes que poderiam levar a turvao do produto envasado, durante o armazenamento a frio, so normalmente removidos por tratamentos com PVPP ou slica hidrogel, antes ou aps a filtrao. Foi estabelecido, h muitos anos, que somente as chamadas protenas precursoras de turvao so capazes de agregar-se aos polifenis. A literatura disponvel relaciona o elevado contedo de prolina dessas protenas ao processo de formao de precipitado (1). Na cerveja, as protenas responsveis pela turvao se originam, predominantemente, da frao de gliadina rica em prolina (hordena) da cevada maltada. A prolina um aminocido distinto em muitos aspectos (2). Uma de suas caractersticas peculiares sua cadeia lateral ligada ao nitrognio da amida, introduzindo uma estrutura em anel com 5 tomos (pirrolidina) na cadeia peptdica (Fig 1). Enquanto os outros aminocidos contribuem com duas ligaes que permitem a rotao da cadeia peptdica, a prolina contribui com apenas uma, devido a esta estrutura em anel. Alm disso, a presena do volumoso anel de pirrolidina restringe a liberdade rotacional do aminocido que precede a prolina. Como resultado, os resduos de prolina conferem uma conformao rgida e extensa cadeia 1

peptdica, maximizando a exposio do anel de pirrolidina ao solvente. Mltiplas prolinas em seqncia conferem rigidez ainda maior, e acredita-se que as poliprolinas adotam uma conformao preferencial nica em soluo, chamada de hlice de poliprolina II. Devido estrutura em anel da pirrolidina, a ligao peptdica que precede a prolina no tem o hidrognio no nitrognio da amida. Como resultado, o oxignio da carbonila que precede a estrutura em anel (indicado por uma seta na Figura 1), torna-se um forte receptor de hidrognio. Essa ltima caracterstica explica por que, apesar de sua natureza hidrofbica, as prolinas freqentemente se localizam em reas das protenas expostas a solventes. Tambm explica por que este oxignio da carbonila se liga facilmente por ponte de hidrognio aos grupos hidroxila dos polifenis. Assume-se, de um modo geral, que a formao de grandes agregados protenaspolifenis guiada, principalmente, por interaes hidrofbicas (3, 4). Outras interaes, incluindo as pontes de hidrognio acima mencionadas, podem contribuir para estabilizar os agregados. As interaes hidrofbicas ocorrem pela exposio do anel hidrofbico de pirrolidina da prolina, que tende a ficar face a face com os anis aromticos presentes nos polifenis. Embora as cadeias laterais de outros aminocidos tais como, por exemplo, a fenilalanina, tambm exibam um anel hidrofbico, acredita-se que a restrio de mobilidade, a natureza extensa e a exposio a solventes das reas ricas em prolina sejam decisivas para sua peculiar aptido de se ligar aos polifenis. Fig. 1. Modelo de computador representando um resduo de prolina numa cadeia peptdica. A estrutura hidrofbica do anel de pirrolidina claramente visvel. O oxignio da carbonila ligado ao hidrognio (em vermelho), que precede imediatamente a estrutura do anel de pirrolidina, est indicado com uma seta. Os nitrognios das amidas so mostrados em azul.

Fig. 2. Modelos de computador do dmero da catequina, a procianidina B3. As reas hidrofbicas da molcula de polifenol so mostradas em branco. Os grupos hidroxila fenlicos que poderiam estar envolvidos na formao de pontes de hidrognio com protenas ricas em prolina so mostradas em vermelho (oxignio) e azul (hidrognio).

Fig. 3. Modelo de computador de uma ponte de polifenol (crculo), ligando duas cadeias peptdicas via resduos de prolina presentes em cada uma delas. Os resduos de prolina so mostrados em verde e branco.

Polifenis na turvao a frio Substncias polifenlicas tais como os flavonides, esto presentes na maioria das plantas, estando concentradas em suas sementes, pele ou casca do fruto e flores. Embora assunto para algum debate, reconhece-se que tais polifenis contribuem na preveno da oxidao e estabilidade do flavour das cervejas (5, 6, 7). 3

Os flavonides de base polifenlica, so formados, comumente, por dois anis de benzeno de cada um dos lados de um anel de trs carbonos. Grupos hidroxila adicionais, acares, oxignio e grupos metila, criam vrias classes de flavonides, tais como flavanis, flavanonas, flavonas, flavan-3-is, antocianinas e isoflavonas. Os polifenis formadores de turvao tm, pelo menos, dois grupos para ligao, cada um dos quais tem pelo menos dois grupos hidroxi num anel aromtico (8). A catequina o bloco monomrico dos polifenis mais complexos encontrados na cerveja. A procianidina B3 e a prodelfinidina B3 so dmeros da catequina. A procianidina C2 incorpora trs metades de catequina. Juntos, esses trs polifenis representam cerca de 80% do contedo fenlico da cevada (9). Foram construdos modelos tridimensionais de computador dos principais polifenis encontrados na cerveja. O modelo do dmero da catequina, procianidina B3 (Fig. 2) mostra claramente a presena de grandes reas hidrofbicas interrompidas por grupos polares hidroxila. Levando em conta todos os dados disponveis, os possveis modos de interao entre os peptdeos ricos em prolina e a procianidina B3 foram explorados usando tcnicas de modelagem por computador. Os detalhes moleculares das interaes prolina-polifenol foram estudados, titulando-se um peptdeo rico em prolina com diferentes polifenis e identificando os produtos formados por NMR (10, 11). Com base nos resultados obtidos, as interaes hidrofbicas foram maximizadas atravs de um empilhamento face a face da pirrolidina da prolina e dos anis aromticos da procianidina B3. Os graus de liberdade foram reduzidos de modo significativo quando tentamos, simultaneamente, formar uma ponte de hidrognio entre o oxignio da carbonila que precede a prolina e um dos grupos hidroxila do polifenol. Os dados obtidos mostraram que a ligao com a procianidina B3 cobre cerca de trs aminocidos, e indicaram que mais procianidinas B3 podem se ligar ao peptdeo, desde que os locais de ligao com o polifenol estejam separados por, pelo menos, trs aminocidos. Os nossos experimentos modelo tambm mostraram que uma nica molcula de procianidina B3 ligada a um peptdeo contendo prolina, pode ligar-se a uma segunda cadeia peptdica contendo prolina. A implicao desta observao que, via esta segunda ligao, a procianidina B3 pode unir cadeias peptdicas por ligao cruzada, formando complexas redes (Fig. 3). Fig. 4. Modelo de computador de uma possivel rede de protena-polifenol

Fig. 5. Experimento modelo mostrando a turbidez obtida atravs da combinao de diferentes preparaes de gliadina com vrios nveis de catequina. Foi usada gliadina de trigo tal qual (a) ou aps uma pr-incubao com a protease neutra do B. amyloliquefaciens (b), ou com a oligopeptidase prolina-especifica do F. meningosepticum (c). A turvao formada quando apenas o tampo usado para dissolver a catequina foi adicionado gliadina no hidrolisada mostrada por (d).

Experimentos de difuso mostraram ainda que um outro mecanismo leva formao de redes. Foi observado que, antes da dimerizao e precipitao, os peptdeos ricos em prolina se tornam cada vez mais cobertos com polifenis (11). Acima de uma certa carga de polifenis, a associao dos polifenis entre si pode conferir estabilidade aos complexos de protenapolifenol. Dessa forma, a associao de cadeias peptdicas ocorre simultaneamente via pontes com polifenis e via associao de polifenis entre si. Um modelo de computador de uma possvel rede peptdeo-polifenol resultante de tais interaes mostrado na Figura 4. Pode-se esperar que tais redes precipitem, turvando a cerveja, em condies de baixa temperatura. Preveno da turvao a frio na fabricao de cerveja Entre as vrias opes disponveis, o uso de adjuntos a que, mais provavelmente, traz uma significativa contribuio para reduo do potencial de turvao a frio da cerveja. As fraes de protena presentes no milho e no arroz tm contedos relativamente baixos de prolina, diluindo o nvel de protenas formadoras de turvao, que so extradas do malte. Entretanto, resfriar a cerveja a aproximadamente 0C num tanque de maturao, adicionar PVPP e/ou slica hidrogel e filtrar o precipitado da cerveja continua sendo o padro industrial para preveno da turvao a frio. H algumas desvantagens no uso de PVPP. Estas incluem elevados custos operacionais, elevados custos de investimento, se o PVPP for regenerado, e uma reduo do potencial antioxidante natural da cerveja, j que o PVPP se liga seletivamente aos polifenis presentes (o PVPP se assemelha a poliprolina). Embora a slica hidrogel tenha menor custo, sua capacidade de remoo do resduo de protenas formadoras de turvao, limitada, de modo que as cervejas clarificadas por este mtodo devem apresentar estabilidade coloidal meramente marginal (13).

Fig. 6. Representao esquemtica de duas seqncias peptdicas derivadas da hordena e possveis locais para formao de pontes com polifenis (circulados). As setas indicam possveis pontos de clivagem para protease prolina-especfica. A seta dupla ilustra a fraca interao de polifenis com oligopeptdeos contendo apenas um nico resduo de prolina.

Fig. 7. Estabilidade coloidal de cervejas engarrafadas estocadas a temperatura ambiente por 1, 4, 5, 6, 8 e 13 meses. As cervejas foram produzidas em escala de 20 hl e estabilizadas com PVPP (30 g/hl) ou 1,25 e 2,5 unidades de enzima (PPU)/kg de malte. Duplicatas da dosagem de 2,5 PPU/kg de malte ilustram a reprodutibilidade do mtodo enzimtico. As turvaes foram medidas usando um tanmetro calibrado.

O uso de uma enzima proteoltica cida, como papana, uma alternativa para a estabilizao da cerveja. Por esse processo, as protenas residuais formadoras de turvao, so degradadas, de modo que a formao da rede de protena-polifenol inibida. Entretanto, nenhuma das atividades enzimticas presentes na papana pode hidrolisar eficientemente 6

protenas com alto contedo de prolina. Conseqentemente, a papana por vezes sobredosada, afetando a qualidade da espuma da cerveja. A hiptese Conforme detalhado acima, a turvao da cerveja depende fortemente de uma interao hidrofbica entre polifenis e protenas ricas em prolina. Reduzindo-se a extenso destas reas ricas em prolina, via hidrlise com uma enzima proteoltica adequada, a formao de redes que precipitam, causando turvao, deveria ser eficazmente prevenida. Embora houvesse a possibilidade de que os pequenos oligopeptdeos originados ainda se ligassem aos polifenis, imaginava-se que os pequenos complexos resultantes seriam to solveis que nenhuma precipitao ocorreria com o resfriamento. O desafio a esta hiptese requeria a disponibilidade de uma enzima que pudesse clivar as protenas ricas em prolina em fragmentos muito pequenos. Para evitar a hidrlise das protenas formadoras de espuma, a protease selecionada teria que ser altamente especfica. Desafiando a hiptese Para testar a nossa hiptese, partimos de um experimento modelo no qual a formao da turvao a frio foi reproduzida, adicionando-se catequina, lentamente, a uma soluo de gliadina, uma protena de trigo rica em prolina, sob agitao (14). A turvao formada foi acompanhada usando um tanmetro calibrado. Com a adio de quantidades crescentes de catequina a uma soluo de gliadina intacta, a turvao da soluo aumentou antes do equilibrio (Fig 5). O experimento foi repetido, mas desta vez usamos uma soluo de gliadina que tinha sido pr-hidrolisada com uma protease neutra de uma espcie de Bacillus (PNR da DSM Food, Specialities). Esta enzima incapaz de quebrar ligaes peptdicas envolvendo prolina, concentrando seus ataques em ligaes peptdicas envolvendo resduos de leucina e de fenilalanina, os quais no tm sido relacionados s interaes polifenol-protena. Apesar de longas incubaes com nveis suficientemente elevados de enzima, a pr-digesto da gliadina com protease neutra praticamente no afetou o nvel de turvao de gliadina-catequina formada. Entretanto, com a pr-hidrolisao da gliadina usando uma enzima prolina-especfica (propil-oligopeptidase de F. meningosepticum (15)), a formao da turvao foi suprimida ao nvel registrado para a soluo de gliadina no-hidrolisada, ou seja, sem adio de catequina. Estes resultados suportam claramente a hiptese de que, somente uma protease prolinaespecfica pode efetivamente evitar a formao de redes de precipitao de protenas ricas em prolina e catequina (16).

Fig. 8. Esquema de uma linha de produo usando protease prolina-especfica para estabilizao da cerveja. O concentrado de enzima introduzido via tanque BC (Brewers Clarex), em quantidades de aprox. 2 ml/hl de mosto, usando um sistema de dosagem simples por batelada. Observe a ausncia de tanques de PVPP ou slica hidrogel e sua respectiva capacidade tampo sensvel ao oxignio na rea de processo.

A Figura 6 mostra as seqncias de aminocidos de dois diferentes peptdeos ricos em prolina, derivados de hordena, e ilustra os resultados obtidos neste experimento modelo. Para maior clareza, foram adicionadas setas para indicar as possveis reas de clivagem para uma protease prolina-especfica, e as reas onde as duas cadeias peptdicas podem se unir por ligao cruzada com polifenis foram circuladas. evidente que a incubao destes peptdeos derivados de hordeina com uma protease prolina-especfica ir resultar em uma mistura de muitos fragmentos peptdicos muito pequenos. Os resultados do experimento mostram que estes minsculos fragmentos peptdicos no podem precipitar com catequina. Assumimos que com pequenos fragmentos peptdicos difcil obter uma rede de protena-polifenol suficientemente grande para causar turvao, e que os pequenos fragmentos peptdicos so muito mais solveis em gua do que as protenas formadoras de turvao intactas. Em contraste com os muitos pontos de clivagem possveis para uma protease prolinaespecfica, no se pode esperar que uma protease neutra introduza um nico corte sequer nas duas seqncias de hordena apresentadas. Do mesmo modo, a papana incapaz de clivar estas seqncias de hordena. Embora a papana seja conhecida por quebrar a cadeia peptdica, preferencialmente, junto aos resduos de arginina, a hidrlise de ligaes peptdicas contendo arginina impedida pelo grande nmero de resduos de prolina presentes nas seqncias de hordena mostradas. Experimentos de fabricao de cerveja em escala industrial Tendo sido demonstrado o profundo impacto da protease prolina-especfica na formao da turvao, continuamos os nossos estudos com uma enzima mais adequada s consideraes prticas da fabricao de cerveja. Em estudos anteriores, identificamos uma endo-protease prolina-especfica secretada pelo microorganismo Aspergillus niger (17). Em contraste com as proteases prolina-especficas conhecidas, a enzima derivada de A. niger grau alimentcio, tem 8

um pH timo cido, uma endo-protease pura e est disponvel em escala industrial. Vrios testes de laboratrio e de micro-escala ( microcervejaria) foram realizados com a finalidade de testar esta enzima nos complexos ambientes da preparao do mosto, adies de lpulo e fervura, fermentao, maturao, filtrao e engarrafamento. Convencidos da qualidade da nova enzima, vrios ensaios de 20 hl foram conduzidos no Institut Franais des Boissons de la Brasserie Malterie (IFBM) em Nancy, Frana. Quatro cervejas de puro malte foram produzidas exatamente nas mesmas condies. Cada lote foi produzido a partir de 300 kg de malte de cevada e lpulo em pellets. O processo de fermentao com uma cepa de levedura de baixa fermentao foi conduzido a 12C at 5 Plato e a 14C at o final da fermentao. Aps a maturao a frio por 5 dias a 1C +/- 1C, as cervejas foram carbonatadas a 5,2 g/l, e pasteurizadas a 60C por 20 minutos. Em trs dos quatro testes, foram usadas duas concentraes da protease prolinaespecfica derivada de A. niger. A enzima foi adicionada no inicio da fermentao e no foi usado PVPP ou slica hidrogel. A fabricao de um lote de controle (sem enzima) usou 30 g/hl de PVPP (Polyclar AT) juntamente com o auxiliar filtrante. Aps engarrafamento e pasteurizao, amostras foram estocadas at 13 meses a temperatura ambiente, com leitura de turvao efetuada em diversos intervalos de tempo. Aps 13 meses de estocagem a temperatura ambiente, a turbidez das cervejas tratadas com a enzima provou ser significativamente mais baixa do que a do controle no qual foi usado PVPP (Fig. 7). Os resultados destes experimentos de fabricao de cerveja em escala semiindustrial validaram os resultados dos experimentos modelo e confirmaram a hiptese de que a turvao a frio pode ser prevenida eficazmente usando uma protease prolina-especfica. Alm disso, os testes em escala semi-industrial tambm demonstraram que o uso da protease prolina-especfica resulta em efeitos negligenciveis no sabor e na estabilidade da espuma (16). O baixssimo contedo de prolina das protenas da cerveja formadoras de espuma (18), em combinao com a altssima especificidade da enzima usada, fornecem uma explicao aceitvel para esta observao. Uma vez que, com o uso da enzima, os polifenis no so removidos, no de se admirar que fomos capazes de confirmar nveis acentuados de polifenis na cerveja engarrafada. Considervel simplificao da fabricao de cerveja O uso de uma protease prolina-especfica durante a fase de fermentao da cerveja oferece um nmero de vantagens significativas em particular, os benefcios do ponto de vista do processamento de cerveja so muito interessantes. Por exemplo, com a adio de um pequeno volume de soluo concentrada de enzima aos tanques de fermentao (aprox. 2 ml/hl de mosto 12 Plato), somente um tempo mnimo de permanncia da cerveja nos tanques de maturao a frio necessrio. Alm disso, a capacidade de filtrao aumenta, porque menos precipitado se forma. O mais importante, entretanto, a possibilidade de eliminar completamente grandes volumes de produtos em p como PVPP ou slica hidrogel. Alm das consideraes bvias com relao manipulao, estocagem e descarte, o uso de PVPP ou slica hidrogel demanda grandes cuidados. Por exemplo, durante a pr-hidratao do PVPP, h um risco significativo de entrada de oxignio durante as adies do p e na limpeza e esterilizao do equipamento

usado. O uso do processo enzimtico aboliria a necessidade de um controle to rigoroso do oxignio. A protease prolina-especfica da DSM est sendo comercializada atualmente pela DSM Beverage Enzymes, com o nome de Brewers Clarex, e um esquema da linha de produo usando o processo enzimtico para preveno da turvao a frio mostrado na Fig.8. Devido sua simplicidade, o processo enzimtico poderia ser uma opo atrativa no caso de haver necessidade de aumento temporrio dos volumes de produo. Finalmente, o novo processo enzimtico desenvolvido permite aos produtores de cerveja iniciar um planejamento para eliminao de materiais em p, em linha com a crescente aceitao de que a filtrao livre de Kieselguhr ganhar popularidade nos prximos anos.

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