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CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL REA DE CONCENTRAO: SANIDADE ANIMAL LVIA AIRES LISBOA

O Papel da BRG1 no Controle Epigentico em Ovrios Sunos

LONDRINA 2008

Lvia Aires Lisboa

O Papel da BRG1 no Controle Epigentico em Ovrios Sunos

Dissertao apresentada ao curso de PsGraduao em Medicina Veterinria da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial obteno do ttulo de mestre em Medicina Veterinria. Orientador: Marcelo Marcondes Seneda

Lvia Aires Lisboa

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O Papel da BRG1 no Controle Epigentico em Ovrios Sunos

Dissertao de Mestrado Orientador:Marcelo Marcondes Seneda

COMISSO EXAMINADORA

_____________________________________________________

Prof a. Dr a. Evelyn Rabelo Andrade

___________________________________________________________

Prof a. Dr a. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga

___________________________________________________________

Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda

Londrina, ___ de ______ de 2008.

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Aos meus pais Jos Carlos e Marina e a minha irm Las. AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus por me capacitar para este trabalho, pelas pessoas que Ele coloca em minha vida e pelo discernimento e sabedoria para resolver os problemas.

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A minha mame Marina pela companhia no laboratrio durante a noite, pelas idas ao frigorfico, enfim pelo apoio incondicional e pela participao ativa nesses anos de mestrado. Ao meu papai Jos Carlos que nesses anos no poupou ligaes e mensagens para diminuir a distncia entre ns. A minha irm e amiga Las por sempre corrigir meus trabalhos e pelo apoio incondicional mesmo quando eu estava errada. A minha vov Maria Aparecida que responsvel por grande parte da minha educao. Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda por acreditar em mim, pela pacincia e compreenso nestes anos. Aos meus queridos amigos da equipe CENTRA, Fabiana, Evelyn, Wanessa, Ktia, Gustavo, Marilu, Roberta, Augusto, Mariana e Letcia pelo companheirismo, apoio e pela amizade. As minhas amigas Marilu, Evelyn e Wanessa por no pouparem esforos para colaborar com meu trabalho e com meu bem estar. Aos meus amigos Thales, Alexandre, Tiago e Mariana pela boa vontade em colaborar e principalmente pela amizade sincera. equipe do Laboratrio de Virologia por viabilizar a realizao do meu trabalho, ao funcionrio Paulo por estar sempre to disposto a ajudar. Aos residentes de grandes animais por me cederem tantas vezes o computador para pesquisas. Aos funcionrios Beto do frigorfico KM3 e Ju do frigorfico de Ibipor pela ateno, boa vontade e por se colocarem sempre disposio. A todos que de alguma forma colaboraram para a concluso deste trabalho.

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SUMRIO

PGINA 1. INTRODUO 08

2. REVISO BIBLIOGRFICA 2.1. Ovrio mamfero 2.2. Oognese 2.3. Foliculognese 2.4. Epigentica 2.5. Estrutura do nucleossomo mamfero 2.6. Modificaes epigenticas 2.7. Complexo SWI/SNF BRG1

11 11 11 14 17 18 19 21 23 27

REFERNCIAS

3. JUSTIFICATIVA

4. OBJETIVOS 4.1. Gerais 4.2. Especfico 28 28 29

5. ARTIGO PARA PUBLICAO

REFERNCIAS

46 50

LEGENDA

1. Introduo

14 A reproduo uma rea da cincia que desafia os pesquisadores. Por representar o incio da vida, a possibilidade da compreenso de seus mecanismos reguladores gera crescentes perspectivas e interesse de diversas reas.

Neste contexto, os avanos nas biotcnicas associadas reproduo animal, tm trazido inegveis benefcios s medicinas veterinria e humana. Na pecuria esses avanos resultam no melhor aproveitamento do material gentico dos animais de alto valor zootcnico, otimizando a produo do rebanho nacional. Este fato contribui para que o Brasil possua o terceiro maior rebanho mundial de sunos e alcance expressiva competitividade no mercado internacional. J em relao

medicina humana, as pesquisas com sunos assumem inestimvel importncia visto a semelhana da espcie com o homem. Os sunos, atravs do uso de biotcnicas reprodutivas na medicina regenerativa, tais como transgenia e clonagem, podem fornecer substncias vitais ao homem, como insulina e hormnio tireoidiano, sendo ainda a espcie responsvel pelos xenotransplantes. Conclui-se assim pela importncia e necessidade do profundo conhecimento da fisiologia reprodutiva desta espcie.

Um campo fundamental do conhecimento a fisiologia reprodutiva feminina, na qual a interao de dois processos, a foliculognese e a oognese, origina o gameta feminino. Apesar do amplo interesse e das muitas pesquisas realizadas, existem ainda vrias lacunas a serem esclarecidas, principalmente quanto fase inicial do desenvolvimento folicular, sendo o conhecimento dos mecanismos reguladores do incio da foliculognese um dos pontos essenciais para o progresso da cincia. Nesta linha, a epigentica, uma recente rea do conhecimento, traz

15 promissoras perspectivas para o esclarecimento de aspectos pouco compreendidos da fisiologia ovariana.

A epigentica consiste no estudo das modificaes fenotpicas herdveis sem alterao na seqncia do DNA. Os mecanismos epigenticos regulam a atividade de transcrio, alterando os padres de expresso gnica. Relevante contribuio trouxe o Projeto Genoma Humano, ao revelar que o ser humano e um fungo possuem quantidades aproximadas de genes, comprovando que a complexidade biolgica no depende do nmero de genes, mas sim de como esses genes so usados (expressos), aspecto regulado pela epigentica.

Portanto, os mecanismos epigenticos so fundamentais, atuando no ncleo da clula, na estrutura do nucleossomo. Por muito tempo acreditou-se em uma funo apenas estrutural para o nucleossomo, mas recentemente, descobriu-se o seu papel crucial e dinmico no controle da expresso gnica. Alguns mecanismos podem modificar sua estrutura, permitindo ou inibindo o acesso ao DNA, controlando assim a expresso do cdigo gentico. Um exemplo so os complexos remodeladores de cromatina, que alterando de maneira energia-dependente os contatos DNA-histona, modificam os padres de expresso gnica. H evidncias que a BRG1, uma importante subunidade do complexo remodelador SWI/SNF participa nos processos de foliculognese e embriognese modulando a transcrio; entretanto o modo de funcionamento destes remodeladores e de suas subunidades desconhecido at o momento.

Infere-se do exposto que a epigentica se apresenta como uma indita e promissora rea de investigao dos mecanismos que regulam a foliculognese inicial. Considerando a importncia da espcie suna no contexto da biotecnologia

16 reprodutiva, o objetivo deste trabalho foi analisar a presena da BRG1 em folculos ovarianos em diferentes estgios do desenvolvimento com a finalidade de propor uma possvel funo desta protena no processo da foliculognese.

17 2. Reviso Bibliogrfica

2.1. Ovrio mamfero

O ovrio mamfero constitudo pelas regies cortical e medular. A regio cortical contm folculos ovarianos em diferentes estgios de desenvolvimento, bem como corpos lteos, albicans e hemorrgicos. A regio medular localizada na poro mais interna do ovrio, com exceo dos eqdeos, sendo constituda por tecido conjuntivo, algumas clulas musculares lisas, nervos, artrias e veias (Comarck, 1991), responsveis pela nutrio e sustentao do ovrio (Hafez, 1996).

O ovrio desempenha funes endcrina e excrina ou gametognica. A primeira responsvel pela produo e liberao de hormnios esterides e diversos peptdeos e a segunda, a qual exercida pela interao de dois fenmenos, a oognese e a foliculognese (Saumande, 1991), responsvel pela produo e liberao de ocitos (Hafez, 1996).

2.2. Oognese

A oognese em mamferos pode ser definida como uma seqncia de eventos atravs dos quais as clulas germinativas primordiais (CGPs) desenvolvemse e diferenciam-se at a formao do ocito haplide fecundado (Russe, 1983). um processo que se inicia na vida fetal e envolve crescimento e diferenciao celular, assim como sntese e armazenamento de novas organelas (Song et al., 2006). Vale ressaltar que somente alguns ocitos conseguem completar este processo, meses ou anos mais tarde no animal adulto, aps a fecundao (Wassarman, 1988).

18 Atravs de sucessivas divises mitticas, as CGPs se multiplicam e originam grupos de oognias, conectados entre si por interaes citoplasmticas (van den Hurk & Zhao, 2005). Em algumas espcies, como ruminantes, roedores, sunos e primatas, a diferenciao e a multiplicao das oognias ocorrem ainda no feto em desenvolvimento, muito antes do parto. Em outras, como carnvoros e lagomorfos, esses processos se prolongam para o perodo imediatamente ps-natal (Banks, 1992). Em sunos, o processo de diferenciao das CGPs em oognias ocorre entre os dias 33 e 60 de gestao (Oxender et al., 1979; McCoard et al., 2001). Por volta do 60 dia de gestao ocorre o pico da mitose e a quantidade mxima de oognias (Black & Erickson, 1968); estas por sua vez sofrem replicao do DNA, iniciam a meiose e diferenciam-se em ocitos (van den Hurk & Zhao, 2005).

Os ocitos formados iniciam a primeira diviso meitica, passando pelos estgios da prfase I: leptteno, zigteno, paquteno e diplteno (Hirshfield, 1991). O estgio de diplteno tambm conhecido como dictioteno ou vescula germinativa (Gordon, 1994), e nesta fase que ocorre a primeira interrupo da meiose (Moore & Persaud, 1994). Os ocitos cujos ncleos encontram-se em prfase I so denominados ocitos primrios ou imaturos (Figueiredo et al., 2002).

Nestas fases iniciais da meiose, onde vrias protenas de reparo do DNA e outros fatores so solicitados para a recombinao do cromossomo, os ocitos so extremamente vulnerveis, resultando na degenerao de muitos deles. Essa perda de ocitos pode chegar a 60% em sunos (van den Hurk & Zhao, 2005).

O ncleo do ocito permanecer em prfase I at a puberdade, quando ondas de hormnio luteinizante estimulam a retomada da meiose (Eppig et al., 2004) e o ncleo oocitrio entra em diacinese (Figueiredo et al, 2002). Neste momento,

19 ocorre o rompimento da vescula germinativa (VG), seguida das fases de metfase I, anfase I e telfase I, quando ento ocorrer a expulso do primeiro corpsculo polar, resultando na formao do ocito secundrio (Betteridge et al., 1989). O ncleo do ocito comea a segunda diviso meitica, que avana apenas at a fase de metfase II, quando ocorre a segunda parada da meiose (Gordon, 1994). A diviso somente ser retomada caso ocorra a fecundao ou a ativao por partenognese, possibilitando assim a expulso do segundo corpsculo polar e a formao do ocito haplide fecundado (Moore & Persaud, 1994).

Os mecanismos que regulam a oognese ainda no so esclarecidos, porm sabe-se que durante o crescimento oocitrio ocorrem alteraes dinmicas na estrutura e funo da cromatina, essenciais para o desenvolvimento e capacitao meitica do ocito (De La Fuente, 2006). Estudos em camundongos demonstraram um remodelamento da cromatina durante o crescimento oocitrio, onde inicialmente a cromatina apresentou-se descondensada (NSN, do ingls non-surrounded nucleolus), no entanto aps os processos de crescimento e diferenciao, foi observada uma alterao na organizao nuclear, tornando-a progressivamente condensada (SN, do ingls surrounded nucleolus) (Debey et al., 1993). Esta diferena est relacionada com importantes modificaes durante a oognese (De La Fuente, 2006). Ocitos com a configurao NSN apresentam alto nvel de transcrio, enquanto que a aquisio da configurao SN est associada a uma represso global da atividade transcricional in vivo (Miyara et al., 2003). Apesar destas informaes, pouco conhecido sobre os eventos biolgicos envolvidos nas modificaes da estrutura da cromatina durante a oognese nos ocitos mamferos (De La Fuente, 2006).

20 2.3. Foliculognese

A foliculognese um processo que ocorre simultaneamente oognese, quando o ocito est entre as fases de prfase I e metfase II. Tambm inicia-se na vida pr-natal na maioria das espcies e caracteriza-se pela formao, crescimento e maturao folicular. Este evento origina-se com a formao do folculo primordial e culmina com o desenvolvimento do folculo pr-ovulatrio ou De Graaf (Saumande, 1991; Moore & Persaud, 1994).

De acordo com o grau de evoluo, os folculos podem ser divididos em prantrais ou no cavitrios e antrais ou cavitrios (Hulshof et al., 1994). Os folculos pr-antrais representam cerca de 90% da populao folicular do ovrio (Erickson, 1986) e so constitudos pelos folculos primordiais, primrios e secundrios (Hulshof et al., 1995; van den Hurk et al., 1997). Os folculos antrais podem ser classificados como folculos tercirios e folculos De Graaf, denominados ainda maduros ou pr-ovulatrios. importante salientar que alguns folculos podem ser ativados e se desenvolverem at o estgio tercirio na fase pr-natal, no entanto, somente na vida ps-natal, sob efeito hormonal, podem atingir o estgio provulatrio (Fortune, 1994).

Os folculos primordiais so os primeiros a serem formados e os que se encontram em maior quantidade no ovrio, sendo denominados de pool de reserva (Figueiredo et al., 2002). So caracterizados por um ocito imaturo central

circundando por uma camada de clulas somticas planas, conhecidas como clulas da pr-granulosa, originrias do mesoderma. Os folculos permanecem neste estgio de quiescncia at a ativao folicular, quando dada continuidade ao desenvolvimento.

21 A ativao folicular consiste na transio do folculo primordial para primrio, e caracterizada por trs eventos principais: mudanas na forma das clulas da granulosa de plana para cbica, proliferao destas clulas e aumento de tamanho do ocito (Hirshfield, 1991). H vrios aspectos a serem esclarecidos sobre este mecanismo, no entanto possvel que fatores que estimulam a proliferao das clulas da granulosa sejam provveis promotores da ativao folicular (Fair, 2003).

Como descrito acima, aps ativao so formados os folculos primrios, que consistem em um ocito circundado por uma camada de clulas cubides. Nesta classe folicular, as clulas da granulosa aumentam de nmero e tornam-se mais volumosas (van den Hurk, 1997). Outro evento marcante a expresso gnica para a sntese de protenas para a formao da zona pelcida, estrutura ao redor do ocito mantida por todo desenvolvimento (Seneda & Bordingon, 2007). As informaes sobre a ativao e o crescimento folicular so escassas, contudo, admite-se para a fase inicial do crescimento, uma ao predominantemente local e de vrios fatores de crescimento, como o Kit Ligand (Parrot & Skinner, 1999), GDF-9 (Vitt et al., 2000), bFGF (Nilsson et al., 2001) e LIF (Nilsson et al., 2002).

A prxima etapa so os folculos secundrios, formados por proliferao das clulas da granulosa, sendo caracterizados por uma ou mais camadas de clulas ao redor do ocito. Nestes folculos o tamanho do ocito aumenta, a zona pelcida j pode ser observada e nos mais desenvolvidos possvel observar clulas tecais. Durante o processo de formao do folculo secundrio, alguns marcadores tm sido reportados como de grande importncia, tais como ativina A (Zhao et al., 2001), EGF (Gutierrez et al., 2000) e BMP-15 (Juengel et al., 2002).

22 A etapa seguinte do desenvolvimento consiste no folculo tercirio, cuja principal caracterstica a formao do antro, uma cavidade repleta de lquido. Ocorre tambm a multiplicao das camadas da granulosa e a organizao completa das clulas da teca. Nesta etapa a ao gonadotrfica j pode ser detectada, sendo ento iniciados os efeitos amplos do FSH e LH (van den Hurk et al., 2000). Alguns marcadores, como ativina A e sua protena de ligao folistatina - foram identificados desde o estgio de folculo primordial at grandes folculos antrais (Silva et al., 2004). Com a evoluo dos folculos tercirios, a cavidade antral aumenta e o ocito fica aderido parede do folculo pelas clulas do cumulus, originando o folculo pr-ovulatrio que corresponde a fase final do desenvolvimento folicular (Hulshof et al., 1994).

Durante a foliculognese, as clulas dos folculos ovarianos sofrem intensa proliferao e diferenciao desde o momento da ativao do folculo primordial at alcanarem capacidade ovulatria (Ruiz-Cortez et al., 2005). Admite-se um programa coordenado entre elementos genmicos e epigenticos regulando o complexo processo da foliculognese em ovrios mamferos (Ruiz-Cortez et al., 2005).

Apesar do interesse crescente, pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam a foliculognese, principalmente no que se refere fase inicial do

desenvolvimento folicular. Com o objetivo de auxiliar na elucidao destes mecanismos, reas recentes do conhecimento, como a epigentica, comeam a trazer perspectivas promissoras (Seneda & Bordignon, 2007).

23 2.4. Epigentica

O termo epigentica refere-se ao estudo das modificaes fenotpicas herdveis sem alteraes na seqncia do DNA. Conforme alteraes bioqumicas, a mobilidade do nucleossomo pode ser alterada pela modificao na interao do DNA com as histonas, permitindo assim uma importante mudana na capacidade de expresso do cdigo gentico (Seneda & Bordignon, 2007).

Os processos epigenticos so naturais e essenciais para muitas funes do organismo, porm se ocorrerem inadequadamente podem ter efeitos adversos na sade e no comportamento (Weinhold, 2006). Agentes como metais pesados, pesticidas, hormnios, vrus, bactrias entre outros podem gerar alteraes bioqumicas na cromatina, interferindo na expresso de certos genes, podendo levar a disfunes respiratrias, reprodutivas e a vrios tipos de cncer. Essas modificaes epigenticas podem ser transmitidas por at quatro geraes (Weinhold, 2006), evidenciando assim a importncia da epigentica no processo evolutivo.

2.5. Estrutura do nucleossomo mamfero

No ncleo dos eucariotos, a cromatina carrega no somente informao gentica codificada pelo DNA, mas tambm informao epigentica carreada pelas histonas na forma de modificaes covalentes reversveis (Mellor, 2006).

O nucleossomo a unidade estrutural fundamental da cromatina e consiste de aproximadamente 146 pares de bases de DNA arranjados ao redor de um octmero de protenas denominadas histonas (figura 1). Este octmero formado por duas cpias de cada uma das quatro histonas centrais, H2A, H2B, H3 e H4

24 (Trotter & Archer, 2007) e uma histona de conexo denominada H1, que delimita o local onde o DNA entra e deixa o nucleossomo, concluindo assim duas voltas de DNA ao redor das histonas (Kamakaka & Biggins, 2005). Por muito tempo, acreditou-se em uma funo apenas estrutural do nucleossomo, uma maneira da clula realizar o empacotamento da longa fita do DNA, para permitir a condensao e organizao do mesmo no ncleo da clula (Cosgrove & Wolberger, 2005). Recentemente, descobriu-se o papel crucial e dinmico do nucleossomo no controle da expresso gnica. Conforme alteraes bioqumicas, a interao do DNA com as histonas pode variar, permitindo assim uma importante modificao na capacidade de expresso do cdigo gentico (Seneda & Bordingnon, 2007).

As histonas so constitudas por um domnio globular e por uma estrutura indefinida denominada cauda. Ambas as estruturas so alvos de modificaes pstranslacionais que esto relacionadas com estados distintos da cromatina, os quais regulam o acesso ao DNA (Cosgrove et al., 2004). Dessa acessibilidade ao DNA depende o controle da transcrio e expresso gnica. Uma alta mobilidade do nucleossomo necessria para desestabilizar a fibra da cromatina e assim aumentar a acessibilidade ao DNA, enquanto uma baixa mobilidade do nucleossomo est presente na estabilizao da cromatina, diminuindo assim o acesso ao DNA (Cosgrove et al., 2004). A mobilidade do nucleossomo regulada por mecanismos epigenticos.

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Figura 1: estrutura do nucleossomo, DNA envolto no octmero (em verde) de histonas H2A, H2B, H3 e H4 e H1, histona de conexo.

2.6. Modificaes epigenticas

bem estabelecido que modificaes epigenticas nas histonas regulam a estrutura da cromatina e consequentemente a expresso gnica. No entanto h diferentes mecanismos que podem modular a cromatina, so eles: metilao do DNA, modificaes covalentes nas histonas e fatores remodeladores da cromatina energia-dependente.

A metilao do DNA consiste na adio de uma radical metil base citosina na fita de DNA. Este processo est relacionado com a represso da transcrio por impedir o acesso ao DNA no local da reao e importante na represso gnica de mamferos e plantas, embora no ocorra em alguns eucariotos como leveduras e Caenorhabditis elegans (Bird, 2002)

As modificaes covalentes so mediadas por enzimas e consistem na adio ou remoo de grupos qumicos capazes de interferir na coeso do DNA com as

26 histonas, basicamente por modificaes de cargas eltricas (Seneda & Bordignon, 2007). As protenas histonas so alvos de muitas modificaes ps-translacionais, incluindo metilao, fosforilao, acetilao e ubiquitinizao (Zhang, 2001). Essas reaes so predominantemente reversveis, constituindo assim uma maneira dinmica de facilitar ou reprimir a ao do DNA (Mellor 2006).

Os remodeladores da cromatina consistem em complexos proticos que utilizam energia da hidrlise do ATP para alterar a posio do nucleossomo no DNA, conduzindo ativao ou represso da transcrio (Cosgrove et al., 2004). Os eucariotos contm pelo menos cinco famlias de remodeladores de cromatina: SWI/SNF, ISWI, NURD/Mi-2, INO80 e SWR1 (Saha et al., 2006). O complexo SWI/SNF e suas subunidades so objetos de muito interesse.

2.7. Complexo SWI/SNF BRG1

O complexo remodelador de cromatina SWI/SNF um complexo proteico ATP-dependente e est envolvido em aspectos crticos do crescimento celular e estabilidade do genoma (Kadam & Emerson, 2003). Possui massa molecular de 1 MDa e consiste de aproximadamente nove subunidades, embora essa composio possa variar nos diferentes tipos celulares (Mohrmann & Verrijzer, 2005). Foi primeiramente identificado em leveduras e altamente conservado entre os eucariotos (Peterson & Workman, 2000). Este complexo tem um papel importante no controle da expresso gnica, de uma maneira energia-dependente ele altera a estrutura do nucleossomo por modificar a interao DNA-histona, influenciando a atividade transcricional, podendo esta ser ativada ou reprimida.

27 A BRG1 (brahma related gene 1) uma importante subunidade da famlia SWI/SNF. A funo exata desta protena desconhecida, entretanto estudos mostram que ela est envolvida na ativao do genoma embrionrio (AGE) e um marcador da qualidade oocitria e embrionria. Ocitos com a expresso da BRG1 inativada completaram a meiose e foram fecundados, porm houve bloqueio dos embries no estgio de 2 clulas e reduo de 30% na trasncrio dos genes (Bultman et al., 2006). A ausncia da expresso da BRG1 foi associada letalidade embrionria precoce (Bultman et al., 2000).

Um estudo analisou a expresso desta protena em diferentes tecidos humanos saudveis e constatou que a expresso da BRG1 foi predominantemente vista em tipos celulares que sofrem constante proliferao e auto-renovao como clulas das criptas intestinais, epitlio da bexiga e espermatognias (Reisman et al.,2005). Sabe-se que durante o crescimento folicular ocorre intensa proliferao, requerendo assim uma investigao mais detalhada sobre a funo desta protena durante o desenvolvimento folicular.

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32 3. Justificativa

A foliculognese um universo a ser explorado. Apesar dos extraordinrios avanos verificados nos ltimos anos, ainda h vrias lacunas para uma perfeita compreenso do processo de crescimento folicular, especialmente na fase prantral. A fim de auxiliar nesse entendimento, a epigentica se apresenta como uma promissora rea do conhecimento. Os complexos remodeladores de cromatina regulam a transcrio por alterar a interao DNA-histonas no nucleossomo. Um importante complexo o SWI/SNF, composto por vrias subunidades proticas, entre elas a BRG1. A funo da BRG1 ainda desconhecida, porm h evidncias do seu envolvimento na oognese, foliculognese e embriognese. O

esclarecimento da funo e/ou modo de ao desta subunidade durante o crescimento folicular auxiliar na compreenso dos mecanismos regulatrios da foliculognese, desconhecidos at o momento.

33 4. Objetivos

4.1. Gerais:

Considerar modificaes epigenticas de remodeladores de cromatina no desenvolvimento folicular Auxiliar na elucidao de mecanismos envolvidos na

foliculognese, ainda pouco compreendidos.

4.2. Especfico:

Pesquisar a imunolocalizao da BRG1 em folculos primrios, secundrios, tercirios e antrais na espcie suna

34 5. Artigo para publicao

O Papel da BRG1 no Controle Epigentico em Ovrios Sunos

35 Resumo

Durante o crescimento folicular e oocitrio ocorrem alteraes dinmicas na estrutura da cromatina e conseqentemente na expresso gnica. Estas modificaes so reguladas por mecanismos epigenticos capazes de modificar a estrutura do nucleossomo atravs de reaes bioqumicas, influenciando assim a expresso do DNA. Os remodeladores de cromatina alteram as interaes DNAhistonas, influenciando a atividade transcricional, por facilitar ou inibir o acesso ao DNA. Uma famlia importante de remodeladores o complexo SWI/SNF, composto por vrias subunidades proticas, entre elas a BRG1. Nosso objetivo foi analisar os padres de expresso da BRG1 em diferentes estgios do desenvolvimento folicular. Para tal, ovrios de marrs (n=10) foram coletados imediatamente aps a eviscerao e ento lavados duas vezes em PBS resfriado. Os ovrios foram divididos em fragmentos de aproximadamente 8x8x8 mm e homogeneizados por agitao constante em soluo de paraformaldedo 4% em temperatura de 4C por 12 h. Os fragmentos ovarianos foram posteriormente lavados trs vezes em PBS a 4C e imediatamente transferidos para lcool 70% para posterior processamento para imunofluorescncia. Os tecidos foram inclusos em parafina e seccionados utilizando protocolos histolgicos padro. Para a imunofluorescncia, as amostras foram desparafinizadas e reidratadas por trs passagens sucessivas em etanol. Aps lavar em PBS-Brij, a recuperao antignica foi realizada pela incubao em tampo citrato de sdio por 5 minutos em uma panela de presso.

Subseqentemente, as sees foram bloqueadas por 1 h com soro total caprino e ento incubadas com anticorpo policlonal anti-BRG1 produzido em coelho (1/200) ou com IgG de coelho no imunizado (controle) na mesma concentrao dos anticorpos primrios, durante 12 horas a 4C.Os anticorpos primrios foram identificados

36 utilizando-se AlexaFluor 594-anti IgG de coelho na diluio 1/1000. As clulas foram contracoradas com DAPI. Sinais de imunofluorescncia foram mensurados em microscpio Nikon eclipse 80i. Sinais positivos para BRG1 foram detectados em todas as amostras analisadas. Nos folculos primrios a protena foi encontrada apenas no ncleo do ocito, no entanto conforme o desenvolvimento folicular foi identificado a expresso da BRG1 nas clulas da granulosa e nas clulas da teca, em um padro bem definido conforme a proximidade das clulas em relao ao ocito. Estes resultados sugerem uma participao importante da BRG1 no processo de crescimento folicular, possivelmente modulando a proliferao das clulas da granulosa e da teca, alm de todo crescimento e maturao do ocito.

Palavras-chave: BRG1, ocito, foliculognese, complexo SWI/SNF, sunos

37 Abstract

Dynamic changes in chromatin structure and gene expression occur during follicular and oocyte growth. Epigenetic mechanisms regulate these changes through biochemical reactions that modify the nucleosome structure, and consequently affecting DNA expression. Chromatin remodelers that alter DNA-histones interactions can influence transcriptional activity by facilitating or repressing DNA access. The SWI/SNF complex represents an important chromatin remodeling family, which comprises many proteins subunits including the BRG1 (brahma-related gene 1). Our aim in this study was to analyze BRG1 expression patterns in different stages of follicular development. Ovaries (n=10) were collected from pre-pubertal gilts immediately after evisceration and then rinsed twice in cold PBS. Ovarian fragments of 8x8x8 mm were cut and placed into a 4% paraformaldehyde solution at 4C for 12 hours. Ovarian fragments were then washed three times in PBS at 4C and transferred to 70% Ethanol. Tissues were processed for embedding in paraffin, and sectioned using standard histological protocols. For immunofluorescence, samples were deparaffinized and rehydrated through three changes of alcohol. After washing in PBS-Brij, antigen retrieval was performed by incubating the tissue sections in sodium citrate buffer for 5 min in a pressure cooker. Sections were subsequently blocked for 1 h with normal goat serum and then incubated with primary antibodies, polyclonal rabbit anti-BRG1 (1/200) or control rabbit IgG at the same concentration, overnight at 4 degrees. Primary antibodies were detected using Alexa Fluor 594-antirabbit 1/1000 diluted secondary antibody. Cells were counterstained with DAPI. Immunofluorescence signals were evaluated using a Nikon eclipse 80i microscope. Positive fluorescent signal for BRG1 was detected in all analyzed samples. In

primary follicles, the protein was detected only in the oocyte nucleus. However, in

38 growing follicles, BRG1 was identified in granulosa and theca cells in a well defined pattern according to the proximity of the cells from the oocyte. These results suggest an important participation of BRG1 in the regulation of follicular growth, probably modulating granulosa and theca cells proliferation, as well as oocyte growth and maturation

Key-words: BRG1, oocyte, folliculogenesis, SWI/SNF complex, porcine

39 Introduo

O ovrio mamfero responsvel pela produo de ocitos aptos para fecundao e pela produo de hormnios esterides essenciais fecundao e prenhez (Seneda et al., 2008). Os ocitos encontram-se inclusos em folculos, os quais so responsveis pela manuteno da viabilidade, bem como crescimento e maturao oocitria (Figueiredo et al., 2002). Os primeiros folculos a serem formados no ovrio so denominados primordiais, nos quais o ocito envolvido por uma camada de clulas somticas denominada clulas da pr-granulosa. Aps a formao, componentes do folculo primordial so mantidos em um estado de quiescncia, sendo o ocito mantido em prfase I da meiose, enquanto as clulas da pr-granulosa permanecem na fase G-Zero do ciclo celular (Pepin et al., 2007). Essa quiescncia permanece at a ativao do folculo primordial, caracterizada pela mudana na forma das clulas da granulosa e pela proliferao das mesmas (BrawTal & Yossefi, 1997). A ativao ainda no totalmente compreendida, mas admitese os fatores de proliferao celular como provveis promotores deste processo (Fair, 2003). Em relao expresso gnica, a transio do folculo primordial para o primrio a fase de maior incidncia de alteraes na expresso dos genes, quando comparada com todas as outras fases do desenvolvimento folicular (Pan et al., 2005).

Uma vez ativados, os folculos passam pelos estgios primrio, secundrio, tercirio e antral. Admite-se para a fase inicial do crescimento folicular, uma ao predominantemente local e de vrios fatores de crescimento, como o Kit Ligand (Parrot & Skinner, 1999), GDF-9 (Vitt et al., 2000), bFGF (Nilsson et al., 2001) e LIF (Nilsson et al., 2002). Sinalizaes entre o ocito e as clulas da granulosa tm se

40 mostrado como uma chave regulatria na transio do folculo primrio para secundrio e antral, e membros da famlia TGFB so requeridos para esta transio (Pangas & Matzuk, 2004). Os ocitos tornam-se competentes para retomar a meiose durante o estgio final de desenvolvimento do folculo antral (Eppig et al., 1992), fase estimulada por ondas de hormnio luteinizante (LH). Uma vez retomada a meiose, os ocitos progrediro at a fase de metfase II, quando ocorrer a segunda interrupo da diviso. A meiose somente ser retomada caso ocorra a fecundao, possibilitando assim a formao do ocito haplide fecundado (Moore & Persaud, 1994).

Apesar da foliculognese ser objeto de grande interesse de pesquisadores, vrios mecanismos envolvidos no processo de ativao folicular e oocitrio permanecem obscuros, mas admite-se um programa coordenado de elementos genmicos e epigenmicos regulando o complexo processo da foliculognese nos ovrios mamferos (Ruiz-Cortez et al, 2005). Estudos recentes mostraram o crescimento oocitrio durante as mudanas dinmicas na estrutura e funo da cromatina, essenciais para conferir maturao e competncia meitica ao ocito ( De La Fuente, 2006).

Nos eucariotos, a infomao gentica armazenada em um polmero dinmico denominado cromatina, composta pela associao do DNA com protenas chamadas histonas (H1, H2A, H2B, H3 e H4). A unidade estrutural fundamental da cromatina o nucleossomo, consttuido por 146 pares de bases do DNA arranjados ao redor destas histonas (Trotter e Archer, 2007). O controle transcricional da expresso gnica depende crucialmente da acessibilidade do DNA, a qual epigeneticamente regulada por modificaes nas histonas (Narlikar et al., 2000). O

41 remodelamento da cromatina uma forma de modificao epigentica capaz de regular a transcriao por alterar a organizao do nucleossomo, facilitando ou restringindo o acesso ao DNA, determinando assim a ativao ou represso, respectivamente, da transcrio. Os complexos remodeladores da cromatina realizam atividades enzimticas, modificando a estrutura da cromatina por alterar o contato DNA-histonas com o nucleossomo de uma forma ATP dependente (Martens & Winston, 2003).

Os eucariotos contm pelo menos cinco famlias de remodeladores de cromatina : SWI/SNF, ISWI, NURD/Mi-2, INO80 e SWR1 (Saha et al, 2006). O complexo SWI/SNF um dos mais estudados e composto por multisubunidades (7 a 13 subunidades) reguladoras da expresso gnica por remodelamento da estrutura da cromatina atravs de elementos promotores e regulatrios ( Knott et al., 2006). A protena BRG1 (brahma related gene) uma importante subunidade ATPase deste complexo. Sua exata funo no conhecida, no entando sabe-se que ela se liga a outras protenas, glicocorticides (Inayoshi et al., 2005) e receptores de estrgeno (Ichinose et al., 1997). A expresso da BRG1 em ocitos (Bultman et al., 2000) e embries (Bultman et al, 2006) de camundongos evidenciam a participao desta protena na foliculognese e embriognese, embora pouco tenha sido relatado a respeito. Ocitos de fmeas que sofreram mutao para anular a expresso da BRG1 completaram a meiose e foram fecundados, porm os

embries concebidos destes vulos exibiram problemas na ativao do genoma embrionio e o desenvolvimento dos mesmos foi interrompido no estgio de 2 a 4 clulas com a atividade transcricional reduzida em 30% dos genes (Bultman et al, 2006).

42 Considerando as evidncias da participao da BRG1 na foliculognese, bem como a importncia das modificaes epigenticas na organizao da cromatina e expresso gnica, objetivou-se neste trabalho pesquisar a presena da BRG1 nas diferentes fases do denvolvimento folicular. A partir de ovrios sunos submetidos imunofluorescncia, foram analisados folculos primrios, secundrios, tercirios e antrais, bem como os ocitos neles inclusos.

Material e mtodos

Ovrios de marrs foram coletados em abatedouros imediatamente aps a eviscerao. Logo aps a coleta, os ovrios foram lavados duas vezes em PBS resfriado, divididos em fragmentos de aproximadamente 8x8x8 mm e

homogeneizados por agitao constante em soluo de paraformaldedo 4% em temperatura de 4C por 12 h. Os fragmentos ovarianos foram posteriormente lavados trs vezes em PBS a 4C e imediatamente transferidos para lcool 70%. Foi utilizado protocolo histolgico padro, no qual os tecidos foram desidratados em diferentes concentraes de lcool, diafanizados em Citrisolve (Fisher Scientific Canad, Ottawa, Ontario), includos em parafina e seccionados seriadamente espessura de 3 m. Nesses cortes foi realizada a tcnica de imunofluorescncia.

Imunofluorescncia

Os fragmentos ovarianos foram desparafinizados com Citrisolve (Fisher Scientific Canad, Ottawa, Ontario) e reidratados por trs passagens sucessivas em

43 etanol. Aps lavar em PBS-Brij (tampo fosfato salina [PBS] com 0,03% de Brij 35) por 10 minutos, a recuperao antignica foi realizada pela incubao em tampo citrato de sdio por 5 minutos em uma panela de presso. As seces foram resfriadas temperatura ambiente e, em seguida, lavadas trs vezes em PBS-Brij. Subseqentemente, as sees foram bloqueadas por 1 h em PBS-Brij com 10% de soro total caprino e albumina srica bovina 2,5% e ento incubadas com anticorpo policlonal, produzido em coelho, anti-BRG1 (Abcam Inc., Cambridge, MA; ab8895, 1/200). O controle negativo foi realizado utilizando IgG de coelho no imunizado (Jackson Immunoresearch Laboratrios, PA) na mesma diluio dos anticorpos primrios. A incubao com o anticorpo primrio foi realizada sob agitao por 12 h a 4C. Os anticorpos primrios foram detectados utilizando-se AlexaFluor 594-antiIgG de coelho (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) na diluio 1/1000. As clulas foram contracoradas com 4',6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI). Sinais de

imunofluorescncia foram mensurados em microscpio Nikon eclipse 80i e as imagens capturadas em sistema de fotodocumentao digital.

Resultados

Atravs de anlise de imunofluorescncia realizada em ovrios de porcas prpberes, foi analisada a presena da protena BGR1, uma subunidade do complexo remodelador da cromatina SWI/SFN, em folculos primrios, secundrios, tercirios e antrais. Sinais de imunofluorescncia positivos para BGR1 foram expressos em todas as amostras analisadas (figura 1), sugerindo assim um envolvimento da protena com o desenvolvimento folicular. Nos folculos primrios a BRG1 esteve presente apenas no ncleo do ocito, no entanto a expresso da mesma foi evidenciada nas clulas da granulosa nas prximas etapas do desenvolvimento. Nos

44 folculos secundrios, alm do ncleo, houve expresso da BRG1 tambm nas clulas da granulosa prximas ao ocito. Nesta etapa de desenvolvimento, o folculo uma estrutura mais compacta e no h muito espao entre o folculo e ocito. J o folculo tercirio caracterizado pelo incio da formao cavidade antral e pela completa organizao das clulas da teca, dividas em teca interna e externa. Neste estgio, o contato ocito-granulosa comea a diminuir, pois o espao central comea a ser preenchido pelo fludo folicular. Nesta fase observamos a expresso da BRG1 nas clulas da granulosa mais prximas s clulas tecais e tambm no ncleo do ocito. Nos folculos antrais, a BRG1 alm de presente no ncleo do ocito, tambm foi observada nas clulas da granulosa e nas clulas tecais. importante informar que folculos primordiais no foram analisados por no apresentarem marcao para BRG1.

Discusso

Em todas as classes foliculares analisadas foram observados sinais de imunofluorescncia positivos para a expresso da BRG1, sugerindo o envolvimento desta subunidade do complexo SWI/SNF no processo da foliculognese.

O desenvolvimento folicular um processo lento, o perodo do incio do crescimento do folculo primordial at o estgio de folculo pr-ovulatrio leva quatro meses em sunos (Morbek et al, 1992), e as clulas do folculo ovariano sofrem intensa proliferao e diferenciao (Ruiz-Cortez et al, 2005). O complexo SWI/SNF parece estar envolvido nestes dois processos, a BRM (protena brama), uma das subunidades deste complexo, foi relacionada com a diferenciao celular, pois seus nveis aumentaram durante o processo de diferenciao de hepatcitos e clulas neurais (Itoh et al, 2008). J a BRG1, parece ter maior envolvimento com a

45 proliferao celular, pois sua expresso foi predominantemente vista em tecidos em constante proliferao ou auto-renovao, como clulas das criptas intestinais, epitlio da bexiga e espermatognias (Reisman et al., 2005). Estas informaes podem sugerir uma funo para a BRG1 durante a foliculognese no processo de proliferao das clulas da granulosa.

Para o sucesso do desenvolvimento folicular necessria a ativao dos folculos primordiais. As mudanas na expresso gnica durante a transio de folculo primordial para folculo primrio tm sido considerado o evento mais complexo da foliculognese, pela intensa reorganizao da estrutura folicular e incio do crescimento e desenvolvimento (Pan et al, 2005). No entanto, as mudanas na estrutura da cromatina, quando ocorre ativao da BRG1, so pobremente caracterizadas durante essa transio (Pan et al, 2005). Em nosso trabalho a BRG1 apareceu somente no ncleo do ocito de folculos primrios e s depois, nas fases subseqentes do desenvolvimento que sua expresso se expande, sendo evidente tambm nas clulas da granulosa, sugerindo que esta protena comea a participar da foliculognese aps a ativao dos folculos primordiais, que no apresentaram marcao.

Aps ativao, os folculos primrios iniciam a fase de crescimento, cujos mecanismos regulatrios so pouco esclarecidos, porm um papel crucial do ocito tem sido demonstrado (Eppig, 2001). O desenvolvimento folicular inicial parece ser dependente de fatores secretados pelo prprio ocito, como GDF-9 (fator-9 de crescimento e diferenciao) e BMP-15/GDF-9B (protena-15 ssea morfogentica) (Carabatsos et al., 1998; Galloway et al., 2000). Vale ressaltar que a BRG1 esteve

46 presente nos ocitos de todos folculos analisados, demonstrando assim a sua participao no desenvolvimento folicular por meio da atividade regulatria do ocito.

O processo de transio do folculo primrio para secundrio marcado por proliferao das clulas da granulosa e aumento do ocito. Alguns marcadores tm sido reportados como de grande importncia para a formao do folculo secundrio, tais como ativina-A (Zhao et al., 2001), EGF (Gutierrez et al., 2000) e BMP-15 (Juengel et al., 2002). Neste estgio a zona pelcida j pode ser evidenciada, as clulas tecais comeam a se organizar e os folculos parecem comear a responder s gonodatrofinas (Fair, 2003). No folculo secundrio as clulas da granulosa adquirem capacidade proliferativa e em nossos resultados, nesta fase que foi observado o incio da expresso da BRG1 na granulosa, reforando a idia de um possvel papel desta protena na regulao da proliferao das clulas da granulosa.

A etapa seguinte do desenvolvimento consiste no folculo tercirio, cuja principal caracterstica o incio da formao do antro. As camadas da granulosa se multiplicam e as clulas da teca se organizam completamente em teca externa e interna (Driancourt, 1991). Nesta etapa, a ao gonadotrfica j pode ser detectada, sendo ento iniciados os efeitos amplos do FSH e LH (van den Hurk et al, 2000). Quanto expresso da BRG1, a localizao nas clulas da granulosa diferiu dos folculos secundrios, sendo sua expresso evidente nas clulas da granulosa prximas s clulas da teca. Considerando-se a intensa participao interativa entre as clulas da teca e da granulosa para a esteroidognese, admite-se uma possvel atividade da BRG1 neste processo, principalmente pelo fato de j se ter demonstrado o vnculo da BRG1 com receptores de estrgeno (Ichinose et al., 1997).

47 Nos folculos antrais, a cavidade antral aumenta muito e o ocito fica preso granulosa pelas clulas do cumulus. Sabe-se que o progresso atravs dos sucessivos estgios da foliculognese dependente de uma efetiva comunicao do ocito com as clulas da granulosa e da granulosa com as clulas da teca (Knight & Glister, 2003). A BRG1 esteve presente no ocito, na granulosa e nas clulas da teca. Considerando-se as dinmicas modificaes morfo-funcionais nesta etapa do desenvolvimento folicular, sugere-se uma participao efetiva da BRG1 de maneira bastante ampla. A BRG1 pode exercer funes distintas nas diferentes estruturas, podendo atuar na regulao da transcrio no ocito, na proliferao celular nas clulas da granulosa e da teca, alm do possvel envolvimento na esteroidognese. Contudo estas informaes ainda devem ser melhor investigadas.

Dentre as histonas com atividades importantes na foliculognese, destaca-se a histona H3. A fosforilao da serina 10 da histona H3 foi relacionada com atividade transcricional favorvel ao processo de diviso celular (Hans e Dimitrov, 2001). Por sua vez, esta modificao da H3 apresentou-se vinculada ao tanto do FSH como do estradiol, durante o perodo pr-ovulatrio, comprovando a estreita relao desta alterao na cromatina com a regulao do crescimento folicular (Ruiz-Corts et al., 2005). Ainda da H3, a lisina 4 (K4), tem despertado o interesse dos pesquisadores. A H3K4 e a enzima reguladora da sua metilao Lysine Specific Demethylase 1 (LSD1) parecem exercer um papel central no comando da expresso gnica de gametas, tanto em organismos mais simples, como a Drosophila (Di Stefano et al., 2007), como tambm nos mamferos (Godmann et al., 2007). Ao longo do desenvolvimento folicular, demonstrou-se uma distribuio especfica da H3K4 mono, di e tri-metilada, com presena bem definida em folculos

48 antrais e um surpreendente e progressivo decrscimo com a proximidade da ovulao (Seneda et al., 2008).

Uma associao da H3K4 com a BRG1 foi apresentada por Bultman et al. (2002). Durante a ativao do genoma de embries oriundos de ocitos de camundongas com depleo do gene BRG1, houve um decrscimo na expresso da H3K4 dimetilada. Esses autores demonstraram uma reduo de aproximadamente 61% de expresso da H3K4 dimetilada, quando em comparao com embries originados de camundongas normais. Comparando a modulao da BRG1 nas diversas categorias foliculares do presente trabalho com os resultados de H3K4 mono, di e trimetilada obtidos por Seneda et al. (2008), constata-se identidade de expresso entre BRG1 e H3K4 em folculos ovarianos. Os ocitos dos folculos primrios, secundrios e tercirios apresentaram marcao tanto para H3K4 mono, di e trimetilada como para BRG1, porm nas clulas da granulosa apenas a BRG1 foi expressa. J em folculos antrais, todas as formas de metilao da H3K4 foram identificadas (Seneda et al., 2008) em ocitos, clulas da granulosa e da teca, situao idntica observada no presente trabalho para a BRG1. Estes resultados evidenciam uma relao entre esses marcadores, no entanto mais estudos so necessrios para afirmar uma possvel funo correlacionada entre BRG1 e H3K4.

O fato de se ter identificado a BRG1 em ocitos desde as fases iniciais do crescimento folicular, atesta a ativa participao deste gene a partir do comeo do crescimento oocitrio at a fase embrionria, tendo sido demonstrada letalidade embrionria precoce em homozigotos para a nulidade de BRG1 e vrios problemas para os heterozigotos (Bultman et al, 2000). A ativao do genoma embrionrio foi claramente associada com a BRG1 em estudo posterior, sendo mesmo considerado

49 um gene primordial neste processo de ativao (Bultman et al., 2006). O incio do desenvolvimento embrionrio, antes da ativao do genoma embrionrio, coordenado por RNAs e protenas sintetizadas e armazenadas pelo ocito (Sirard & Coenen, 1994). Como demonstrado no presente trabalho, a expresso da BRG1 ocorre de maneira bastante precoce, sugerindo a sua importncia no controle do genoma embrionrio advindo desde perodo anteriores, no incio do crescimento oocitrio.

O complexo SWI/SNF foi primeiramente identificado em leveduras e altamente conservado entre os eucariotos (Peterson & Workman, 2000). Esta informao nos leva a pensar em uma funo bsica para esse complexo e suas subunidades. No entanto estudos mais detalhados so necessrios para afirmar a exata funo da BRG1 durante a foliculognese, porm nossos resultados sugerem que esta protena requerida no processo de crescimento folicular e oocitrio, que envolve proliferao e diferenciao celular.

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54 Legenda

Figura 1: Localizao por imunofluorescncia da BRG1 em folculos ovarianos de diferentes estgios de desenvolvimento. Na primeira coluna a colorao DAPI (em azul) foi utilizada para evidenciar ncleo de clulas foliculares, a segunda coluna mostra a localizao da BRG1 (em vermelho) e a terceira, a sobreposio das figuras. Nos folculos primrios a BRG1 est presente somente nos ocitos, nos secundrios a expresso da protena j pode ser detectada tambm nas clulas da granulosa prxima ao ocito. Nos tercirios a BRG1 est presente no ocito e na granulosa e nos folculos antrais tambm pode ser vista nas clulas da teca, alm da granulosa e ocito.

55

DAPI

SNF2 BRG1

merge

Primary follicle 20x

Secondary follicle 60x

Tertiary follicle 20x

Antral follicle

20x

Antral follicle

60x

Oocyte from antral follicle 60x

Figura 1.