Bioqumica I Segunda Aula Prtica: Curva de calibrao e quantificao de protenas.

Sumrio
Sumrio..................................................................................................................................................1 OBJETIVOS..........................................................................................................................................2 INTRODUO.....................................................................................................................................2 2.1 Mtodos Fotocolorimtricos..........................................................................................................2 2.2 Leis da fotometria..........................................................................................................................3 2.3 Mtodo do biureto para determinao de protenas.......................................................................5 2.4 Protenas presentes no leite............................................................................................................5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.................................................................................................6 3.1 Materiais e reagentes.....................................................................................................................6 3.2 Parte experimental.........................................................................................................................7 3.2.1 Precipitao isoeltrica da casena..........................................................7 3.2.2 Diluio do leite para dosagem de protenas totais.................................7 3.2.3 Curva de Calibrao e dosagem de protena...........................................7 RESULTADOS E DISCUSSES..........................................................................................................8 4.1 Precipitao da casena .................................................................................................................8 4.2 Protenas do filtrado e Protenas totais e Solues padro.............................................................8 4.3 Medidas no espectrofotmetro.......................................................................................................9 4.5 Determinao da porcentagem de casena...................................................................................13 CONCLUSO.....................................................................................................................................14 REFERENCIAS ..................................................................................................................................14

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OBJETIVOS A seguinte aula prtica tem como objetivo elaborar as curvas de calibrao e sensibilidade de um mtodo fotocolorimtrico a partir da resoluo de clculos de diluies e concentraes. Relacionar o mtodo fotocolorimtrico com situaes nas quais ele pode ser aplicado, tendo como exemplo a dosagem de protenas do leite pelo mtodo da reao do biureto. INTRODUO 2.1 Mtodos Fotocolorimtricos O mtodo fotocolorimtrico foi desenvolvido com a finalidade de dosar substncias biolgicas. Neste mtodo so utilizadas reaes que resultam em solues coloridas. A intensidade da cor produzida proporcional concentrao da substncia que est sendo dosada. Em conseqncia desta proporcionalidade, possvel dosar substncias em solues de concentrao desconhecida (amostra), ao comparar a intensidade da cor produzida por esta substncia intensidade da cor produzida pela mesma substncia em outra soluo onde a concentrao previamente determinada (padro). A diferena de colorao muitas vezes imperceptvel a olho nu. A medida da intensidade de cor efetuada por instrumentos denominados fotocolormetros ou espectrofotmetros. Estes instrumentos possuem uma fonte de luz branca, filtros coloridos (fotocolormetro), prismas ou retculos de difrao (espectrofotmetro), atravs dos quais pode ser feita a seleo do comprimento de onda (), e um sistema onde a intensidade da luz detectada, transformada em corrente eltrica, amplificada e medida. Ao incidir um feixe de luz sobre uma soluo corada, verifica-se que a intensidade de luz que emerge da soluo (I), menor que a intensidade de luz incidente nesta soluo (Io). A diferena entre a intensidade de luz de incide e a intensidade de luz que atravessa a soluo corada pode ser medida e expressa pelo coeficiente obtido atravs da diviso da intensidade da luz emergente (I) pela intensidade da luz incidente (Io). Este coeficiente chamado de transmitncia (T). Por sua vez, mede-se a intensidade de luz absorvida por uma soluo

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corada pela reduo da medida da intensidade de luz transmitida. A medida de absoro chamada de absorbncia (A) ou extino (E), logo A e T so inversamente proporcionais. > concentrao > intensidade de cor > Absorbncia < Transmitncia A relao entre e concentrao da substncia e a absorbncia chamada de fator de calibrao (FC). Fc = C/A. A concentrao de uma substncia em uma determinada amostra pode ser determinada atravs da comparao da intensidade da cor obtida nesta amostra com a intensidade da cor produzida em uma soluo padro aplicando uma regra de trs. Para evitar erros de aferio, no utilizado um nico padro para realizar a comparao. realizada uma srie de determinaes com concentraes crescentes da soluo padro, medindo as suas respectivas absorbncias, a curva padro. calculado o fator de calibrao para cada soluo padro e feita uma mdia destes fatores, o fator de calibrao mdio (FCM). Os mtodos fotocolorimtricos encontram grande aplicao em bioqumica sendo utilizados preferencialmente em relao a outros mtodos, sempre que apresentarem grau de exatido desejado, uma vez que permitem medidas rpidas e sensveis. A sensibilidade particularmente importante na determinao de pequenas quantidades de metablitos e outras substncias presentes em materiais biolgicos. 2.2 Leis da fotometria O princpio bsico da fotometria baseado no fato de que: partculas dispersas ou dissolvidas em uma soluo interferem seletivamente com um raio de luz que passa atravs desta soluo. Esta interferncia depende dos seguintes fatores:
Cor do composto ou do tipo de ligao qumica presente; Tamanho da partcula; Transparncia da soluo; Combinao dos fatores acima.

Deste modo, as partculas podem absorver e transmitir parte do espectro, dependendo da sua concentrao, da sua natureza qumica e/ou da sua cor. Se pudermos medir o total de luz que incide (Io) sobre a soluo de uma determinada substncia e o total da luz transmitida (It), podemos avaliar o quanto a substncia absorveu (absorbncia: A) A seguinte formulao pode ser feita: Transmisso = It / Io (luz transmitida / luz incidente).

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Observe que o termo transmisso tem aplicao limitada, uma vez que, a It Io menos a luz que absorvida no s pela substncia que se deseja medir, mas tambm pelo solvente, pelo material da cubeta e por outras substncias a existentes. Assim, It a luz transmitida aps as absores pela substncia de interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito, admite-se It =1 (100% de Transmitncia) a luz transmitida aps Io atravessar a cubeta contendo uma soluo denominada branco. Este branco contm todos os componentes do meio, exceto a substncia a ser medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o fototubo (fotoclula), a Transmitncia = 0, ou seja, no h luz transmitida a ser medida. Na prtica, a transmitncia (T), que medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na passagem da luz), pouco utilizada, pois substituda pelo valor de densidade ptica (D.O.) ou absorbncia (A), termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitncia: A = log 1/T A absorbncia , desta forma, medida em uma escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). A relao da A com a concentrao da substncia pode ser compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a absorbncia de uma soluo proporcional concentrao da substncia na soluo e distncia percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a soluo (caminho ptico): A = . l.c, onde: = coeficiente extino molar, que constante para cada substncia, e definido como a absorbncia (A) de uma soluo l molar da substncia em um determinado comprimento de onda (), numa cubeta de caminho ptico l = l cm (largura da cubeta) e c = concentrao da soluo. Observe, portanto, que a absorbncia uma funo linear da concentrao. Assim, para uma mesma substncia, considerando-se o caminho ptico constante, a A diretamente proporcional concentrao desta substncia. No entanto, as Leis de LambertBeer nem sempre so obedecidas. Algumas desobedincias so conhecidas e atribudas a fatores como: mudana na natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos baixos das concentraes das solues, etc. Tambm as presenas de cidos, bases e sais na soluo podem contribuir para essas desobedincias, por estarem mais completamente dissociados, medida que aumenta a diluio, visto que absoro da luz pelos ons diferente daquela apresentada pelas molculas no ionizadas. Para se evitar discrepncias das Leis de Lambert-Beer, deve-se trabalhar com solues mais diludas e construir, previamente, uma curva padro, em que so usadas concentraes conhecidas (e crescentes) da substncia em anlise, e verificar as absorbncias no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho ptico adequado.

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Desta forma, teremos os limites de concentrao nos quais a soluo obedece s Leis de Lambert-Beer, ou seja, onde h linearidade. Com o emprego da curva padro, podemos, tambm, determinar a concentrao de uma soluo problema. O comprimento de onda () usado para a obteno da curva padro obtido pela preparao do espectro de absoro da substncia em estudo e , normalmente, o onde a absorbncia para a substncia apresenta o valor mximo. 2.3 Mtodo do biureto para determinao de protenas As origens do mtodo do biureto podem ser traadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificaes do mesmo. O reagente de biureto um reagente analtico formado por hidrxido de potssio (KOH) e sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de sdio e potssio (KNaC4H4O64H2O). Este reagente de colorao azul torna-se violeta na presena de protenas, e muda para rosa quando combinado com polipeptdios de cadeia curta. O hidrxido de potssio no participa na reao, mas meramente prov um meio alcalino no qual a reao ocorre. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica. O produto de reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na regio de 270 nm aumentarem em seis vezes a sensibilidade do mtodo do biureto, a banda na regio de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, porque diversas substncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na regio de 270 nm causando muita interferncia no mtodo. O mtodo de biureto tem sido aplicado para determinar a concentrao de protenas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangneo, lquido crebro espinhal (lqor), urina, alimentos, saliva, leite, fibrinognio e tecido animal As protenas apresentam muitas ligaes peptdicas, quando tratadas com o Reagente de Biureto, produzem uma colorao cuja intensidade obedece a Lei de Lambert-Beer. Esta Lei estabelece que a absorbncia de uma soluo aumente medida que aumenta a concentrao de partculas absorventes. 2.4 Protenas presentes no leite As principais protenas do leite so a casena, a b-lactoglobulina e a a-lactoalbumina. Os cinco tipos de casenas (fosfoprotenas) representam 85% das protenas do leite, o restante constitudo pela b-lactoglobulina e a-lactoalbumina.

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Outras protenas, como, por exemplo, as enzimas, as imunoglobulinas e os hormnios, so encontrados em pequenas quantidades. Tanto a b-lactoglobulina como a a-lactoalbumina so nutricionalmente melhores que a casena, devido ao maior contedo de aminocidos essenciais, como lisina, metionina e triptofano. A casena, principal protena do leite, um exemplo de protena nutriente do tipo fosfoprotena encontrada no leite fresco. Quando coagulada com renina chamada de "paracasena" (casena de coalho) e, quando coagulada atravs da reduo de pH (utilizao de cidos) chamada "casena cida". A casena no coagula com o calor. precipitada pelos cidos ou pela renina, uma enzima proteoltica produzida no estmago dos vitelos (bezerros) recm-nascidos (tambm produzida por alguns tipos de plantas e micrbios). A enzima tripsina hidrolisa a peptona retirando o fosfato. A casena contm um nmero razoavelmente alto de peptdeos de prolina que no interagem. No apresenta nenhuma ponte dissulfeto. Como conseqncia apresenta relativamente pouca estrutura secundria ou estrutura terciria, no formando estruturas globulares. Por isso no pode desnaturar. relativamente hidrofbica, tornando-se pouco solvel em gua. Encontra-se no leite como uma suspenso de partculas de casena (micelas de casena), de modo que a regio hidrfoba (apolar) fica no interior e a regio hidrfila (polar) na superfcie exposto a gua. As casenas das micelas se prendem juntas por ons de clcio e interaes hidrofbicas. O ponto isoeltrico da casena 4.6. o valor de pH onde as cargas eltricas dos aminocidos se igualam e se anulam e ento ela precipita (coagulao cida). A protena purificada insolvel em gua. Enquanto insolvel em solues salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diludo e em solues salinas tais como oxalato de sdio e acetato de sdio. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1 Materiais e reagentes 2 pipetas graduadas de 10 mL; 1 pipeta graduada de 5 mL; 5 pipetas graduadas de 2 mL; 1 pipeta graduada de 1 mL; 2 peras; Soluo padro de protenas 5 mg/mL;

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HCl 2% v/v; Reagente do biureto; Papel indicado de pH; Papel de filtro qualitativo; Leite desnatado longa vida; Bquer 50 mL; Tubos de ensaio; Estante; Caneta hidrogrfica; gua destilada.

3.2 Parte experimental 3.2.1 Precipitao isoeltrica da casena Em um bquer de 50 mL colocou-se 10 mL de gua destilada e juntou-se 10 mL de leite longa vida desnatado. Com uma pipeta de 2 mL adicionou-se, gota a gota, HCl (2%) com agitao at coagular o leite (ponto isoeltrico). Com o auxilio de um papel indicador, mediuse o pH e anotou-se o volume de HCl gasto. Aps sedimentao do precipitado, filtrou-se a soluo com um papel de filtro para a dosagem das protenas que no precipitaram nas condies acima (amostra PF = tubo 7) 3.2.2 Diluio do leite para dosagem de protenas totais Diluiu-se 0,5 mL de leite em 9,5 mL gua temperatura ambiente (proporo 1:20) e obteve-se a PT, correspondente ao tubo 8. 3.2.3 Curva de Calibrao e dosagem de protena Pipetou-se os valores estipulados de gua, protena padro e reagente do biureto em cada tubo de ensaio, conforme a Tabela 1. Para dar maior confiabilidade nas diluies, utilizamos um agitador de tubos e os deixamos em repouso por 10 minutos. Aps, fizemos a leitura no espectrofotmetro, lendo a absorbncia em 540 nm.

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RESULTADOS E DISCUSSES Neste experimento, tem-se um exemplo da aplicao da fotocolorimetria. Para tanto se fez o fracionamento das protenas do leite e sua dosagem pelo Mtodo do Biureto. Assim com a utilizao da fotocolorimetria foi possvel quantificar as protenas do leite. 4.1 Precipitao da casena Para a precipitao da casena, adicionou-se 1,3 mL de cido clordrico No preparo da amostra titulada como Pf (filtrado: protenas lactoalbumina + lactoglobulinas) aferiu-se o pH no momento inicial da coagulao do leite pela adio do HCl, isto porque segundo a literatura, o ponto isoeltrico da casena (protena a ser separada neste procedimento) exatamente em pH 4,6. E, portanto o quo prximo deste ponto, melhor ser a precipitao desta protena e assim o filtrado conter apenas as protenas desejadas. Desta forma, foram adicionados 1,3mL de HCl e o pH foi medido e encontrou-se entre 4 e 5. Um fator importante para obtermos uma melhor amostra foi a utilizao do leite desnatado longa vida, pois no pode haver turbidez na amostra que pode causar interferncia na leitura do equipamento, o que possivelmente aconteceria com o uso de um leite integral, devido a grande quantidade de gordura. 4.2 Protenas do filtrado e Protenas totais e Solues padro Para o preparo destas amostras, Pf e Pt, foi necessrio fazem uma diluio sendo:

Pf diludo em 1:2 (C real = C calculado x 2) PT diludo em 1:20 (C real = C calculado x 20) Isto porque, a lei de Lambert-Beer e valida somente para solues relativamente

diludas, uma vez que acima de certas concentraes a relao entre a absorbncia e a concentrao deixa de ser linear, tornando vivel a analise da absorbncia das amostras no equipamento. Para a determinao da concentrao das amostras Pf e Pt pelo mtodo fotocolorimtrico utilizou-se a relao que permite calcular esta a partir da medida de absorbncia de uma soluo padro, cuja concentrao conhecida. Utilizou-se uma soluo padro com diferentes concentraes (Tabela 1) e foi traada a curva de calibrao em que no eixo das abscissas esto s concentraes e nas ordenadas s respectivas absorbncias (Grfico 01). Assim, devido s concentraes de protenas nos tubos e da reao destas com o reagente do biureto, pode observar um gradiente de colorao em que:

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O tubo 1 (branco), contendo apenas gua e a soluo do biureto, possua uma colorao azulada e foi utilizado para calibrar o espectrofotmetro, Do tubo 2 ao 6, com o aumento da concentrao de protenas, observou um gradiente da cor lils. Os tubos 7 e 8 apresentaram colorao lils intermediaria as dos tubos 2 ao 6. Tabela 1 Composio dos tubos - determinao da curva de calibrao.

Tubos Padro de protena (mL) Amostra (mL) gua destilada (mL) Reagente do biureto (mL)

Branco 1 0 0 1,0

Curva de calibrao 2 3 4 5 6 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 0 0 0 0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 5

Pf 7 0 1,0 0

Pt 8 0 1,0 0

4.3 Medidas no espectrofotmetro. Nesta pratica estavam disponveis dois equipamentos, fotocolormetro e espectrofotmetro. As medidas foram efetuadas no espectrofotmetro por possvel selecionar exatamente o comprimento de onda adequado, no caso 540nm. Nas medidas de absorbncias das solues padro e das amostras (Pf e Pt) alguns cuidados foram tomados afim de obter um melhor resultado:

O aparelho foi zerado com o tubo 1 (branco, ou seja concentrao 0 de protenas) e a leitura do branco fez-se entra cada dois tubos para assegurar que o equipamento continuasse calibrado.

Fez-se a limpeza externa da cubeta em todas as medidas com papel higinico, a fim de no afetar o valor da absorbncia registrada pelo espectrofotmetro.

Como este equipamento utiliza apenas uma cubeta por vez, entre todas as trocas de solues, fez-se a lavagem das cubetas principalmente quando se trocava uma soluo de concentrao maior para o branco na calibrao. 4.4 Determinao da concentrao de Pf e Pt Aps as medidas das solues padro e amostras, para a determinao da concentrao temos os resultados relacionados na tabela abaixo. Tabela 2 Dados da anlise dos tubos de ensaio no espectrofotmetro.

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Tubos Absorbncia [ ] (mg/mL)

Branco 1 0 0

2 0,036 1

Curva de calibrao 3 4 5 0,072 0,107 0,141 2 3 4

6 0,191 5

Pf 7 0,136

Pt 8 0,091

Com esses dados foi possvel construir a curva de calibrao que est representada no grfico abaixo.

0,20 0,18 0,16

Curva de Calibrao

Absorbncia (540 nm)

0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 Concentrao - mg/mL

Grfico 01 Curva de calibrao - absorbncia versus concentrao de protenas Com a anlise do grfico foi possvel fazer algumas constataes:

Na curva de calibrao obteve-se uma reta entre os limites de concentrao de cada uma das solues padro, portanto obedecem a Lei de Lambert-Beer.

A curva padro obtida est de acordo com o esperado, ou seja, apresentou uma relao diretamente proporcional entre as absorbncias e concentraes das solues padro.

Esta poro linear englobou a maioria dos pontos, o que garante um limite bom de sensibilidade do mtodo. Desta forma, se os valores de concentrao encontrados para Pf e Pt, pela extrapolao dos dados de absorbncia na reta, estiver entre os pontos ser um valor confivel, pois est dentro da sensibilidade do mtodo. Como a curva de calibrao foi obtida com xito, ento possvel determinar de forma

precisa as concentraes de Pf e Pt. Para esta determinao fez uso do grfico da Curva de calibrao, ao incluir os dados de absorbncia de Pf e Pt e extrapolar esses valores na curva e por conseguinte no eixo de

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concentrao obteve-se o grfico 2 e os valores de concentrao de Pt 2,51 mg/ml e Pf 3,7 mg/mL, aproximadamente.

0,20 0,18 0,16 0,14

Curva de Calibrao

Pf

Absorbncia

0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02

Pt

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 Concentrao - mg/mL

Grfico 02 Determinao da concentrao de Pt e Pf Para confirmar esses valores, ainda com o auxilio do grfico, fez-se uso de algumas relaes: Fator de converso. De acordo com a literatura, a partir dos valores de absorbncia e concentrao de cada uma das solues padro, pode-se calcular um Fator de Calibrao e como so vrios padres determinou-se o Fator de Calibrao Mdio a partir de: FC = concentrao padro / absorbncia padro FCM = FC / n de FC Tubo 01 (branco) FC = 0, C = 0, absorbncia = 0 Tubo 02 Tubo 03 Portanto, FCM = 138,14 / 5 FC = 1 / 0,036 FC = 27,778 FC = 2 / 0,072 FC = 27,778 Tubo 06 Tubo 05 Tubo 04 FC = 3 / 0,107 FC = 28,037 FC = 4 / 0,141 FC = 28,369 FC = 5 / 0,191 FC = 26,178

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FCM = 27,628 Tabela 3 Valores de FC e FCM Tubos FC FCM Branco 1 0 2 27,778 Curva de calibrao 3 4 5 27,778 28,037 28,369 27,628 6 26,178

E com esses valores, a determinao da concentrao de Pf e Pt feita pela relao: [amostra] = Absorbncia da amostra x FCM Pf Tubo 07 [ ] = 0,136 x 27,628 [ ] = 3,757 mg/mL Lei de Lambert-Beer Ainda possvel determinar o valor da concentrao por outra relao: ABS = k . C Lei de Lambert-Beer: absorbncia linearmente proporcional a concentrao. Est equao associada ao grfico obtido e corresponde a uma equao da reta reduzida que passa pela origem, ou seja: Equao da reta reduzida: y = ax + b a = coeficiente angular x = valor da concentrao y = valor da absorbncia b = coeficiente linear (valor que a curva toca no eixo y, neste caso igual a 0, pois o grfico passa pela origem do plano cartesiano). Voltando na lei de Lambert-Beer, y = ax ABS = k [ ] Em que k corresponde a x (coeficiente angular) e este coeficiente determinado por: ybya/xbxa ou ABS b ABS a / [ ] b [ ] a Assim, pelo grfico escolheram-se os valores que estavam precisamente em cima da reta, ou seja, valores do tubo 2 e 4: k = 0,107 0,036 / 3 1 k = 0,0355 Finalmente, os valores da concentrao de Pf e Pt so determinados: Pt Tubo 08 [ ] = 0,091 x 27,628 [ ] = 2,514 mg/mL

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ABS = k [ ] [ ] = ABS / k Pf Tubo 07 [ ] = 0,136 / 0,0355 [ ] = 3,831 mg/mL Tabela 4 Valores de concentrao de Pt e Pf Pela extrapolao Pf Pt do grfico 3,7 mg/ml 2,51 mg/ml Pelo Fator de Calibrao Mdio 3,757 mg/mL 2,514 mg/mL Pela Lei de Lambert-Beer 3,831 mg/mL 2,563 mg/mL Pt Tubo 08 [ ] = 0,091 / 0,0355 [ ] = 2,563 mg/mL

Observa-se que existem algumas divergncias dos valores pelos diferentes mtodos de determinao da concentrao, devido a erros de leitura, aproximaes entre outros indeterminados, mas todos se encontraram na mesma faixa e, portanto so considerados confiveis. 4.5 Determinao da porcentagem de casena Os valores da concentrao utilizados para Pf e Pt foram os obtidos pelo FCM, por ser um valor intermedirio aos outros dois mtodos utilizados. Entretanto esse valor de concentrao no o real, pois foram feitas diluies, assim necessrio fazer as correes: Pf diludo em 1:2 (C real = C calculado x 2) C real = 3,757 x 2 C real = 7,514 mg/ml PT diludo em 1:20 (C real = C calculado x 20)

C real = 2,514 x 20 C real = 50,28 mg/ml E para a determinao da concentrao de casena, C casena = C real Pt C real Pf C casena = 50,28 7,514 C casena = 42,766 mg/mL E para a determinao da % de casena, % casena = (C casena / C real Pt) x 100

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% casena = (42,766 / 50,28) x 100 % casena = 85,06%

CONCLUSO Nesta prtica pode-se observar que com o aumento da concentrao de protenas, h, tambm, um aumento no valor da absorbncia medida no espectrofotmetro na faixa de 540 nm. Atravs dos resultados obtidos atravs do espectrofotmetro, foi possvel calcular as curvas de calibrao. Em toda leitura deve haver um tubo considerado o branco, onde no h o material de estudo, e nos demais tubos a concentrao do material aumenta gradativamente, gerando um gradiente. Os clculos apresentados tm como objetivo mostrar a concentrao de casena presente no material estudado, que foi retirada atravs da ao do cido clordrico. Uma relao pode ser descrita para para mostrar a concentrao da casena: Tubo 8 Tubo 7 (PT PF). Notamos que a porcentagem de casena encontrada est de acordo com a literatura, o que indica que, apesar de erros laboratoriais, o experimento mostrou boa confiabilidade.

REFERENCIAS As protenas do leite. Disponvel em <http://www.pratiqueleite.com.br/article.php?recid= 2787>. Acessado em 23/03/11 Determinao do ponto isoeltrico da casena. Disponvel em <http://analgesi.co.cc/html/ t26482.html>. Acessado em 24/03/11 Espectrofotometria, conceitos. Disponvel em <http://www.ufrgs.br/leo/site_espec /conceito.html>. Acessado em 24/03/11 Roteiros de aulas prticas. UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, INSTITUTO DE BIOLOGIA, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR. Disponvel em <http://www.uff.br/gcm/GCM/graduacao_arquivos/Apostila.pdf>. Acessado em 24/03/11 ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos Mtodos existentes. Revista Qumica

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Nova, v. 21, n. 6, p.787-793, junho de 1998. Disponvel em http://www.scielo.br /pdf/qn/v21n6/2914.pdf>. Acessado em 23/03/11