UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS SECCIN CIENCIAS DE LA SALUD ANIMAL

MANUAL DE PRCTICAS DE VIROLOGA

AUTORES
ABEL CIPRIAN CARRASCO ALMA NOEMI MONTES DE OCA CHVEZ EDNA MARIBEL LEGASPI NUEVO FLOR OLIVIA MARTNEZ MARTNEZ GERARDO ARCILA LPEZ TELLO HUGO RAMREZ LVAREZ HUMBERTO ALEJANDRO MARTNEZ RODRGUEZ MARA DE LOURDES JARA RAMREZ MARA MARTHA GARCA FLORES RAL ARTURO MAR CRUZ RODOLFO CRDOVA PONCE CUAUTITLN IZCALLI A 30 DE ENERO DEL 2012

NDICE I. Introduccin II. Objetivos III. Presentacin del Curso IV. Reglamento General e Interno del Laboratorio de Virologa V. BIOSEGURIDAD VI. Calendario de Actividades y Evaluacin PRCTICA 1 Material y Equipo utilizado en el Laboratorio de Virologa. PRCTICA 2 Coleccin y Envo de muestras para el Diagnstico Viral PRCTICA 3 Microscopa electrnica PRCTICA 4 Inoculacin de Animales de Laboratorio PRCTICA 5 Inoculacin en Embriones de Pollo PRCTICA 6 Cultivo Celular PRCTICA 7 Pruebas de diagnstico Viral. A) ELISA B) ELECTROFORESIS C) REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA PRCTICA 8 Hemoaglutinacin e Inhibicin de la Hemoaglutinacin. ANEXO Reporte de resultados obtenidos en la prctica
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3 3 4 5 9 14 16 19 28 32 43 53 62 62 66 71 74 79

INTRODUCCIN El presente manual pretende ser un complemento de los conceptos revisados en la parte terica de la asignatura de Virologa, al igual que mostrar algunas metodologas empleadas para un mejor desempeo del trabajo en un laboratorio.

OBJETIVO Que el alumno conozca los procedimientos de toma y envi de muestras, para que estas sean consideradas adecuadas para su procesamiento en el laboratorio, y aplicando algunas tcnicas virolgicas permitir el aislamiento, identificacin y diagnstico.

PRESENTACIN DEL CURSO

ESTE ES UN ESFUERZO POR ACTUALIZAR Y OFRECER UN MEJOR MANUAL PARA EL REA DE VIROLOGA VETERINARIA. POR LO QUE LA INFORMACIN CONTENIDA EN ESTA RECOPILACIN ES TODAVA SUJETA A REVISIN, CORRECCIN O CUALQUIER SUGERENCIA QUE AL LECTOR LE PAREZCA IMPORTANTE PARA QUE ESTE MANUAL PUEDA CUMPLIR CON SUS EXPECTATIVAS Y LAS PLANTEADAS POR LOS PROFESORES DE VIROLOGA. POR MI RAZA HABLAR EL ESPRITU

CUAUTITLN IZCALLI A 30 DE ENERO DEL 2011.

ATENTAMENTE PROFESORES DE VIROLOGA

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CODIGO: DOC-CB-DEX-01-

REGLAMENTO GENERAL PARA 00 LOS LABORATORIOS

N de REVISIN: 01

1) Este reglamento aplicar para personal acadmico, alumnos y laboratoristas. 2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deber utilizarse bata blanca con manga larga. 3) La tolerancia para el inicio de la sesin de laboratorio ser hasta de 10 minutos a partir de la hora sealada. 4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las prcticas. 5) En todo momento deber mostrarse una conducta adecuada en el rea de trabajo. 6) Queda prohibido en los laboratorios: a) Tirar basura fuera del cesto. b) Ingerir alimentos y/o bebidas. c) Fumar. d) Recibir visitas. e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos. f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios. g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesin experimental. h) Sentarse sobre las mesas de trabajo. i) Mover el mobiliario de su lugar. j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura. 7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos o mezclas de ellos que en cualquier estado fsico representan un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas, txicas, inflamables o biolgico-infecciosas (Art. 3 de la Ley General del Equilibrio y Proteccin del Ambiente). 8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de telfonos celulares, reproductores de sonido o cualquier medio electrnico de entretenimiento. El uso de las computadoras porttiles queda restringido a temticas relacionadas con la asignatura. 9) El acceso al laboratorio se permitir nicamente cuando est presente uno de los profesores del grupo. 10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deber programarse con el profesor responsable en un horario que no interfiera con aquel destinado para el desarrollo de las prcticas. 11) Para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene debidamente el vale de material (FPE-CB-DEX-01-09) y lo entregue a la persona responsable, dejando como depsito la credencial vigente de la UNAM.

12) El alumno deber revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando cualquier anomala (faltante o material daado) y ser devuelto en las condiciones en que se recibi, de no hacerlo, se har acreedor a las sanciones establecidas en cada laboratorio. 13) Es obligacin de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el laboratorio.

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REGLAMENTO INTERNO LABORATORIO DE VIROLOGA

El presente reglamento tiene como objetivo, que las prcticas y el trabajo dentro del laboratorio se realicen en las mejores condiciones posibles de bioseguridad para los alumnos, los profesores y las personas que en l laboran. Por lo tanto deber seguir las indicaciones de dicho reglamento, o de lo contrario se har merecedor a las sanciones segn sea el caso. 1. El uso de cubreboca y guantes ser obligatorio en aquellas prcticas que lo requieran por el riesgo de infeccin o contaminacin que pudieran implicar. 2. Los objetos personales como los cuadernos, libros, mochilas prendas de vestir no debern permanecer sobre las mesas de trabajo durante el desarrollo de la prctica. Existen gavetas en la parte inferior de las mesas para que los alumnos puedan guardar sus objetos personales, lo que adems previene la obstruccin del paso a travs de los pasillos, as se evitan accidentes en caso de una emergencia. 3. El alumno deber lavarse las manos antes y despus de realizar la prctica. 4. El alumno deber desinfectar la mesa de trabajo antes y despus de la realizacin de la prctica. 5. El alumno no podr tener dentro del laboratorio mascotas o animales que no sean los destinados a la prctica que se est llevando a cabo. 6. Una vez iniciada la prctica, el alumno no podr entrar o salir del laboratorio hasta la conclusin de la misma. 7. No est permitido pipetear con la boca, por el riesgo que esto implica para su salud. 8. Se prohbe colocar material biolgico infeccioso y/o contaminado directamente sobre la mesa de trabajo. 9. No est permitida la eliminacin de material biolgico infeccioso y/o contaminado en el bote de basura o en las tarjas. 10. Siga las indicaciones del profesor para el uso correcto del equipo de laboratorio que se est empleando durante la prctica, si tiene dudas, pregunte antes de emplearlo para evitar daarlo, dado que de ser as, tendr que reponer dicho material o equipo.
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11. Una vez concluida la prctica, el alumno deber colocar su banco sobre la mesa de trabajo. 12. Evitar el uso de un lenguaje soez.

BIOSEGURIDAD La idea de bioseguridad surgi para proteger a las personas que, ya sea por trabajo o por estudio, lleguen a estar en contacto con algn patgeno o muestra potencialmente infecciosa. Durante muchos aos se trabaj en los laboratorios sin preocuparse por el contacto con material biolgico, aun en reas donde este tipo de material es el objeto del estudio y se realizan actividades que implican la propagacin de los agentes de riesgo biolgico. En la dcada de los 80, con la aparicin del virus de la inmunodeficiencia humana, surge el primer Manual de Bioseguridad del Centro de Control de Enfermedades (CDC). Bioseguridad tal como lo define la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) en su Manual de Bioseguridad para el Laboratorio, se refiere a los principios, tcnicas y prcticas aplicadas con el fin de evitar la exposicin no intencional a agentes de riesgo biolgico y toxinas, o su liberacin accidental. Existe otro concepto emparentado con el de Bioseguridad, que es el denominado por la OMS, Bioproteccin (o Biocustodia), y se refiere a las medidas de proteccin de la institucin y del personal destinadas a reducir el riesgo de prdida, robo, uso incorrecto, desviaciones o liberacin intencional de agentes biolgicos o toxinas. Esto implica, adems del cumplimiento de las Normas de Bioseguridad, tener control y registros sobre el uso y almacenamiento de agentes de riesgo biolgico o toxinas que puedan ser utilizados para provocar algn tipo de dao a personas, al ambiente o a la economa de un pas. El trabajar en un laboratorio implica un riesgo constante de exposicin con diferentes materiales como por ejemplo, aqullos derivados del manejo de material infeccioso, radiacin, compuestos txicos, qumicos e inflamables. En el caso particular del material biolgico-infeccioso, el peligro surge de la posibilidad de exponerse a agentes patgenos e infectarse por dicha exposicin. En laboratorios de diagnstico clnico, de investigacin, industriales, de patologa clnica, de produccin de biolgicos, de enseanza, u otros donde se lleguen a manejar patgenos aislados o muestras que los contengan, los profesionales del laboratorio debemos prestar especial cuidado en las medidas que tomamos para prevenir un accidente. Por otra parte, hoy en da el cumplimiento de normas de Seguridad y Bioseguridad es un requisito para la certificacin de calidad, a la que aspiran por voluntad propia o necesidad laboral muchos laboratorios. En nuestro pas la cultura de la Bioseguridad, aunque ha avanzado en especial en los laboratorios de Salud Pblica, an no est instalada en muchos laboratorios de investigacin y docencia. Muchas veces se argumenta la falta de recursos econmicos para cumplir con las normas, si bien, esto es un problema real para algunos de los aspectos, la reorganizacin y modificacin de conductas pueden implementarse sin mayores erogaciones. Los agentes de riesgo biolgico pueden ingresar al organismo por distintas vas: oral, respiratoria, cutnea, mucosas, en particular la conjuntiva. Estos agentes han sido clasificados por la OMS y los factores utilizados para agrupar a los microorganismos son (i) patogenicidad, (ii) dosis infectiva, (iii) modo de transmisin, (iv) rango de hospedero, (v) disponibilidad de medidas de prevencin efectivas y, (vi) disponibilidad de tratamiento efectivo. Actualmente, la clasificacin es la siguiente: Grupo de riesgo 1 (GR1): Agentes no asociados con enfermedades en humanos adultos saludables ni en animales (nulo o bajo riesgo al individuo o la comunidad). Ejemplo: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ciertas cepas de Escherichia coli.
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Grupo de riesgo 2 (GR2): Agentes asociados con enfermedades humanas raramente serias para las cuales siempre hay medidas preventivas y/o teraputicas disponibles. El riesgo de diseminacin de la infeccin es limitado (riesgo individual moderado, bajo riesgo a la comunidad). Ejemplo: Adenovirus, Papovavirus, entre otros. Grupo de riesgo 3 (GR3): Agentes asociados con enfermedades humanas serias o letales para las cuales podran estar disponibles medidas preventivas y/o teraputicas. El contagio entre individuos infectados es poco comn (alto riesgo individual, bajo riesgo a la comunidad). Ver listado abajo. Grupo de riesgo 4 (GR4): Agentes causantes de enfermedades humanas serias o letales para las cuales no hay medidas preventivas y/o teraputicas disponibles. El contagio entre individuos infectados se da fcilmente (alto riesgo individual, alto riesgo a la comunidad). Ver listado abajo. Listado de virus patgenos que deben ser manejados en un NB3 de acuerdo al CDC. Arbovirus Togaviridae Virus del bosque de Semliki (Alphavirus) Virus de la encefalitis equina venezolana Arenaviridae Flexal Virus de la coriomeningitis linfoctica Bunyaviridae Hantavirus Virus de la fiebre del valle de Rift Coronaviridae SARS-CoV Arbovirus Flaviviridae Virus de la encefalitis japonesa (Flavivirus) Virus de la fiebre amarilla Virus de la encefalitis de San Luis Poxviridae Virus monkeypox Retroviridae Virus de inmunodeficiencia humana tipos 1 y 2 Virus linfotrpico de clulas T humanas (HTLV) tipos 1 y 2 Virus de inmunodeficiencia del simio (SIV) Rhabdoviridae Virus de la estomatitis vesicular Listado de virus patgenos que deben ser manejados en un NB4 de acuerdo al CDC. Arenaviridae Virus Guanarito Virus Lassa Virus Junin Virus Machupo Sabia Bunyaviridae (Nairovirus) Virus de la fiebre hemorrgica de Crimea-Congo Filoviridae Virus bola Virus Marburg Flaviviridae Virus de la encefalitis japonesa (Togavirus) Virus de la fiebre amarilla Virus de la encefalitis de San Luis Herpesviridae (alpha) Herpesvirus simiae (Herpes B o virus Monkey B) Paramyxovirus Morbillivirus equino
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Agentes causantes de fiebre hemorrgica indefinidos. A su vez, se han descrito cuatro Niveles de Bioseguridad (NB) para los laboratorios, que se definen en base al agente biolgico presente y a los procedimientos que se realizan, estableciendo una combinacin de prcticas, instalaciones y equipos de proteccin. Nivel 1 (NB1): prcticas, equipo y medidas adecuadas para el nivel de enseanza. El trabajo se realiza con cepas definidas y caracterizadas de microorganismos que no causen enfermedad en humanos adultos sanos. No se necesita el uso de equipo especial de proteccin, con el equipo bsico es suficiente. Nivel 2 (NB2): prcticas, equipo y medidas adecuadas para laboratorios de anlisis, diagnstico o patologa clnica donde se manejen microorganismos de riesgo moderado que estn presentes en la comunidad y se encuentran asociados a enfermedades humanas de severidad variable. Si el procedimiento involucra generacin de aerosoles o salpicaduras, debe realizarse en una cabina de seguridad biolgica (tipo II) y utilizar centrfugas con rotores cerrados. Nivel 3 (NB3): prcticas, equipo y medidas adecuadas para laboratorios de anlisis/diagnstico clnico e investigacin donde manejen agentes conocidos o no conocidos que potencialmente puedan transmitirse por aerosol o salpicaduras y, que puedan causar una infeccin potencialmente letal. Nivel 4 (NB4): prcticas, equipo y medidas adecuadas para laboratorios de anlisis/diagnstico clnico e investigacin que involucren la manipulacin de agentes exticos peligrosos que representen un gran riesgo por causar enfermedades letales, que puedan transmitirse va aerosol y para los cuales no haya vacuna ni terapia conocida. Los laboratorios de NB3 y NB4 son de contencin por lo que se requieren barreras adicionales, acceso controlado estrictamente, renovacin de aire y filtracin del aire que sale, estricto manejo de los desechos. Es en estos laboratorios donde se trabaja con los agentes de riesgo ms elevado y aquellos responsables de enfermedades emergentes, como el SARS. En Mxico existen varios laboratorios de NB3, como el LBS3 comisin Mxico Estados Unidos para la prevencin de la fiebre aftosa y otras enfermedades exticas de los animales (CPA). No existen laboratorios de NB4 en Mxico y son pocos en el mundo. En todos los mbitos de atencin de salud humana y animal y de investigacin deben respetarse normas de Bioseguridad y realizar prcticas seguras para disminuir la potencial exposicin a riesgo de tipo biolgico. Lo observado en los informes de las infecciones laborales indica claramente cules son las vas ms comunes de exposicin: Ingestin: Pipeteo con boca. Salpicaduras en boca. Colocacin en boca de artculos o dedos contaminados. Consumo de comida en lugar de trabajo. Inoculacin: Accidentes con agujas. Cortaduras con objetos punzo cortantes. Mordedura de animales. Contaminacin de piel o mucosas: Contacto con superficies, equipo o artculos contaminados. Salpicaduras en piel intacta o no intacta (con algn tipo de lesin).
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 Salpicaduras en ojos, boca o nariz. Inhalacin: Por diversos procedimientos que producen aerosoles. De todas ellas, la generacin de aerosoles, junto con los accidentes con agujas, es una de las principales causas de infecciones adquiridas en el laboratorio. Los procedimientos ms comunes que producen aerosoles son: centrifugar, moler, mezclar, agitar vigorosamente, sonicar, abrir contenedores de material infeccioso cuya presin interna pueda ser distinta a la ambiental, inocular animales por va intranasal, colectar tejidos infectados de animales o huevos. Mxico es un gran productor de desechos biolgico infecciosos. La Organizacin Panamericana de la Salud (OPS) ha estimado que se generan 13,160 toneladas de RPBI en las 60,100 camas de hospital usadas al ao en nuestro pas. La NOM-087-ECOL-SSA1-2002, establece los requisitos para el manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI), los cuales define como aquellos materiales generados durante los servicios de atencin mdica que contengan agentes biolgicoinfecciosos y que puedan causar efectos nocivos a la salud y al ambiente. De acuerdo a esta norma, los RPBI se clasifican en: sangre, cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos, patolgicos, residuos no anatmicos y objetos punzocortantes. Cada uno de ellos debe ser identificado, envasado, almacenado, recolectado, transportado y tratado de forma particular. En un laboratorio de docencia experimental se debe envasar los residuos lquidos en recipientes hermticos rojos (sangre, residuos no anatmicos) o amarillos (patolgicos) y los residuos slidos en bolsas de polietileno rojas (cultivos y cepas de agentes infecciosos, residuos no anatmicos) o amarillas (patolgicos). En caso de desechar objetos punzocortantes debe de hacerse en recipientes rgidos de polipropileno rojo. A continuacin se detallan lo que es considerado RPBI: Muestras de sangre o sus derivados an cuando se hayan secado, as como los recipientes que los contienen o contuvieron. Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos. Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la produccin de agentes biolgicos. Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos. Los rganos, fluidos corporales y cadveres. Los objetos punzo cortantes usados.

Material que ha estado en contacto con muestras biolgicas durante el diagnstico, incluyendo navajas, lancetas, jeringas, pipetas Pasteur, agujas hipodrmicas, bisturs, cajas de Petri, cristalera entera o rota, porta y cubre objetos, tubos de ensayo y similares. Est prohibido desechar lquidos inflamables, txicos, corrosivos o material biolgico por los desages de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. En cada caso se deben seguir los procedimientos establecidos para la gestin de residuos.

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BIBLIOGRAFA Humberto H.L.V., Nilda V.A.N., Cristina R.P., 2007.Laboratorios de bioseguridad nivel 3 y 4: Investigacin de patgenos peligrosos. Rev Mex Patol Clin 54 (4): 177186. Humberto H.L.V., Nilda V.A.N., Cristina R.P., 2008. Bioseguridad en el laboratorio: medidas importantes para el trabajo seguro. Bioquimia 33 (2): 59-70 Susana Fink (Editorial). 2010 Bioseguridad: una responsabilidad del investigador. MEDICINA 70 (3): 299-302. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental Salud ambiental - Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo.

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CALENDARIZACIN DE PRCTICAS

ASIGNATURA ______VIROLOGIA_____________________________________________ GRUPO(S) ___________________________________ SEMESTRE _2012-II CARRERA_M.V.Z.

SEMANA No.

FECHA (SEMANAL)

NOMBRE DE LA PRCTICA, PROYECTO Y/O ACTIVIDAD

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Presentacin y forma de trabajo I. Material y Equipo utilizado en el laboratorio de virologa. Lavado de material

II. Coleccin y envo de muestras para el diagnstico viral III. Inoculacin en embriones de pollo IV. Cultivo celular (1 parte)

III. Inoculacin en embriones de pollo IV. Cultivo celular (2 parte)

IV. Inoculacin de animales laboratorio (1 y 2 parte) 1 EXAMEN PARCIAL VI. Microscopia electrnica

de

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VII Pruebas de diagnstico viral: a) Deteccin de anticuerpos (Ensayo Inmuno Enzimtico y/o Inmunodifusin en Agar Gel). b) Deteccin de Antgenos Virales (Electroforesis en Geles de Poliacrilamida). 2 EXAMEN Parcial VIII Hemoaglutinacin VIII. Inhibicin de la Hemoaglutinacin 3 EXAMEN FINAL
Entrega de Calificaciones ltima Semana de Clases

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SEMANA No. 7 11 14

FECHA (SEMANAL)

EXAMEN

1er. Examen parcial 2do. Examen parcial 3er. Examen Final

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PRCTICA 1 Material y Equipo Utilizado en el Laboratorio de Virologa. INTRODUCCIN La seleccin y uso adecuado del material del laboratorio es fundamental para el xito del experimento y trabajo de laboratorio. La eficiencia del trabajo exige disponer del material adecuado en cantidad y calidad, tenerlo en buenas condiciones, convenientemente preparado e identificado y bien ordenado para poder usarlo inmediatamente en cualquier momento, aunque actualmente el uso de material desechable se ha incrementado. El lavado de material empleado en cultivo celular, es uno de los procesos en los que se debe exigir el mayor esmero, ya que las superficies de cristal pueden estar limpias, pero habitualmente son inadecuadas para los mtodos de cultivo celulares. El material debe ser de buena calidad, ya que la toxicidad del vidrio, impide el crecimiento celular. A menudo las clulas se dividen abundantemente en ciertas reas de la superficie de cristal y mueren en reas vecinas, a veces las reas txicas no afectan a las clulas hasta que se adhieren y comienzan a dividirse. Gran parte de las tcnicas requieren de material estril por lo que deben observarse precauciones de asepsia en el manejo del mismo para evitar contaminaciones. Todo material debe esterilizarse inmediatamente despus de su empleo, para que pueda ser manipulado sin riesgo para su uso posterior. LAVADO DE MATERIAL Existen diferentes trenes de lavado para el material de virologa y de igual manera tratamientos particulares dependiendo del tipo de material a utilizar (ej. Si es nuevo, sucio, contaminado etc.). Detergentes ms empleados Extran, Stergene, 7X, Microsolve y Decon 25. lcalis: Jabn suave, Trifosfato de Sodio, Carbonato de Sodio, Metasilicato de Sodio. ESTERILIZACIN DE MATERIAL La esterilizacin del material se puede llevar a cabo principalmente por dos mtodos: FSICOS. o Calor hmedo (autoclave): En general 15 libras de presin, 120 C. durante 15 minutos. Este tipo de esterilizacin se utiliza para material resistente a esta temperatura.
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o Calor seco (horno Pasteur): General 170 C durante 2 horas. Este tipo de esterilizacin se utiliza para material de vidrio. Tambin se emplea la incineracin (animales muertos) y flama directa (rea de trabajo). o Radiaciones: Utilizando luz ultravioleta o rayos gamma por 24 horas. Esencialmente utilizado para material de plstico. o Filtracin: Principalmente para material y soluciones lbiles al calor. QUMICOS. o xido de etileno. OBJETIVOS Familiarizar al estudiante con el material y equipo utilizado en el laboratorio de virologa veterinaria Adiestrar al estudiante en el manejo, cuidado y preparacin del material que se utiliza en el laboratorio de virologa veterinaria. Prctica Tren de lavado Material por Equipo Pipetas graduadas Matraz Erlenmeyer Cajas y tubos para cultivo Jeringas Cajas de Petri Vasos de precipitados Papel estraza Franela Alcohol al 70% Marcador indeleble Material y Equipo por Grupo Agua con Extrn Agua destilada Agua desmineralizada Horno Pasteur
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 Autoclave Masking Tape Escobillones Servitoallas Jabn lquido para manos

PROCEDIMIENTO

I. II.

Previo tratamiento de inactivacin del material que se utilizar, se iniciara el tren de lavado. Sumergir el material de vidrio (exclusivamente) que este manchado en solucin crmica (dicromato de Potasio y cido clorhdrico), dejar el material en estas condiciones entre 24 a 48 horas. Sacar el material y enjuagar exhaustivamente con agua corriente. Escurrir el exceso de agua. Tallar con escobilln y sumergir en un recipiente que contenga detergente no inico (Extran), dejar el material en estas condiciones entre 5 a 10 minutos. Sacar el material y enjuagar exhaustivamente con agua corriente. Escurrir el exceso de agua. Tallar con escobilln y enjuagar en un recipiente que contenga agua destilada. Escurrir el exceso de agua. Tallar con escobilln y enjuagar en un recipiente que contenga agua desmineralizada o desionizada. Escurrir el exceso de agua. Preparar el material para esterilizacin de acuerdo a las instrucciones del profesor.

III. IV. V.

VI. VII. VIII. IX. X.

XI. XII.

BIBLIOGRAFA Ian F.R. Culture of animal cells, a manual of basic technique. 2da edition. Ed. A John Wiley & Sons, INC., Publication. 1987. Coll M.J. Tcnicas de diagnstico en Virologa. Ed. Diaz de Santos S.A. 1993.

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PRCTICA 2 Coleccin y Envo de Muestras para el Diagnstico Viral

INTRODUCCIN La importancia de la coleccin y envo de muestras adecuadas, radica en poder demostrar principalmente el efecto y/o la presencia de partculas virales. El diagnstico de laboratorio detecta la presencia de un virus en un organismo cuando se manifiesta en general por alguna alteracin del mismo (ya sea por enfermedad natural o por infeccin experimental). Los virus en sus estadios extracelulares son metablicamente inactivos, no se multiplican, por esto cuando se sospecha de la presencia de un virus en un determinado material biolgico se deben buscar las condiciones apropiadas (animal susceptible, va de inoculacin, etc.) para que el virus produzca algn cambio en el husped de tal forma que permita su identificacin. En la mayor parte de los casos no se usa para el diagnstico el husped natural (cuando se trata de animales grandes). El aislamiento viral se realiza inoculando la muestra en animales susceptibles, huevos embrionados o cultivos celulares, donde el virus se replicar produciendo generalmente algn cambio patolgico. El posible aislamiento del virus depende de muchos factores: La atencin del veterinario para la coleccin de muestras en el momento adecuado, que es cuando los animales muestran los primeros signos clnicos y los virus estn presentes en gran concentracin. La seleccin correcta de la muestra, su transporte hacia el laboratorio, el medio de conservacin y el uso de cultivos celulares apropiados o sistema de crecimiento viral, lo cual aumenta substancialmente las posibilidades de aislar al virus presente. FACTORES QUE AYUDAN A UN AISLAMIENTO CORRECTO Normas generales: Para la adecuada recoleccin, conservacin y envo de muestras es indispensable tener presente las siguientes normas: Toda muestra debe ser remitida perfectamente identificada y con su historia clnica completa. Las muestras ideales se obtienen de animales vivos en distintos estadios de la enfermedad. Si se requiere aislar al agente, la toma ideal debe realizarse en el momento en que se supone que la concentracin de virus es mxima, es decir, en la fase inicial de la enfermedad, antes de que haya produccin de anticuerpos y disminuya la cantidad de virus presente. Si es necesaria la necropsia, sta debe guardar un orden y metodologa adecuada, adems debe realizarse en el menor tiempo posible despus de la muerte del animal.
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 Para la recoleccin de cualquier tipo de muestra, utilizar material limpio, seco y de preferencia estril. Los envases utilizados para el envo de muestras deben ser en lo posible irrompibles, hermticos y de dimensiones adecuadas, el tiempo entre la obtencin de la muestra y su llegada al laboratorio no deber ser superior a 24 horas.

TOMA Y REMISIN DE MUESTRAS El momento adecuado es siempre lo antes posible luego del estado virmico o de la manifestacin de signos clnicos, los virus se encuentran generalmente en concentracin mxima en ese momento y disminuyen, en ocasiones muy rpidamente, a los pocos das. Las muestras tomadas como ltimo recurso despus de varios das o semanas de tratamiento ineficaz con una terapia de antibiticos elegida empricamente son en general una prdida de tiempo y gasto innecesario. Las muestras deben ser tomadas evitando contaminaciones bacterianas y colocadas inmediatamente en un frasco estril que contenga un lquido protector (glicerina "buffer" fosfato pH 7,2 estril). Cuando la temperatura es moderada y el tiempo de transporte hasta el laboratorio es inferior a un da, se puede utilizar para conservar la muestra hielo (temperatura de 4 C). Si es verano y el tiempo de transporte supera las 24 hrs., se puede utilizar hielo seco (-70 C), aunque tambin es posible usar hielo comn y cambiarlo durante el transporte.

PREPARACIN DE MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL La preparacin de las muestras depender de su naturaleza y de los fines que se persigan. Las heces se suspenden al 20% en solucin salina bufferada (SSB) (cuando son de consistencia normal) y se centrifugan obtenindose el sobrenadante. Las muestras de exudado nasal se toman con hisopos estriles contenidos en tubos con 2 ml. de SSB y antibitico, luego se comprime el algodn contra las paredes del tubo y el lquido se centrifuga a 2.500 r.pm. por 10 min. Al sobrenadante obtenido se le agrega antibitico. Los tejidos con lesiones y los materiales de necropsia se maceran con mortero estril, se diluyen en SSB, o caldo triptosa fosfato y se centrifuga. El sobrenadante ser el inculo viral por lo tanto debe ser manejado en condiciones estrictas de esterilidad. TROPISMOS El tropismo se puede definir como la afinidad que tienen los virus por un rgano o tejido. La clase o tipo de muestra a colectar depender de la enfermedad o signos que presente el husped. En caso postmortem se colectan aquellos tejidos por los que el virus muestra predileccin.
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Virus Neurotrpicos: Cerebro, mdula espinal etc. Ej.: Rabia, Encefalomielitis Ovina, Encefalitis Equina Venezolana, Encefalitis Equina del Este, Encefalitis Equina del Oeste, Encefalitis de San Luis, Virus del Oeste del Nilo (West Nile). Virus Dermotrpicos: Piel. Ej. : Viruela del pichn, del canario, de la gallina, del pavo, del cerdo, ovina y caprina, Ectima contagiosa, vaccinia, papilomatosis oral canina, papilomatosis bovina, estomatitis vesicular, virus del mixoma del conejo. Virus Neumotrpicos: Pulmn, lquido pleural etc. Ej. : Influenza aviar (de baja patogenicidad), Influenza porcina, Influenza equina, Virus respiratorio sincitial, Parainfluenza, Virus de la bronquitis infecciosa aviar. Calicivirus felino, Laringotraqueitis infecciosa aviar. Virus Pantotrpicos. Hgado, bazo, pulmn, rin etc. Ej.: Fiebre porcina clsica, Fiebre porcina africana, Distemper canino, Fiebre catarral maligna, Rinotraqueitis infecciosa bovina, Influenza aviar (de alta patogenicidad). Virus Enterotrpicos: Aparato digestivo. Ej.: Rotavirus, Astrovirus, Diarrea viral bovina, Adenovirus, Enterovirus, Parvovirus canino, Panleucopenia viral felina.

MUESTRAS PARA HISTOPATOLOGA Los tejidos para examen histopatolgico deben obtenerse en trmino de pocas horas, ya que en caso contrario los virus pueden ser destruidos por desecacin, inactivacin trmica, muerte celular o descomposicin bacteriana. Adems, debern ser colectados en forma asptica tomando todo tipo de precauciones. Pueden ser colectadas en tarros, bolsas de plstico, tubos estriles de boca ancha, frascos con rosca, etc. NUNCA DEBEN SER CONGELADOS ANTES DE LA FIJACIN. El material de biopsia o necropsia se coloca en una solucin fijadora tan pronto como sea posible, la Formalina Fosfatada Buferada al 10% es un buen fijador para propsitos generales. Las muestras de los diversos rganos deben ser cortadas a menos de un centmetro de espesor (con tamao no mayor de 3 x 3 cm) y deben colocarse inmediatamente en 10 veces su volumen en solucin de Formalina al 10%. Los tejidos se deben dejar en este fijador agitndolos de vez en cuando. La muestra tomada para examen debe ser representativa de la lesin y si es posible debe incluirse parte de los tejidos vecinos aparentemente normales. Deben enviarse muestras de todos los rganos. Siempre es conveniente congelar y guardar parte del rgano, de tal forma que puedan llevarse a cabo pruebas ulteriores en espera de los resultados del examen de histopatologa. SUERO El suero debe manipularse por mtodos aspticos ya que la presencia de microorganismos contaminantes lo hace un material inadecuado. Este se puede guardar durante cortos perodos a 4 C y luego ser usado. Por el hecho que tiene sustancias neutralizantes termolbiles, debe ser conservado en tubos con tapa o rosca o utilizar
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tubos eppendorf y guardarlos durante largos perodos a -20 C o a temperaturas inferiores.

HECES Las muestras tomadas con hisopos a pesar de estar contaminadas deben manipularse en forma asptica con el fin de no introducirles otros contaminantes y de exponer al personal de laboratorio innecesariamente; en caso de contenido intestinal, s es posible adicionarle antimicrobianos y antimicticos (Penicilina, Estreptomicina y anfotericina B). Las heces se congelarn a -20 C o sern refrigeradas para diagnstico virolgico; los hisopos rectales son refrigerados a 4 C. Para tomar muestras de heces, se toma una bolsa de polietileno a modo de guante y se introduce el dedo ndice en el recto del animal a muestrear, estimulando la defecacin. Cuando se obtiene el volumen de materia fecal deseado se voltea la bolsa de polietileno se cierra tratando de evacuar el aire y finalmente se rotula. Es una muestra ideal para enfermedades virales gastroentricas ocasionadas por rotavirus, astrovirus, parvovirus, adenovirus y otros. FLUIDOS El material fluido como lavados farngeos, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, leche, secreciones y/o exudados (en enfermedades vesiculares) deben ponerse en recipientes estriles y refrigerarse inmediatamente. Para evitar el desecamiento de torundas, stas debern permanecer en un tubo que contenga un medio de transporte. El medio de transporte para virus consiste en solucin salina amortiguada adicionada con protenas (gelatina al 0.5%, albmina o suero fetal bovino al 2%) para proteger al virus contra la inactivacin, y antibiticos y antimicoticos (Vancomicina, Anfotericina B y Colistin) para prevenir la multiplicacin de bacterias y levaduras. Otros medios de transporte que se pueden utilizar son: Medio de transporte de Stuart, solucin salina balanceada de Hanks y Medio Liebowitz-Emory. ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS. Una vez en el laboratorio, las muestras se guardan preferiblemente en congeladores a -70 C. Un buen nmero de virus pueden preservarse en congeladores a 20 -25 C. Los virus que no tienen envoltura como los adenovirus y enterovirus sobreviven muy bien a los procesos de congelacin con una mnima prdida del ttulo viral, a diferencia de los virus envueltos que con un solo ciclo de congelacindescongelacin puede disminuir el titulo hasta 100 veces; por ello es importante utilizar protenas como crioprotectores.

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TABLA I: Muestras apropiadas para el diagnstico de laboratorio en varios sndromes clnicos. Enfermedad Animal vivo Hisopo nasal, nasofarngea, orofarngea, lavados nasales o bronquiales, aspirados traqueales, biopsias, conjuntival y sangre. Raspado de la lesin, hisopo del rea afectada y sangre. Postmortem

Enfermedad respiratoria y ocular

Tejidos de sistemas afectados, ganglio linftico.

Enfermedad cutnea y de membranas mucosas

Tejidos de sistemas afectados, ganglio linftico. Tejidos de sistemas afectados, ganglio linftico y contenido intestinal. Tejidos de varios rganos

Gastroenteritis

Heces y sangre

Enfermedad sistmica

Sangre, hisopos nasales, urogenitales y heces Sangre, lquido cefalorraqudeo, heces, hisopos nasales y urogenitales. Hisopos urogenitales, orina y sangre Sangre de las hembras y moco vaginal.

Enfermedad del S.N.C.

Tejidos de sistemas afectados, ganglios linfticos.

Enfermedad del aparato urinario

Tejidos de sistemas afectados, ganglios linfticos. Tejido del feto y placenta, sangre del corazn, contenido intestinal.

Aborto

IDENTIFICACIN DE LAS MUESTRAS La identificacin de las muestras es de primordial importancia para el laboratorio; se puede llevar a cabo mediante el uso de tela adhesiva o etiquetas auto adheribles y deben estar acompaadas de la siguiente informacin: HISTORIA CLNICA: Nombre, direccin, telfono, fax y correo electrnico del mdico veterinario. Nombre, direccin, telfono, fax y correo electrnico del propietario. Nombre de la explotacin pecuaria y tipo.
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 Ubicacin completa. Especie, raza, sexo y edad del animal. Identificacin o nombre del animal. Nmero de animales en la explotacin. Porcentaje de morbilidad y mortalidad y antecedentes sanitarios. Signos clnicos. Tiempo de evolucin de la enfermedad. Tratamiento efectuado. Vacunas aplicadas (nmero y fecha). En caso de necropsia, descripcin de hallazgos macroscpicos. Tipos de muestras, fecha y hora de la toma. Sistema de conservacin utilizado. Diagnstico clnico y presuntivo. Prueba o pruebas particulares que se solicitan. Observaciones. ENVO DE MUESTRAS AL LABORATORIO Considerando que las muestras biolgicas son potencialmente infecciosas, se recomienda el trasporte de manera adecuada y responsable, para lo cual se deben seguir las siguientes recomendaciones mnimas: Como medio ideal de conservacin, se utiliza la refrigeracin con hielo natural, hielo seco o gel refrigerante en fundas hermticas. La totalidad de las muestras recolectadas deben enviarse utilizando un sistema de empaque de doble caja. La caja interna, preferentemente debe ser de un material aislante de la temperatura externa, siendo las ms recomendadas las cajas de espuma flex (icopor) por su bajo peso y fcil manipulacin. Las muestras debern ser enviadas en recipientes individuales y bien identificadas. Entre cada funda, frasco o recipiente se coloca un material que amortige los golpes,

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que logre mantener fijas las muestras y absorba la humedad (papel, aserrn, etc.); puede usarse tambin espumaflex para este fin. La informacin bsica que acompaa las muestras se enva debidamente protegida, dentro de un sobre y en funda plstica, entre la caja interna y la externa. La caja externa se cierra de tal manera que todas las esquinas y/o tapas queden selladas con cinta adhesiva (aumenta la resistencia de la caja y garantiza el aislamiento de las muestras). Si las condiciones lo permiten, envolver la caja externa con papel de empaque, sellar con cinta adhesiva y colocar con letra grande y clara: Manjese con cuidado!, Material biolgico infeccioso y refrigerado!, Tratamiento urgente! etc. o colocarlos dentro de contenedores especiales rotulados con el emblema universal de residuos peligrosos biolgico infecciosos.

Igualmente, pero de manera menos relevante anotar la direccin del laboratorio. Las muestras deben llegar lo ms pronto posible al laboratorio, las que han sido sometidas a refrigeracin deben llegar de preferencia dentro de las primeras 24 horas post-extraccin. El medio ms eficaz y seguro para el envo de muestras al laboratorio es el mensajero directo, en algunas condiciones se requiere del servicio por mensajera. No es recomendable enviar muestras los fines de semana, perodos cercanos a vacaciones, das festivos y horas no hbiles ya que se corre el riesgo de que las muestras no se reciban, no se trabajen o se haga un mal procesamiento de ellas. Si esto no puede evitarse se debe llegar antes a un acuerdo previo con el laboratorio. La obtencin de las muestras debe hacerse por un mdico veterinario o bajo su direccin. OBJETIVO Mostrar al estudiante la forma correcta e indicada para colectar y enviar una muestra a un laboratorio de diagnstico viral, con base a su tropismo. Prctica Toma de muestras Material por equipo Animal domstico Jeringa de 1 o 3ml. Torundas de algodn con alcohol
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 Tubo de ensaye c/s SSF Tubo c/s anticoagulante Portaobjetos Hisopos Ligadura Marcador indeleble Guantes de exploracin (por alumno) Material y Equipo por Grupo Masking Tape Centrfuga Refrigerador Balanza Bolsas de residuos biolgico infecciosos roja y amarilla Recipiente para punzocortantes PROCEDIMIENTO: variable segn especie animal con la que se trabaje. DISPOSICIN FINAL DE DESECHOS BIOLGICOS Inspeccionar e identificar el material biolgico para clasificarlo de acuerdo a su origen y tipo segn la tabla anexa. Tipo de residuos Sangre Cultivos celulares y virus Residuos no anatmicos derivados de la prctica Lquidos Slidos Patolgicos (cadveres, fluidos y rganos, embriones de pollo Objetos punzo cortantes: agujas hipodrmicas , porta y cubre objetos, y cristalera Lquidos Slidos Estado fsico Slidos Envasado Bolsa de plstico Recipientes hermticos Bolsa de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos Color Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo

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El material de cristalera utilizado durante la prctica como son tubos, matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI sern inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y esterilizados. BIBLIOGRAFA http://iicasaninet.net/laborat/Muestras.htm. Toma y envo de muestras al laboratorio. Granoff A and Webster RG. Encyclopedia of virology. 2 Edition, vol 1,2 y 3. Academic Press. 1999. Mohanty/Dutta. Virologa veterinaria. Ed. Interamericana, 1983. Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. Veterinary virology, 3er Ed. Academic Press, 1999.

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PRCTICA 3 Microscopia Electrnica.

INTRODUCCIN Tanto el electrn como el fotn tienen propiedades muy semejantes, al ser partculas asociadas a una onda electromagntica y puesto que un objeto se ve gracias a los fotones que enva, tambin se puede observar bombardendolo de electrones. La luz visible tiene una gran longitud de onda lo que causa el fenmeno de difraccin, esto impide distinguir 2 puntos separados por menos de 4 diezmilsimas de milmetro. Los rayos ultravioleta permiten obtener aumentos del orden de 1500 veces, por tener menor longitud de onda, y el haz de electrones, al tener una longitud de onda mas corta proporciona ampliaciones superiores. La longitud de onda asociada al movimiento rpido de los electrones es 100,000 veces menor que de las radiaciones luminosas, lo que se traduce en aumentos del orden de 100,000X o ms. Las diferencias entre el microscopio ptico y el microscopio electrnico se basan en las caractersticas propias del electrn. Estos son partculas negativas cuyos ases no pueden atravesar el aire y el cristal como lo hace la luz, por lo que no pueden impresionar la retina. Estos inconvenientes se solucionan aplicando vaci en el interior del aparato, con el fin de que las molculas del aire no constituyan un obstculo para los electrones; las lentes pticas de cristal son reemplazadas por lentes electromagnticas y el haz de electrones forma una imagen en una pantalla fluorescente o tambin sobre una emulsin sensible para la obtencin de fotografas de la imagen. Tipos de Microscopios Electrnicos: Existen dos tipos principales de microscopios electrnicos: Microscopio electrnico de transmisin (MET): Se lanza un rayo de electrones a travs de la muestra del cual se obtienen imgenes bidimensionales similares ha radiografas, en las cuales se puede identificar algunas caractersticas estructurales y de tamao. Microscopio electrnico de barrido (MEB): Se bombardea la superficie de la muestra generndose electrones secundarios de los cual se obtienen imgenes tridimensionales, en las cuales se puede identificar caractersticas estructurales, adems de informacin sobre la composicin de las muestras estudiadas. Usos: Investigacin: Ayuda a conocer la estructura viral, adems de su composicin. Diagnostico: Identifica partculas virales directamente en las muestras.
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Toma y Envi de muestras: Se deben seguir los mismos procedimientos de toma y envo de muestras que generalmente se utilizan para el laboratorio de virologa. Pero los mtodos de conservacin son diferentes, ya que en este caso se puede utilizar la congelacin (-200 C) o se utiliza glutaraldehido, tetracloruro de osmio o acrolena como conservadores qumicos que no altera las estructuras proteicas (Precaucin, son altamente txicos). Las muestras que se pueden enviar son: Lesiones vesiculares y costras. Heces. Secreciones respiratorias. Sangre y suero. Exudados y trasudados. Lquido cefalorraqudeo. Tejidos. Cultivos celulares. Procesamiento general de la muestra. Muestras de tejidos: Se selecciona el rea lesionada mediante tcnicas histopatolgicas, posteriormente se deshidrata el tejido y se embebe en resina epoxy, para formar un pellet, mediante un ultramicrotomo se realizan cortes finos de 500nm de grosor, se colocan en una rejilla de cobre o platino y se sigue el procedimiento de tincin. Una tcnica alterna es mediante la congelacin del cubo de tejido y la realizacin de cortes ultrafinos, para posteriormente seguir un procedimiento de tincin. Muestras liquidas: Se centrifugan a 60,000 -100,000 rpm mediante una ultracentrfuga para concentrar las partculas virales, formndose un pellet en el fondo del tubo, se retira el sobrenadante, y se agrega agua destilada, volviendo a suspender el pellet, posteriormente se vuelve a centrifugar. Se toma una gota del pellet y se coloca en una rejilla de cobre o platino recubierta de colodin. Se tie y se observa al microscopio. Muestras de heces: A una pequea cantidad de heces se le agrega agua destilada y se homogeniza, posteriormente se sigue el mismo procedimiento para muestras liquidas. Tcnica de inclusin de muestras en resina Fijacin con glutaraldehido. Lavado con solucin buffer. Postfijacin con Tetroxido de osmio al 1%, 90 minutos. Lavado con solucin buffer. Deshidratacin mediante alcoholes progresivos. Alcohol al 50%, 3 minutos; Alcohol al 60%, 3 minutos; Alcohol al 70%, 3 minutos; Alcohol al 80%, 3 minutos; Alcohol al 100%, 15 minutos (repitiendo este paso 3 veces con cambios de alcohol).
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 Infiltracin de la muestra. Se sumerge la muestra en oxido de propileno por 10 minutos, repitiendo este paso 3 veces con cambios de la solucin. Posteriormente se sumerge la muestra en una solucin de oxido de propileno y resina en relacin 2:1, durante 60 minutos; se realiza un segundo paso sumergiendo la muestra en una solucin de oxido de propileno y resina en una relacin 1:1. Para la preinclusin, se coloca la muestra destapada un da antes en la campana de deshidratacin para que evapore el oxido de propileno; a la muestra se le retira el exceso de resina. Las muestras se colocan en papel aluminio y se meten al horno a 60C una hora adicionndoles resina pura; posteriormente, este paso se vuelve a repetir recambiando la resina. Para la inclusin se colocan las muestras en cpsulas de gelatina y se llenan con resina colocndolas en el horno a 60C por 24 horas. Posteriormente se realizan cortes semifinos y se tien con azul de toluidina para elegir la zona de inters y enseguida se realizan cortes finos montndolos en rejillas de cobre para observarse al microscopio electrnico. Tcnicas de tincin: Tincin negativa: Las partculas virales no dispersan los electrones lo suficiente como para ser visible al microscopio electrnico, por lo que se utilizan metales pesado como el acetato de uranilo, cido fosfotungstico o molibdato de amonio entre otros, para dar un fondo electrn-opaco mediante el cual se pueden visualizar las partculas. Obtenindose imgenes bidimensionales, que evidencian la estructura del virus. Imbibicin con oro: La muestra es sometida mediante cargas elctricas a un aerosol formado de oro coloidal. El cual se sedimenta en la superficie de la muestra y se cristaliza. Posteriormente se observa en el MEB. Crofractura: La muestra se congela y luego el bloque congelado se fractura con una cuchilla quedando expuestas varias superficies externas e internas de la muestra. Estas superficies se pueden teir mediante tincin negativa o con oro coloidal. Inmunoelectroqumica: Se utilizan anticuerpos marcados con oro o con peroxidasa, que tambin es electrn-opaca, estos se ponen a reaccionar con la muestra donde se unirn especficamente con los antgenos deseados y al observarlos en el MET se observaran reas sombreadas.

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OBJETIVO El alumno reconocer los tipos de microscopios electrnicos que se utilizan y su diferencia con el microscopio ptico, as como algunas tcnicas de procesamiento de muestras para el diagnstico ultramicroscpico viral.

BIBLIOGRAFA Ingraham J.L., Ingraham C.A., Prentiss H. Introduccin a la microbiologa. Editorial Reverte S.A. Espaa 1998. Mahy B.W.J., Kangro H.O. Virology methods manual. Ed. Academic Press Inc. E.U.A. 1996. Specter S., Lanez G.J. Clinical virology manual. Ed. Elsevier Science Publishing Company Inc. E.U.A. 1990. Stainer R.Y., Ingraham J.L., Wheelis M.L., Painter P.R. Microbiologa. 2da. Edicin. Editorial Reverte S.A. Espaa, 1996.

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PRCTICA 4 Inoculacin de Animales de Laboratorio INTRODUCCIN En nuestros das la experimentacin cientfica en sus aspectos bsicos y aplicados ha aumentado la necesidad de utilizar animales para su realizacin. Esta experimentacin muchas veces no sera posible realizarla en ausencia de los animales de laboratorio. Tanto la prueba de nuevas drogas antivirales, como las terapias alternativas para diferentes enfermedades son ensayadas en modelos biolgicos, as como tambin la elaboracin de vacunas , comienzan con ensayos en cultivo de clulas y finalizan en el empleo de modelos animales de la especie adecuada para el problema que se quiere resolver. Los modelos animales, permiten estudiar y comprender el origen de ciertas enfermedades, as como analizar el mecanismo de innumerables procesos biolgicos. La inoculacin de animales susceptibles fue el primer procedimiento empleado para el cultivo de virus. Este mtodo ha sido sustituido en parte por el cultivo del embrin de pollo o por cultivos celulares, pero an este tiene la ventaja de que permite estudios clnicos de la enfermedad. IMPORTANCIA La utilizacin de animales de laboratorio permiti que se desarrollaran, por ejemplo, las vacunas para la rabia, ntrax, viruela, ttanos, difteria y poliomielitis, adems de la obtencin de la insulina y diversos antibiticos y la dilucidacin de la estructura del ADN. Los avances de la investigacin en cncer, cardiologa, trasplantes de rganos, SIDA y la enfermedad de Alzheimer, pueden ser tambin atribuidos en gran parte a los estudios realizados en animales de laboratorio. La experimentacin con animales es fundamental en las ciencias biomdicas, no solo para comprender los mecanismos celulares que son la base de la vida, sino tambin para favorecer el desarrollo de mejores mtodos de prevencin, diagnstico y tratamiento de las enfermedades que afectan al ser humano y a los animales. El uso en el laboratorio de animales de experimentacin es tambin indispensable para las pruebas de potencia, alcance y seguridad de sustancias biolgicas utilizadas en medicina y para la determinacin de la toxicidad de un gran nmero de compuestos que se preparan por sntesis qumica y cuyo uso puede representar un riesgo para la salud. Los animales constituyen un excelente sistema para el aislamiento de algunos virus que no se replican ni en cultivos de clulas ni en embriones de pollo, as como tambin para el estudio de la patogenia de las infecciones vrales. Tambin proporciona rganos y tejidos para la preparacin de cultivos celulares.
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FACTORES QUE SE DEBEN TOMAR EN CUENTA AL UTILIZAR ANIMALES DE LABORATORIO: 1.- Que sea apropiado y que permita la transferencia de la informacin. 2.- Costo, disponibilidad y alojamiento. 3.- Generalizacin de los resultados. 4.- Facilidad y adaptabilidad a la manipulacin experimental. 5.- Nmero de animales necesarios para realizar el experimento. 6.- Tiempo de vida. 7.- Sexo, edad y progenie necesarias. 8.- Especie, gentica, susceptibilidad y raza. 9.- Considerar la posibilidad de una proteccin con anticuerpos maternos o de una incompetencia inmunolgica. 10.- Consecuencias ecolgicas e implicaciones ticas del uso de los mismos.

ALGUNOS DE LOS INCONVENIENTES DEL EMPLEO DE ANIMALES SON: 1. Su elevado costo. 2. La limitacin del espacio para jaulas y materiales. 3. La infeccin cruzada entre los animales. 4. Riesgo de infeccin en el laboratorio de otros animales y del hombre que los cuida. 5. infeccin latente. 6. Falta de respuesta inmune. 7.- El husped natural es sin duda, el ideal para propagar y estudiar a los virus pero esto no es prctico ni posible, cuando ste es el hombre o los animales de gran talla. ANIMALES DE LABORATORIO CLASIFICACIN AXENICOS: Son aquellos que se obtienen a partir de cesrea, la lactacin y alimentacin se realiza de manera estril, no presentan ningn tipo de flora en su organismo. GNOTOBITICO O GENOTOBITICO: Son aquellos que previamente fueron axnicos slo que se le inocula a su flora 1 o 2 microorganismos conocidos, se mantienen de manera controlada. LIBRES DE PATGENOS ESPECFICOS (SPF): Nacen de forma natural, presentan flora normal, pero son mantenidos de manera controlada y no presentan ningn tipo de microorganismos causantes de enfermedad.
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 Ratones Los ratones son entre los animales de laboratorio, los ms empleados para la experimentacin biomdica. El ratn lactante (menos de 48 horas de edad) y adulto se utiliza para el aislamiento viral, principalmente para virus miembros del grupo Coxsackie, Herpesvirus, Arbovirus y Reovirus. Conejos Se utilizan para la preparacin de sueros hiperinmunes fundamentalmente, as como para el diagnstico de: Pseudorrabia, Rabia y Viruela de Mamferos. Cobayos Son muy importantes en el campo de la nutricin. Tambin son utilizados para el aislamiento viral, obtencin de suero, tejidos para cultivo de clulas, como fuente de complemento. Adems para la propagacin de enfermedades neumotrpicas como Influenza, enfermedades vesiculares de los animales domsticos y rickettsias. Hmster Se utilizan para diagnstico de enfermedades neurotrpicas y como fuente de tejidos para cultivos celulares. Aves Los pollos se utilizan para inoculaciones peculiares de la especie y para suministrar glbulos rojos para la reaccin de hemoaglutinacin, preparacin de sueros hiperinmunes y como fuente de tejido para cultivo celular. Primates El uso de estos animales fue decisivo para lograr la vacuna de la poliomielitis (cultivos primarios de rin y pruebas de neurovirulencia) y tambin para comprender los fenmenos de compatibilidad sangunea; otras enfermedades que involucran estudios con primates son la malaria, sarampin, hepatitis y las enfermedades cardacas. Por su parentesco con el hombre, los primates son utilizados habitualmente en las ltimas etapas del ensayo de nuevas terapias. Perros y gatos Estos animales representan menos de 1% de los animales utilizados en investigacin; los primeros se usaron para el desarrollo de la vacuna de parvovirus canino y en ellos se realiz el primer trasplante exitoso de rin. En los gatos se realizaron estudios del mecanismo de la visin y de las inmunodeficiencias (patologa presente en el SIDA) y se desarrollo la vacuna contra leucemia felina. Para el estudio del SIDA se ha demostrado que la inoculacin del virus de inmunodeficiencia felina en gatos es un mejor modelo para el estudio de la enfermedad que el desarrollado en primates.
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VAS DE INOCULACIN La va de inoculacin depende del virus estudiado y su posible tropismo. Las vas de inoculacin ms comnmente utilizadas son: Intracerebral. Intravenosa. Oral. Intranasal. Intraperitoneal. Intramuscular. Subcutnea. Escarificacin. Ocular.

OBSERVACIONES DESPUS DE LA INOCULACIN. Despus de la inoculacin; diariamente deben examinarse los animales para estudiar todo signo de infeccin y comprobar la duracin del perodo de incubacin. Para las enfermedades neurotrpicas es recomendable un perodo de 3 - 4 semanas y de 1 semana para las enfermedades neumotrpicas. En los animales que mueran en el transcurso del perodo de observacin se deber realizar la necropsia y tomar las muestras correspondientes. TITULACIN DE LA INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS Toda investigacin debe contar con mtodos confiables para la medicin de las propiedades de los virus, la infectividad es la propiedad que ms nos interesa. La concentracin de viriones infectantes de una suspensin puede titularse utilizando diluciones decrecientes del material infeccioso a un determinado nmero de hospedadores susceptibles (cultivos celulares, embriones de pollos, animales de laboratorio u hospedador natural), observndolos para ver si hay evidencia de replicacin viral. La titulacin de los virus se mide determinando la capacidad de producir un efecto dado, por ejemplo: muerte del animal, efectos citopticos, hemoaglutinacin, etc. Para calcular el nmero de partculas infecciosas de la suspensin viral, se aplica el mtodo del Punto Final (PF). El PF es la dilucin del virus que mata, infecta, causa parlisis etc. al 50% de la poblacin husped. De esta manera se pretende ser ms exacto, ya que con una dilucin determinada de virus encontramos que muere el 50% de los animales inoculados El ttulo de infectividad de la suspensin original de virus es el nmero de Dosis Letales 50% o Dosis Infectantes 50% por volumen inoculado. Las dosis difieren en los distintos hospedadores por lo que es preciso hacer referencia al sistema hospedador empleado, por ejemplo: DI 50%: Dosis Infectante al 50%, aplicable a sistemas de unidad bsica.
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DICC 50%: Dosis Infectante en Cultivo Celular al 50%, aplicable en cultivo celular. DIEP 50%: Dosis Infectante en Embrin de Pollo, aplicable en huevos embrionados. DLEP 50%: Dosis Letal en Embriones de Pollo al 50%, aplicable en huevos embrionados. DL 50%: Dosis Letal al 50%, aplicada en animales cuando la infeccin es seguida de muerte. DP 50%: Dosis Paraltica al 50%, aplicada en animales cuando la infeccin seguida de parlisis. Dilucin del virus * DL 50% DI 50% 100 10/10 100, 000 105 10 -1 9/10 10, 000 104 10-2 8/10 1000 103 10-3 7/10 100 102 10-4 6/10 10 101 10-5 5/10 10-6 4/10 10-7 2/10 10-8 1/10 10-9 0/10

* Nmero de respuestas positivas sobre nmero de respuestas probables. El PF 50% en este ejemplo es 10-5 TITULO = 105 DL 50%/Volumen inoculado. El mtodo bioestadstico de Reed & Muench es el ms comnmente utilizado para la INTERPOLACIN (valor intermedio) del PF 50% en datos derivados de una respuesta en la que no se observa el 50% de respuestas positivas y el 50% de respuestas negativas. Mtodo de Reed & Mench 1) Disponer los datos en forma tabular. 2) Abarcar diluciones tanto las ms bajas donde se obtienen todas las respuestas positivas, como las diluciones ms altas donde se obtiene todas las respuestas negativas. En la prctica puede utilizarse el mtodo con 2 diluciones prximas al PF 50%. 3) Separar el nmero de respuestas positivas y negativas y hacer la acumulacin de respuestas positivas y negativas. El PF del siguiente ejemplo, est entre las diluciones10-5 y 10-6 por lo tanto hay que calcular la dilucin exacta donde est el 50% de respuestas positivas por interpolacin a partir de las frecuencias acumuladas de las respuestas positivas y negativas.
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4) Las respuestas positivas acumuladas se suman desde la dilucin ms alta a la ms baja considerando que si en la dilucin 10-7 se murieron 2 es de esperarse que se mueran tambin en la dilucin 10-6 adems de los 4 que murieron en esta dilucin. Igual sucede con la acumulacin de respuestas negativas, si en la dilucin 10-3 hubo un negativo es de esperarse que en la dilucin 10-4 tambin ser negativo, adems de los 3 negativos de esta dilucin. 5) Obtener la proporcin de respuestas positivas sobre respuestas negativas y el porcentaje de respuestas positivas a partir de los totales acumulados. 6) Aplicar la siguiente frmula para determinar la distancia proporcional (DP) en la que se estima est el PF 50% entre las diluciones 10-5 y 10-6. DP = %>50 50 %>50 - %<50

7) Determinar el PF con la siguiente frmula: PF 50% = Log de la dilucin del % >50% + (DP X log del factor de dilucin) 8) Determina el ttulo con la siguiente frmula Ttulo: Inverso del PF 50%. Ejemplo: Se titul un virus de Newcastle en embrin de pollo inoculando 0.1ml por embrin, evaluando la letalidad del virus, los resultados obtenidos fueron los siguientes: 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Dilucin del virus No. de respuestas positivas/ No. 10/10 9/10 7/10 6/10 4/10 de respuestas probables 10 9 7 6 4 Respuestas positivas 0 1 3 4 6 Respuestas negativas 38 28 19 12 6 Positivos 0 1 4 8 14 Negativos Totales Positivos sobre 38/38 28/29 19/23 12/20 6/20 acumulados totales % de respuestas 100 96.50 82.60 60.0 30.0 positivas DP = %>50 50 Sustituyendo: 60 - 50 = 10 = 0.333 %>50 - %<50 60 30 30 PF 50% = Log de la dilucin del % >50% + (Dp X log del factor de dilucin) Sustituyendo: -5 + (0.33) (-1) = -5.33 PF 50% = 10-5.33 Titulo: Inverso del PF 50%.
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10-7 2/10 2 8 2 22 2/22 0.0

10-8 0/10 0 10 0 32 0/32 0

Sustituyendo:

10-5.33 Inv. 105.33 DLEP 50%/0.1ml

REGLAMENTACIN INVESTIGACIN

PARA

EL

USO

DE

LOS

ANIMALES

EN

Desde hace muchos aos la mayora de los pases poseen leyes generales o regulaciones que sancionan el maltrato de los animales, pero las pautas para el uso cientfico de los mismos son relativamente recientes. La primera ley de proteccin de animales fue sancionada en Inglaterra en 1876; en ella se inclua una referencia a los animales de experimentacin. En los pases desarrollados se han intentado crear normas ticas para el uso de animales para la investigacin, docencia y experimentacin. Algunos poseen legislaciones muy severas como Gran Bretaa, otros pases europeos tienen regulaciones o requisitos bien especificados y controles severos para el uso de animales de investigacin. En Canad existe un programa de control que aparte del cuidado de los animales, implica la acreditacin y entrenamiento de las personas que trabajan con ellos. En estados unidos adems de las disposiciones legales que cada institucin debe establecer, estos deben ser controlados por un comit de tica y de cuidado de uso de animales. En Mxico se aplica la NOM-062-1999, especificaciones tcnicas para la produccin, cuidado y uso de animales de laboratorio y la NOM-033-ZOO-1995, Sacrificio humanitario de los animales domsticos y silvestres. En la mayora de los pases de Occidente se condena el maltrato a los animales; en muchos de ellos se eliminaron las peleas de gallos, perros y corridas de toros. No hay duda que los animales pueden sufrir y que debe evitarse al mximo su sufrimiento, pero no puede ponerse al mismo nivel el uso de gallos o perros para peleas, que la utilizacin y mantenimiento de animales para el desarrollo de nuevas vacunas y terapias. PRINCIPIOS INTERNACIONALES PARA LA GUA EN INVESTIGACIN BIOMDICA QUE INVOLUCRA EL USO DE ANIMALES. 1. El avance del conocimiento en el rea de la biologa y el desarrollo de mejores medios para la proteccin de la salud y bienestar tanto para el hombre como en los animales, requiere como recurso, la experimentacin con animales vivos e intactos de una gran variedad de especies. 2. Mtodos tales como modelos matemticos, simulacin por computadora o ensayos biolgicos in vitro deberan ser usados en forma prioritaria, siempre que se consideren apropiados. 3. Los experimentos con animales deben ser establecidos solamente despus de estudiar su importancia y relevancia para la salud y el avance del conocimiento.
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4. Los animales seleccionados para un experimento deben ser de la especie y calidad apropiada para el mismo; debe usarse el mnimo nmero necesario para la obtencin de resultados cientficos vlidos. 5. Los investigadores y todo el personal involucrado nunca deben de dejar de tratar a los animales como seres sensibles; deben tener en cuenta su cuidado y uso adecuado tratando de minimizar su dolor, mortificacin y estrs como imperativos ticos. 6. Los investigadores deben inferir que aquellos procedimientos que causan dolor en los seres humanos tambin causan dolor en otras especies de vertebrados, a pesar de que se necesita profundizar ms en el conocimiento de la percepcin de dolor en animales. 7. Los procedimientos con animales que causan ms que un dolor momentneo o mnimo deben realizarse con una sedacin apropiada, analgesia o anestesia de acuerdo con las prcticas veterinarias aceptadas. Cirugas y otros procedimientos dolorosos no deben realizarse con animales sin anestesiar o paralizados por agentes qumicos. 8. En el caso de requerirse dispensas con relacin a las provisiones del artculo 7, las decisiones deberan tomarlas no solo los investigadores involucrados, sino un comit integrado adecuadamente, teniendo en cuenta las provisiones de los artculos 4, 5 y 7. Estas excepciones no deben tomarse con fines de docencia o demostracin. 9. Al final o en el momento adecuado durante un experimento, aquellos animales que sufran dolor crnico o incapacidad irreversible deben ser sacrificados sin dolor. 10. Deben procurarse las mejores condiciones de habitabilidad para los animales, el cuidado de los mismos debe estar bajo supervisin de veterinarios con experiencia en animales de laboratorio. 11. Es responsabilidad del director de un instituto o departamento que utiliza animales asegurar que los investigadores y personal tengan las calificaciones o experiencia adecuadas para conducir experimentos con animales. Deben ofrecer oportunidades de entrenamiento en estos servicios en lo que concierne al cuidado y prcticas de los animales que van a utilizarse tanto para el bienestar de estos como para la seguridad del investigador. La utilizacin de animales para propsitos cientficos plantea problemas morales y filosficos por solucionar, para los cuales no existen criterios ticos objetivos. S existe por el contrario, un consenso general de que la crueldad deliberada es inaceptable. Los investigadores que utilizan animales deberan ser conscientes de que estn ejerciendo un privilegio y no un derecho, aunque no sea posible establecer reglas universales puesto que el valor de los animales difiere de una cultura a otra.
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OBJETIVOS El alumno se familiarizara con el manejo adecuado de los animales ms comnmente utilizados en el laboratorio de virologa. El alumno utilizar la tcnica de inoculacin de virus ms adecuada, para su propagacin en los diferentes animales utilizados en el laboratorio de virologa.

Prctica Inoculacin de animales Material por equipo Pollo de un da de nacido o ratn lactante (no ms de 48hrs. de nacido). Punzocat calibre 24. Jeringa 1ml. Alcohol al 70%. Torunda con alcohol. Virus. Franela Marcador indeleble Guantes de exploracin (por alumno) Material y equipo por grupo Jaulas para cra. Jaulas para pollo (con fuente de calor). Bebederos. Comederos. Alimento. Viruta. Bolsas de residuos biolgico infecciosos roja y amarilla Recipiente para punzocortantes PROCEDIMIENTO Para la ejecucin de algunas tcnicas se recomienda previa tranquilizacin o anestesia de los animales para facilitar el manejo.

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INTRAPERITONEAL 1. Anestesiar ligeramente al animal con ter o cloroformo. 2. Sujetar al animal en posicin dorsal sobre la palma de la mano con los dedos, meique, anular, ndice y pulgar. 3. Colocar al animal con la cabeza hacia abajo e inocular en la parte ventral, hacia un lado de la lnea media. 4. Desinfectar la zona y retirar la aguja. OCULAR 1. Sujetar la cabeza del animal y mantener el ojo abierto del mismo. 2. Depositar la gota del inculo sobre el ojo. 3. Dejar absorber. NASAL 1. Sujetar al animal de manera que pueda facilitarse la ejecucin de esta tcnica. 2. Dejar caer las gotas del inculo en el orificio nasal, ayudndose de una jeringa pequea o de un gotero. 3. Dejar absorber. Nota: Esta inoculacin puede ser peligrosa por la formacin de aerosoles DISPOSICIN FINAL DE DESECHOS BIOLGICOS Inspeccionar e identificar el material biolgico para clasificarlo de acuerdo a su origen y tipo segn la tabla anexa. Tipo de residuos Sangre Cultivos celulares y virus Residuos no anatmicos derivados de la prctica Lquidos Slidos Patolgicos (cadveres, fluidos y rganos, embriones de pollo Lquidos Estado fsico Slidos Envasado Bolsa de plstico Recipientes hermticos Bolsa de plstico Recipientes Color Rojo Rojo Amarillo Amarillo
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hermticos Objetos punzo cortantes: agujas hipodrmicas , porta y cubre objetos, y cristalera Slidos Recipientes rgidos Rojo

El material de cristalera utilizado durante la prctica como son tubos, matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI sern inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y esterilizados. REPORTE DE RESULTADOS Consultar el anexo. BIBLIOGRAFA Koller B and Smithies. Altering genes in animals for gene targeting. Anual Review of Immunology. 10: 785-807. 1992. Rosenkrantz A and Moura Duarte FA. Laboratory animals studies in the quest of health and knowledge. Publicacin de ICLAS-CEMIB, FESBE, Scientific Meeting, Aguas Das Lindoias, Brasil. 1986. Svendsen P and Han J. Handbook of Laboratory Animal Science. Press Boca Ratn, FI. 1994. United States Department of Health and Human Services. Animals Research. The search for life-saving answers, Washington, DDHS publications. United States National Academy of Sciences. Science medicine and animals. Washington, National academy Press, 1991.

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PRCTICA 5 Inoculacin en Embriones de Pollo INTRODUCCIN Woodruff y Goodpasture en 1931 comienzan a utilizar embriones de pollo como medio de cultivo y propagacin de virus en forma sistemtica, aunque anteriormente los utilizaron por primera vez Rous y Murphy con este mismo propsito. Theiler y Smith en 1937 produjeron exitosamente una vacuna contra Fiebre Amarilla en embrin de pollo la cual no solo fue altamente efectiva sino tambin sumamente segura. Ventajas del empleo del embrin de pollo para cultivar virus 1.- Son de fcil adquisicin y / o produccin. 2.- Son baratos. 3.- Poseen un tamao adecuado para su manipulacin y almacenamiento 4.- Estn relativamente libres de virus o microorganismos. 5.- No forman anticuerpos contra los virus inoculados (a excepcin de algunos casos y bajo condiciones especiales). Desventajas del empleo del embrin de pollo para cultivar virus 1.- El cascarn es opaco y no se puede determinar con precisin la replicacin viral (al ovoscopiar solo se puede determinar el desarrollo del embrin y su viabilidad) 2.- Existe la posibilidad de contaminacin por protenas embrionarias en la recuperacin de virus y en su purificacin, as como en la produccin de vacunas a partir de embrin de pollo. Usos del embrin de pollo en virologa 1.- Aislamiento de virus. 2.- Produccin de antgenos de diagnstico para virus, clamidias y rickettsias. 3.- Aislamiento y diferenciacin de los virus para su diagnstico. 4.- Produccin de biolgicos (vacunas con virus activo o inactivo).

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* Si bien, se pueden utilizan huevos embrionados de pavo o de pato para el aislamiento viral, los ms ampliamente empleados son los de pollo, dado que los dos primeros tienen un periodo de incubacin ms prolongado. Factores que influyen en la replicacin de los virus en el embrin de pollo 1.- Edad del embrin al momento de inocular. 2.- Va de inoculacin empleada. 3.- Dilucin y volumen del inculo 4.- Temperatura de incubacin (antes y despus de la inoculacin) 5.- Tiempo de incubacin despus de la inoculacin (en promedio 1 a 6 das dependiendo el virus inoculado). 6.- Estado fisiolgico y nutricional de las aves, especialmente a lo referente a deficiencias vitamnicas y minerales, as como al empleo de inhibidores enzimticos. *Estos factores influyen en forma diferente para cada virus y por tanto se debern estudiar de manera independiente para cada caso en particular. Nota: En general los embriones de pollo requieren una temperatura de incubacin de 37 a 39C, con una humedad del 40 al 70%, siendo la ptima del 60%. Adems requieren una relacin de oxgeno y bixido de carbono de 21% y 0.5% respectivamente. Ovoscopiado El ovoscopiado consiste en la revisin del huevo contra una fuente de luz concentrada, de preferencia en un cuarto oscuro, de modo que la sombra del embrin y sus estructuras asociadas sean visibles; adems se observan fcilmente los movimientos ondulatorios del embrin. Tambin durante el ovoscopiado se selecciona el punto adecuado de entrada a travs del cascaron para cada va de inoculacin, el cual deber evitar los grandes vasos de las membranas, ya que su puncin durante la inoculacin podra conducir a hemorragias y a la muerte del embrin. Durante esta etapa tambin se delimita la cmara de aire, la cual servir como referencia para la inoculacin y la recuperacin de tejidos y fluidos. Es importante aprender a reconocer la viabilidad y edad aproximada del embrin, ya que estos dos factores determinan la va de inoculacin y el xito de la misma.

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Mtodos para comprobar la replicacin viral en el embrin 1.- Muestras de lquidos embrionarios, de membranas y del mismo embrin, para realizar pruebas cuantitativas de infectividad. 2.- Observacin de las lesiones patolgicas producidas por la replicacin viral, algunas de las cuales son las siguientes: Tortuosidad y empequeecimiento del embrin (enanismo) Congestin de la epidermis. Disminucin del fluido amnitico. Engrosamiento y edema de la membrana corioalantoidea (MCA). Engrosamiento y fibrosis de la membrana amnitica. Hemorragias subcutneas en los tejidos (principalmente petequias). Desarrollo alterado de las plumas. Lesiones vesiculares (Pocks) en la membrana corioalantoidea. Muerte del embrin Depsitos de uratos en el estroma renal. A nivel microscpico la presencia de cuerpos de inclusin y sincitios. ESTRUCTURAS EMBRIONARIAS
Esquema del Embrin de Pollo
Cmara de aire

Saco Vitelino

Cavidad Amnitica

Embrin

Membrana Corioalantoidea

Albmina

Vas de inoculacin

Nota: Existen otras vas de inoculacin para el embrin de pollo como son la va intra-embrionaria o embrionaria, la va endovenosa y la va intra-cerebral, pero las cuales no son de uso comn y se emplean generalmente para investigacin y en algunos virus en particular.

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Vas de inoculacin ms comnmente empleadas en el embrin de pollo Va de Inoculacin Virus que se puede utilizar Parainfluenza Parotiditis Encefalitis Equina Venezolana Rabia, Newcastle Cavidad Alantoidea (CA) Bronquitis Infecciosa Rubola Lengua Azul Sarampin Influenza Aviar Rabia Cavidad Amnitica (CAm) Parainfluenza Parotiditis Newcastle Viruela Marek Membrana Corioalantoidea (MCA ) Sarcoma de Rous 10 a 12 das Laringotraqueitis Aviar Aujeszky Bronquitis Infecciosa Va Saco Vitelino (SV) Rabia 5 a 8 das 0.2 a 1 ml. Cosecha de lquido para produccin de vacunas y preparacin de antgeno. 0.1 a 0.5 ml. Cosecha de lquido para produccin de vacunas y preparacin de antgeno. 10 a 12 das 0.1 a 0.2 ml. Cosecha de lquido amnitico, preparacin de vacunas y antgeno. 9 a 12 das 0.1 a 0.2 ml. Cosecha de lquido alantoideo para: Preparacin de vacunas, antgeno para pruebas serolgicas, Anlisis qumicos. Edad del embrin Volumen del inculo Aplicacin

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OBJETIVOS El alumno reconocer la importancia del embrin de pollo como un medio de aislamiento y propagacin de virus de importancia veterinaria. Familiarizar al alumno con el manejo de las tcnicas de inoculacin ms comnmente empleadas en huevos embrionados de aves, incluyendo la recuperacin de tejidos, membranas y fluidos embrionarios con el propsito de recuperar, aislar, identificar y/o titular a los virus. El alumno aprender a elegir apropiadamente huevos embrionados de acuerdo a las necesidades de propagacin del virus y en relacin con la edad del embrin.

Prctica Inoculacin de embrin de pollo

Material inoculacin Material por equipo Jeringa insulnica Agujas de diferentes calibres. Bulbos y/o boquillas (MCA). Perforador (Lancetas) Lpiz Pegamento blanco Iodo al 2%. Embriones de 9-11 das de edad Hisopo. Ovoscopio Virus Caja de Petri de 20 cm de dimetro. Mecheros Cerillos Alcohol al 70% Franela Material que deben traer para la prctica de forma individual Guantes de exploracin Cubrebocas Gorro Material y equipo por grupo Estufa bacteriolgica (incubadora)
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Centrfuga Bolsas de residuos biolgico infecciosos roja y amarilla Recipiente para punzocortantes

PROCEDIMIENTO Va de inoculacin cavidad alantoidea Esta va tiene la ventaja de su simplicidad de realizacin y recuperacin de grandes cantidades de lquidos virulentos para anlisis qumicos, produccin de vacunas o preparacin de antgenos para pruebas serolgicas. El procedimiento para su realizacin es el siguiente: 1.- Por ovoscopiado se seleccionan embriones de 9 a 12 das de edad, se delimita la cmara de aire por medio de un lpiz, y se marca con una X el lugar de la inoculacin, la cual se encontrar aproximadamente a 5 mm de la lnea limtrofe de la cmara de aire y opuesta al lugar donde se encuentre el embrin. 2.-Se procede a la desinfeccin del lugar marcado con tintura de iodo y se perfora el cascarn. 3.- Se introduce la aguja aproximadamente 2 cm, suficiente para alcanzar la cavidad alantoidea y evitar el saco vitelino. 4.- Se deposita el inculo (0.1 a 0.2 ml). 5.- Se retira la aguja y se procede al sellado de la perforacin por medio de Pegamento blanco. 6.- Incubar el tiempo adecuado para cada virus en particular, monitoreando la viabilidad del embrin por ovoscopiado cada 24 hrs. Los embriones muertos antes de 24 hrs pos-inoculacin se consideran muertes por traumatismo. 7.- La recoleccin de los tejidos y lquidos se deber realizar tomando las mximas precauciones de asepsia, dada la naturaleza infecciosa de los virus. Va de inoculacin membrana corioalantoidea. 1.- Los embriones seleccionados para esta va de inoculacin debern tener una edad de 10 a 12 das. 2.- Se delimita la cmara de aire de la manera habitual con un lpiz, pero adems se marcar el lugar de inoculacin, que en esta ocasin se encontrar en la zona media del huevo, comprendiendo una franja de aproximadamente 2 cm. de extensin, de preferencia en la zona donde se localiza el embrin y colocada hacia arriba. 3.- Se desinfecta con tintura de iodo el lugar marcado para la inoculacin y la cmara de aire. Procediendo a colocar el huevo en posicin horizontal.
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4.- Primero se perfora el centro del pice, posteriormente se realiza una pequea perforacin en el lugar en el que se realizar la inoculacin, la cual solo deber comprender el cascarn, respetando las membranas del cascarn y ms importante an la membrana corioalantoidea (esta ltima perforacin se podr realizar con ayuda de una pequea sierra). 5.- Con la ayuda del bulbo o la boquilla se realizar una ligera succin, la cual provocar que se reduzca la cmara de aire y una ligera separacin de la MCA y las membranas del cascarn, dando lugar a la formacin de una pequea bolsa en la parte superior, justo donde se deber encontrar la zona marcada para la inoculacin. 6.- Empleando la aguja calibre 23 de pulgada de largo, se depositar el inoculo tan solo introduciendo la punta de la aguja y con el bisel hacia abajo, en la bolsa formada por la separacin de la MCA y las membranas del cascarn. 7.- Se retira la aguja y se realizan ligeros movimiento de balanceo para permitir que el inoculo se distribuya sobre la MCA. 8.- Se procede al sellado comenzando por el sitio de inoculacin y continuando con el orificio en el pice. 9.- Para esta va de inoculacin, la incubacin se realiza en posicin horizontal.

Recuperacin de tejidos y fluidos El propsito principal de haber realizado la inoculacin de embrin de pollo es la de recuperar el virus en altas concentraciones, para ello es necesario la cosecha de los materiales infectados del huevo embrionado, tomando especial cuidado al momento de seleccionar el huevo del cual se realizar la cosecha, dado que la mayor produccin de virus se obtiene de los embriones moribundos y no de los embriones muertos. Esto hace necesaria la adaptacin de los tiempos de ovoscopiado para cada virus en cuestin, ya que algunos de ellos requiere periodos cortos como de 8 a 10 horas, mientras que otros requieren lapsos de 24 horas o ms. Un criterio para determinar cuando un embrin se encuentra moribundo es que presente movimientos lentos, en ese momento se puede tomar la decisin de retirarlo de la incubadora y colocarlo en el refrigerador hasta realizar la cosecha general. Los virus inoculados por cavidad alantoidea generalmente se recuperan para su empleo como virus hemoaglutinantes. La cavidad saco vitelino se emplea de manera preferencial para clamidias y rickettsias, mientras que la cavidad amnitica se emplea para el aislamiento de cepas de virus de Influenza. La MCA se emplea para virus que se caracterizan por la produccin de lesiones vesiculares denominadas Pocks, y las cuales sirven para cuantificar el poder infectante de un virus por medio del conteo de dichas lesiones producidas, dndonos un ndice denominado ndice de formacin de placas.
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Prctica Inoculacin de embrin de pollo Material recoleccin Material por equipo Cajas de Petri estriles (20cm) Jeringas de 5 o 10 ml con agujas calibre 18 y 20 de una pulgada de largo Alcohol al 70% Charolas de plstico para huevo. Tubos de centrfuga de 10ml. Embriones de pollo inoculados. Mecheros Cerillos Marcador indeleble Franela

Material que debern traer para la prctica de manera individual Guantes de exploracin Cofia Cubrebocas Tijeras curvas estriles. Pinzas curvas con punta roma estriles. Material y equipo por grupo Bolsas de residuos biolgico infecciosos roja y amarilla Recipiente para punzocortantes

PROCEDIMIENTO Lquido Alantoideo 1.- Seleccionar mediante el ovoscopio los embriones vivos o moribundos, procediendo a colocarlos en el refrigerador a 4C durante 12 hrs. este procedimiento ayudar a reducir los cambios postmortem y las hemorragias provocadas por estos, permitiendo diferenciar las hemorragias producidas por la replicacin viral y lograr la mxima recuperacin de virus. Adicionalmente la sangre contenida en los vasos no escapara a la cavidad alantoidea durante la cosecha de los fluidos gracias a el procedimiento de refrigerar previamente los embriones. 2.- Colocar el huevo en un cartn en posicin vertical con la cmara de aire hacia arriba y desinfectar esta ltima. 3.- Con ayuda de las tijeras y las pinzas estriles, quitar el casquete que cubre la cmara de aire y la membrana del cascarn y MCA que forma la base de esta cmara.

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4.- Con una jeringa de 5 ml. y una aguja calibre 18, se aspira el lquido alantoideo. Se puede colectar los lquidos de varios embriones en la misma jeringa, siempre y cuando se trate del mismo virus inoculado. 5.- Centrifugar durante 10 minutos a 1500 r.p.m. y obtener el sobrenadante, que se colocar en volmenes de 0.5 ml almacenndolos a 20C hasta su utilizacin. Membrana corioalantoidea 1.- Se llevan a cabo los paso 1,2 y 3 de la tcnica anterior. 2.- Se descarga en una caja de Petri el contenido del huevo evitando el desprendimiento de la MCA. 3.- La MCA adherida al cascarn de desprende con ayuda de las pinzas procurando obtenerla completa. 4.- Guardar la membrana a 70C hasta su posterior utilizacin.

DISPOSICIN FINAL DE DESECHOS BIOLGICOS

Inspeccionar e identificar el material biolgico para clasificarlo de acuerdo a su origen y tipo segn la tabla anexa.

Tipo de residuos Sangre Cultivos celulares y virus Residuos no anatmicos derivados de la prctica

Estado fsico Slidos Lquidos Slidos

Envasado Bolsa de plstico Recipientes hermticos Bolsa de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos

Color Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo

Patolgicos (cadveres, fluidos y rganos, embriones de pollo Objetos punzo cortantes: agujas hipodrmicas , porta y cubre objetos, y cristalera

Lquidos Slidos

El material de cristalera utilizado durante la prctica como son tubos, matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI sern inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y esterilizados.

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REPORTE DE RESULTADOS Consultar el anexo. BIBLIOGRAFA Ballew H.C., Forrester F.T., Lyerla H.C., Velleca W.M., Bird B.R., Roberts J.D. Basic laboratory methods in virology. U.S.Department of health, education and welfare. Public health service. Center for disease control. Atlanta, Georgia 1976. Ian F.R. Culture of animal cells, a manual of basic technique. 2da edition. Ed. A John Wiley & Sons, INC., Publication. 1987.

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PRCTICA 6 Cultivo Celular INTRODUCCIN La introduccin de cultivos celulares significo un gran adelanto en la virologa, pues gracias a ellos se han logrado aislar virus por mucho tiempo desconocidos y que son de importancia mdica. El cultivo celular in vitro se realiza en medios artificiales, en los cuales se mantiene mediante la mezcla de soluciones orgnicas complejas, mantenidas bajo condiciones fsico-qumicas y sobre recipientes que los contienen y aslan del medio externo. Aplicaciones del cultivo celular en virologa Aislamiento y replicacin viral. Estudio de la patogenicidad viral. Elaboracin de biolgicos (vacunas) Estudio de drogas antivirales Titulacin viral. Diagnstico virolgico. Sistemas de cultivo o o o o Cultivo Rotatorio. Cultivo en Monoestratos (estacionario). Cultivo en Suspensin. Cultivo en Perfusin.

El sistema de cultivo se compone de cuatro elementos:

1. Soporte: Tipos de soporte: vidrio, plstico desechable, microsoportes.

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Recipientes de cultivo: caja tipo Falcon, roller bottles (botellas para sistema rotatorio), tubos Leighton.

2. Atmsfera. Los componentes ms significativos de la atmsfera son el oxgeno y el dixido de carbono. Oxgeno: en cultivo celular se cubre con la tensin atmosfrica, en cultivo de rganos requieren ms del 95% dada su geometra y dificultad de difusin del gas en su interior. Dixido de carbono: influye en la cantidad de CO2 disuelto, el pH y la cantidad de iones de bicarbonato (HCO3).

3. Propiedades fsicas: pH y capacidad amortiguadora: el pH ptimo en la mayora de los cultivos celulares es de 7.4. Fibroblastos Clulas transformadas Clulas epidrmicas 7.4-7.7 7.0-7.4 5.5

En cultivo celular el indicador de pH es el rojo de fenol Color pH Prpura 7.8 Azul-Rojo 7.6 Rojo 7.4 Naranja 7.0 Amarillo 6.5

El medio de cultivo debe estar amortiguado para evitar el cambio brusco de pH, el ms usado para este fin es el bicarbonato de sodio (que tambin equilibra el CO2 atmosfrico), adems se puede usar el HEPES. Osmolaridad: se requiere un rango de 266-320 mOsm/Kg. Temperatura: Influye en la tasa del crecimiento de las clulas y el pH, la ptima en general es de 37 C. Viscosidad: determinada por el contenido de suero, tiene poca influencia sobre el crecimiento pero ayuda a evitar el dao celular (a mayor viscosidad menor dao celular). Tensin superficial: se debe mantener disminuida la aparicin de espuma ya que sta causa un aumento en la desnaturalizacin de protenas por tanto se incrementa el riesgo de contaminacin.

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4. Nutrimentos. Todo medio de cultivo est formado por los siguientes elementos: Soluciones salinas equilibradas (BSS): es una mezcla de sales inorgnicas, incluyendo bicarbonato sdico y suplementada con glucosa. Aminocidos: se requieren los aminocidos esenciales u otros, pues el requerimiento puede variar de una clula a otra; un suplemento comn es de glutamina ya que sta es inestable en el medio. Vitaminas: el medio MEM slo se suplementa con vitaminas del complejo B, los dems grupos son aportados por el suero. Su limitacin se manifiesta en la supervivencia de las clulas y en la reduccin de la tasa de crecimiento ms que en la densidad celular. Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular: dependiendo del medio, este incluye en su formulacin nuclesidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lpidos, etc. La adicin de piruvato permite al medio de cultivo incrementar su produccin endgena de CO2. Hormonas y factores de crecimiento (suero): los tipos de suero ms empleados son suero de ternera (calf serum, CF), suero fetal bovino (fetal calf serum, FCS), suero de caballo (horse serum, HS) y suero humano (human serum, HuS). Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibiticos y antifngicos): para evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar con uno o ms antibiticos de diferente espectro de accin pero debe de ser controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo, los ms usados son: Penicilina (100UI/ml)/ Estreptomicina (100g/ml); Gentamicina (50g/ml) y Anfotericina-B (2.5g/ml).

Clasificacin de los medios en base a sus funciones: Medios esenciales para crecimiento celular. Medios esenciales para el mantenimiento de las clulas. Medios esenciales para infeccin. Medios esenciales para funciones especializadas. Clasificacin de los medios en base a sus componentes: Medios de composicin qumica definida o sinttica. Medios semisintticos. Medios de composicin qumica indefinida o naturales. Ejemplos de medios:
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 Medio Basal de Eagle (BME): contiene slo los aminocidos esenciales, suplementado con suero fetal bovino 10%, para crecimiento de fibroblastos de ratn y clulas HeLa. Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM): contiene ms aminocidos y en mayor concentracin que BME. Se usa para casi todo tipo de cultivo y requiere suplementarse con suero 10%. RPMI 1640: diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas en suspensin. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM): contiene cuatro veces ms la concentracin de aminocidos y vitaminas que el BME. Se usa para la seleccin de hibridomas. Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM): es un medio completo que incluye la formulacin albmina bovina, transferrina, selenito, etc. Es muy til para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. McCoy 5: para lneas celulares diploides tanto de rata como humanas. Medio L-15 de Leibovitz: para cultivo de virus. Medio F-10 de Ham: debe suplementarse con protenas y hormonas, contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es til para cultivo de lneas clulas humanas y amniticas. Medio F-12 de Ham: suplementos protenicos combinado con IMDM es un medio libre de suero. til para el crecimiento de lneas celulares. Medio 199: usado para el cultivo de cromosomopatas. clulas no diferenciadas y estudio de

CLASIFICACIN DEL CULTIVO CELULAR I. CULTIVO PRIMARIO

Son de primera generacin, proceden del animal original (embriones, rganos o tejidos), se obtienen mediante la disgregacin celular enzimtica o mecnica. La mayora tiene un crecimiento muy limitado in vitro (5 a 10 divisiones mximo), manteniendo el nmero cromosmico de la especie de origen.

II.

CULTIVO SECUNDARIO

Provienen de cultivos primarios, dando as origen a monoestratos de superficies uniformes que se han obtenido de clulas individuales. Se divide en:

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1. Cepa o Diploides (Cepa Celular Diploide): derivan de tejidos fetales, normalmente proceden de pulmn o piel, mantienen sus caractersticas cromosmicas diploides hasta aproximadamente 50 a 80 pases. 2. Lnea o Heteroploides (Lneas Continuas): normalmente proceden de tejidos tumorales o de mutacin ocurrida en clulas diploides, presentan alteraciones en el nmero y morfologa cromosmica, crecen rpidamente y pueden subcultivarse indefinidamente. Su morfologa puede cambiar con respecto a la clula original.

CONTEO CELULAR Es importante llevar a cabo el conteo de las clulas para asegurar una concentracin adecuada as como su viabilidad al momento de la siembra o pasaje de manera que no haya un sobrecrecimiento del cultivo despus de una incubacin prolongada que dificultara la observacin del efecto de los virus sobre las clulas. El conteo se realiza contabilizando el nmero total de clulas en los cuadros grandes del hemocitmetro (cmara de Neubauer) y este nmero se divide entre el nmero de cuadros contados a fin de sacar un promedio de clulas por cuadro. Este promedio se multiplica por el factor 10,000 y luego por el factor de dilucin (fd), obtenindose as el nmero de clulas por ml. Para determinar su viabilidad se utiliza Azul Tripan al 0.4% con una mezcla de clulas en suspensin y se depositan en la cmara de Neubauer, este colorante se introducir en las clulas que presenten una prdida de la continuidad de la membrana (clulas muertas).

TITULACIN Cuando un virus ha sido aislado, identificado y se ha producido un abasto de l, el siguiente paso es conocer su potencia y patogenicidad, para lo cual se determina la mnima cantidad necesaria para obtener una respuesta especfica en un husped, la determinacin cuantitativa de esta actividad viral se llama Titulacin. Si el sistema para la titulacin viral es en cultivos celulares, el ttulo se expresa en Dosis Infectante en Cultivo Celular al 50% (DICC 50). La replicacin viral nos da como resultado una amplificacin de los efectos producidos por la mnima cantidad de virus, a esto se le llama Infectividad Viral, lo cual corresponde a un solo elemento, ya sea un virin o una molcula de cido nucleico infeccioso.

CRIOPRESERVACIN La criopreservacin es la conservacin de clulas a muy bajas temperaturas, las cuales disminuyen su actividad metablica/enzimtica a cero. Las clulas pueden ser conservadas indefinidamente sin prdidas significativas de viabilidad siempre
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que estas sean congeladas en un medio adecuado y sean enfriadas y descongeladas correctamente. Los criopreservadores son usados para prevenir el dao celular durante el proceso de congelacin. Este dao es principalmente por el incremento de cristales y cambios osmticos durante la congelacin-descongelacin. Todos los criopreservadores poseen una alta solubilidad en agua y tienen baja toxicidad en las clulas y se clasifican en base a su actividad penetrativa en la clula o no penetrativa. Los criopreservadores ms comnmente usados son el glicerol y el dimetilsulfoxido (DMSO).

La metodologa para la congelacin consiste en una mezcla de medio de cultivo conteniendo: a) 10-20% suero b) 5-10% DMSO c) 5 x 106 2 x 107 clulas/ml. a) 90% suero fetal bovino b) 10% DMSO c) Clulas METODOS PARA DETERMINAR EL CRECIMIENTO VIRAL El crecimiento de un virus en cultivo celular puede determinarse por cualquiera de los siguientes mtodos: 1. Muestras de virus en fase lquida o celular para determinaciones de infectividad. 2. Estudios sobre el metabolismo celular. 3. Modo de accin del virus sobre anticuerpos y otras sustancias antivirales. 4. Pruebas serolgicas (hemoaglutinacin, hemoadsorcin, sueroneutralizacin etc.).

CRECIMIENTO DE LOS VIRUS EN CULTIVO CELULAR La propagacin de un virus in vitro exige en primer lugar que se cuente con un cultivo celular que sea capaz de soportar la actividad viral. El crecimiento se determina por los efectos citopticos producidos por el virus y estos pueden variar desde aquellos muy severos en los que hay destruccin total de las clulas o solamente presentarse alteraciones celulares. Para observar este
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efecto se realiza la tincin de rutina HE en donde las clulas tienen afinidad marcada por los colorantes.

EFECTOS DE LOS VIRUS EN LA CLULA Algunos efectos citopticos producidos en cultivos celulares por virus son caractersticos y esto hace posible el establecimiento de un diagnstico presuntivo rpido. Este efecto puede variar de acuerdo al virus inoculado y se clasifican de la siguiente forma: 1. Efecto citoptico (picnosis, cariolisis, cariorrexia, lisis celular etc). Ej: picornavirus, Herpesvirus, Adenovirus. 2. Productores de cuerpos de inclusin (intracitoplasmticos, intranucleares, acidfilos o basfilos) ej. Herpes simple, Rabia. 3. Formadores de sincitios o clulas gigantes, ej. Parainfluenza, Lentivirus (Artritis Encefalitis Caprina). 4. Productores de cambios en los tejidos (neoplasias, tumores). Ej: Papovavirus, Retrovirus. OBJETIVOS El alumno conocer los tipos, sistemas y necesidades nutritivas de las clulas in vitro para el aislamiento y replicacin viral. El alumno conocer cuales son los efectos que producen los virus al infectar clulas in vitro.

Prctica Cultivo celular. Material por equipo Ratn o pollo Cajas para cultivo celular Cajas de Petri Medio de cultivo Vaso de precipitados Tubos de medio de cultivo Solucin de lavado con antibitico Benzal Alcohol al 70% Franela Mechero Gasas
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 Marcador indeleble Servitoallas Material por grupo Matraz de 50ml Agitador magntico Platina con termostato Estufa de CO2 Campana de flujo laminar Tripsina Microscopio invertido Pipetas de 1 y 5ml. Pipeteador automtico Algodn Alcohol al 70% Parafilm Filtros de 21 y 45m de dimetro Tanque de nitrgeno lquido Bolsas de residuos biolgico infecciosos roja y amarilla Recipiente para punzocortantes Material que deben traer de manera individual y/o por equipo Bistur con hoja de bistur Cofia Tijeras rectas o curvas estriles Pinzas con dientes de ratn estriles Guantes estriles Cubreboca PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Desinfectar el rea de trabajo con alcohol al 70% y franela. Poner sobre la mesa una hoja de papel estraza estril Encender los mecheros. Colocar la caja de Petri sobre el papel y abrirla, en la base poner el cadver del ratn o pollo. Realizar la antisepsia de todo el animal con alcohol al 70% y en lnea media realizar la asepsia con benzal. Realizar una incisin en lnea media abarcando piel, msculo y peritoneo. Localizar ambos riones y proceder a extirparlos. En la base de la caja de Petri colocar ambos riones y quitar la cpsula. Realizar una incisin en lnea media de ambos riones y retirar la pelvicilla renal. Lavar con la solucin de lavado (antibitico). Realizar pequeos cortes al rgano con el bistur de manera que queden lo ms pequeos posible. Lavar con solucin de lavado.
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13. Introducir los cortes del rgano en un matraz que contenga solucin de Tripsina al 0.25% y verseno por 30 min a 37 C en agitacin constante. 14. Parar la reaccin de la Tripsina introduciendo el matraz en un recipiente que contenga hielo. 15. Realizar el tamizado con gasa estril del contenido del matraz. 16. Poner 1 ml del contenido que obtuvimos despus del tamizado en la cmara de Neubauer. 17. Proceder al conteo de las clulas tal y como se ha descrito previamente. 18. Introducir las clulas en cajas tipo Falcon de 25 ml. 19. Agregar 5 ml de medio de cultivo. 20. Incubar a 37 C el tiempo que sea necesario para su crecimiento. 21. Revisar cada 24 hrs el cultivo. DISPOSICIN FINAL DE DESECHOS BIOLGICOS
Inspeccionar e identificar el material biolgico para clasificarlo de acuerdo a su origen y tipo segn la tabla anexa.

Tipo de residuos Sangre Cultivos celulares y virus Residuos no anatmicos derivados de la prctica

Estado fsico Slidos Lquidos Slidos

Envasado Bolsa de plstico Recipientes hermticos Bolsa de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos

Color Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo

Patolgicos (cadveres, fluidos y rganos, embriones de pollo Objetos punzo cortantes: agujas hipodrmicas , porta y cubre objetos, y cristalera

Lquidos Slidos

El material de cristalera utilizado durante la prctica como son tubos, matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI sern inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y esterilizados. REPORTE DE RESULTADOS Consultar el anexo. BIBLIOGRAFA Coll M.J. Tcnicas de diagnstico en Virologa. Ed. Diaz de Santos S.A. 1993. Ian F.R. Culture of animal cells, a manual of basic technique. 2da edition. Ed. A John Wiley & Sons, INC., Publication. 1987.
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PRCTICA 7 PRUEBAS DE DIAGNSTICO VIRAL Pruebas que detectan Anticuerpos, Antgenos y cido Nucleico. PRUEBA QUE DETECTA ANTICUERPOS: ELISA - INMUNOENSAYO LIGADO A ENZIMAS (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INTRODUCCIN. En el caso de virologa la prueba de ELISA mayormente utilizada es la indirecta la cual detecta y cuantifica anticuerpos (Ac) especficos que se unen a un antgeno (Ag) fijado en un soporte slido (placa de 96 pozos). Las tcnicas de ELISA presentan como caractersticas tener una alta sensibilidad, especificidad, rapidez, economa (los productos utilizados tienen una larga vida de anaquel), posibilidad de hacer estudios de grandes poblaciones en un corto plazo, sencillez, no precisa de instalaciones costosas y existe la posibilidad de automatizarlo. No obstante que las tcnicas inmunoenzimticas se comenzaron a desarrollar desde 1966 por Avrameas y Uriel, en los ltimos aos se han comenzado aplicar de forma generalizada. El ELISA indirecto, se basa en el uso de anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Estando el antgeno fijado sobre un soporte slido, el complejo antgeno-anticuerpo quedar inmovilizado y por tanto podr fcilmente ser revelado mediante la adicin de un substrato especfico que al actuar la enzima, producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o colormetro. La cantidad de anticuerpos es determinada por el grado de actividad enzimtica de la muestra a probar comparando con la reactividad de muestras controles positivos y negativos adecuados (Snchez-Vizcano y Cambra, 1987; Ternyinck y Avrameas, 1989). Algunas enfermedades VIRALES diagnosticadas por la prueba de ELISA indirecta son: Enfermedad de Aujeszky Enfermedad de Newcastle Fiebre Aftosa Leucemia Viral Felina Fiebre Porcina Clsica SIDA Felino Rinotraqueitis Infecciosa Bovina Rotavirus Artritis Encefalitis Caprina Maedi-Visna Anemia Infecciosa Equina Leucosis Aviar
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Las enzimas y cromgenos (colorantes) usados ms comnmente son: Enzima Fosfatasa Alcalina Sistema de Color de Reaccin Sustrato P-Nitrofenil fosfato Amarillo (pNPP) 2,2-Azino-bis (3etilbenztiazolina-6Verde cido sulfnico)(ABTS) o-Fenilenediamina Naranja (OPD) 3,3.5,5Tetrametilbencidina Azul (TMB) o-Dianizidina Amarillo/Naranja cido 5Aminosaliclico Caf (5AS) Producto Final Soluble

Soluble

Soluble Soluble Soluble Soluble

Perxidasa

OBJETIVO Que el alumno identifique un mtodo inmunoenzimtico indirecto utilizado en virologa para la identificacin de anticuerpos especficos. Prctica ELISA indirecta. Material por equipo Suero problema Microplaca de fondo plano de 96 pozos Micropipeta con puntas Reactivos para ELISA indirecto Alcohol al 70% Franela Marcador indeleble Guantes de exploracin (por alumno) Bolsas de residuos biolgico infecciosos roja y amarilla Solucin con desinfectante (cloro)

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Material por grupo Lector de ELISA Estufa PROCEDIMIENTO 1. Agregar 100 L de suero problema (a una dilucin de 1:10 a 1:100) a una microplaca de 96 pozos previamente sensibilizada y bloqueada. 2. Incubar la microplaca a 37C por 1 hora. 3. Realizar al menos 3 lavados (PBS-Tween). 4. Adicionar100 L del conjugado anti IgG peroxidado (la dilucin ser segn las especificaciones del fabricante). 5. Realizar al menos 3 lavados (PBS-Tween). 6. Adicionar el sustrato (100L). 7. Incubar de 15 a 30 minutos en obscuridad y a temperatura ambiente. 8. Realizar la lectura midiendo la D.O. u observacin directa.

DISPOSICIN FINAL DE DESECHOS BIOLGICOS Inspeccionar e identificar el material biolgico para clasificarlo de acuerdo a su origen y tipo segn la tabla anexa. Tipo de residuos Sangre Cultivos celulares y virus Residuos no anatmicos derivados de la prctica Lquidos Slidos Patolgicos (cadveres, fluidos y rganos, embriones de pollo Objetos punzo cortantes: agujas hipodrmicas , porta y cubre objetos, y cristalera Lquidos Slidos Estado fsico Slidos Envasado Bolsa de plstico Recipientes hermticos Bolsa de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos Color Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo

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El material de cristalera utilizado durante la prctica como son tubos, matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI sern inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y esterilizados. REPORTE DE RESULTADOS Consultar el anexo. BIBLIOGRAFA Coll M.J. Tcnicas de diagnstico en Virologa. Ed. Daz de Santos S.A. 1993. Sanchez-Vizcano J.M., Cambra A.M. Tcnica Inmunoenzimticas en patologa animal y vegetal. Madrid 1987. Ternyinck T., Avrameas s. Tcnicas inmunoenzimticas. Ed. Iberoamericana. Mxico. 1989.

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PRUEBA QUE DETECTA ANTGENOS (PROTINAS): ELECTROFORESIS INTRODUCCIN Esta tcnica se basa en la separacin de los principales constituyentes proteicos de una mezcla en zonas distintas, segn su peso molecular y bajo la influencia de un campo elctrico, pH y temperatura entre otras. Se conoce como electroforesis al movimiento de partculas cargadas bajo la influencia de un campo elctrico. Esta tcnica permite identificar los componentes simples en las mezclas complejas. Cuando el antgeno proteico se quiere caracterizar y se encuentra mezclado con otros antgenos, puede hacerse primero una separacin por electroforesis en gel de poliacrilamida con duodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE [por sus siglas en ingls "polyacrylamide gel electrophoresis"]), de manera que la posicin de las diferentes protenas en el gel est en funcin de su tamao molecular. Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforticas, dado que renen propiedades idneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos qumicos. Los aminocidos y protenas poseen cargas positivas y negativas debido a la presencia de grupos ionizables con el grupo carboxilo o el grupo amino, por lo que en una solucin pueden estar cargados positiva o negativamente o como molculas neutras o sin carga (punto isoelctrico). En la tcnica de SDS-PAGE, se mezclan las protenas con el detergente aninico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. Los complejos protena/SDS poseen una estructura elipsoide o de bastn, donde la cadena proteica es distendida y solubilizada por el detergente, estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamao, mayor movilidad de la protena, y viceversa.

1.-Controles Se establecen como controles marcadores de peso molecular (PM) de diversas protenas ya conocidas para as comparar las bandas y determinar su PM.

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2.- Antgenos: Vacunas comerciales, sobrenadante de cultivos celulares entre otros. 3.-Colorantes: Estos son importantes ya que se unirn a la protena separada previamente y dar a conocer el respectivo peso molecular. La elaboracin de los geles consta de dos partes (gel separador y compactador); para la observacin correcta de las protenas. En el gel separador, la movilidad es restringida por el tamao del poro, el cual depende de la concentracin de reactivos del gel. As, si se requiere resolver componentes de muy alto PM, se utilizan geles al 5% o al 7,5%, mientras que los geles de poro menor, ej. 15-20% son tiles en la separacin de pptidos y protenas pequeas. Los geles de poro intermedio (10-12%) proveen una separacin adecuada para protenas de ~10.000-90.000 daltons.

Partes de un gel de SDS-PAGE. Est compuesto de dos geles de distinta porosidad y pH, que cumplen con funciones diferentes, para aumentar el poder de resolucin. Aplicaciones: Monitoreo de los esquemas de purificacin. Anlisis de la pureza del producto aislado. Combinacin con tcnicas de Inmunoelectrotransferencia o Western blot.
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OBJETIVO El alumno conocer el principio de la tcnica as como las ventajas, desventajas y distintas aplicaciones en el laboratorio de Virologa.

Prctica Electroforesis de antgenos vacunales

Material por grupo Matraces de 50ml Soluciones para la electroforesis Pipetas de 10 ml. Agua desionizada Micropipetas con puntas Cmara de electroforesis Fuente de poder Vacunas Marcador de peso Algodn Alcohol al 70% Franela Marcador indeleble Servitoallas Bolsas de residuos biolgico infecciosos roja y amarilla Solucin con desinfectante (cloro)

Material que deben traer de manera individual Guantes de exploracin

PROCEDIMIENTO + Armar la cmara de electroforesis. + Preparar las soluciones para el gel separador con los reactivos a temperatura ambiente. Gel separador (12%). Agua Destilada Tris HCl 1.5 M pH 8.8 SDS stock 10% Acrilamida-Bis (stock 30%) 3.35 ml 2.5 ml 100 l 4 ml
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Persulfato de amonio 10% (100 mg/ml.) Temed Total + Dejar polimerizar 30 minutos. + Colocar el gel concentrador.

50 l _5 l___ 10ml

Gel concentrador (4%) Agua Destilada Tris HCl 0.5 M pH 6.8 SDS stock 10% Acrilamida-Bis (stock 30%) Persulfato de amonio 10% (100 mg/ml.) Temed Total + Dejar polimerizar 45 minutos. + Enjuagar el gel con solucin tampn de corrida 1x. + Colocar las muestras (antgenos vacunales), previamente preparadas con buffer de lisis y de muestra, adems de colocar el marcador de peso preteido (10l). + Correr a 120 volts constantes y parar diez minutos despus de que salga el colorante de las muestras. +Desmontar el gel y teir con Comassie. +Interpretacin y anlisis. 1.5 ml 0.625 ml 25 l 0.325 ml 12.5 l _2.5 l___ 2.5 ml

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DISPOSICIN FINAL DE DESECHOS BIOLGICOS

Inspeccionar e identificar el material biolgico para clasificarlo de acuerdo a su origen y tipo segn la tabla anexa.

Tipo de residuos Sangre Cultivos celulares y virus Residuos no anatmicos derivados de la prctica

Estado fsico Slidos Lquidos Slidos

Envasado Bolsa de plstico Recipientes hermticos Bolsa de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos

Color Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo

Patolgicos (cadveres, fluidos y rganos, embriones de pollo Objetos punzo cortantes: agujas hipodrmicas , porta y cubre objetos, y cristalera

Lquidos Slidos

El material de cristalera utilizado durante la prctica como son tubos, matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI sern inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y esterilizados. REPORTE DE RESULTADOS Consultar el anexo. BIBLIOGRAFA Abbas, A.K., Lichtman, A.H. y Pober, J.S. Inmunologa Celular y Molecular. Tercera Edicin. Ed. McGraw-Hill-Interamericana. 1998. Coll M.J. Tcnicas de diagnstico en Virologa. Ed. Diaz de Santos S.A. 1993. Dinter, Z. Diagnostic Virology: A review of methods at the National Veterinary Institute. Ed. J. Moreno-Lpez . Swedish University of Agricultural Sciences, National Veterinary Institute, Upsala, Sweden, Swedish International Developing Authority. 1989.
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PRUEBA QUE DETECTA CIDOS NUCLEICOS: Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) INTRODUCCIN En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la tcnica de PCR que es una tcnica para la sntesis in vitro de secuencias especficas de ADN con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biologa Molecular ni en los procedimientos de diagnstico basados en el estudio de ADN. La tcnica se basa en el principio de replicacin del ADN en los organismos eucariotas, realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la sntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin de doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers o cebadores). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados in vitro de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de ADN que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reaccin en cadena de la polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas: 1 Desnaturalizacin del ADN de doble cadena 2 Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de las hebras 3 Elongacin de la cadena por la participacin de la ADN polimerasa En la primera etapa (desnaturalizacin) la doble hlice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas temperaturas (95C). La renaturalizacin se producir cuando la temperatura descienda. Se trata de una etapa crtica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 95C durante 30 segundos a 1 minuto. En el segundo paso (hibridacin) los cebadores se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los oligonucletidos: la composicin de bases, el tamao y la concentracin. En la prctica, la temperatura de hibridacin puede oscilar entre 45C y 65C, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde. En la tercera etapa (elongacin) se produce la sntesis de una cadena sencilla (producindose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la direccin 5-> 3 mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los
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desoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. En la mayora de las reacciones, la etapa de extensin se realiza a 72C. Tericamente esta temperatura puede variar entre 70-72C. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1000 pares de bases.

Temperaturas y tiempos de los ciclos La Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un nmero determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el nmero de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificndolos podemos optimizar la reaccin. El termociclador es el aparato que se utiliza para realizar la PCR y que nos permite controlar de forma precisa y homognea la temperatura y los tiempos. Nmero de ciclos Tambin adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el nmero de ciclos que se utilizan. Este nmero depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera emprica). Es importante no realizar un nmero alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificacin de productos no deseados originados por hibridaciones no especficas. Hay que tener en cuenta que la reaccin est producida por una enzima que sufre el efecto meseta que describe la atenuacin en la tasa de la acumulacin del producto. Despus de un nmero determinado de ciclos la amplificacin deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilizacin.
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Contaminacin en la PCR La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una tcnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequea) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la tcnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente. Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones: Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR Uso de instrumental exclusivo para la PCR Utilizacin de reactivos y tubos estriles Uso de guantes por el manipulador Realizacin de controles de blanco (se aade agua en lugar de ADN, no debe existir amplificacin).

Deteccin de DNA viral La tcnica de PCR nos permite identificar el ADN viral a partir de muestras muy pequeas, as como tambin aquellos animales que han sido negativos en pruebas que slo identifican Ac. Es una prueba confirmatoria de diagnstico para infecciones virales.

OBJETIVO Que el alumno identifique una tcnica de diagnstico viral basada en la deteccin de cido nucleico (ADN) utilizando la prueba de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), as como tambin su importancia a nivel de medicina veterinaria.

BIBLIOGRAFIA Abbas, A.K., Lichtman, A.H. y Pober, J.S. Inmunologa Celular y Molecular. 3er Edicin. Ed. McGraw-Hill-Interamericana. 1998. Coll M.J. Tcnicas de diagnstico en Virologa. Ed. Diaz de Santos S.A. 1993.

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PRCTICA 8 Hemoaglutinacin e Inhibicin de la Hemoaglutinacin. HEMOAGLUTINACIN INTRODUCCIN El fenmeno conocido como hemoaglutinacin (HA) fue descrito por primera en 1941 por Hirts, quien analizo el mecanismo de aglutinacin ocasionado por el virus de la influenza. Este proceso no es un fenmeno inmunolgico, es una actividad enzimtica por medio de la cual algunos virus y los micoplasmas se unen a los eritrocitos de aves y mamferos. La deteccin de la HA inducida por virus sirve de prueba preliminar para identificar un virus. Muchos virus contienen en su superficie glicoprotenas como la hemaglutinina y neuraminidasa, la primera tiene la capacidad de aglutinar glbulos rojos de ave, cuye, o de humano tipo O y de otros mamferos. Los virus que poseen la caracterstica de HA son los Orthomixovirus, los Paramixovirus, los Flavivirus, los Bunyanvirus, algunos Adenovirus, Reovirus, Parvovirus y Coronavirus. La HA se basa en la capacidad que tiene la enzima hemoaglutinina para unirse a receptores localizados en el estroma de los eritrocitos. Y esta se produce cuando la proporcin de hemoaglutinina viral y de eritrocitos es ptima, permitiendo la unin de varios eritrocitos adyacentes a una unidad de hemoaglutinina. OBJETIVOS El alumno se adiestrara en el manejo de las tcnicas de hemoaglutinacin e inhibicin de la hemoaglutinacin, reconocindolas como un mtodo sencillo y til para el diagnstico de ciertas enfermedades virales. El alumno aprender el manejo de las tcnicas de hemoaglutinacin e inhibicin de la hemoaglutinacin e interpretar la titulacin de un virus hemoaglutinante y de suero de animales inmunes. MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo Alcohol al 70% Solucin buffer de fosfatos (PBS) solucin salina fisiolgica (SSF) Solucin de eritrocitos al 0.2 - 0.5% (Ave) o al 1 % (Perro) Microplaca de 96 pozos de fondo en U Micropipetas de 0-200l con puntas
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 Marcador indeleble Franela Masking tape Material por Grupo Virus Lector de placa Solucin con desinfectante (Cloro) Guantes de exploracin (por alumno)

PROCEDIMIENTO 1. Agregar 50l de PBS o SSF a cada pozo de una fila completa de la microplaca de fondo en U. 2. Agregar 50l de virus al primer pozo 3. Realizar diluciones dobles seriadas transfiriendo 50 l del pozo 1 al 2, y del pozo 2 al 3 y as sucesivamente hasta terminar en el pozo 12, obteniendo una dilucin 1:2048. 4. Agregar 50l de la suspensin de eritrocitos del 0.2 al 1% (segn la especie) a cada pozo. 5. Se deber contar con un control negativo, donde se le agregar solamente 50l de PBS + eritrocitos. 6. Mezclar suavemente 7. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 30 min, o hasta la formacin de un botn bien delimitado en el fondo del pozo del control negativo. 8. Realizar la lectura con el lector de placa. INTERPRETACIN Titulo: El punto final de la titulacin del virus se encontrar en la dilucin ms alta que produzca el 100% de hemoaglutinacin. Unidad Hemoaglutinante (UHA): Mnima cantidad de virus capaz de hemoaglutinar el 100% de eritrocitos. Control de UHA: Determinar el volumen en mililitros en el cual se tienen las UHA deseadas, en el caso de 8 UHA: Ttulo del antgeno = X ml 8 UHA deseadas
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Ejemplo: Se tiene un antgeno cuyo ttulo es de 1:320 y se quiere trabajar con 8 UHA. Sustituyendo valores tenemos: 320 = 40 ml. 8 REPORTE DE RESULTADOS Consultar el anexo.

INHIBICIN DE LA HEMOAGLUTINACIN INTRODUCCIN Los anticuerpos (Ac) que son capaces de reconocer a sus antgenos virales correspondientes, se unen al virus en sus sitios de unin, por lo tanto inhiben la hemoaglutinacin. Este fenmeno se utiliza como mtodo para identificar un virus especfico y para medir la concentracin de Ac en el suero sanguneo. Para realizar la prueba de Inhibicin de la Hemoaglutinacin, primero es necesario titular el virus para determinar su actividad hemoaglutinante y se recomienda utilizar cuatro u ocho veces la dosis mnima hemoaglutinante, (es decir cuatro u ocho unidades hemoaglutinantes (UHA). MATERIAL Y REACTIVOS Material por equipo Suero de ave Solucin antignica de Virus (4 8 UHA) Solucin de eritrocitos al 0.5% Microplaca de 96 pozos de fondo en U Micropipeta de 0-200l con puntas. Franela Alcohol al 70% Marcador indeleble Masking tape Guantes de exploracin (por alumno)
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Material por grupo Lector de placas Solucin con desinfectante PROCEDIMIENTO 1. Agregar 50 l de PBS o SSF a toda una fila de la microplaca de fondo en U 2. Agregar 50l de suero al primer pozo. 3. Realizar diluciones dobles seriadas transfiriendo 50 l del pozo 1 al 2, y del pozo 2 al 3 y as sucesivamente hasta terminar en el pozo 12 obteniendo una dilucin 1:2048. 4. Agregar 50l de virus (4 -8 UHA) a cada pozo de la fila de la microplaca de fondo en U. 5. Incubar a 37 C durante 30min. 6. Agregar 50l de la suspensin de eritrocitos del 0.2 al 1% (segn la especie) a cada pozo. 7. Mezclar suavemente 8. Dejar incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 9. Se deber contar con un control positivo, donde se le agregar solamente 50l de virus + eritrocitos y un negativo (PBS + eritrocitos) INTERPRETACIN Ttulo: Corresponde a la menor cantidad de anticuerpos unidos al virus que inhiben la Hemoaglutinacin (HA); esto se observa en el fondo del ltimo pozo en que se forma un botn de glbulos rojos bien delimitado.

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DISPOSICIN FINAL DE DESECHOS BIOLGICOS

Inspeccionar e identificar el material biolgico para clasificarlo de acuerdo a su origen y tipo segn la tabla anexa.

Tipo de residuos Sangre Cultivos celulares y virus Residuos no anatmicos derivados de la prctica

Estado fsico Slidos Lquidos Slidos

Envasado Bolsa de plstico Recipientes hermticos Bolsa de plstico Recipientes hermticos Recipientes rgidos

Color Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo

Patolgicos (cadveres, fluidos y rganos, embriones de pollo Objetos punzo cortantes: agujas hipodrmicas , porta y cubre objetos, y cristalera

Lquidos Slidos

El material de cristalera utilizado durante la prctica como son tubos, matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI sern inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y esterilizados. REPORTE DE RESULTADOS Consultar el anexo. BIBLIOGRAFA Plan Nacional de Sanidad avcola, manual de procedimientos; Influenza Aviar Altamente Patgena, Secretara de Agricultura, Ganadera y Pesca, 2003. Prescott L., Harley J., Klein D. Microbiologa. Ed. McGraw-Hill- Interamericana, 1999. Tizard I. Inmunologa Veterinaria. Ed. McGraw-Hill-Interamericana, 4 Ed. 1995.

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ANEXO MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA LABORATORIO DE VIROLOGA Prctica__________________________________ Grupo________ Equipo________ Semestre_______ Nombre del alumno(s)__________________________

Fecha________________ Calificacin_____________

1.- Describe brevemente el procedimiento que realizaron.

2.- Qu virus utilizaron?

3.- Qu resultados obtuvieron? (Si es necesario realiza dibujos).

4.- Conclusiones.

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