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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

BIOMETRIA, TAXA DE ECLOSÃO E MICROBIOTA BACTERIANA E FÚNGICA DE OVOS DE JACARÉ-DO- PANTANAL - Caiman yacare DAUDIN, 1802

Rachel de Sousa Lima Pulcherio

CUIABÁ - MT

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

BIOMETRIA, TAXA DE ECLOSÃO E MICROBIOTA BACTERIANA E FÚNGICA DE OVOS DE JACARÉ-DO- PANTANAL - Caiman yacare DAUDIN, 1802

Autora: Rachel de Sousa Lima Pulcherio

Orientadora: Profª. Drª. Rosa Helena dos Santos Ferraz Co-Orientadora: Profª. Drª. Valéria Dutra

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.

CUIABÁ MT

2012

FICHA CATALOGRÁFICA

FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP) Bibliotecária: Patrícia Jaeger /

Dados Internacionais para Catalogação na Publicação (CIP)

Bibliotecária: Patrícia Jaeger / CRB1-1736.

P981b

Pulcherio, Rachel de Sousa Lima.

Biometria, taxa de eclosão e microbiota bacteriana e fúngica de ovos de Jacaré-do-Pantanal Caiman yacare DAUDIN, 1802 / Rachel de Sousa Lima Pulcherio - Cuiabá: Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT, 2012.

91f.:il.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.

Orientadora: Prof.ª Drª. Rosa Helena dos Santos Ferraz. Co Orientadora: Prof.ª Drª Valéria Dutra.

1 Caiman yacaré Jacaré-do-Pantanal 2. Microbiota bacteriana e fúngica. 3. Biometria. 4. Ninho. 5. Enterobactéria 6. Espécie Crocodiliano 7. Criação Comercial - Jacaré 8. Incubação Artificial 9. Taxas de Eclosão 10. Ovos de Jacaré. I. Título. II. Pulcherio, Rachel de Sousa Lima. III. UFMT.

CDU: 598.14:636:591.613 (817.2)

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO PRÓ-REITORIA DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO PRÓ-REITORIA DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO PRÓ-REITORIA DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Avenida Fernando Corrêa da Costa, 2367 Boa Esperança Cep: 78060900 CUIABÁ/MT Tel : +55 65 3615-8627 Email : cpgvet@ufmt.br

FOLHA DE APROVAÇÃO

TÍTULO : "Biometria, taxa de eclosão e microbiota bacteriana e fúngica de ovos de jacaré-do-pantanal - Caiman yacare Daudin, 1802."

AUTOR : Mestranda Rachel de Sousa Lima Pulcherio

Dissertação defendida e aprovada em 29/02/2012.

Composição da Banca Examinadora:

Presidente Banca / Orientador

Pós-Doutor(a) Rosa Helena dos Santos Ferraz

Instituição :

Examinador Interno

Doutor(a)

SANDRA HELENA RAMIRO CORRÊA

Instituição :

Examinador Externo

Doutor(a)

Zilca Maria da Silva Campos

Instituição :

Embrapa Pantanal

Examinador Suplente

Doutor(a)

Valéria Dutra

Instituição :

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CUIABÁ, 29/02/2012.

PARECER DA COMISSÃO DE BIOÉTICA

PARECER DA COMISSÃO DE BIOÉTICA

PARECER DA COMISSÃO DE BIOÉTICA

DEDICATÓRIA

DEDICATÓRIA Dedico este trabalho ao meu filho Davi, que enche meus dias de luz; e à

Dedico este trabalho ao meu filho Davi, que enche meus dias de luz; e à minha família, que, com seu imenso amor e paciência, me deram o apoio necessário para que eu chegasse até aqui.

Dedico-o, igualmente, in memoriam, à minha avó, Heber de Mattos Pulcherio, que, se tivesse tido oportunidade, teria sido médica veterinária e que me legou exemplos inesquecíveis de amor aos animais e de terna compaixão pelas suas dores.

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, por ter estado sempre ao meu lado e me dado a

Agradeço primeiramente a Deus, por ter estado sempre ao meu lado e me dado a oportunidade de realizar o mestrado e ingressar no setor acadêmico e da pesquisa. Sou grata, em especial, ao meu namorado Thiago José Campos de Souza pelo esforço em me incentivar na realização da pesquisa e pelo carinho e paciência em me tranquilizar nas horas de angústia. Ele faz parte desta conquista. Muito obrigada à minha orientadora, Professora Doutora Rosa Helena dos Santos Ferraz e à minha co-orientadora, Professora Drª. Valéria Dutra, pelo auxílio, paciência e sabedoria em me orientar durante a execução deste trabalho. Agradeço ao Sr. Acássio da Silva Prado pela boa vontade e disposição em nos guiar e localizar os ninhos no Pantanal, à Fazenda Ypiranga e Pousada Piuval, na pessoa dos senhores João Losano Eubank de Campos e Eduardo Matos Eubank de Campos e ao médico veterinário Lauzimar Fernando Morandi, por viabilizarem a realização desse experimento. Agradeço de coração à minha amiga e bióloga Tainá Figueras Dorado Rodrigues por estar ao meu lado durante as coletas e permitindo, generosamente, que a minha inexperiência diminuísse em contato com o muito que sabe. Agradeço, ainda, aos discentes de graduação da Faculdade de Medicina Veterinária, Fernanda Harumi Maruyama e Luiz Felipe Souza de Lima; à discente do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Thaís Ruiz, e ao aluno Marcos Antônio Gonçalves Ardevino Filho, do Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação da Biodiversidade da Universidade Federal de Mato Grosso/UFMT, pela disposição de todos em me ajudarem nas idas ao Pantanal e no andamento da pesquisa. Agradeço, também, a todos os colegas de trabalho no Laboratório de Microbiologia do Hospital Veterinário da UFMT pelos ensinamentos e ajuda, oferecidos durante o trabalho de isolamento das bactérias no laboratório e que foram de grande valia na realização deste trabalho. Por fim, mas não por último, agradeço a meu pai, Ayrton Pulcherio Filho, por ter sido e ser sempre para mim, uma referência em termos de ética e responsabilidade profissional; à minha mãe, Maria Cristina de Carvalho Sousa Lima

Piloni e ao meu padrasto, Pedro Roberto Piloni, pelo cuidado e atenção ao meu filho

Piloni e ao meu padrasto, Pedro Roberto Piloni, pelo cuidado e atenção ao meu filho para que eu pudesse realizar este trabalho.

EPÍGRAFE

EPÍGRAFE “Se as coisas con tinuarem do jeito que vão, um dia o mundo não terá

“Se as coisas continuarem do jeito que vão, um dia o mundo não terá mais répteis. Certas pessoas aceitarão tranqüilamente essa situação, mas eu me inquieto diante de tal perspectiva. Os répteis constituem uma parte velha da natureza silvestre, o meio em que o homem obteve os nervos e os hormônios e estamos dispostos a deixar que toda natureza silvestre desapareça. Quando tal acontecer, já não seremos rigorosamente humanos.” (Archie Carr e redatores da Life, 1971)

RESUMO

RESUMO BIOMETRIA, TAXA DE ECLOSÃO E MICROBIOTA BACTERIANA E FÚNGICA DE OVOS DE JACARÉ-DO-PANTANAL - Caiman

BIOMETRIA, TAXA DE ECLOSÃO E MICROBIOTA BACTERIANA E FÚNGICA DE OVOS DE JACARÉ-DO-PANTANAL - Caiman yacare DAUDIN, 1802

A criação comercial do jacaré-do-Pantanal tem-se consolidado no Estado de Mato

Grosso através do sistema de criação denominado ranching em que os ovos são coletados na natureza, incubados artificialmente e recriados em instalações apropriadas. Dessa forma, verifica-se que esta atividade econômica está em íntima dependência da eficiência reprodutiva da espécie na natureza e das condições de incubação artificial. As taxas de eclosão na crocodilicultura refletem o sucesso da incubação artificial, estando diretamente relacionadas, tanto às condições de transporte do ovo, quanto às condições físicas e sanitárias da incubadora. Considerando a escassez de informações sobre os ninhos, a biometria dos ovos, dos filhotes e a composição da microbiota bacteriana e fúngica de ovos de C. yacare destinados à criação comercial, o presente trabalho teve como objetivo dimensionar os ninhos de C. yacare, quantificar o número de ovos por ninho, realizar a biometria

dos ovos e dos filhotes recém-eclodidos, verificar as taxas de eclosão e caracterizar

a microbiota bacteriana e fúngica de ovos no momento da coleta para a incubação

artificial. Foram avaliados 20 ninhos provenientes de quatro diferentes áreas denominadas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro em uma fazenda no Pantanal Norte, município de Poconé. A média da altura, largura da base e do ápice dos ninhos foram, respectivamente, de 36,3 cm, 126,8 cm e 46,5 cm. Desses 20 ninhos obteve-se um total de 464 ovos, com uma média de 23,2 ovos por ninho e taxa de eclosão de 72,41% (336 ovos). Dos 128 ovos que não eclodiram, 124

(96,9%) se apresentaram com odor fétido e conteúdo caseoso/pútrido e 4 (3,1%)

continham filhotes que possuíam o vitelo exteriorizado. Os valores médios obtidos para o comprimento, a largura e a massa dos ovos foram, respectivamente, de 6,6 cm, 3,9 cm e 67,5 g. Os valores médios para o comprimento rostro-cloacal e massa corpórea dos filhotes recém-eclodidos foram respectivamente, de 12,2 cm e 45,1 g.

A análise estatística não mostrou significância estatística (p>0,05) entre as quatro

regiões, para os parâmetros: dimensões dos ninhos, taxa de eclosão, número de ovos inférteis, ovos que não eclodiram (odor fétido ou retardo no desenvolvimento), número de ovos por ninho, tamanho dos ovos e dos filhotes. Nos 20 ninhos estudados, foram identificadas 22 bactérias diferentes, sendo as mais frequentes Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes e Flavobacterium multivorum e as menos freqüentes foram Escherichia hermanni, Hafnia alvei, Morganella morganni, Salmonella sp., Shigella sonnei e Serratia marcescens. Sete fungos diferentes foram encontrados, sendo o Fusarium sp. o mais comum e

Geotrichum sp., Mycelia sterilia e Trichoderma sp. os de menor ocorrência. Todas as bactérias e fungos isolados já haviam sido relatados por outros autores como integrante da microbiota oral e/ou cloacal de crocodilianos e/ou como agentes etiológicos de processos patológicos.

Palavras-chave: Caiman yacare. Criação comercial. Enterobactéria. Incubação artificial. Ninho.

ABSTRACT

ABSTRACT BIOMETRY, HATCH RATES AND BACTERIAL AND FUNGAL MICROBIOTA OF PANTANAL CAIMAN EGGS – Caiman yacare

BIOMETRY, HATCH RATES AND BACTERIAL AND FUNGAL MICROBIOTA OF PANTANAL CAIMAN EGGS Caiman yacare DAUDIN, 1802

The commercial breeding of the Pantanal Caiman has been growing in the State of Mato Grosso through the breeding system named ranching, which means that the eggs are collected in the wild, they are artificially incubated and the hatchlings are reared in adequate rearing pens. Thus, one can observe that this economic activity is intimately dependent on the species reproductive efficiency in the wild and on the conditions the artificial incubation occurs. The hatch rates at crocodilian farming reflect the success of the artificial incubation, being directly related both to the conditions of the egg transportation and to the sanitary conditions of the incubator room. Taking into consideration the lack of information about the nests, about the eggs biometry, about the hatchlings, and about the composition of the bacterial and fungal microbiota of C. yacare meant to commercial breeding, this paper aimed at measuring the C. yacare nests, at counting the number of eggs per nest, at taking the biometry of eggs and of new born hatchlings, at checking the hatch rates, and at characterizing the bacterial and fungal microbiota of eggs at the moment of collection for artificial incubation. Twenty nests from four different areas Piuval, Estrada Parque, Vazante and Lixeiro - of a farm in North Pantanal, in the town of Poconé were evaluated. The average height, width of the bottom and of the top of the nests were, respectively, 36.3 cm, 126.8 cm and 46.5 cm. From these 20 nests, there was a total of 464 eggs, with an average of 23.2 eggs per nest and hatch rate of 72.41% (336 eggs). Among the 128 eggs that did not hatch, 124 (96.9%) presented a fetid smell and a caseous/putrid content, and 4 (3.1%) had hatchlings with the yolk-sac unresorbed. The average values observed as for the length, the width and the mass of the eggs were, respectively, 6.6 cm, 3.9 cm and 67.5 g. The average values as for the snout-vent length and for the body mass of the new born hatchlings were, respectively, 12.2 cm and 45.1 g. The statistical analysis did not reveal relevant statistical differences (p>0.05) among the four regions, as for the parameters: sizes of the nests, hatch rates, number of infertile eggs, eggs that did not hatch (fetid smell or late development), number of eggs per nest, size of the eggs and of the hatchlings. In the 20 nests that were studied, 22 different bacteria were identified, and the most frequent were Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes e Flavobacterium multivorum while the less frequent were Escherichia hermanni, Hafnia alvei, Morganella morganni, Salmonella sp., Shigella sonnei e Serratia marcescens. Seven different fungi were found, the Fusarium sp. being the most frequent and the Geotrichum sp., Mycelia sterilia and Trichoderma sp. the less frequent. All bacteria and fungi that were isolated at this study have already been related by other authors as part of the crocodilians oral and/or cloacal microbioat or as ethiological agents of infectious processes.

Key

incubation. Nest.

words:

Caiman

yacare.

Commercial

breeding.

Enterobacteria.

Artificial

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Mapa mostrando a localização geográfica dos 20 ninhos nas quatro

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Mapa mostrando a localização geográfica dos 20 ninhos nas quatro áreas do Pantanal Norte, município de Poconé/MT

29

Figura 2: Mensuração da largura do ápice do ninho de Caiman yacare

29

Figura 3: Coleta de amostra microbiológica da superfície dos ovos em ninho de Caiman yacare

30

Figura 4: Ovos coletados e acondicionados para o transporte, no material vegetal do respectivo ninho

31

Figura 5: Mensuração do comprimento do ovo de C. yacare com paquímetro analógico

31

Figura 6: Exame ovoscópico em ovo de C. yacare mostrando-se translúcido e, portanto, classificado como grau zero e caracterizado como

32

Figura 7: Sistema de incubação artificial de ovos de C. yacare adotado na propriedade rural no Pantanal Norte, município de Poconé/MT

33

Figuras 8a-d: Ninho de C. yacare da área Piuval localizado em um capão de gravatás (a), na área Estrada Parque (b) e Lixeiro (c) em campos de murundus e na Vazante em cambarazais

38

Figuras 9a-b: Ninhos de C. yacare contendo invertebrados como cupins (a) e diplópodas (b)

38

Figuras 10a-b: Ovo de C. yacare após abertura, evidenciando o conteúdo caseoso (a) e pútrido (b), ambos com odor fétido

41

Figuras 11a-b: Filhote de C. yacare sem odor fétido e com retardo no desenvolvimento, evidenciado pelo vitelo fora da cavidade abdominal e feto em autólise caracterizando a morte fetal

42

LISTA DE TABELAS

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare

Tabela 1 - Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, respectivas áreas de ocorrência, coordenadas geográficas e ocorrência de invertebrados, no município de Poconé, MT abr

 

2011

37

Tabela 2 - Médias da altura (cm), largura da base (cm) e do ápice (cm) dos ninhos de Caiman yacare em diferentes áreas, município de Poconé, MT abr 2011

de ocorrência dos ninhos, número de ovos por ninho, número de

39

Tabela 3 - Médias do comprimento (cm), largura (cm) e da massa (g) de ovos de Caiman yacare nas respectivas áreas, no município de Poconé, MT abr 2011

39

Tabela 4 - Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, área

ovos não eclodidos e taxa de eclosão, no município de Poconé, MT

abr 2011

41

Tabelas 5 - Médias do número de ovos de Caiman yacare, da taxa de eclosão,

 

do número de ovos não eclodidos (inférteis ou com odor fétido),

nas respectivas áreas de coleta, no município de Poconé, MT abr

2011

42

Tabela 6 - Médias do comprimento rostro-cloacal - CRC (cm) e da massa (g) de filhotes recém-eclodidos de Caiman yacare, e coeficiente de variação, nas respectivas áreas de coleta, no município de Poconé, MT abr 2011

43

Tabela 7 - Ocorrência das bactérias nas respectivas áreas e ninhos coletados, no município de Poconé, MT abr 2011

44

Tabela 8 - Ocorrência dos fungos nas respectivas áreas e ninhos coletados, no município de Poconé, MT abr 2011

45

SUMÁRIO

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 15 1.1 Taxonomia 15 1.2 Distribuição geográfica 16 1.3 Importância

1

INTRODUÇÃO

15

1.1 Taxonomia

15

1.2 Distribuição geográfica

16

1.3 Importância ecológica e econômica

16

1.4 Justificativa e objetivos

17

2

REVISÃO DE LITERATURA

19

2.1 Maturidade sexual e período reprodutivo

19

2.2 Nidificação

e postura

19

2.3 Incubação natural

21

2.4 Biometria

de

ninhos

22

2.5 Biometria de ovos e filhotes

23

2.6 Sistema de criação comercial e incubação artificial

24

2.7 Microbiota

bacteriana

26

2.8 Microbiota

fúngica

27

3

MATERIAL E MÉTODOS

28

3.1 Área de estudo

28

3.2 Georreferenciamento e biometria do ninho

28

3.3 Coleta das amostras, transporte e biometria dos ovos

30

3.4 Ovoscopia

e incubação artificial

31

3.5 Processamento microbiológico

33

3.6 Biometria dos filhotes

34

3.7 Delineamento

experimental e análise estatística

34

4

RESULTADOS

36

4.1 Georreferenciamento, caracterização e biometria dos ninhos

36

4.2 Ovoscopia e biometria dos ovos

37

4.3 Incubação artificial e taxa de eclosão

39

4.4 Biometria dos filhotes

42

4.5 Microbiota bacteriana e fúngica

43

5

DISCUSSÃO

46

5.1

Caracterização e biometria dos ninhos

46

5.3 Incubação artificial e taxa de eclosão 48 5.4 Biometria dos filhotes 51 5.5 Microbiota

5.3 Incubação artificial e taxa de eclosão

48

5.4 Biometria dos filhotes

51

5.5 Microbiota

bacteriana

51

5.6 Microbiota

fúngica

55

6 CONCLUSÕES

59

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

60

REFERÊNCIAS

61

APÊNDICE A ARTIGO CIENTÍFICO

74

15

1 INTRODUÇÃO

O Caiman yacare, conhecido como jacaré-do-Pantanal, é uma das espécies de

crocodilianos de ocorrência em território brasileiro (UETZ, GOLL e HALLERMANN, 2011). Ele é considerado um crocodiliano de porte médio, atingindo de dois metros e meio a três metros de comprimento na vida adulta (MIRANDA et al., 2002). Os indivíduos dessa espécie, assim como os outros crocodilianos passam boa parte de sua vida na água, utilizando as margens dos rios e/ou lagoas para termorregulação, alimentação e reprodução (ZUG, VITT e CALDWELL, 2001). Durante o início da década de 90, as populações de jacaré-do-Pantanal foram consideradas reduzidas de alguma forma, principalmente devido ao aumento da caça ilegal durante os anos 70 e 80, porém, os maiores problemas que o C. yacare

enfrenta atualmente são a destruição de seu habitat, a construção de hidrelétricas e

o assoreamento de rios que continuam a afetar as populações de jacarés,

principalmente no Brasil (CAMPOS et al., 2010). E, embora em alguns locais se apresente reduzido, está classificado como espécie de baixo risco de extinção, pois possui ampla distribuição e populações numerosas (IUCN, 1996), provavelmente

devido ao seu pequeno tamanho na maturidade, associado à habilidade de se adaptar a uma ampla variedade de ambientes e ao fato ter aprendido a viver com cautela (CAMPOS et al., 2010).

1.1 Taxonomia

Todos os crocodilianos vivos pertencem à classe Reptilia, subclasse Archosauria, ordem Crocodylia, subordem Eusuchia e família Crocodylidae. Atualmente, encontram-se divididos em 25 espécies das quais seis podem ser encontradas no Brasil: Melanosuchus niger, Paleosuchus palpebrosus, Paleosuchus trigonatus, Caiman crocodilus, Caiman yacare e Caiman latirostris (UETZ, GOLL e HALLERMANN, 2011).

16

1.2 Distribuição geográfica

Os crocodilianos são, hoje, os maiores répteis vivos no planeta (LANE, 2006)

e estão distribuídos na maior parte dos estuários doces e salobros, rios e zonas pantanosas de todas as regiões tropicais e semitropicais do mundo (RUEDA- ALMONACID et al., 2007). Especificamente, o C. yacare pode ser encontrado nas

planícies do Norte e Leste da Bolívia e no Oeste do Brasil, desde o Sul da Amazônia até os rios Guaporé/Madeira e Paraguai/Paraná e no Norte da Argentina (CAMPOS

et al., 2010).

1.3 Importância ecológica e econômica

Os crocodilianos são predadores que estão no topo da cadeia alimentar no ambiente em que vivem. Esta posição lhes confere um papel importante como consumidores de peixes, moluscos, insetos e outros, a partir do momento em que favorecem a seleção natural de suas presas habituais e eliminam indivíduos mais velhos ou fracos das populações, mantendo o equilíbrio natural. Também são importantes espécies sentinelas da degradação dos ecossistemas por contaminantes ambientais e o monitoramento do nível de contaminantes em crocodilianos pode fornecer uma boa indicação do nível de contaminantes no ecossistema aquático (MILNES e GIULLETTE, 2008). Além disso, suas fezes enriquecem as águas onde vivem e aumentam a produtividade biológica das mesmas, promovendo o crescimento de algas e de todo tipo de organismos plantócnicos (RUEDA-ALMONACID et al., 2007). Um número de doenças que se desenvolvem na água são vetoriadas por populações de moluscos, mosquitos e peixes saudáveis e, ao consumirem grandes quantidades dessas espécies, os crocodilianos podem exercer um controle biológico indireto de muitos parasitos que estão presentes nesses animais como os moluscos (Ipomoea) que atuam como hospedeiros da Fasciola hepatica e Schiistosoma

17

mansoni, que atacam as populações humanas e seus animais (RUEDA- ALMONACID et al., 2007; MAZZOTTI et al., 2009). A partir dessas informações, percebe-se que as atividades dos crocodilianos mantêm o equilíbrio, a função e a estrutura do ecossistema (CRAIGHEAD, 1968), gerando a necessidade da implementação de programas de manejo que aliem o aproveitamento econômico à conservação de suas populações selvagens remanescentes (KING, 1989), evitando-se, assim, o comércio ilegal da espécie e otimizando a sustentabilidade da atividade econômica. Desse modo, com a regulamentação do sistema de criação denominado ranching, pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis - Ibama (BRASIL, 1990; BRASIL, 2009), a exploração comercial da espécie em suas áreas de ocorrência passou a ser uma alternativa ecológica e economicamente viável, pois visa a preservar a espécie e a permitir o manejo sustentado do jacaré-do-Pantanal (CAMPOS, MOURÃO e COUTINHO, 2005).

1.4 Justificativa e objetivos

Além de promover a conservação dos ambientes naturais e da biodiversidade, reduzindo a pressão exercida pela caça nessas populações (BULTE e DAMANIA, 2005), a crocodilicultura aumenta a produtividade da terra, através da diversificação dos meios de produção (COUTINHO e CAMPOS, 2002) e incrementa os rendimentos das mesmas pela comercialização do couro e da carne no mercado nacional e internacional (RODRIGUES et al., 2007). Dessa forma, a criação comercial do C. yacare tem alcançado grande destaque econômico no Estado de Mato Grosso, pois, além de o jacaré-do-Pantanal ser uma espécie nativa e abundante na região, houve, em 1990, a regulamentação do sistema de criação pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (Ibama) denominado ranching (BRASIL, 1990; BRASIL, 2009). O ranching fundamenta-se na coleta de filhotes ou de ovos na natureza, mediante prévio levantamento populacional da espécie na área pretendida e, após a autorização e o controle do órgão ambiental federal, os ovos são incubados artificialmente e recriados em instalações apropriadas (CAMPOS, MOURÃO e

18

COUTINHO, 2005). Verifica-se, por conseguinte, que esta atividade econômica está em íntima dependência da eficiência reprodutiva da espécie na natureza. O conhecimento da biologia reprodutiva e de técnicas para a incubação artificial são por isso fatores decisivos para o sucesso em longo prazo da criação comercial. Alguns dados sobre a biologia reprodutiva de espécies de crocodilianos, incluindo o C. yacare, podem ser obtidos de Verdade (1995); Platt e Thorbjarnarson (2000); Campos (2003); Coutinho et al.(2005); Bassetti (2006); Zhang et al. (2008); Velasco e Ayarzagüena (2010), porém eles não se referem à biometria dos ovos destinados

a esse sistema de criação e às técnicas de incubação artificial, embora

Huchzermeyer (2003) tenha afirmado que as taxas de eclosão na crocodilicultura são baixas devido à utilização de técnicas inadequadas na incubação artificial, bem como em razão das condições físicas e sanitárias da incubadora. As condições

sanitárias do processo de incubação (assepsia durante a coleta e incubação artificial dos ovos) são pouco exploradas, embora fatores como exposição a alta temperatura e umidade (FERGUSON, 1981a) e manuseio no momento da coleta (BASSETTI, 2006) já tenham sido relatados como condições que favorecem o processo de contaminação de ovos por fungos e bactérias. Considerando a escassez de informações sobre os ninhos, sobre a biometria

de ovos e sobre a composição da microbiota bacteriana e fúngica de ovos de C.

yacare incubados naturalmente e que são coletados e destinados às criações comerciais, o presente trabalho teve como objetivo dimensionar os ninhos de C. yacare, descrever a fitofisionomia da área onde o ninho foi construído, o número de ovos por ninho, as biometrias dos ovos e dos filhotes recém-eclodidos, verificar as taxas de eclosão dessa espécie e caracterizar a microbiota bacteriana e fúngica de ovos no momento da coleta para a incubação artificial.

19

2 REVISÃO DE LITERATURA

Neste capítulo, serão abordados alguns tópicos referentes ao processo reprodutivo de Caiman yacare relacionados à oviposição, à incubação, à biometria e à microbioba bacteriana e fúngica.

2.1 Maturidade sexual e período reprodutivo

Na natureza, as fêmeas de C. yacare podem tornar-se vitelogênicas com cerca de cinco anos de idade e comprimento rostro-cloacal (CRC) maior que 55 cm, mas ovários maduros, com folículos vitelogênicos avançados, somente foram observados em fêmeas com sete anos de idade e CRC maior que 70 cm (COUTINHO et al., 2001). Entretanto, o tamanho mínimo de reprodução efetiva é ainda maior em vida livre e, embora fêmeas jovens (CRC<75 cm) sejam eventualmente capazes de realizar postura, a maioria das fêmeas na população começa a nidificar com cerca de nove a dez anos de idade, quando atingem CRC equivalente a 80 cm e massa corporal acima de 12 kg (CAMPOS, 1993; CAMPOS e MAGNUSSON, 1995; COUTINHO, 2000), na mesma idade em que os machos também atingem maturação completa das gônadas (COUTINHO et al., 2005). Em ambiente natural, o período reprodutivo do C. yacare está associado ao início da estação chuvosa, ocorrendo a postura dos ovos de dezembro a fevereiro no Brasil (CAMPOS et al., 2010).

2.2 Nidificação e postura

A escolha do local para nidificação varia de espécie para espécie entre os crocodilianos. As espécies que vivem em florestas constroem ninhos em montes de folhas colhidas do chão da floresta e dependem do calor produzido pela compostagem ao invés do sol para incubar os ovos. As espécies de pântanos fazem

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ninhos em montes a partir da vegetação existente nestes ambientes e dependem tanto do calor da compostagem como do sol para a incubação dos ovos, enquanto que os animais que vivem em rios constroem seus ninhos nos bancos de areia acima do nível de inundação e dependem do sol para obter o calor necessário à incubação (HUCHZERMEYER, 2003). As espécies de jacarés da família Alligatoridae constroem seus ninhos em montes com restos de folhagens e gravetos dentro da mata, próximos de corpos d‟água e nos tapetes de vegetação flutuante. No Pantanal Sul, Campos e Magnusson (1995) descrevem ninhos de C. yacare em florestas perto de rios intermitentes, em trechos de florestas em campos inundados e em campos rodeados por água. Os fatores que levam as fêmeas a selecionarem o habitat de nidificação são desconhecidos (COUTINHO e CAMPOS, 2005), porém, o tamanho e a composição dos ninhos dependem mais do habitat e da disponibilidade de material do que das espécies envolvidas (MAGNUSSON, 1979). Verdade (1995) concluiu também para o C. latirostris que a presença da terra pode ser justificada pela necessidade de complementação do tamanho "normal" do ninho, onde, aparentemente, não há folhas em quantidade suficiente para sua construção. No Pantanal, é provável que os ciclos anuais de cheia e seca alterem a disponibilidade dos locais de nidificação e também a oferta do material para construção dos ninhos do C. yacare (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995). Todos os ovos de uma ninhada são depositados ao mesmo tempo no ninho e cobertos com o material do mesmo (HUCHZERMEYER, 2003). O número e o tamanho dos ovos estão relacionados com a espécie e o tamanho dos indivíduos (RUEDA-ALMONACID et al., 2007), de modo que fêmeas menores e mais jovens realizam a postura de ovos em número e tamanho menores em relação a fêmeas mais velhas, que dão origem a filhotes mais fortes e viáveis (HUCHZERMEYER, 2003). Vários autores correlacionaram o número de ovos de cada ninho com a massa corporal das fêmeas, como ocorre no C. yacare (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995), no C. crocodilus crocodilus (CAMPOS, 2003) e no C. latirostris (LARRIERA et al., 2004; MONTINI et al., 2006). Segundo Campos (2003), outros fatores como a idade, o estado nutricional e a genética dos pais também podem influenciar a produção de ovos em Caiman crocodilus crocodilus, Paleosuchus palpebrosus e Melanosuchus niger. Quanto ao número de ovos por ninho, diversos valores são apresentados nas diferentes espécies. Webb e Cooper-Preston (1989) relatam para o Crocodilus

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porosus ninhos contendo de 2 a 78 ovos e Soberón, Tabet e Alvarez (2002) relatam valores médios para o Crocodilus acutus de 24,77 ovos por ninho. Em Caiman crocodilus crocodilus o número médio de ovos por ninho encontrados por Pérez (2001) e Campos (2003) foram, respectivamente, de 29,6 e de 25, variando este último de 14 a 38 ovos. Para o C. yacare, Campos et al. (2010) descrevem valores entre 22 a 35 ovos, com no máximo 42 ovos por ninho.

2.3 Incubação natural

O período de incubação varia, aproximadamente, de 60 a 90 dias, mas depende da espécie, assim como da temperatura, sendo menor com o aumento da temperatura (HUCHZERMEYER, 2003). No jacaré-do-Pantanal, da postura dos ovos

até a eclosão dos filhotes, podem decorrer até 70 dias, dependendo das condições

de incubação dos ovos e dos cuidados da fêmea (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995).

A temperatura e umidade ideais para o desenvolvimento dos embriões de

crocodilianos durante esse período, respectivamente, é de 97-99% e de 28°C a 34°C (BASSETTI, 2006). Em ambiente natural, Campos et al. (2008) revelaram que os ovos de ninhos de C. crocodilus crocodilus estudados perderam peso durante a incubação e atribuíram esse fato à perda de água, pois os jacarés nessa população

nidificaram no fim da estação de seca, quando o nível das águas do rio está baixo. As fêmeas investem tempo na construção e nos cuidados contra predadores

no ninho, permanecendo ao lado dos filhotes recém-eclodidos até um ano de vida

(CINTRA, 1989). As principais causas de mortalidade de ovos de jacarés no Pantanal são as inundações e a predação dos ninhos (COUTINHO e CAMPOS, 2005). Além de causar as inundações, as chuvas têm efeito direto na sobrevivência

dos ovos, pois interferem na temperatura dos ninhos de floresta e de vegetação flutuante (CAMPOS, 1993). As inundações foram relatadas como a principal causa de mortalidade de ovos, atingindo 29% para o Melanosuchus niger (VILLAMARÍN-JURADO e SUÁREZ, 2007) e 12,8% para M. niger e Caiman crocodilus (VILLAMARÍN et al., 2011), tendo sido a média de sucesso de eclosão para o Melanosuchus niger de 42,4% (VILLAMARÍN-JURADO e SUÁREZ, 2007).

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Quanto à predação, Campos e Magnusson (1995) relatam que os lobinhos (Cerdocyon thous), quatis (Nasua nasua) e porcos-monteiros (Sus scrofa) são espécies capazes de destruir parcial ou totalmente os ninhos. Já no Equador, Villamarín-Jurado et al. (2011) afirmam que 69,7% dos ninhos foram predados, principalmente por humanos, lagartos e jaguars. A viabilidade dos ovos também depende do tipo de habitat de nidificação. Montini et al. (2006) relataram um sucesso maior de eclosão em ninhos de C. latirostris construídos em vegetação flutuante do que naqueles feitos em floresta. Nos ninhos de crocodilianos também pode haver uma interação com invertebrados como cupins em ninhos de Paleosuchus trigonatus (MAGNUSSON, LIMA e SAMPAIO, 1985) e formigas em ninhos de Alligator mississipiensis (ALLEN et al., 1997). Neste último trabalho, os autores investigaram os efeitos da formiga de fogo (Solenopsis invicta) sobre filhotes de aligátores. Esta espécie frequentemente se instala nos ninhos desses crocodilianos e, à medida que se inicia o processo de eclosão, elas podem penetrar nos ovos e consumir o conteúdo do mesmo, picando os filhotes até que a mãe os leve para a água, o que, se ocorrer de forma rápida, não trará maiores consequências para os filhotes, mas, se houver demora, poderão aparecer edemas, principalmente ao redor dos olhos e extremidades dos membros.

2.4 Biometria de ninhos

Verdade (1995) mensurou ninhos de C. latirostris e obteve valores médios para a altura, comprimento e largura de, respectivamente, 49,2 cm, 134,2 cm e 103,4 cm. Platt e Thorbjarnarson (2000) obtiveram para os mesmos parâmetros, no Crocodylus acutus, as seguintes dimensões: 30 cm, 200 cm e 160 cm, em ninhos feitos em montes de areia e folhas. Villamarín-Jurado e Suárez (2007) obtiveram valores médios, para o Melanosuchus niger, de 0,54 m de altura e 1,65 m de diâmetro e no C. yacare foram relatadas dimensões médias de 44 cm de altura, 132 cm de comprimento e 121 cm de largura (FAUNAGUA-MAPZA-SERNAP-SITIPNIS,

2004).

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2.5 Biometria de ovos e filhotes

Huchzermeyer (2003) afirma que o fator mais importante relacionado à ninhada é o tamanho do ovo que consequentemente terá influência no tamanho do filhote. Webb e Cooper-Preston (1989) relatam dimensões médias de ovos de

Crocodilus porosus de 7,84 cm de comprimento (variando de 6,57 a 8,95 cm), 4,90

cm de largura e 109,19 g. de massa. Em Crocodylus acutus, Platt e Thorbjarnarson

(2000) descrevem valores médios para o comprimento, largura e massa, respectivamente e 70,5 mm, 44,1 mm e 85,6 g. Cardeilhac et al. (1999) mensuraram ovos de Alligator mississippiensis provenientes de três regiões diferentes: a região

Sul dos Everglades, o Sudoeste de Louisiana e o Lago Griffin, cujos valores médios

obtidos, respectivamente, para cada uma das três regiões foram: comprimento de 7,25 cm, 7,26 cm e 7,57 cm, largura de 4,079 cm, 4,20 cm e 4,47 cm e a massa de 68,85 g, 72,4 g e 86 g. Estes autores observaram diferença estatística na região do Lago Griffin, que foi atribuída às graves mudanças ambientais. Em ovos de C. latirostris, Verdade (1995) descreve uma média de 6,728 cm para o comprimento, 4,28 cm para a largura e 70,888 g para a massa e Piña, Simoncini e Larriera (2005), para a mesma espécie, apresentam o comprimento, a largura e a massa, variando respectivamente, de 3,03 a 5,05 cm, de 4,25 a 8,27 cm e de 30,75 a 88,56 g. Em C. crocodilus crocodilus, Pérez (2001) descreve largura de 49,1 mm e massa de 61,1 g

e Campos (2003) obteve para esta mesma espécie valores médios de comprimento

de 5,78 cm e largura de 3,59 cm. Miranda et al. (2002) relatam que a média da

massa dos ovos foi de 61,28 g para o C. yacare. Campos et al. (2008), em C. crocodilus crocodilus e C. crocodilus yacare, encontraram uma relação positiva entre o número de ovos, a média do volume do ovo (média estimada entre o comprimento e a largura do ovo) e o tamanho do embrião no Amazonas. Porém, na região do Pantanal Central, essa relação ocorreu apenas entre o número de ovos e a média do volume dos ovos. Neste mesmo estudo, também houve uma relação positiva entre o número de ovos e a média do volume dos ovos com as fêmeas, já que fêmeas maiores usam um espaço maior na cavidade abdominal para produzir ovos maiores e em maior quantidade. Temsiripong (1999) realizou a biometria de filhotes de Alligator mississippiensis, cujo CRC foi de 13,9 cm, variando de 10,5-16,6 cm e a massa

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média foi de 62,22 g, variando de 30-90 g. Segundo Verdade (1995), a biometria de filhotes de C. latirostris apresentou a média de comprimento total (CT) de 24,654 cm

e massa de 47,61 g. Pérez (2001) também realizou a biometria de recém-nascidos

de C. crocodilus crocodilus em que a média do CT foi de 22,4 cm, variando de 19,6

a 25,5 cm, enquanto a média de massa corpórea encontrada foi de 39,1 g, variando

de 26,1 a 57,5 g. Miranda et al. (1999) mensuraram o comprimento rostro-cloacal e a

massa corpórea de filhotes recém-eclodidos de C. yacare que foram submetidos a diferentes temperaturas de incubação e obtiveram as seguintes médias, respectivamente, 13,23 cm e 52,78 g a 28º C e 13,58 cm e 53,09 g a 32ºC. Estes autores concluíram que as temperaturas testadas não influenciaram o ganho de massa, mas, no geral, o melhor CRC foi obtido em temperatura de 32°C. Além da temperatura, Campos e Magnusson (1995) afirmam que os ovos maiores deram origem a maiores filhotes de C. yacare coletados no Pantanal Sul.

2.6 Sistema de criação comercial e incubação artificial

Além da produção de carne e couro (SARKIS-GONÇALVES et al., 2001), outra vantagem da criação comercial de crocodilianos é a prevenção da alta mortalidade dos ovos causada pela predação e inundação e a redução da mortalidade dos filhotes recém-eclodidos, diminuindo o impacto sobre a espécie na natureza (CASTRO e SILVA, 2005). No Brasil, o modelo legal vigente para a exploração de populações naturais de jacaré (COUTINHO e CAMPOS, 2006) é o ranching, regulamentado a partir da Portaria 126 de 1990 do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis - Ibama (BRASIL, 1990; BRASIL, 2009). Este sistema de criação só pode ser aplicado em locais com grandes remanescentes populacionais (SARKIS-GONÇALVES et al., 2001), já que a coleta dos ovos/filhotes só deve ser realizada mediante prévio levantamento populacional da espécie na área pretendida e autorização do órgão competente (CAMPOS, MOURÃO e COUTINHO, 2005). A incubação artificial é utilizada nas criações comerciais após a coleta autorizada de ovos na natureza. A incubação é um processo relativamente simples, em que devem ser consideradas a temperatura e a umidade das incubadoras. Os

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ovos podem ser incubados em bandejas plásticas contendo vermiculita umedecida, o que proporciona conservação da umidade e manutenção do calor necessário durante a incubação (GRIGG,1987). Huchzermeyer (2003) sugere a incubação dos ovos em prateleiras, pois afirma que facilita o acesso e a remoção aos ovos inférteis, reduzindo o risco de contaminação e também previne o superaquecimento causado pelo calor metabólico produzido pelo embrião. O ambiente de incubação é extremamente importante, pois influencia a taxa de desenvolvimento embrionário, crescimento após a eclosão, o período de incubação, a mortalidade embrionária e o sexo (LUXMOORE, 1992). O sucesso dessa modalidade de incubação está diretamente relacionado às condições de transporte dos ovos do ninho à incubadora e das condições físicas e sanitárias da incubadora durante esse processo (GRIGG, 1987). Segundo Huchzermeyer (2003), a taxa de eclosão em relação ao número de ovos por ninho na incubação artificial é baixa, o que pode ser atribuído à utilização de técnicas inadequadas. Em cativeiro, Verdade (2001) relatou uma taxa de eclosão de 79,83% de ovos de C. latirostris no sistema de ciclo fechado, caracterizado pela reprodução, oviposição e incubação em cativeiro. Nesta mesma espécie, no sistema ranching, Piña et al. (2007a) descrevem taxas de eclosão de 73,4% e também, taxas de eclosão que variaram de acordo com a temperatura de incubação, em que 79,3% foi obtido a 29°C, 77,9% a 31°C e 50,6% a 33°C (PIÑA et al., 2007a). Em ovos de Caiman crocodilus crocodilus incubados artificialmente, Pérez (2001) encontrou 84,1% de sucesso de eclosão em que 1,71% dos ovos não eclodidos apresentaram morte embrionária, 9,84% eram inférteis e 4,22% possuíam malformações que foram atribuídas a fatores hereditários. Miranda et al. (2002) relataram taxas de eclosão relacionadas à temperatura de incubação em C. yacare de 66,63% a 28°C e de 83,3% a 30°C. Martinéz et al. (2002) encontraram, em ovos de C. latirostris e C. yacare, 77% de sucesso de eclosão em que 9% dos ovos eram inférteis e 14% sofreram morte embrionária. Joanen e McNease (1981) revelaram que, além de fatores ambientais, o estado da incubação dos mesmos no momento da coleta também influencia a eclosão.

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2.7 Microbiota bacteriana

As condições sanitárias do processo de incubação (assepsia durante a coleta

e incubação artificial dos ovos) são pouco exploradas, embora fatores como

exposição a alta temperatura e umidade (FERGUSON, 1981a) e manuseio no momento da coleta (BASSETTI, 2006) já tenham sido relatados como condições que favorecem o processo de contaminação de ovos por fungos e bactérias. Por outro lado, Ferguson (1981a) relatou que a presença de bactérias no ninho durante a incubação natural facilita a eclosão do filhote pela ação dos ácidos

oriundos do metabolismo bacteriano sobre a camada externa do ovo. Existem poucas informações referentes à constituição dessa microbiota, mas Schumacher e Cardeilhac (1990) encontraram, na membrana de ovos de Alligator mississipiensis com lesões características de contaminação, os seguintes microorganismos:

Enterobacter cloacae, Citrobacter sp., Proteus sp. e Pseudomonas aeruginosa. Todas essas espécies fazem parte da microbiota intestinal de crocodilianos, indicando uma contaminação fecal como fonte do problema. Salmonella arizona, Pseudomonas aeruginosa e Aeromonas hydrophila foram isoladas de membranas da casca de ovos de crocodilos do Nilo que não eclodiram no Zimbabwe (FOGGIN, 1992). Gattamorta et al. (2002) investigaram a presença de Salmonella sp. no conteúdo de ovos recém-eclodidos de C. latirostris. Em contrapartida aos escassos

relatos da microbiota de ovos de crocodilianos, a microbiota oral e cloacal de crocodilianos tem sido descrita sem, no entanto, ser correlacionada à microbiota dos ovos (RAMOS et al., 1993; HUCHZERMEYER, 2000; GERMINO et al., 2008; SILVA

et al., 2009). Teoricamente, a bactéria pode infectar o ovo, tanto via transovariana, através de uma infecção do vitelo, quanto durante a postura, através da casca. A casca e as membranas apresentam uma certa barreira para a penetração da bactéria, porém, pequenas rachaduras na casca permitem facilmente o acesso da bactéria (HUCHZERMEYER, 2003). Em média, 3 a 15% dos ovos têm a casca rachada durante o processo de postura (JOANEN, 1969; POOLEY, 1969; WEBB, MESSEL e MAGNUSSON, 1977; GOODWIN e MARION 1978) e, se um ovo sofre uma contaminação, ele pode representar um perigo para os ovos adjacentes no ninho.

Além disso, a terra onde os ninhos são construídos também se torna contaminada

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com

(HUCHZERMEYER, 2003).

o

tempo,

principalmente

2.8 Microbiota fúngica

se

algum

ovo

é

quebrado

antes

da

eclosão

Os fungos estão normalmente presentes no solo (GAIRHE, 2007) e, sob certas condições, como alta umidade, também podem infectar os ovos de crocodilianos no ninho (HUCHZERMEYER, 2003), já que os ninhos deste grupo de animais são construídos a partir de materiais do ambiente como terra, galhos e folhas (VERDADE, 2001). Huchzermeyer (2003) ainda afirma que o risco de uma infecção fúngica é maior em ninhos feitos em formato de monte, devido ao tipo de material utilizado para a construção dos mesmos. Os fungos presentes no material do ninho são capazes de penetrar a casca do ovo, Hibberd (1994) descobriu que o tamanho dos poros da casca de ovos de Crocodylus porosus era suficiente para

permitir que hifas e esporos entrassem. Ela também relatou o crescimento de hifas ao longo de pequenas rachaduras na casca, isolando as espécies Fusarium solani,

Paecilomyces lilacinus e Aspergillus sp

Schumacher e Cardeilhac (1990) também

isolaram os fungos Fusarium oxysporum, Paeciliomyces aviotti, Penicillium fellucanum e Aspergillus niger em ovos de Alligator mississippiensis. O fungo pode não matar todos os embriões afetados durante a incubação, porém, alguns filhotes infectados podem morrer tardiamente (HIBBERD e HARROWER, 1993). Gairhe (2007) avaliou as causas de mortalidade de filhotes de gavial e mostrou que apenas 38% dos filhotes sobreviveram nos primeiros dez meses de vida e, desses 38%, 18,98% tinham lesões fúngicas na pele, cujos isolados revelaram a presença dos fungos Curvularia spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Pseudallescheria boydii, Rhizopus spp. e Trichoderma spp

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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Área de estudo

A coleta dos ovos e do material para a caracterização da microbiota bacteriana e fúngica de ovos de C. yacare foi realizada em uma fazenda localizada no município de Poconé, durante o mês de abril de 2011, conforme aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal - Cepa/UFMT (protocolo nº. 23108.044293/10- 8). Esta propriedade realiza a coleta e a incubação artificial de ovos destinados à criação comercial. Para tanto, durante o mês de março foram realizados nesta propriedade o censo de ninhos e a respectiva identificação. De um total de 103 ninhos encontrados, 20 foram coletados para a incubação artificial sendo definidos por sorteio levando-se em conta as quatro regiões da fazenda que apresentaram maior ocorrência: a área designada de Piuval (ninhos nº. 1-6), a área Estrada Parque (ninhos nº. 7-11), Vazante (ninhos nº. 12-16) e a área denominada Lixeiro (ninhos nº. 17-20).

3.2 Georreferenciamento e biometria do ninho

No local de cada ninho trabalhado foi realizado o georreferenciamento (Figura 1) e parâmetros biométricos como altura, largura da base e do ápice (Figura 2) dos 20 ninhos foram mensurados com auxílio de fita métrica flexível. Dados referentes à fitofisionomia da área escolhida pela fêmea para a construção do ninho também foram coletados de acordo com o preconizado por Cunha, Junke e Leitão-Filho

(2007).

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29 Figura 1: Mapa mostrando a localização geográfica dos 20 ninhos nas quatro áreas do Pantanal

Figura 1: Mapa mostrando a localização geográfica dos 20 ninhos nas quatro áreas do Pantanal Norte, município de Poconé/MT.

quatro áreas do Pantanal Norte, município de Poconé/MT. Figura 2: Mensuração da largura do ápice do

Figura 2: Mensuração da largura do ápice do ninho de Caiman yacare.

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3.3 Coleta das amostras, transporte e biometria dos ovos

Os ninhos foram abertos com cuidado, sem que os ovos fossem tocados e, após a abertura, procedeu-se à coleta das amostras microbiológicas da superfície dos ovos por swabs (Figura 3), sendo então acondicionadas em meio de transporte (meio de Stuart), resfriadas a aproximadamente 4ºC em recipiente isotérmico e transportadas para o processamento, não excedendo o período de 24 horas até a semeadura.

não excedendo o período de 24 horas até a semeadura. Figura 3: Coleta de amostra microbiológica

Figura 3: Coleta de amostra microbiológica da superfície dos ovos em ninho de Caiman yacare.

Após a coleta, os ovos de cada ninhada foram identificados, indicando a sua posição original no ninho, acondicionados em caixas forradas com o material vegetal do respectivo ninho (Figura 4) e transportados até a incubadora. Após a chegada dos ovos na propriedade, foi realizada a contagem e a biometria (Figura 5) dos mesmos. Os parâmetros analisados foram a mensuração do eixo maior (comprimento), do menor (largura) e da massa, respectivamente aferidos por paquímetro analógico e dinamômetro de mão (Pesola® de 100g e precisão de ±

0,3g).

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31 Figura 4: Ovos coletados e acondicionados para o transporte, no material vegetal do respectivo ninho.

Figura 4: Ovos coletados e acondicionados para o transporte, no material vegetal do respectivo ninho.

para o transporte, no material vegetal do respectivo ninho. Figura 5: Mensuração do comprimento do ovo

Figura 5: Mensuração do comprimento do ovo de C. yacare com paquímetro analógico.

3.4 Ovoscopia e incubação artificial

Todos os ovos passaram pelo exame de ovoscopia e foram classificados de acordo com o grau de desenvolvimento embrionário adaptado de Ferguson (1981b), sendo considerados de grau zero (Figura 6) aqueles que se apresentaram inteiramente translúcidos (inférteis) e de graus um a quatro aqueles que

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apresentaram graus crescentes de opacidade, sendo o grau quatro totalmente opaco. Desde o ingresso dos ninhos ao incubatório até a eclosão do último ninho transcorreram 39 dias de incubação artificial, período em que temperatura (em ºC) e umidade relativa do ar (em %) foram verificadas a cada seis horas, respectivamente, por um termômetro de mínima e máxima e um higrômetro.

por um termômetro de mínima e máxima e um higrômetro. Figura 6: Exame ovoscópico em ovo

Figura 6: Exame ovoscópico em ovo de C. yacare mostrando-se translúcido e, portanto, classificado como grau zero e caracterizado como infértil.

Após o término do período de incubação de cada ninho, os ovos que não eclodiram foram abertos por incisão longitudinal com lâmina de bisturi e o conteúdo foi inspecionado quanto à presença ou não de embrião/feto. Amostras microbiológicas foram colhidas do conteúdo de cinco ovos, sendo dois deles com odor fétido e outros três sem aparente decomposição e com filhotes não eclodidos que apresentavam o vitelo exteriorizado. Os ovos com odor fétido foram caracterizados não só pela presença dessa característica, mas também pela observação de uma coloração escurecida e manchas circulares na casca. No local destinado à incubação, cada ninho foi mantido separadamente em pequenos recintos delimitados por tijolos de oito furos, forrados e cobertos pelo material oriundo do ninho, conforme procedimento adotado na propriedade em coletas anteriores (Figura 7). Os ovos foram depositados nesses compartimentos

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(incubadora), onde permaneceram até o momento da eclosão. Antes da colocação dos ovos na incubadora, foi coletada uma amostra microbiológica dos tijolos, que foi conservada e processada nas mesmas condições descritas anteriormente.

e processada nas mesmas condições descritas anteriormente. Figura 7: Sistema de incubação artificial de ovos de

Figura 7: Sistema de incubação artificial de ovos de C. yacare adotado na propriedade rural no Pantanal Norte, município de Poconé/MT.

3.5 Processamento microbiológico

Para a identificação de bactérias, as amostras coletadas foram semeadas em ágar sangue e ágar Mac Conckey para a identificação de bactérias, sendo incubadas em ambiente aeróbico e anaeróbico a 37ºC e observadas a cada 24 horas por até 72 horas. Após a observação do crescimento bacteriano, as colônias foram identificadas de acordo com suas características morfotintoriais e provas bioquímicas. As análises foram realizadas segundo a metodologia descrita por Quinn et al. (1994) e Koneman et al. (2001). A colônia condizente com Salmonella sp. foi confirmada através da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) em que a extração foi realizada segundo a metodologia de fervura-centrifugação descrita por Soumet et al. (1994) e o PCR segundo Suh & Song (2005), utilizando um par de primers que originam produtos de amplificação de 298 pares de base correspondente ao gene invA.

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Para a pesquisa de fungos e leveduras, as amostras coletadas foram semeadas em ágar Sabouraud-dextrose (4%) e ágar Sabouraud-dextrose com cloranfenicol (100 mg/L), incubadas em ambiente aeróbico de 28ºC a 30°C e observadas a cada 24 horas por até sete dias. Após a observação do crescimento fúngico, procedeu-se ao microcultivo nos meios ágar batata-dextrose (BDA) e ágar fubá acrescido de Tween-80 a 1%. Os dois últimos meios foram empregados visando a estimular a esporulação dos fungos, às vezes insuficiente ou ausente em ágar-Sabouraud. A incubação foi realizada de forma similar à descrita anteriormente para o cultivo inicial. Lâminas originadas no microcultivo foram coradas com lactofenol e azul de tripano (0,05%) para determinar a diferenciação de estruturas reprodutivas sexuais e ou assexuadas. Para a classificação dos fungos, foram utilizadas as chaves de identificação segundo Domsch, Gams e Anderson (1993), Alexpoulos, Mims e Blackwell (1996), Watanabe (2002) e Harman et al. (2004).

3.6 Biometria dos filhotes

Após a eclosão, a biometria dos filhotes também foi realizada com a mensuração do comprimento rostro-cloacal (CRC), a qual foi obtida com auxílio de fita métrica flexível e com a aferição da massa por meio de dinamômetro de mão (Pesola® de 100g e precisão de ± 0,3g). Após a biometria, os filhotes foram transferidos para as instalações da criação comercial e os ovos remanescentes foram contados para a verificação da taxa de eclosão e, na sequência, abertos para a verificação da presença de embrião/feto conforme descrito anteriormente.

3.7 Delineamento experimental e análise estatística

O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos (áreas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro). Todos os ovos de um determinado ninho foram considerados uma parcela. O número de repetições de

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cada tratamento foi diferente em função da proporção de ninhos encontrados em cada área. As correlações entre a quantidade de ovos por ninho, a biometria dos ninhos, dos ovos e dos filhotes, a taxa de eclosão, a quantidade de ovos inférteis e os ovos que não eclodiram (por odor fétido ou retardo no desenvolvimento em relação aos outros filhotes eclodidos no mesmo ninho) e as áreas estudadas foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e teste de médias Tukey conforme Banzato e Kronka (1992), utilizando-se o software SAEG.

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4 RESULTADOS

4.1 Georreferenciamento, caracterização e biometria dos ninhos

As coordenadas geográficas de cada ninho e as respectivas áreas de ocorrência estão descritas na tabela 1. Os ninhos dos quais o material biológico foi coletado, localizados na área Piuval, foram construídos pelas fêmeas no interior de capões de gravatás e próximos à água. Eles eram formados por raízes, terra úmida e uma pequena quantidade de material em decomposição no solo (serrapilheira). Os ninhos localizados na Estrada Parque eram construídos em campos de murundus e, em sua maior parte, eram constituídos de serrapilheira e, em menor proporção, de terra e raízes. Na Vazante, os ninhos foram encontrados em cambarazais (ninhos 12 e 14) e campos de murundus (ninhos 13, 15 e 16) e eram formados por serrapilheira, gravetos e uma quantidade menor de terra. Os ninhos localizados na área do Lixeiro foram construídos em campos de murundus e continham terra, gravetos e pouca serrapilheira (Figuras 8a-d). Todos os ninhos investigados neste trabalho possuíam sombreamento parcial oferecido por árvores localizadas ao redor dos mesmos e foram construídos em camada única. Além disso, foi observada a presença de invertebrados (tabela 1), como cupins em 40% dos ninhos, formigas em 30%, diplópodas em 25% (Figuras 9a-b) e lacraias em 5% em todas as quatro áreas. Dos 20 ninhos caracterizados, observou-se altura média de 36,3 cm, variando de 20 a 46 cm. A média da largura da base e do ápice dos ninhos foi, respectivamente, de 126,8 cm (variando de 94 cm a 137 cm) e 46,5 cm (variando de 31 cm a 66 cm). Comparando as médias das quatro áreas estudadas, observou-se que não houve diferença estatística para a altura, largura da base e do ápice dos ninhos entre elas (P<0,05), como descrito na tabela 2.

37

Tabela 1 Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, respectivas áreas de ocorrência, coordenadas geográficas e ocorrência de invertebrados, no município de Poconé, MT abr 2011

Ninho

Área

Coordenadas geográficas

Invertebrados

1

S

16° 24'59''; WO 56° 36'38.8''

Cupins/formigas

2

S 16° 25'05.5''; WO 56° 36'33.2''

Cupins/formigas

3

Piuval

S 16° 24'49.1''; WO 56° 36'33.6''

Cupins/diplópodas

4

S 16° 24'59.8''; WO 56° 36'33.6''

Cupins

5

S 16° 24'42.7''; WO 56° 36'31.5''

----

6

S 16° 25'03.3''; W 56° 36'32.9''

Diplópodas

7

S

16° 23'07.8''; W 56° 37' 40.2''

Formigas

8

S 16° 23'06.0''; W 56° 37'42.2''

---

9

Estrada Parque

S 16° 23'13.7''; W 56° 37'40.4''

Cupins

10

S 16° 23'16.0''; W 56° 37'42.7''

Diplópodas/cupins

11

S 16° 22'52.5''; W 56° 37'47.2''

---

12

S

16° 22'37.3''; W 56° 36'45.3''

Diplópodas/formigas

13

S 16° 22'38''; W 56° 36'44.1''

Cupins/formigas

14

Vazante

S 16° 22'07.1''; W 56° 36'45.8''

---

15

S 16° 21'59.3''; W 56° 36'54.5''

Cupins

16

S 16° 21'598.7''; W56°36'57.1''

---

17

S

16°22'10.3''; W 56°37'58''

Formigas/lacraia

18

S

16° 22'6.0''; W 53° 38'5.3''

---

19

Lixeiro

S 16° 21'57.9''; W 56° 38'05.5''

---

20

S 16° 22'9.8''; W 56° 37'34''

Diplópodas

4.2 Ovoscopia e biometria dos ovos

Nos 20 ninhos analisados, chegou-se a um total de 464 ovos que foram submetidos ao exame ovoscópico, obtendo-se para os graus 0 (totalmente translúcido), 2, 3 e 4 (totalmente opaco), respectivamente, 19 (4,1%), 2 (0,4%), 26 (5,6%) e 417 (89,9%) ovos. Dentre os 417 ovos opacos, 66 deles apresentavam rachaduras e material viscoso emergindo por elas, evidenciando a eclosão dos animais no momento do exame; outros 38 ovos opacos não apresentavam rachaduras, mas possuíam odor fétido e um ovo apresentou-se quebrado.

38

38 Figuras 8a-d: Ninho de C. yacare na área Piuval localizado em um capão de gravatás

Figuras 8a-d: Ninho de C. yacare na área Piuval localizado em um capão de gravatás (a), na área Estrada Parque (b) e Lixeiro (c) em campos de murundus e na Vazante em cambarazais (d).

(c) em campos de murundus e na Vazante em cambarazais (d). Figuras 9a-b: Ninhos de C.

Figuras 9a-b: Ninhos de C. yacare contendo invertebrados como cupins (a) e diplópodas (b).

39

Tabela 2 - Médias da altura (cm), largura da base (cm) e do ápice (cm) dos ninhos de Caiman yacare em diferentes áreas, município de Poconé, MT abr 2011

Altura do ninho

Base do ninho

Ápice do ninho

Piuval

35,67 a

114,83 a

46,83 a

Estrada Parque

34,70 a

113,40 a

50,00 a

Vazante

39,60 a

177,80 a

47,60 a

Lixeiro

36,25 a

101,25 a

40,50 a

Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey (P<0,05).

Quanto à biometria dos ovos provenientes dos 20 ninhos, as médias do comprimento, da largura e da massa foram respectivamente, de 6,6 cm (variando de 5,2 cm a 7,8 cm), 3,9 cm (variando de 3,4 cm a 4,4 cm) e 67,5 g (variando de 30 g a 87 g.) Para os parâmetros analisados, em termos de comprimento, largura e massa, não houve diferença estatística (tabela 3) entre as quatro áreas (p<0,05).

Tabela 3 - Médias do comprimento (cm), largura (cm) e da massa (g) de ovos de Caiman yacare nas respectivas áreas, no município de Poconé, MT abr 2011

Comprimento dos ovos

Largura dos ovos

Massa dos ovos

Piuval

6,66 a

4,00 a

68,30 a

Estrada Parque

6,62 a

3,98 a

69,36 a

Vazante

6,62 a

3,98 a

64,32 a

Lixeiro

6,47 a

3,86 a

66,76 a

Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey (P<0,05).

4.3 Incubação artificial e taxa de eclosão

Durante o período analisado, a temperatura média foi de 28,5°C, tendo sido observada uma temperatura mínima de 23,6°C e máxima de 33,7°C. A umidade relativa do ar média foi de 81,3%, sendo o valor mínimo igual a 57,4% e o valor máximo igual a 95,8%. A variação da temperatura (em °C) e da umidade relativa do ar (em %) durante o período de incubação está descrita no gráfico 1.

40

88,0 30,5 86,0 30,0 84,0 29,5 82,0 29,0 80,0 28,5 78,0 28,0 76,0 27,5 74,0
88,0
30,5
86,0
30,0
84,0
29,5
82,0
29,0
80,0
28,5
78,0
28,0
76,0
27,5
74,0
27,0
72,0
26,5
70,0
26,0
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Umidade (%)
Temperatura (C)

Dias de amostragem (abril/2010)

Média diária de Umidade (%)Umidade (%) Temperatura (C) Dias de amostragem (abril/2010) Média diária de Temperatura (°C) Gráfico 1 -

Média diária de Temperatura (°C)de amostragem (abril/2010) Média diária de Umidade (%) Gráfico 1 - Variação média da temperatura (em

Gráfico 1 - Variação média da temperatura (em °C) e umidade relativa do ar (em %) no ambiente durante a incubação dos ovos.

O número de ovos por ninho variou de 5 a 33 ovos (Tabela 4), sendo a média de 23,2. Após o término da incubação, 336 ovos (72,4%) eclodiram. Dos 128 (27,6%) que não eclodiram, 124 (96,9%) apresentaram odor fétido e, ao serem abertos, possuíam conteúdo que variava de caseoso a pútrido (Figuras 10a-b) e 4 (3,1%) não possuíam odor fétido e continham filhotes que, quando comparados com os filhotes do mesmo ninho já eclodidos, estavam atrasados quanto ao desenvolvimento (Figura 11a), o que foi evidenciado pela presença do vitelo ainda fora da cavidade abdominal. Dentre os 124 ovos, em 15 deles (12,1%) foi possível observar a presença de feto e/ou embrião, caracterizando a morte embrionária/fetal (Figura 11b), não sendo possível a identificação deles no restante (109; 87,9%) devido à decomposição avançada.

41

Tabela 4 - Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, área de ocorrência dos ninhos, número de ovos por ninho, número de ovos não eclodidos e taxa de eclosão, no município de Poconé, MT abr 2011

Ninho

Área

Nº de ovos por ninho

N°. ovos não eclodidos

Taxa de eclosão (%)

1

25

5

80

2

33

6

81,81

3

Piuval

11

5

45,45

4

25

3

88

5

5

5

0

6

23

2

91,3

7

27

3

88,88

8

25

16

64

9

Estrada Parque

30

12

60

10

26

4

84,61

11

25

25

0

12

30

7

76,66

13

26

7

73,07

14

Vazante

26

6

76,92

15

28

3

10,71

16

15

8

53,33

17

22

5

77,27

18

20

3

85

19

Lixeiro

10

2

80

20

32

1

96,87

TOTAL

464

128

2 80 20 32 1 96,87 TOTAL 464 128 Figuras 10a-b: Ovo de C. yacare após

Figuras 10a-b: Ovo de C. yacare após abertura, evidenciando o conteúdo caseoso (a) e pútrido (b), ambos com odor fétido.

42

42 Figuras 11a-b: Filhote de C. yacare sem odor fétido e com retardo no desenvolvimento, evidenciado

Figuras 11a-b: Filhote de C. yacare sem odor fétido e com retardo no desenvolvimento, evidenciado pelo vitelo fora da cavidade abdominal e feto em autólise caracterizando a morte fetal.

A comparação da taxa de eclosão, do número de ovos não eclodidos (inférteis ou com odor fétido ou com retardo no desenvolvimento fetal) e a comparação das médias do número de ovos por ninho entre as quatro áreas não mostraram significância (p>0,05), indicando que esses parâmetros não sofreram influência do fator área (Tabela 5).

Tabelas 5 - Médias do número de ovos de Caiman yacare, da taxa de eclosão, do número de ovos não eclodidos (inférteis ou com odor fétido), nas respectivas áreas de coleta, no município de Poconé, MT abr 2011

Número de ovos não eclodidos

Ovos com odor

Número de ovos

Taxa de eclosão

Ovos inférteis

 

fétido

Piuval

20,33 a

77,04 a

4,91 a

16,39 a

Estrada Parque

26,60 a

57,91 a

6,76 a

35,33 a

Vazante

25,20 a

73,60 a

0,80 a

25,6 a

Lixeiro

21,00 a

86,90 a

3,57 a

9,57 a

Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey (P<0,05).

4.4 Biometria dos filhotes

A biometria dos filhotes recém-eclodidos de jacaré-do-Pantanal também foi aferida, sendo a média do comprimento rostro-cloacal (CRC) de 12,2 cm, possuindo, o menor filhote, comprimento igual a 10,7 cm e o maior 13,1 cm. A massa média dos

43

filhotes foi de 45,1 g, variando de 31 a 58 g. A comparação das médias do CRC e da massa dos filhotes entre as áreas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro também não mostrou significância e estão descritas na tabela 6.

Tabela 6 - Médias do comprimento rostro-cloacal - CRC (cm) e da massa (g) de filhotes recém- eclodidos de Caiman yacare, e coeficiente de variação, nas respectivas áreas de coleta, no município de Poconé, MT abr 2011

 

Comprimento rostro-cloacal

Massa

Piuval

12,125 a

41,959 a

Estrada Parque

12,38 a

47,564 a

Vazante

11,98 a

46,44 a

Lixeira

12,225 a

43,67 a

CV

3,478

11,919

Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Tukey (p<0,05).

4.5 Microbiota bacteriana e fúngica

A amostra microbiológica coletada na incubadora antes da chegada dos ovos resultou em sete bactérias diferentes: Alcaligenes sp., Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes, Flavobacterium multivorum, Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae, Shigella sp. e Streptococcus sp. Essa mesma amostra também resultou nos seguintes fungos: Aspergillus sp., Mycelia sterilia e Penicillium sp. Nas amostras de ovos de C. yacare oriundas de 20 ninhos coletados, foram identificadas 22 bactérias diferentes, sendo a mais frequente a espécie Bacillus cereus, isolada em 95% das amostras e as espécies Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Salmonella sp., Serratia marcescens e Shigella sonnei foram isoladas em 5% dos ninhos (Tabela 7). Essas mesmas amostras evidenciaram a presença de sete diferentes fungos, sendo seis gêneros e uma espécie (Tabela 8). O Fusarium sp. foi o mais comum, presente em 40% das amostras e os gêneros Geotrichum sp., Mycelia sterilia e Trichoderma sp. os menos comuns, com 10% de ocorrência. As amostras oriundas do conteúdo dos ovos com odor fétido apresentaram os seguintes microorganismos: Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Flavobacterium multivorum, Pseudomonas stutzeri,

44

Staphylococcus aureus e Streptococcus sp

eclodidos apresentaram: Aeromonas hydrophila, Alcaligenes sp., Escherichia colli,

Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas stutzeri, Staphylococcus sp. e Streptococcus sp O fungo encontrado na amostra do conteúdo do ovo com odor fétido resultou em Geotrichum sp. e no filhote não eclodido foi o Fusarium sp.

Aquelas provenientes dos filhotes não

Tabela 7 - Ocorrência das bactérias, em porcentagem, nas respectivas áreas de coleta, no município de Poconé, MT abr 2011

Bactérias

Acinetobacter sp. Aeromonas hydrophila Alcaligenes sp. Bacillus cereus Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Enterobacter aglomerans Escherichia colli Escherichia hermanni Flavobacterium multivorum Hafnia alvei Morganella morganni Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas

stutzeri.

Salmonella sp.

Piuval

(%)

16,66

16,66

-

100

66,66

66,66

-

50

16,66

66,66

-

-

33,33

33,33

33,33

16,66

S.

aureus

-

S.

intermedius

-

Serratia liquefacians

33,33

Serratia marcescens

-

Shigella sonnei

-

Streptococcus sp.

66,66

Estrada

Parque

(%)

60

20

40

80

40

40

-

20

-

80

20

20

20

20

60

-

20

20

-

-

-

20

Vazante

Lixeiro

TOTAL

(%)

(%)

(%)

20

50

35

20

50

25

60

25

30

80

100

95

100

100

75

60

75

60

60

-

15

60

25

40

-

-

5

80

100%

80

-

-

5

-

-

5

20

-

20

60

-

30

20

-

30

-

-

5

40

-

15

20

-

10

-

-

10

20

-

5

-

25

5

60

25

45

45

Tabela 8 - Ocorrência dos fungos, em porcentagem, nas respectivas áreas de coleta, no município de Poconé, MT abr 2011

 

Piuval

Estrada Parque

Vazante

Lixeiro

Total

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

Fungos

Aspergillus sp.

16,6

20

20

50

25

Cunninghamella

33,3

40

25

25

-

echinulata

 

Fusarium sp.

66,6

20

40

25

40

Geotrichum sp.

--

20

20

-

10

Mycelia sterilia

16,6

20

-

-

10

Penicillium sp.

16,6

40

40

50

35

Trichoderma sp.

16,6

-

-

25

10

46

5 DISCUSSÃO

5.1 Caracterização e biometria dos ninhos

O local de nidificação caracterizado neste trabalho se assemelha às descrições encontradas para outros crocodilianos (GREER, 1970; FERGUSON, 1985; PÉREZ, 2001; MIRANDA et al., 2002; HUCHZERMEYER, 2003; AVANZINE et al., 2007) incluindo o C. yacare (COUTINHO e CAMPOS, 2005). Na natureza, são encontrados ninhos com diferentes itens em sua constituição, de acordo com a espécie e os recursos disponíveis no ambiente de nidificação. Há ninhos, por exemplo, constituídos por material vegetal, como capim, gravetos e eventualmente misturados com terra (SARKIS-GONÇALVES et al., 2001), como descrito para os ninhos das regiões Estrada Parque e Vazante. Segundo Huchzermeyer (2003), as espécies que vivem em florestas constroem ninhos a partir de montes de folhas encontradas no chão da floresta e dependem do calor produzido pela compostagem, e não do sol, para incubar os ovos. As espécies que vivem em pântanos fazem o ninho a partir da vegetação de mangue e também dependem do calor da compostagem, bem como do sol para a incubação dos ovos. Villamarín-Jurado e Suárez (2007) descreveram ninhos de Melanosuchus niger como montes cônicos feitos de serrapilheira e raízes e ainda afirmaram que todos os ninhos encontrados estavam próximos a uma lagoa, o que corrobora os dados obtidos nesta investigação pois, como descrito acima, os ninhos de C. yacare encontrados estavam sempre localizados próximo à água e eram formados por montes de serrapilheira, raízes e terra. Com relação à biometria dos ninhos de Caiman yacare, os valores obtidos neste experimento para a altura e a largura foram, respectivamente, menores e maiores do que aqueles apresentados por Faunagua-Mapza-Sernap-Sitipnis (2004). A altura também foi menor em relação aos valores obtidos para o C. latirostris (VERDADE, 1995) e M. niger (VILLAMARÍN-JURADO e SUÁREZ, 2007) e maior quando comparada ao C. acutus (PLATT e THORBJARNARSON, 2000). Já a largura foi menor do que aquelas encontradas no C. acutus (PLATT e THORBJARNARSON, 2000) e M. niger (VILLAMARÍN-JURADO e SUÁREZ, 2007) e maior em relação àquela obtida no C. latirostris (VERDADE, 1995). Não é possível inferir que o tamanho da espécie influencie o tamanho do ninho, mas esta variedade de tamanhos entre diferentes espécies de crocodilianos possivelmente está relacionada à disponibilidade de material para a

47

construção do mesmo conforme descrito por Magnusson (1979), assim como os ciclos anuais de cheia e seca no Pantanal, que alteram não só a oferta de material como também a disponibilidade dos locais de nidificação (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995), ou seja, os ninhos terão variações de tamanho e constituição de acordo com disponibilidade do material no ambiente. À semelhança do observado nos ninhos de C. yacare, Magnusson, Lima e Sampaio (1985) e Allen et al. (1997) também relataram a presença de invertebrados como cupins e formigas, respectivamente para o Paleosuchus trigonatus e Alligator mississipiensis. No entanto, esses autores não relataram a presença de diplópodas como observado para o C. yacare. Embora não se tenha objetivado o estudo das interrelações entre esses invertebrados e o jacaré-do-Pantanal, Allen et al. (1997) investigaram os efeitos da formiga de fogo (Solenopsis invicta) sobre filhotes de aligatores. Esta espécie frequentemente se instala nos ninhos desses crocodilianos e, à medida que se inicia o processo de eclosão, elas podem penetrar nos ovos e consumir o conteúdo do mesmo, picando os filhotes até que a mãe os leve para a água, o que, se ocorrer de forma rápida, não trará maiores consequências para os filhotes, mas, se houver demora, poderá aparecer edema, principalmente ao redor dos olhos e extremidades dos membros.

5.2 Ovoscopia e biometria dos ovos

Dos 464 ovos submetidos ao exame de ovoscopia, 19 mostraram-se translúcidos, o que evidenciou a condição de infertilidade dos mesmos. Os 445 restantes apresentaram algum grau de opacidade, sugerindo, portanto, que estariam férteis e consequentemente viriam a eclodir. No entanto, a inspeção dos mesmos durante a biometria mostrou que um estava parcialmente quebrado e outros 38 apresentaram odor fétido e, embora os 39 ovos estivessem totalmente opacos, esses ovos provavelmente não iriam eclodir, o que foi verificado no exame físico após o período de incubação. Dessa forma, verificou-se que a expectativa de que o número de ovos restantes (406) eclodissem não se concretizou. O que se observa é que, durante o exame ovoscópico, ovos com conteúdo pútrido ou caseoso, mas que não apresentam odor fétido e, portanto, não podem ser identificados ao exame físico, podem ser confundidos com um ovo embrionado de grau quatro. Isso talvez justifique a diferença entre o número de ovos efetivamente eclodidos (336) e a expectativa de eclosão frente ao exame ovoscópico.

48

Webb e Cooper-Preston (1989) e Verdade (1995) relatam médias das dimensões dos ovos, respectivamente, para o Crocodilus porosus e Caiman latirostris, maiores do que as relatadas neste experimento, embora os valores citados por Verdade (1995) sejam ligeiramente maiores. Diferentemente ocorreu em relação aos valores obtidos por Campos (2003) para o C. crocodilus crocodilus, sendo estes dados inferiores aos encontrados no C. yacare. Embora se trate da mesma espécie, Miranda et al. (2002) encontraram valores médios de massa inferiores aos obtidos neste experimento. A diferença entre as dimensões dos ovos das espécies C. porosus e C. latirostris, que foram maiores que a do C. yacare, e do C. crocodilus crocodilus, que foram um pouco menores, pode ser justificada pelo fato de serem espécies distintas cujas dimensões corpóreas também diferem entre elas, pois, o tamanho do ovo está positivamente correlacionado ao tamanho da fêmea, em que fêmeas maiores são capazes de produzir ovos maiores e em maior quantidade (FERGUNSON, 1985; PLATT e THORBJARNARSON, 2000; HUCHZERMEYER, 2003; CAMPOS, 2003; LARRIERA et al., 2004; MONTINI et al., 2006; RUEDA-ALMONACID et al., 2007). Além disto, Huchzermeyer (2003) afirmou que nos crocodilianos o tamanho dos ovos varia com a idade das fêmeas, de modo que fêmeas mais jovens apresentam ovos menores, o que pode justificar a diferença da massa encontrada por Miranda et al. (2002) que foi inferior à relatada nesta investigação, ainda que se tratando da mesma espécie.

5.3 Incubação artificial e taxa de eclosão

Para a incubação artificial de ovos de crocodilianos não são recomendadas temperaturas abaixo de 27ºC ou acima de 34ºC, o que poderia comprometer a sobrevivência dos embriões (SARKIS-GONÇALVES et al., 2001). Neste experimento, embora tenha sido registrada uma temperatura de 23,6ºC, as médias ficaram compreendidas dentro do intervalo citado como ideal para crocodilianos. A temperatura e umidade relativa do ar são capazes de interferir na incubação dos ovos e consequentemente modificar a taxa de eclosão (MIRANDA et al., 2002; PIÑA, LARRIERA e CABRERA, 2003; PIÑA, SIMONCINI E LARRIERA, 2005; PIÑA et al., 2007a). A taxa de eclosão obtida neste experimento (72,4%) provavelmente esteja associada ao número de ovos comprometidos (fétidos com conteúdo caseoso e/ou pútrido) e não às variações da

49

temperatura durante o curto tempo de incubação artificial, pois os ovos foram coletados no terço final do período de incubação. Alguns estudos sugeriram que temperaturas muito altas ou baixas causam malformações e comprometem a sobrevivência dos filhotes (WEBB e COOPER-PRESTON, 1989). Por outro lado, Miranda et al. (2002) relataram que os ovos de Caiman crocodilus yacare que tiveram a temperatura reduzida de 30° C para 28° C sofreram danos severos. O número de ovos por ninho encontrado para o C. yacare corrobora os dados apresentados por Campos et al. (2010). Segundo Rueda-Almonacid et al. (2007), o número de ovos produzidos está relacionado com o tamanho dos indivíduos e a espécie, embora Campos (2003), em estudo com Caiman crocodilus crocodilus, Paleosuchus palpebrosus e Melanosuchus Níger, concluiu que há outros fatores capazes de afetar a produção de ovos, além do tamanho da fêmea como a idade, o estado nutricional e a genética dos pais. Embora neste experimento não se tenha objetivado a captura e biometria das fêmeas, vários autores correlacionaram o número de ovos de cada ninho com a massa corporal de fêmeas de várias espécies de crocodilianos como o C. crocodilus crocodilus (CAMPOS, 2003) e o C. latirostris (LARRIERA et al., 2004; MONTINI et al., 2006). Todos eles afirmaram que existe uma correlação positiva entre o número e o tamanho dos ovos e o tamanho das fêmeas, sendo que as fêmeas maiores realizam a postura de mais e maiores ovos que as fêmeas menores. Além disso, Basseti (2006) afirma que, o estresse no período pré-reprodutivo também pode afetar o desenvolvimento gonadal de fêmeas de crocodilianos com baixa posição hierárquica, impedindo que entrem no estro ou diminuindo o desenvolvimento folicular e, consequentemente, o número de ovos. Esses fatores (tamanho, idade, genética e estado nutricional dos pais), como explicado anteriormente, são capazes de interferir tanto na biometria como no número de ovos por ninho, dessa forma, assim como também não houve diferença estatística entre as quatro áreas no parâmetro biometria dos ovos, compreende-se essa igualdade de resultados quando analisado o número de ovos por ninho, já que esses parâmetros estão correlacionados por possuírem as mesmas causas. Na tabela 4 apresentada nos resultados, observou-se que os ninhos 3, 5, 16 e 19 continham um número de ovos por ninho abaixo do que está descrito por Campos et al. (2010) para o C. yacare que descrevem valores entre 22 a 35 ovos, com no máximo 42 ovos por ninho. Essa diferença pode ser justificada pelas descrições no parágrafo acima, porém, Hunt (1989) descreve em seu trabalho, com ninhos de aligátores, que quando ocorre a predação dos ninhos, as fêmeas os cobrem novamente, deixando-os aparentemente intactos e com uma quantidade menor de ovos. O que também corrobora

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essa hipótese é a taxa de eclosão desses ninhos que, com excessão do ninho 19 estavam abaixo ou em torno de 50%, pois os ovos de crocodilianos são altamente sensíveis ao calor excessivo causado pela incidência solar direta (SARKIS-GONÇALVES et al., 2001). A taxa de eclosão verificada neste experimento (72,41%) apresenta valor próximo àquele (79,83%) descrito por Verdade (2001) para o C. latirostris criado no sistema de ciclo fechado (farming), assim como, nesta mesma espécie, Piña et al. (2007a) relataram taxas de eclosão que variaram de acordo com a temperatura de incubação (79,3% a 29°C; 77,9% a 31°C e 50,6% a 33°C), obtendo, em outro experimento, média de sucesso de eclosão de 73,4% (PIÑA et al., 2007b). Miranda et al. (2002) também revelaram taxas de eclosão relacionadas à temperatura de incubação em C. yacare (66,63% a 28°C e de 83,3% a 30° C). O valor obtido neste experimento está compreendido entre os valores mínimo e máximo obtidos por Miranda, mas, considerando-se que a temperatura média de incubação neste experimento foi de 28,5°C, pode-se dizer que se obteve uma taxa de eclosão superior a relatada por esses autores. Na Argentina, Martinéz et al. (2002) revelaram taxas de eclosão de 77% em C. latirostris e C. yacare. Quanto à taxa de ovos inférteis, Pérez (2001) relata taxas de 9,84% para o Caiman crocodilus crocodilus e Martinéz et al. (2002) encontraram 9% em ovos de C. latirostris e C. yacare. Neste experimento (C. yacare), os ovos inférteis, corresponderam a 4,1%, sendo essa taxa inferior às citadas anteriormente. Com relação aos ovos que não eclodiram (128) e foram abertos, em 15 deles (12,1%) observou-se morte fetal, não sendo possível identificar morte embrionária, devido ao grau de autólise dos tecidos, restando apenas conteúdo putrido no interior do ovo. Conforme citação de Huchzermeyer (2003), é difícil a diferenciação entre um ovo infértil e um com morte embrioária precoce. Martinéz et al. (2002) também obtiveram taxa de mortalidade embrionária (14%) acima das obtidas neste experimento. Segundo Huchzermeyer (2003), a infertilidade do ovo pode ser explicada por fatores genéticos, doenças ou a condição nutricional da fêmea, o que poderia justificar a taxa de 4,09% encontrada neste trabalho e a diferença com os dados de Pérez (2001), sendo que, em nenhum dos trabalhos foi verificada a condição nutricional e sanitária das fêmeas. No caso dos ovos que aparentemente não possuiam odor fétido (4; 3,1%), mas que também não eclodiram, ao serem abertos, observou-se a presença de feto vivo, porém, ainda com o vitelo exteriorizado, mostrando um retardo no desenvolvimento em relação aos demais animais da ninhada. Sabe-se que alguns fatores, como a temperatura e umidade, podem ser responsáveis pelo retardo no desenvolvimento embrionário de

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crocodilianos (FERGUSON 1985, MIRANDA et al. 2002, HUCHZERMEYER, 2003). Isso também pode ser justificado pela variação individual, em que os ovos em um mesmo ninho são afetados de forma diferente pelo tratamento térmico, dependendo do potencial de desenvolvimento de cada indivíduo, conforme relatado por Miranda et al. (2002).

5.4 Biometria dos filhotes

O comprimento rostro-cloacal de filhotes recém-eclodidos de C. yacare mostrou-se inferior aos valores apresentados para o Alligator mississippiensis (TEMSIRIPONG, 1999) e C. yacare (MIRANDA et al., 1999), assim como, para o C. latirostris (VERDADE, 1995) C. crocodilus crocodilus (PÉREZ, 2001), embora estes dois últimos autores tenham realizado a mensuração do comprimento total. Quanto à massa corpórea, verificaram-se neste experimento valores menores do que os citados, também para o C. yacare, por Miranda et al. (1999). É possível que tal diferença esteja relacionada à temperatura de incubação, pois, segundo Miranda et al. (1999), a temperatura de incubação é capaz de afetar o desenvolvimento dos animais. A massa corpórea do C. yacare também foi menor do que as citadas para o Alligator mississippiensis e C. latirostris, mas foi maior (45,1 g) quando comparada à do C. crocodilus crocodilus (39,1 g). Huchzermeyer (2003) afirma que o fator mais importante relacionado à ninhada é o tamanho do ovo e, consequentemente, o tamanho do filhote, já que filhotes pequenos possuem, via de regra, menor capacidade de desenvolvimento. Além disso, a massa dos filhotes está relacionada com a espécie e o tamanho das fêmeas, assim como o tamanho dos ovos, como descrito anteriormente (PLATT e THORBJARNARSON, 2000; HUCHZERMEYER, 2003).

5.5 Microbiota bacteriana

A amostra microbiológica que foi coletada na incubadora antes da chegada dos ovos resultou em bactérias que estão naturalmente presentes no ambiente como Alcaligenes sp., Bacillus cereus, Flavobacterium multivorum e Hafnia alvei (QUINN et al., 1994; KONEMAN et al., 2001). Também houve a ocorrência de enterobactérias como o Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Shigella sp. que, além de possuírem

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potencial patogênico, são bactérias comuns à microbiota dos crocodilianos, de outros répteis e também à dos humanos (NOVAK e SEIGEL, 1986; FLANDRY et al., 1989; MISRA, et al. 1993; HUCHZERMEYER, et al., 2000, KONEMAN et al., 2001; CUPUL- MAGAÑA, RUBIO-DELGADO e REYES-JUÁREZ, 2005; JOHNSTON et al., 2010; UHART et al., 2011). A presença dessas espécies pode ser atribuída ao fato de que as instalações destinadas à incubação artificial já haviam sido utilizadas para a incubação de ovos de jacarés-do-Pantanal em anos anteriores. Mesmo tendo sido realizada uma prévia higienização do local, esse agentes podem ter permanecido pela característica quente e úmida desse local, propício para o seu desenvolvimento. Além disso, o manuseio dos tijolos (com os quais foram montadas as incubadoras) pelo ser humano também pode ser considerado como possível fonte de contaminação, já que essas espécies também lhe são comuns (KONEMAN et al., 2001). De forma semelhante, justifica-se a presença do Streptococcus sp., pois também possui potencial patogênico (BARNETT e CARDEILHAC, 1995; BISHOP et al., 2007) e está presente em animais e seres humanos sadios (MATUSHIMA e RAMOS, 1993; QUINN et al. 1994; HUCHZERMEYER et al. 2000). Em relação à microbiota bacteriana de ovos de jacaré-do-Pantanal em ambiente natural, das 22 espécies encontradas, 13 pertencem à família Enterobacteriacea (Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter aglomerans, Escherichia colli, Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Proteus vulgaris, P. mirabilis, Salmonella sp., Serratia liquefacians, Serratia marcescens e Shigella sonnei), quatro se classificam como bactérias gram negativas não fermentadoras da glicose (Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Flavobacterium multivorum e Pseudomonas stutzeri), três são cocos gram positivos (Streptococcus sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus intermedius), e duas são, respectivamente, um bacilo gram positivo (Bacillus cereus,) e um bacilo gram negativo (Aeromonas hydrophila). A presença da espécie Bacillus cereus em 95% das amostras evidenciou a característica do gênero, uma vez que as espécies pertencentes a este gênero são amplamente encontradas no ar, solo e água (QUINN, et al. 1994) e podem estar presentes em amostras de animais conforme relatado por outros autores que identificaram a presença deste gênero no aparelho digestório de crocodilianos aparentemente sadios (WILLIAMS et al., 1990; HUCHZERMEYER et al., 2000; SILVA et al., 2009). A espécie Flavobacterium multivorum também faz parte do grupo de bactérias que estão naturalmente presentes no ambiente, estando amplamente distribuída no solo e na água. Ela apresenta certo potencial patogênico em animais imunodeprimidos (QUINN et

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al., 1994) e já foi relatada em répteis (CUBAS e BAPTISTOTTE, 2007) como cascavéis

(FERREIRA JÚNIOR et al., 2009); tracajá (GATTAMORTA, CARVALHO e CATÃO-DIAS, 2000); jararaca (BASTOS et al., 2008) e Alligator mississipiensis (WILLIAMS et al., 1990).

As

espécies

Citrobacter

freundii,

Enterobacter

aerogenes,

Enterobacter

aglomerans, Escherichia colli, Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Proteus vulgaris, P. mirabilis, Salmonella sp., Serratia liquefacians, Serratia marcescens e Shigella sonnei são enterobactérias e têm sido identificadas em outros estudos como

integrantes comuns da microbiota do trato digestório de répteis, incluindo crocodilianos e podem constituir-se agentes oportunistas de infecções (ROGGENDORF e MÜLLER, 1976; NOVAK e SEIGEL, 1986; FLANDRY et al., 1989; MISRA et al., 1993; HUCHZERMEYER et al., 2000; CUPUL-MAGAÑA, RUBIO-DELGADO e REYES- JUÁREZ, 2005; PESSOA et al., 2008; FERREIRA JUNIOR et al., 2009; JOHNSTON et al., 2010; UHART et al., 2011). Espécies da família Enterobacteriacea, assim como espécies já descritas na microbiota cloacal de crocodilianos eram esperadas, pois o ovo, durante o processo de postura, passa pela cloaca da mãe no momento em que está sendo posto no ninho e, consequentemente, entra em contato com os microorganismos presentes nesta região. Além disso, a fêmea, durante a postura, defeca no ninho, contaminando o ambiente com bactérias residentes do intestino (HUCHZERMEYER,

2003).

O estreptococo pode ser encontrado naturalmente em mucosas e no aparelho respiratório e digestório de animais e seres humanos (QUINN et al., 1994). Este gênero apresentou uma ocorrência de 45,45% dos isolamentos. Essa bactéria, além de ser bastante comum em relatos de animais sadios (MATUSHIMA e RAMOS, 1993; HUCHZERMEYER et al.; 2000), possui grande potencial patogênico. Bishop et al. (2007) relataram casos de fasciíte necrosante em Crocodylus porosus causadas por Streptococcus agalactiae. Madsen (1993) isolou Streptococcus sp. em carne congelada de cauda de crocodilos no Zimbabwe. Barnett e Cardeilhac (1995) atribuíram a septicemia ocorrida em filhotes de aligatores americanos como sendo causada por essa bactéria. As bactérias gram negativas não fermentadoras da glicose encontradas foram:

Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp. e Alcaligenes sp. A espécie Pseudomonas stutzeri é amplamente distribuída em solos e águas e raramente associada a infecções (KONEMAN et al., 2001). No entanto, o gênero Pseudomonas é considerado como uma das principais causas de septicemia provocada por bactérias gram negativas em répteis (MITCHELL, 2006). Ferreira Júnior et al. (2009) relataram a presença da espécie Pseudomonas aeruginosa como sendo uma das de maior ocorrência na microbiota de

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cascavéis, assim como Pessoa et al. (2008) relataram a presença dessa espécie em 16% na microbiota de jabutis domiciliados no Estado de São Paulo. Por outro lado, a Pseudomonas putida foi relatada por Gattamorta, Carvalho e Catão-Dias (2000), em tracajá, como espécie de baixa ocorrência. O gênero Acinetobacter também está presente no solo, na água (QUINN et al., 1994) e já foi relatado em tracajás (Podocnemis unifilis), em baixos níveis, por Gattamorta Carvalho e Catão-Dias, (2000) e por Pessoa et al. (2008) que relataram a espécie Acinetobacter iwoffii em 6% dos casos estudados de jabutis (Geochelone carbonaria) domiciliados no Estado de São Paulo. Esta mesma espécie foi descrita por Ferronato et al. (2009) em 40% dos casos da microbiota oral de Phrynops geoffranus. As bactérias pertencentes ao gênero Alcaligenes são saprófitas e frequentemente são isoladas dos intestinos dos vertebrados (QUINN et al., 1994), podendo-se tornar um patógeno oportunista e causar infecções nosocomiais (KONEMAN et al., 2001). Huchzermeyer et al. (2000) isolaram Alcaligenes faecalis em 6,89% dos isolados de microbiota cloacal de crocodilos anões (Osteolaemus tetraspis).

A espécie Aeromonas hydrophila foi isolada em 25% dos ninhos estudados e

outros trabalhos relataram a sua presença em porcentagens variadas, como Gorden et al. (1979) que isolaram esta mesma espécie em 85% de amostras da cavidade oral e em 70% de amostras obtidas a partir de tecido interno de aligatores americanos que vieram a óbito sem causa aparente, sugerindo que esta espécie poderia estar envolvida na causa da morte. A Aeromonas hydrophila já foi isolada em filhotes de aligatores americanos (BARNETT e CARDEILHAC, 1995). Gattamorta, Carvalho e Catão-Dias (2000) encontraram uma prevalência de 58,62% desta espécie em swabs cloacais de Podocnemis unifilis. Pessoa (2008) relatou apenas 4% de isolados de Aeromonas em Geochelone carbonaria. Johnston et al. (2010) estudaram a microbiota presente nas fezes de aligatores americanos e a Aeromonas hydrophila estava presente em 59 dos 70 isolados. Ferronato et al. (2009) relataram a presença de 25% desta espécie em Phrynops geoffranus. A diferença de resultados obtidos nesta investigação com os trabalhos supracitados pode ser explicada pelo uso de métodos diferentes de isolamento bacteriano (SANTOS et al., 2010). Além disso, Michael (2006) afirma que a presença do gênero Aeromonas sp. é relatada como um dos principais agentes envolvidos em casos

patológicos em répteis, o que pode justificar a alta ocorrência desta bactéria em relatos de animais já doentes.

O gênero Staphylococcus sp. é um grupo de bactérias patogênicas que colonizam,

além de outras estruturas, as membranas mucosas do intestino (QUINN et al., 1994). Este

gênero já foi relatado por estar presente na microbiota oral e intestinal de variadas

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espécies de crocodilianos como aligatores americanos (MAINSTER et al., 1972; BARNETT e CARDEILHAC, 1995), em um crocodilo anão cativo com artrite séptica (HEARD et al., 1988), em gaviais (MISRA et al., 1993), em jacarés-do-papo-amarelo (MATUSHIMA e RAMOS, 1993) e em crocodilos anões (HUCHZERMEYER et al., 2000). Silva et al. (2009) relataram que o gênero Staphylococcus sp. foi o de maior ocorrência com 14,74% na microbiota oral e cloacal de C. latirostris. As amostras do conteúdo dos ovos com odor fétido e dos filhotes sem aparente decomposição e com retardo no desenvolvimento resultaram em bactérias que também foram isoladas da casca dos ovos em ambiente natural, indicando que, mesmo que essas bactérias sejam necessárias para colonização da microbiota dos recém-nascidos, elas também oferecem risco de contaminação, pois a bactéria pode infectar o ovo tanto transovarialmente, através de uma infecção do vitelo, ou após a postura, através da casca. A casca e as membranas apresentam uma certa barreira para a penetração da bactéria, porém, pequenas rachaduras na casca permitem facilmente o acesso à bactéria (HUCHZERMEYER, 2003). Em média, 3 a 15% dos ovos têm a casca rachada durante o processo de postura (JOANEN, 1969; POOLEY, 1969; WEBB, MESSEL e MAGNUSSON, 1977; GOODWIN e MARION, 1978) e, se um ovo sofre uma contaminação, ele pode representar um perigo para os ovos adjacentes no ninho, o que pode explicar a taxa de 27,6% de ovos não eclodidos. Além disso, a terra onde os ninhos são construídos também se torna contaminada com o tempo, principalmente se algum ovo é quebrado antes da eclosão (HUCHZERMEYER, 2003).

5.6 Microbiota fúngica

Os fungos isolados neste experimento são fungos saprófitas, ou seja, amplamente encontrados no solo e meio ambiente e alguns deles, já foram descritos como componentes da microbiota oral e cloacal de crocodilianos ou mesmo como causadores de algum tipo de transtorno patológico (QUINN et al., 1994; HUCHZERMEYER, 2000; HUCHZERMEYER, 2003; SUMMERBELL, 2003). Huchzermeyer (2003) afirma que a maioria das infecções por fungos são oportunistas e que aqueles que fazem parte da microbiota intestinal são excretados diariamente com as fezes e, sob condições favoráveis como o calor e umidade, podem-se multiplicar, o que justifica a presença dos fungos em ovos de C. yacare, pois, além de o ninho ser um ambiente úmido e quente, as

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fêmeas de crocodilianos aí defecam no momento da postura, contaminando o ambiente com os microorganismos presentes na microbiota intestinal. Este mesmo autor ainda afirma que o risco de uma infecção fúngica é maior em ninhos feitos em formato de monte, devido ao tipo de material utilizado para a construção dos mesmos, como é o caso do C. yacare. Além disso, a incubação artificial com o material proveniente do ninho pode oferecer um risco de contaminação dos ovos, principalmente contaminações fúngicas (HUCHZERMETER, 2003). Os fungos presentes no material do ninho são capazes de penetrar a casca do ovo, conforme descrito por Hibberd (1994), que descobriu que o tamanho dos poros da casca de ovos de Crocodylus porosus era suficiente para permitir que hifas e esporos penetrassem. Relatou, também, que houve o crescimento de hifas ao longo de pequenas rachaduras presentes na casca.

A maioria dos fungos encontrados neste trabalho pertence ao Filo Ascomycota

(Aspergillus sp.; Fusarium sp.; Geotrichum sp.; Mycelia sterilia, Penicillium sp. e

Trichoderma sp.), sendo apenas a espécie Cunninghamella echinulata pertencente ao Filo Zygomicota (SUMMERBELL, 2003).

A amostra microbiológica que foi coletada na incubadora antes da chegada dos

ovos resultou em fungos que estão naturalmente presentes no ambiente como Aspergillus

sp., Mycelia sterilia e Penicillium sp. (QUINN et al., 1994; KONEMAN et al., 2001).

O Fusarium sp. foi isolado em 40% das amostras. Esse gênero é principalmente

encontrado em estudos agrícolas, ecológicos ou de biodiversidade (SUMMERBELL, 2003), estando amplamente distribuído no ambiente e, consequentemente, está presente no ambiente de nidificação. Algumas espécies como o Fusarium nygamai estão associadas com raízes de plantas e grãos (BURGESS e TRIMBOLI, 1986) e, como foi descrito neste trabalho, as raízes estão presentes na constituição do ninho de jacarés-do- Pantanal. Já o F. proliferatum tem sido frequentemente isolado no substrato de plantas, em insetos e no solo (O‟DONEL et al., 1998). O F. sacchari na natureza é comumente isolado de uma variedade de plantas tropicais (O‟DONEL et al., 1998). O F. solani é uma espécie bem conhecida pela associação com vários tipos de solo e plantas, assim como o F. oxysporum, que também é relatado em lagos, rios e esgotos (DOMSCH, GAMS e ANDERSON, 1993). O gênero Fusarium, além de estar normalmente presente no ambiente, também é capaz de causar doença tanto em crocodilianos, como em outros répteis e mamíferos. O Fusarium moniliforme já foi isolado dos pulmões de um Alligator mississippiensis que apresentou pneumonia (FRELIER, SIGLER e NELSON, 1985). O Fusarium solani foi isolado de órgãos internos de Crocodilus porosus de cativeiro que também estavam doentes (HIBBERD e HARROWER, 1993; BUENVIAJE et al., 1994).

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Fusarium sp. foi isolado de C. porosus cativos (HIBBERD et al., 1996), da gengiva de um C. crocodilus fuscus de cativeiro (KUTTIN et al., 1978) e da pele de um C. porosus cativo (BUENVIAJE, LADDS e MARTIN, 1998). Hibberd e Harrower (1993) descreveram uma alta mortalidade em filhotes de Crocodylus porosus que foi atribuída ao Fusarium solani, que estava presente em amostras do fígado, dos pulmões e do intestino delgado. Nestes mesmos animais também foram isolados Paecilomyces lilacinus, Cladosporium spp. e Aspergillus spp., mas em uma frequência mais baixa. Amostras ambientais mostraram que este patógeno estava amplamente distribuído no ambiente da fazenda. Uma contaminação dos ovos pelo fungo foi determinada como a causa primária provável da infecção juntamente com subsequente trauma físico nos filhotes. O material do ninho foi implicado como a maior fonte de contaminação do ovo (HIBBERD et al., 1994; 1996).

O Penicillium sp. foi isolado em 35% dos ninhos e este gênero está entre os fungos

mais comuns de decomposição da natureza, sendo comumente encontrado no solo e também em serrapilheiras (SUMMERBELL, 2003). Este fungo também possui potencial patogênico. Em crocodilianos, ele já foi isolado dos pulmões de crocodilos e aligatores (KEYMER, 1974), da pele de C. porosus (BUENVIAJE et al., 1994; HIBBERD et al., 1996) e Huchzermeyer et al. (2000) relatam a presença deste fungo na microbiota intestinal de Osteolaemus tetraspis.

O gênero Aspergillus sp. ocorreu em 25% dos casos. Este também é classificado

como um fungo saprófita, chamado comumente de “fungo do solo” e é um agente oportunista de infecções em animais e humanos (SUMMERBELL, 2003). Em crocodilianos, já foi relatado em C. porosus doentes (BUENVIAJE et al., 1994; HIBBERD

et al., 1996; BUENVIAJE, LADDS e MARTIN, 1998) e de lesões da pele de jacarés (gênero Caiman) de cativeiro (TROIANO e ROMÁN, 1996). Além de também já ter sido

isolado a partir da microbiota intestinal de Osteolaemus tetraspis (HUCHZERMEYER et al., 2000).

A espécie Cunninghamella echinulata também foi isolada em 25% das amostras.

Os membros deste gênero são saprófitas que vivem normalmente no solo, na vegetação em decomposição e podem ser parasitas facultativos de plantas. A patogenicidade da Cunninghamella echinulata é essencialmente determinada pelas condições do hospedeiro

ou do ambiente, capazes de favorecer sua multiplicação e instalação (SCHIPPER e STALPERS, 2002).

O gênero Geotrichum sp. foi isolado em 10% dos ninhos e este também é um

fungo do solo, água, ar e plantas, ele também é comumente encontrado na microbiota de

seres humanos (SUMMERBELL, 2003) e também em crocodilianos (HUCHZERMEYER et

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al., 2000) e, assim como os anteriormente descritos, também é capaz de causar infecções em crocodilianos como em C. porosus (HIBBERD et al., 1996).

A Micelia sterilia é um grupo de fungos no qual não há produção de conídios,

apenas de hifas (HOWARD, 2002). Este grupo de fungos é comumente isolado a partir de substrato de plantas (LACAP, HYDE e LIEW, 2003).

O fungo Trichoderma sp. foi isolado em 10% das amostras e, assim como os

outros, este também está presente no solo e plantas (HARMAN et al., 2004) e também existe relato deste gênero causando doença na pele de aligatores americanos selvagens (FOREYT, LEATHERS e SMITH, 1985) e como componente da microbiota de Osteolaemus tetraspis sadios (HUCHZERMEYER et al., 2000).

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6 CONCLUSÕES

Diante dos resultados apresentados, julgamos poder concluir que:

A constituição dos ninhos está relacionada à disponibilidade de material no ambiente.

É frequente a presença de invertebrados nos ninhos sem que, contudo, fosse possível relacionar tal fato a quaisquer danos ou benefícios aos animais.

A fitofisionomia das áreas selecionadas pelas fêmeas para a construção dos ninhos era diversificada, mas estava sempre associada a curso d‟água.

Não houve diferença estatisticamente significativa entre as quatro regiões estudadas para o parâmetro tamanho do ninho.

O número de ovos por ninho também não variou estatisticamente de acordo com a região analisada.

Não houve diferença estatisticamente significativa entre as quatro regiões estudadas para o parâmetro tamanho dos ovos e dos filhotes.

A taxa de eclosão foi de 72,4% e os ovos que não eclodiram (128; 27,6%) apresentaram morte fetal, conteúdo caseoso ou pútrido ou retardo no desenvolvimento fetal.

A microbiota bacteriana encontrada na superfície dos ovos apresentou-se ampla e reflete a origem a partir do solo, da água e do organismo da mãe.

A microbiota fúngica é saprófita e também reflete sua origem.

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7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Tanto na microbiota bacteriana quanto na fúngica existem espécies com potencial patogênico para o Caiman yacare, seja durante a vida embrionária/fetal ou pós-eclosão. Todavia, os fatores predisponentes que viabilizam a instalação do processo patológico, ainda precisam ser explorados do ponto de vista científico, para que se estabeleça o limite entre as perdas por processo seletivo daquelas efetivamente oriundas do desequilíbrio entre agente etiológico e hospedeiro. Dessa forma, talvez seja possível compreender os fatores que culminam com a perda da viabilidade dos ovos, sejam eles genéticos, ambientais ou patológicos.

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APÊNDICE A - ARTIGO CIENTÍFICO

Trabalho 2616 WM

(Adapt.p.PVB, 14.12.11)

Taxa de eclosão e microbiota bacteriana de ovos de jacaré-do- Pantanal (Caiman yacare Daudin, 1802) 1

ABSTRACT.- 2012. [Hatch rate and bacterial microbiota of the Pantanal caiman (Caiman yacare Daudin, 1802) eggs.] Taxa de eclosão e microbiota bacteriana de ovos de jacaré-do-Pantanal (Caiman yacare Daudin, 1802). The commercial breeding of the Pantanal Caiman has been growing in the State of Mato Grosso and the success of this activity is strongly related to the species reproductive efficiency in the wild, particularly with the conditions of the artificial incubation which interfere directly in the hatch rates. The sanitary conditions of the incubation process (asepsis during the collection and artificial incubation of the eggs) are barely explored. Thus, this paper aims at characterizing both the hatch rates and the bacterial microbiota of the C. yacare eggs at the moment of collection for artificial incubation, as well as at correlating the microbiota and the hatch rates with the environment (phytophysiognomy) in which the nests were collected. Microbiological samples were collected from the surface of eggs in twenty nests, located at a farm in North Pantanal, in the city of Poconé. After being collected, the eggs were counted and prepared to be taken to the incubator. Among these twenty nests, there was a total of 464 eggs in which 336 animals hatched (72.41%). The remaining eggs where opened and 124 (26.72%) of them were fetid and had putrid contents and 4 (0.86%) didn`t have fetid smell but had hatchlings with the yolk-sac still outside the abdominal cavity. Among the 124 eggs, in 15 of them (12.1%) it was possible to see a hacthling and/or embryo, not being possible to see them in the rest (109; 87.9%), due to advanced decomposition. The comparison from the hatch rate with the four areas didn´t show significance (p>0.05), indicating that these parameters were not influenced by the factor area. In the samples from 20 nests, 22 different bacteria were identified: Bacillus cereus (95%), Flavobacterium multivorum (80%), Citrobacter freundii (75%), Enterobacter aerogenes (75%), Streptococcus sp. (45%), Escherichia colli (40%), Acinetobacter sp. (35%), Alcaligenes sp. (30%), Proteus vulgaris (30%), Pseudomonas stutzeri (30%), Aeromonas hydrophila (25%), Proteus mirabilis (20%), Enterobacter agglomerans (15%), Staphylococcus aureus (15%), Serratia liquefacians (10%), Staphylococcus intermedius (10%), Escherichia hermanini (5%), Hafnia alvei (5%), Morganella morganni (5%), Salmonella sp. (5%), Serratia marcescens (5%) and Shigella sonnei (5%). When the areas were compared in terms of microbiota, statistical difference was observed for two species (p<0.05) Citrobacter freundii and Enterobacter agglomerans. However, for the other species, the area effect was not significant (p>0.05). The hatch rates in this paper were 72.41% , and aspects which determine them, whether in natural or artificial environments, still need to be more explored from the scientific point of view. Regarding the microbiota, all the bacteria isolated at this study had already been related by other authors as part of the crocodilians oral and/or cloacal microbiota or as ethiological agents of infectious processes.

INDEX TERMS: nest, commercial breeding, ranching, enterobacteria.

RESUMO.- A criação comercial do jacaré-do-Pantanal tem alcançado grande destaque econômico no

Estado de Mato Grosso e o sucesso dessa atividade está diretamente relacionado à eficiência reprodutiva da espécie

1 Recebido em 14 de dezembro de 2011. Aceito pra publicação em

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na natureza, em especial, às condições de incubação que interferem diretamente nas taxas de eclosão. As condições

sanitárias do processo de incubação (assepsia durante a coleta e incubação artificial dos ovos) são pouco exploradas. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo verificar as taxas de eclosão dessa espécie e caracterizar a microbiota bacteriana de ovos de C. yacare no momento da coleta para a incubação artificial, assim como correlacionar tanto a microbiota como as taxas de eclosão com o ambiente (fitofisionomia) em que os ninhos foram coletados. Foram coletadas amostras microbiológicas da superfície dos ovos em 20 ninhos, localizados em uma fazenda no Pantanal Norte, município de Poconé. Após a coleta, os ovos foram contados e preparados para o transporte até a incubadora. Desses 20 ninhos, obteve-se um total de 464 ovos dos quais eclodiram 336 animais (72,41%). Os ovos remanescentes foram abertos e 124 (26,72%) deles apresentaram odor fétido e conteúdo pútrido e 4 (0,86%) não possuíam odor fétido mas continham filhotes com vitelo ainda fora da cavidade abdominal. Dentre os 124 ovos, em 15 deles (12,1%) foi possível observar a presença de feto e/ou embrião, não sendo possível a identificação deles no restante (109; 87,9%), devido à decomposição avançada. A comparação da taxa de eclosão com as quatro áreas não mostrou significância (p>0,05), indicando que esses parâmetros não sofreram influência do fator área. Nas amostras dos 20 ninhos, foram identificadas 22 bactérias diferentes: Bacillus cereus (95%), Flavobacterium multivorum (80%), Citrobacter freundii (75%), Enterobacter aerogenes (75%), Streptococcus sp. (45%), Escherichia colli (40%), Acinetobacter sp. (35%), Alcaligenes sp. (30%), Proteus vulgaris (30%), Pseudomonas stutzeri (30%), Aeromonas hydrophila (25%), Proteus mirabilis (20%), Enterobacter agglomerans (15%), Staphylococcus aureus (15%), Serratia liquefacians (10%), Staphylococcus intermedius (10%), Escherichia hermanini (5%), Hafnia alvei (5%), Morganella morganni (5%), Salmonella sp. (5%), Serratia marcescens (5%) e Shigella sonnei (5%). Quando as áreas foram comparadas em termos de microbiota, observou-se diferença estatística para duas espécies (p<0,05) Citrobacter freundii e Enterobacter agglomerans, porém, para as demais espécies, o efeito de área não foi significativo (p>0,05). A taxa de eclosão neste trabalho foi de 72,41% e aspectos que as determinam, sejam em ambientes natural ou artificial, ainda precisam ser melhor explorados do ponto de vista científico. Em relação à microbiota, todas as bactérias isoladas já haviam sido relatadas por outros autores como fazendo parte da microbiota oral e/ou cloacal de crocodilianos ou como agentes etiológicos de processos infecciosos.

TERMOS DE INDEXAÇÃO: ninho, criação comercial, ranching, enterobactéria.

INTRODUÇÃO

O jacaré-do-Pantanal (Caiman yacare Daudin, 1802) é uma das seis espécies de crocodilianos de ocorrência no Brasil (Bérnils 2010), cuja criação comercial tem alcançado grande destaque econômico no Estado de Mato Grosso a partir da regulamentação do sistema de criação pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (Ibama) denominado ranching(Brasil 1990, 2009). Este sistema fundamenta-se na coleta de filhotes ou de ovos na natureza, mediante prévio levantamento populacional da espécie na área pretendida, na incubação artificial desses ovos e na recria dos jovens em instalações

apropriadas (Campos et al. 2005). Dessa forma, verifica-se que o sucesso dessa atividade está diretamente relacionado à eficiência reprodutiva da espécie na natureza, em especial, às condições de incubação. Em ambiente natural, o período reprodutivo de C. yacare se estende de janeiro a março (Coutinho & Campos

2006), época em que as fêmeas realizam a postura de 22 a 35 ovos, sendo no máximo 42 ovos por ninho (Campos et al. 2010). O período de incubação de C. yacare varia com a temperatura e umidade durante a incubação, podendo ir de 70 a 90 dias (Miranda et al. 1999). Joanen & McNease (1981) revelaram que, além de fatores ambientais, o estado da incubação dos mesmos no momento da coleta também influencia a eclosão.

Em cativeiro, Verdade (2001) relatou uma taxa de eclosão de 79,83% de ovos de jacaré-de-papo- amarelo (Caiman latirostris) no sistema de ciclo fechado (farming), caracterizado pela reprodução, oviposição e incubação em cativeiro. Em ovos de Caiman crocodilus crocodilus incubados artificialmente, Pérez (2001) encontrou 84,1% de sucesso de eclosão em que 1,71% dos ovos não eclodidos apresentaram morte embrionária, 9,84% eram inférteis e 4,22% possuíam malformações que foram atribuídas a fatores hereditários. Miranda et al. (2002) relataram taxas de eclosão relacionadas à temperatura de incubação em C. yacare de 66,63% a 28°C e de 83,3% a 30°C. Montini et al. (2006) relataram, em C. latirostris, baixa taxa de eclosão (62%) na incubação natural em virtude do local de nidificação, em que o sucesso dessa taxa foi maior em ninhos de vegetação flutuante do que naqueles construídos em matas. Para esta mesma espécie,

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Piña et al. (2007b) relataram uma taxa de eclosão de 73,4% no sistema ranching. Huchzermeyer (2003) afirmou que as taxas de eclosão na crocodilicultura são baixas e as atribuiu à utilização de técnicas inadequadas na incubação artificial. Além dos fatores já citados por Joanen e McNease (1981), Grigg (1987) relatou que o sucesso da taxa de eclosão está diretamente relacionado às condições de transporte do ovo do ninho ao setor de incubação e às condições físicas e sanitárias da incubadora. As condições sanitárias do processo de incubação (assepsia durante a coleta e incubação artificial dos ovos) são pouco exploradas, embora fatores como exposição a alta temperatura e umidade (Ferguson 1981a) e manuseio no momento da coleta (Bassetti 2006) já tenham sido relatados como condições que favorecem o processo de contaminação de ovos por fungos e bactérias. Por outro lado, Ferguson (1981a) relatou que a presença de bactérias no ninho durante a incubação natural facilita a eclosão do filhote pela ação dos ácidos oriundos do metabolismo bacteriano sobre a camada externa do ovo, mas não especificou quais espécies bacterianas poderiam estar envolvidas nesse processo. Existem poucas informações referentes à constituição dessa microbiota, mas Schumacher Cardeilhac (1990) encontraram Enterobacter cloacae, Citrobacter sp., Proteus sp. e Pseudomonas aeruginosa da membrana de ovos de Alligator mississipiensis com lesões características de contaminação. Todas essas espécies fazem parte da microbiota intestinal de crocodilianos, indicando uma contaminação fecal como fonte do problema. Salmonella arizona, Pseudomonas aeruginosa e Aeromonas hydrophila foram isoladas de membranas da casca de ovos de crocodilos do Nilo que não eclodiram no Zimbábue (Foggin 1992). Gattamorta et al. (2002) investigaram a presença de Salmonella sp. no conteúdo de ovos recém-eclodidos de C. latirostris, porém, não isolaram nenhuma espécie. Em contrapartida, a microbiota oral e cloacal de crocodilianos tem sido descrita sem, no entanto, ser correlacionada à microbiota dos ovos (Ramos et al. 1992, Huchzermeyer et al. 2000, Germino et al. 2008, Silva et al. 2009). Considerando a escassez de informações sobre a composição da microbiota bacteriana de ovos de C. yacare incubados naturalmente, o presente trabalho teve como objetivo verificar as taxas de eclosão dessa espécie e caracterizar a microbiota de ovos no momento da coleta para a incubação artificial, assim como correlacionar tanto a microbiota como as taxas de eclosão com o ambiente (fitofisionomia) em que os ninhos foram coletados.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado em uma fazenda localizada no município de Poconé, durante os meses de março e abril de 2011, conforme aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (Cepa/UFMT, protocolo 23108.044293/10-8). Esta propriedade realiza a coleta e a incubação artificial de ovos destinados à criação comercial. Para tanto, durante o mês de março foram realizados nesta propriedade o censo de ninhos e a respectiva identificação. De um total de 103 ninhos encontrados, 20 foram coletados para a incubação artificial, sendo definidos por sorteio, levando-se em conta quatro áreas da fazenda que apresentaram maior ocorrência: a área designada de Piuval (Ninhos 1-6), a Estrada Parque (Ninhos 7-11), a Vazante (Ninhos 12-16) e a Lixeiro (Ninhos 17-20). No local de cada ninho trabalhado, foram coletados dados referentes à fitofisionomia da área escolhida pela fêmea para a construção do ninho, que foi descrita segundo Cunha, Junke & Leitão-Filho (2007), e realizado o georreferenciamento. Após a abertura do ninho, procedeu-se à coleta das amostras microbiológicas da superfície dos ovos por swabs, sendo então acondicionados em meio de transporte (meio de Stuart), resfriados a aproximadamente 4ºC em recipiente isotérmico e transportados para o processamento, não excedendo o período de 24 horas até a semeadura. Após a coleta, os ovos de cada ninhada foram identificados na parte superior, indicando a sua posição original no ninho e transportados até a incubadora, sendo acondicionados em caixas forradas com o material vegetal do ninho. No local destinado à incubação, cada ninho foi mantido separadamente em pequenos recintos delimitados por tijolos de oito furos (Figura 1), forrados pelo material oriundo do ninho, conforme procedimento adotado na propriedade em coletas anteriores. Os ovos foram depositados nesses compartimentos forrados e cobertos com o mesmo material vegetal onde permaneceram, por no máximo 39 dias, até o momento da eclosão. Neste mesmo recinto, foi instalado um termômetro de mínima e máxima e higrômetro, para o acompanhamento, respectivamente, da temperatura (em °C) e umidade relativa do ar (em %) que foram mensuradas a cada seis horas durante todo o período da incubação. Após a eclosão, os filhotes foram transferidos para as instalações da criação comercial e os ovos remanescentes foram contados para a verificação da taxa de eclosão. Todos os ovos passaram pelo exame de ovoscopia e foram classificados de acordo com o grau de desenvolvimento embrionário segundo Ferguson (1981b), sendo considerados inférteis, de grau 0, aqueles que se apresentaram

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totalmente translúcidos e de grau 4 aqueles que não apresentaram nenhuma translucidez ao referido exame. Nos ovos em que não ocorreu a eclosão foram abertos através de um corte longitudinal com lâmina de bisturi e o conteúdo foi inspecionado quanto à presença ou não de embrião/feto. Os ovos com odor fétido foram caracterizados não só pela presença dessa característica, mas também pela observação de uma coloração escurecida, manchas circulares na casca e/ou tamanho diminuído. As amostras coletadas foram semeadas em ágar sangue e ágar Mac Conckey para a identificação de bactérias, sendo incubadas em ambiente aeróbico e anaeróbico a 37°C e observadas a cada 24 horas por até 72 horas. Após a observação do crescimento bacteriano, as colônias foram identificadas de acordo com suas características morfotintoriais e provas bioquímicas. As análises foram realizadas segundo a metodologia descrita por Quinn et al. (1994) e Koneman et al. (2001). A colônia condizente com Salmonella sp. foi confirmada através da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) em que foram realizadas a extração segundo a metodologia de fervura-centrifugação descrita por Soumet et al. (1994) e o PCR segundo Suh & Song (2005), utilizando um par de primers que originam produtos de amplificação de 298 pares de base correspondente ao gene invA. O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos (áreas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro). Todos os ovos de um determinado ninho foram considerados uma parcela. O número de repetições de cada tratamento foi diferente em função da proporção de ninhos encontrados em cada área. A correlação da taxa de eclosão, da quantidade de ovos inférteis e dos ovos em que não houve eclosão por odor fétido ou retardo no desenvolvimento em relação aos outros filhotes eclodidos no mesmo ninho com as regiões estudadas foi submetida à análise de variância (Anova) e teste de médias Tukey conforme Banzato e Kronka (1992), utilizando o software Saeg. A correlação da microbiota bacteriana encontrada em cada ninho com as quatro áreas foi realizada segundo um modelo linear generalizado com função de ligação logística, por meio do pacote estatístico R (2010), em que, para cada bactéria encontrada, foi feita uma análise de deviance. O modelo estatístico que descreve as observações é dado por:

y

ij

i

ij

(Cordeiro & Demétrio 2007).

RESULTADOS

Os ninhos de Caiman yacare dos quais o material biológico foi coletado, localizados na área Piuval, foram construídos pelas fêmeas no interior de capões de gravatás e próximos à água. Eles eram formados por raízes, terra úmida e uma pequena quantidade de material em decomposição no solo (serrapilheira). Os ninhos localizados na Estrada Parque eram construídos em campos de murundus e, em sua maior parte, eram constituídos de serrapilheira e, em menor proporção, de terra e raízes. Na Vazante, os ninhos foram encontrados em cambarazais (ninhos 12 e 14) e campos de murundus (ninhos 13, 15 e 16) e eram formados por serrapilheira, gravetos e uma quantidade menor de terra. Os ninhos localizados na área do Lixeiro foram construídos em campos de murundus e continham terra, gravetos e pouca serrapilheira. Todos os ninhos investigados neste trabalho possuíam sombreamento parcial oferecido por árvores localizadas ao redor dos ninhos e foram construídos em camada única. Nos ninhos das quatro áreas foi observada a presença de invertebrados como cupins em 40% dos ninhos, formigas em 30%, diplópodas em 25% e lacraias em 5% conforme mostrado no quadro 1, assim como as coordenadas geográficas de cada ninho. Com relação à temperatura e umidade no ambiente durante a incubação dos ovos, a temperatura média foi de 28,5°C, tendo sido observada uma temperatura mínima de 23,6°C e máxima de 33,7°C. A umidade relativa do ar média foi de 81,3%, sendo o valor mínimo igual a 57,4% e o valor máximo igual a 95,8%. A variação da temperatura (em °C) e da umidade relativa do ar (em %) durante o período de incubação está descrita na figura 2. Desses 20 ninhos obteve-se um total de 464 ovos (sendo 407 férteis; 38 fétidos e 19 se apresentaram translúcidos ao exame de ovoscopia). Após o termino da incubação, 336 filhotes (72,41%) eclodiram, dos 128 (27,58%) que não eclodiram, 124 (26,72%), ao serem abertos, se apresentaram com odor fétido e conteúdo pútrido e 4 (0,86%) não possuíam odor fétido e continham filhotes que, quando comparados com os filhotes do mesmo ninho já eclodidos, estavam atrasados quanto ao desenvolvimento, o que foi evidenciado pela presença do vitelo ainda fora da cavidade abdominal. Dentre os 124 ovos, em 15 deles (12,1%) foi possível observar a presença de feto e/ou embrião (Figura 3), não sendo possível a identificação deles no restante (109; 87,9%), devido à decomposição avançada (Quadro 1). A comparação da taxa de eclosão, do número de ovos inférteis e dos outros ovos em que não ocorreu a eclosão (odor fétido ou retardo

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no desenvolvimento) entre as quatro regiões não mostrou significância (p>0,05), indicando que esses parâmetros não sofreram influência do fator área (Quadro 2). Nas amostras de ovos de C. yacare oriundas de 20 ninhos coletados, foram identificadas 22 bactérias diferentes que estão relacionadas no quadro 3. Quando a microbiota foi comparada entre as áreas, a análise estatística mostrou que, para a maioria das espécies, o efeito de área não foi significativo (p>0,05), indicando que não existe diferença entre as mesmas (Quadro 4). No entanto, para as espécies Citrobacter freundii e Enterobacter agglomerans observou-se diferença estatística (p<0,05).

DISCUSSÃO

O local de nidificação de Caiman yacare caracterizado neste trabalho se assemelha às descrições encontradas para outros crocodilianos (Greer 1970, Ferguson 1985, Pérez 2001, Miranda et al. 2002, Huchzermeyr 2003, Avanzine et al. 2007). Na natureza, são encontrados ninhos com diferentes itens em sua constituição, de acordo com a espécie e os recursos disponíveis no ambiente de nidificação. Há ninhos, por exemplo, constituídos por material vegetal como capim e gravetos,eventualmente misturados com terra (Sarkis- Gonçalves et al. 2001), como descrito para os ninhos das regiões Estrada Parque e Vazante. As espécies que vivem em florestas constroem ninhos a partir de montes de folhas encontradas no chão da floresta e dependem do calor produzido pela compostagem, e não do sol, para incubar os ovos. As espécies que vivem em pântanos fazem o ninho a partir da vegetação de mangue e também dependem do calor da compostagem, bem como do sol para a incubação dos ovos (Huchzermeyer 2003). Villamarín-Jurado e Suárez (2007) descreveram ninhos de Melanosuchus niger como montes cônicos feitos de serrapilheira e raízes e ainda afirmaram que todos os ninhos encontrados estavam próximos a uma lagoa, o que corrobora os dados obtidos nesta investigação pois, como descrito acima, os ninhos de C. yacare encontrados estavam sempre localizados próximo à água e eram formados por montes de serrapilheira, raízes e terra. Segundo Verdade (1995), em C. Latirostris, a presença da terra pode ser justificada pela necessidade de complementação do tamanho "normal" do ninho onde, aparentemente, não há folhas em quantidade suficiente para sua construção. A semelhança do observado nos ninhos de C. yacare, Magnusson et al. (1985) e Allen et al. (1997) também relataram a presença de invertebrados como cupins e formigas, respectivamente para Paleosuchus trigonatus e Alligator mississipiensis. No entanto, esses autores não