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Laboratrio de Patologia Celular e Molecular Professora: Thereza Qurico dos Santos Aluno: Ricardo dos Santos Pereira Curso:

Cincias Biolgicas

Protocolo de Extrao e Dosagem de Colgeno e Hidroxiprolina

Introduo

O colgeno o principal componente do tecido conjuntivo, a protena mais abundante do organismo e uma das protenas mais conservadas ao longo do processo evolutivo. A molcula de colgeno est disposta sob a forma de a-tripla-hlice. Os principais aminocidos que a compe so: Glicina, Prolina e Hidroxiprolina. O colgeno apresenta 2 aminocidos caractersticos: Hidroxilisina e Hidroxiprolina. A hidroxiprolina responsvel pela estabilidade da molcula de colgeno.

Objetivo

Extrao total e dosagem de colgeno e hidroxiprolina.

Material

Vidraria

4 bales volumtricos de 100 mL; 3 bales volumtricos de 1 L; 6 bechers de 50 mL; 3 bechers de 100 mL;

1 becher de 250 mL; 3 bechers de 500 mL.

Diversos

Eppendorfs de 1 mL; Filtro de papel com 20 cm de dimetro; Frascos para armazenar o material e as amostras extrados; Frascos para armazenar os reagentes.

Reagentes

Acetato de Sdio P.A. Merck; Acetona P.A. Merck; cido Actico 1,0 M Merck; cido Ctrico P.A. Merck; cido Clordrico 6,0 N Merck; cido Clordrico 2,0 M Merck; cido Clordrico 10% v/v - Merck; cido Fosfrico P.A. Merck; cido Perclrico 60% v/v - Merck; gua Destilada; BSA tipo 4 Merck; Citrato de Sdio P.A. Merck; Cloramina T 7% - Merck; Cloreto de Sdio 0,15 M Merck; Coomassie Blue G250 Merck; DAB P.A. Merck; Etanol P.A. Merck; Etanol 70 % v/v - Merck;

Hidrxido de Sdio 2,0 M Merck: Hidroxiprolina P.A. Merck; Isopropanol P.A. Merck.

Equipamentos

Balana digital; Centrifuga; Computador; Espectrofotmetro; Estufa; Geladeira; Manta aquecedora; Medidor de pH; Placa agitadora (Mixer); Potter de 15 mL com pistilo; Programa Excel Microsoft Office 2000; Agitador de Tubos (Vortex).

Metodologia

Preparo da Curva Padro de BSA

BSA [ 1,0 mg / mL ]

Diluir 7x 1,0 mL BSA + 6,0 mL H2O ( [ 0,14 mg / mL ] )

a)

50 mL BSA + 450 mL H2O

b) 100 mL BSA + 400 mL H2O c) 200 mL BSA + 300 mL H2O + 2,5 mL Bradford

d) 300 mL BSA + 200 mL H2O e) 400 mL BSA + 100 mL H2O

Ler D.O. 595 hm (Cubeta de plstico). Obs.: Lavar a cubeta com lcool 70%.

Extrao de Colgeno (Mtodo de Schor Modificado, 1980)

Coloca-se o tecido extrado em acetona para fixao das estruturas e estoca-se o material at a utilizao a 20C; Na utilizao, o material levado estufa a 37C por volta de 1h, para que a acetona evapore; Quando retirado da estufa o material pesado e macerado; O material macerado usado cido Actico 1,0 M e o volume completado; Deixar o material sob agitao em baixa rotao a 25C por 48hs; Aps 48hs centrifugar por 30 minutos a 4000 rpm, recolher o sobrenadante (amostra) e armazenar em geladeira.

Obs.: O volume de cido Actico 1,0 M vai variar de acordo com o material utilizado.

Dosagem de Colgeno

a)

50 mL amostra + 450 mL NaCl

b) 100 mL amostra + 400 mL NaCl c) 200 mL amostra + 300 mL NaCl + 2,5 mL Bradford

d) 300 mL amostra + 200 mL NaCl e) 400 mL amostra + 100 mL NaCl

Ler D.O. 595 hm (Cubeta de plstico). Obs.: Lavar a cubeta com lcool 70 %.

Preparo da Curva Padro de Hidroxiprolina ( [ 15mg / mL ] )

a)

2,0 mL OH-Prolina + 198 mL H2O

b) 4,0 mL OH-Prolina + 196 mL H2O c) 8,0 mL OH-Prolina + 192 mL H2O

d) 12 mL OH-Prolina + 188 mL H2O e) 16 mL OH-Prolina + 184 mL H2O

Adio dos Reagentes:

Adicionar 400 mL de Isopropanol em cada tubo; Adicionar 200 mL do reagente A; Agitar e manter a temperatura ambiente por 4 minutos; Adicionar 2600 mL do reagente B; Agitar e aquecer a 60C por 25 minutos;

Obs.: Amostras muito escuras devem ser diludas com Isopropanol.

Ler D.O. 560 hm (Preferencialmente cubeta de vidro, mas pode ser de plstico). Obs.: Lavar a cubeta com HCl 10%.

Extrao de Hidroxiprolina (Mtodo de Berg, 1982)

Colocar 2,0 mL da amostra obtida na extrao de colgeno e 1,0 mL de HCl 6,0 N; Agitar e aquecer a 116C por 18hs; Ajustar o pH da nova amostra entre 6.0 e 7.0 utilizando NaOH 0,5 M e armazenar em geladeira.

Dosagem de Hidroxiprolina

a)

10 mL amostra + 190 mL H2O

b) 20 mL amostra + 180 mL H2O c) 50 mL amostra + 150 mL H2O + adio dos reagentes

d) 100 mL amostra + 100 mL H2O e) 200 mL amostra + 0 mL H2O

Obs.: Os reagentes e os procedimentos utilizados so os mesmos do preparo da curva padro de OH-prolina.

Limitaes

O cido Actico utilizado s conseguiu extrair o colgeno presente nos tecidos que no apresentavam intensa fibrose, pois neste caso a extrao no foi total, interferindo assim no resultado obtido.

Referncias

Este protocolo uma adaptao do Mtodo de Schor modificado (1980), referente extrao cida de colgeno e do Mtodo de Berg (1982), para a extrao cida de hidroxiprolina.

Observaes

O mtodo de Bradford ideal para a dosagem de colgeno, pois no interfere com os resduos de glicina da molcula presentes na amostra aps extrao.

Preparo dos Reagentes

1. cido Actico 1,0 M

r = 1050 g / L PM = 60,05 g / mol

M = m / mol V

M=

1050 60,05 x 1

= 17, 485 M

Ci . Vi = Cf . Vf

17,485 . Vi = 1 . 1000

Vi = 57,18 mL

2. cido Clordrico 6,0 N

r = 1,19 kg / L

% p/p = 36

1190g 100% x 36%

x= 428,4g

Eqg = mol =36,5 = 36,5 g x 1

N = m / eqg V

N = 428,4g 36,5 x 1

= 12 N

Ci . Vi = Cf . Vf

12 . Vi = 6 . 1000

Vi = 500 mL

3. cido Clordrico 2,0 M

Molaridade = Normalidade

Ci . Vi = Cf . Vf

12 . Vi = 2 . 500

Vi = 83,5 mL

4. Bradford

10 mg Coomassie G250; 5,0 mL Etanol P.A.; 10 mL cido Fosfrico P.A.

Preparo:

Dissolver o Coomasie no Etanol; Colocar o cido Fosfrico; gua q.s.p. 100 mL (Completar com H2O at 100 mL).

Obs.: Utilizar filtro de papel e filtrar at ficar marrom (Utilizar luva). Estvel por 1 ms em geladeira (Conservar em frasco escuro).

5. Cloreto de Sdio 0,15 M

PM = 58,5 g / mol

58,5 g - 1mol

- 0,15 mol

x = 8,775 g / L

6. Hidrxido de Sdio 2,0 M

P.M.= 40g / mol

40g 1 mol / L x 2 mol /L

x= 80g

V= 500 mL \x= 40g

7. Reagente A

Misturar 1 volume de Cloramina T com 4 volumes de Tampo Acetato / Citrato.

Obs.: Fazer 3,0 mL (600 mL de Cloramina T + 2400 mL de Tampo). Volume necessrio para 12 tubos.

Cloramina T 7%

7,0 g Cloramina T; gua q.s.p. 100 mL.

Obs.: Estvel por 3 semanas em geladeira.

Tampo Acetato / Citrato pH = 6,0

57 g Acetato de Sdio; 37,5 g Citrato de Sdio; 5,5 g cido Ctrico; 385 mL de Isopropanol; gua q.s.p. 1L.

8. Reagente B

Misturar 3 volumes de DAB com 13 volumes de Isopropanol. Obs.: Fazer 32 mL (6,0 mL de DAB + 26 mL de Isopropanol). Volume necessrio para 12 tubos.

Dimetilaminobenzaldedo (DAB) em cido Perclrico 60%

20 g DAB; 30 mL cido Perclrico 60% v/v.

Obs.: Estvel por 3 semanas em geladeira (Conservar em frasco escuro).

9. Soluo de Hidroxiprolina

1,5 mg OH-Prolina; gua q.s.p. 100 mL.

Obs.: Dividir em partes iguais de 1,0 mL e congelar (Desprezar cada parte aps o uso).