Abono Orgánico Fermentado Tipo

ABONO ORGNICO FERMENTADO TIPO "BOCASHI"
Bocashi es una palabra japonesa, que significa materia orgnica fermentada. En buenas condiciones de humedad y temperatura, los microorganismos comienzan a descomponer la fraccin ms simple del material orgnico, como son los azcares, almidones y protenas, liberando sus nutrientes
Insumos que se requieren: 1. 2 bultos de rastrojo o de cualquier residuo de cosecha: tamo, bagazo de caa, pasto, etc. Tambin se puede reemplazar con cascarilla de arroz. El material que se utilice debe estar bien seco y picado. 2. 2 bultos de boiga fresca. 3. 2 bultos de tierra cernida de la finca. 4. 1 bulto de carbn vegetal quebrado en partculas pequeas. 5. 5 kilos de salvado de cualquier cereal: trigo, maz o arroz. Tambin se puede utilizar el afrecho de arroz. 6. 5 kilos de ceniza de fogn o de cal agrcola o de cal dolomita. 7. 5 kilos de tierra virgen de bosque nativo (suelo de capote). 8. 4 kilos de melaza. Se puede utilizar 8 litros de miel de purga o de jugo de caa. 9. 200 gramos de levadura granulada para pan. Agua. La cantidad depende de la (prueba del puo). ELABORACIN Y RECOMENDACIONES
Empezamos mezclando el material vegetal (bagazo, tamo, cascarilla, pasto, etc.) con la boiga, luego le revolvemos la tierra cernida, siempre procurando que todo quede muy bien mezclado. Despus seguimos el orden enumerado en la lista de arriba. El montn se debe elaborar y mantener en un sitio cubierto, donde no lo afecte la lluvia, el viento o los rayos solares. De no controlar estos factores, se afecta la calidad final del abono e incluso se llega paralizar la fermentacin. L a melaza se desata en agua, ojala caliente, y ah mismo se revuelve con la levadura. Cuando el montn queda listo, se le aplica esta mezcla, en la medida que lo vamos volteando.
Durante los primeros das, el montn se tapa con costales o con cualquier material permeable que permita el intercambio gaseoso. Nunca se debe cubrir con plstico ya que el vapor se condensa en forma de agua, impidiendo una adecuada fermentacin. El volteo se realiza dos veces por da, una vez por la maana y otra vez por la tarde, durante los 4 o 5 das iniciales, los siguientes 10 das se voltea una vez por da. Esto es indispensable hacerlo as para controlarle la temperatura de fermentacin. Podemos chequear la temperatura utilizando un termmetro de punz. Con el volteo impedimos que la temperatura sobrepase los 50 C. La pila de abono puede tener una altura de 50 a 60 cms. A medida que pasan los das, la altura se va bajando gradualmente, extendiendo el montn hasta lograr una altura de 20 cms. Sabemos que el abono est listo porque su temperatura es igual a la temperatura ambiente, su color es grisceo, queda seco y de consistencia polvosa. Lo ideal es utilizarlo inmediatamente pero se puede empacar en costales y guardarlo hasta por 2 meses. Es importante no descuidar tanto la humedad como la temperatura, porque la actividad microbiolgica puede perjudicarse por la falta de oxigenacin o por un exceso de humedad. Cuando ya tengamos experiencia acumulada en la elaboracin del abono Bocashi, seleccionamos una buena cantidad del mejor abono que hayamos producido para utilizarlo como semilla o sea, como la principal fuente de inoculacin, acompaada de una determinada cantidad de levadura. De esta manera eliminamos el uso de la tierra de bosque nativo y el uso de carbn vegetal, para evitar consecuencias graves por el deterioro de los bosques. COMO SE UTILIZA EL ABONO ORGNICO BOCASHI 1. En los semilleros se puede mezclar con tierra cernida y con carbn vegetal pulverizado en proporcin de 60% a 90% de tierra y 40% a 10% de bocashi. 2. Abonado directo en la base del hoyo donde se coloca la planta, una vez que se trasplant, teniendo cuidado de cubrir el bocashi con un poco de tierra para
que la raz de la planta no quede en contacto directo con el abono ya que as se puede quemar. 3. Abonado a los lados de las plantas. Este sistema sirve para hacerle una segunda y tercera abonada de mantenimiento a los cultivos 4. Abonado directo a los surcos donde se ir a establecer el cultivo que se quiere sembrar. Independientemente de la forma como lo utilicemos, el Bocashi siempre se debe cubrir con tierra para que no se pierda y as obtener mejores resultados. 5. Algunas dosis sugeridas: -hortalizas de hojas > de 10 a 30 gramos, en la base. -hortalizas de tubrculo o que forman cabeza >hasta 80 gramos. -Tomate y pimentn > de 100 a 120 gramos. - Pastos de corte > de 1 a 5 kg. Por m2 -En hortalizas de ciclo corto (Ej. rbano), con una sola aplicacin es suficiente. En especies semestrales podemos hacer 2 aplicaciones, mximo tres. No perdamos de vista que la dosis a aplicar no es algo fijo, depende de la fertilidad original del suelo donde vamos a cultivar, del clima imperante y de las necesidades especficas de nutricin del cultivo que tengamos. Por eso es muy importante que con creatividad e iniciativa, nosotros mismos experimentemos hasta determinar lo que es ms apropiado.
Publicado por cantor676 @ 11:00 PM Comentarios (0) Comentarios Aadir comentario
biologia molecular
Jean-Pierre HERVEG y Maritza BARCIA-MACAY
xpressin de genes clonados en E.

Cochabamba, Bolivia, abril 2006
plan
ipcin en las bacterias C. Expresin de genes de mamferos en bacteria .....a. protenas de fusin .....b. protenas no fusionadas .....c. cuerpos de inclusin D. Ejemplos .....a. La insulina .....b. La hormona del crecimiento humano (hGH)
n: La transcripcin en general la transcripcion: el opron lactose de la transcripcin merasa (ARN pol): dad sigma:
transcripcin ores (t)
cin en los procariotas cia Shine-Dalgarno (SD)
a continuacin
s para el examen
anscripcin. el azcar y la basa especficos del ARN? base se aparea el uralcilo? stece la hidrlisis del PPi? ve un promotor? alabra opron. rencia hay entre operon y policistron? ue X-gal? ue lacZ? que IPTG? peron y repressor.
13. Cul es la protena codificada por el gen i en casa de E 14. Cmo la ARN pol de E. coli hace para fijarse sobre su p 15. Que es que la caja de Pribnow? 16. Que es que un terminador? 17. Cmo se acaba la transcripcin? 18. Que es que la secuencia de Shine-Delgarno? 19. Queremos exprimir un gen de mamfero en E. coli, cu problemas puestos? 20. Que es que una protena de fusin? 21. Podemos producir protenas nativas en casa de E. coli? 22. Lo que es lo que una etiqueta histidina? 23. Describa la sntesis de la insulina por E. coli.
el opron lactose.
a continuacin
nscripcin en las bacterias
uccin: La transcripcin en general
in es el proceso por el que se transmite la informacin el ADN al ARN. La ARN polimerasa utiliza como e las dos cadenas del ADN, la cadena codificante. Al a transcripcin se reconoce un sitio especfico de la ADN en el que se van a unir las protenas del complejo merasa. Este sitio especfico se denomina promotor del
ores de la transcripcin
N, el ARN es una molcula de cido nucleico. El ARN est formado por una nica cadena. El azcar del bosa. El ARN tiene los nucletidos G, A y C, pero la sutituye por el uracilo (U).
e sirve como una suerte de mensajero gentico, o la informacin guardada en el ADN de la clula, leo (En las clulas que tienen un ncleo) hacia otras clula donde se usa para ayudar a producir protenas.
anscribe a partir de una de las dos cadenas del ADN.
slo lo que es neceser para nuestro curso. Para de informacin el estudiante debe ir a el sitio: m.es/~molecula/anucl03.htm
-------------------nas olde ar
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osa azcar de 5 carbonos. Es un componente estructural structura del ARN, como el ATP, GTP, CTP y TTP. parte de la estructura de los nucletidos que forman N.
cilo a de las 4 bases del ARN. Se representa con la letra el ARN, El uracilo reemplaza a la timina. El uracilo se a con la adenina. El porqu el ARN contiene uracilo de timina No es conocido.
a continuacin
rasa y rNTPs rgada de la sntesis de ARN a partir de molde de ADN. promotor que cataliza consiste en:
La polimerasa se une a una secuencia llamada promotor que normalmente est delante de la secuencia que especifica el duos + NTP <===> (ARN)n-residuos + 1 + PPi. primer nucletido que est en el RNA (incluyendo en el prom sido trifosfato (ATP, CTP, GTP y UTP); posteriormente, y todas las bases se toman desde ese punto de referencia, d roliza, lo que abastece la energa de la reaccin. detrs +. El resto del promotor no se transcribe.
lulas contienen una o varias ARN polimerasas. es esta una enzima. Esta enzima sintetiza todo los to el necesario para el cebador en la replicacin del accin es catalizada por la primasa). eriofagos sintetizan una ARN polimerasa que solo N especfico del fago. En eucariontes hay 4 5 ARN diferentes que sintetizan diferentes tipo de ARNs.
ribonucletidos Los nucletidos, ribonucletidos y desoxiribonucletidos est compuestos de una base nitrogenada, un azcar (ribosa o de y un grupo fosfato. Si el azcar es ribosa se trata de ribonucl constituyente del ARN.
---------ador.
ol de la tanscripcin: on lactosa:
a opern lactosa a una sucesin de gens adyacentes, n un slo ARNm. El opern contiene tambin la regin n.
s se encuentran en los eucariotas (Trypanosmas spp.) procariotas. En la figura de la derecha, se ha do el opern lactosa, comenzando por el gene [i], operador [Op]. El contiene regiones que codifican la a [Z], la permeasa [Y] y una transacetilasa [A].
ica el rpresseur. En la ausencia de lactosa, el codificado por un gen [i]. el represor se fija en el p] y la transcripcin del opern se inhibe.
asa y X-Gal: los productos de la hidrlisis de la lactosa: la glucosa y La -galactosidasa hydrolisa la lactosa. Si no ctosa en el medio de cultivo, E. coli exprime solamente -galactosidasa. Al contrario, en presencia de lactosa, idasa es abundantemente expresada. La a hidrolisa tambin el substrato sinttico X-gal: ella onces un compuesto coloreado en azl.
ptido (lacZ): pptido es una parte de la -galactosidasa que no dad por s misma, pero que es necesaria para la accin . LacZ forma parte del gen de -gal. Es posible cortar LacZ y meterla en un plasmido donde ella exprimir el Existen cultivos comerciales de E.coli a los cuales se o el alfa pptido y de plsmidos que continen se a poseer actividad -gal, sas bactrias deben haber tadas con un plsmido codante de LacZ.
actosa y el IPT): uando est presente es un inductor de la expresin de n otros compuestos capces de reaccionar inducir. orio, se utiliza como inductor el isopropil -b-DIPTG). En efecto, al contrario de la lactosa, el IPTG no ado y subsiste en el medio.
El operador: Es una secuencia en el opern en la que se fija el repre La disposicin espacial unducida por la fijacin de se r el operador impide que la ARN polimerasa se fije en el A comenzar la sntesis de l'ARNm codificante de la -gala
enzo de la transcripcin
rasa (ARN pol): rias slo existe una ARN polimerasa (ARN pol). Las las bacterias se unen directamente al ADN sin utilizar de iniciacin. La ARN pol de la bacteria E. coli est or una enzima de base tetramrica que contiene subtipo alpha y con una esteroquiometra alpha2'. El pha2' es suficiente para alargar la transcripcin.
ad sigma: por otro lado necesita la sub-unidad sigma, que sta holoenzima (alpha2'sigma). El factor sigma promotor. La enzima de base se puede unir al promotor de sigma, pero solamente de manera inficaz y sin . La funcin principal del factor sigma es la de eficiencia de la unin de la ARN polimerasa al promotor os enlaces inespecficos. Un solo factor s (s70 chez E. za la transcripcin de la mayora de gens. Ciertos s (virus de bacteria) como el T4, sintetizan su propio iene la habilidad de cambiar la enzima de base de su li para que ella slo y nicamente transcriba los gens
merasa explora la doble hlice del ADN de la bacteria y nera dbil a ella hasta que encuentra a un promotor. La La distancia entre los 2 sitios representa un solo giro de ne entonces fuertemente a la secuencia del promotor, que permite a los 2 motivos de reaccionar al mismo tiem n segmento pequeo de ADN cercano del promotor y factor sigma. transcripcin de ste ADN en ARN. El factor sigma se holoenzima cuando alrededor de una docena de os han sido asemblados. El primer nucletidodo de la DN contiene genralmente una purina (adenina s promotores bacterianos poseen cuatro caractersticas ) lel punto de comienzo de la transcripcin, denominado uencia de la posicin 10 llamada caja de Pribnow 3) la secuencia 35 (TGTTGACA) y (4) la distancia entre as 10 y 35. E punto donde se inicia la transcripcin es una purina (A ou G).
a continuacin
La efficiencia de la terminacin en sitios r-independient entre menos de 25 % a ms de 75 %.
nar la transcripcin
s (t): rias y las levaduras, la transcripcin se termina en discretas llamadas terminadores (t) gracias a dos que responden ms a una seal de transcripcin del una seal del gen.
r -independiente: o ms comn es el fin intrnsico terminacin r e. Los transcriptos adoptan estructuras secundarias a la ARN polimerasa a frenar. Un motivo o secuencia n frequente es una secuencia repetida, inversada y seguida por una secuencia poly-U.
terminaison r-dpendante: El otro mecanismo de finalizacin (terminaison r-dpend llamado dependiente, es poco utilizado por los gens del bacteriano, pero frequentemente utilizado por fagos, co lambda. Este utiliza una protena que se llama r (rho) qu capacidad de poder unirse a un sitio especfico del trans sitio a menudo contiene una secuencia rica en citidina, guanosina y tiene una longitud de 50 a 100 nucletidos. r separa el ARN transcripto a partir de un ADN matrz p una reaccin directa con la ARN polimerasa.
e rico en G, C forma una especie de bincha horquilla, la ARN polimerasa a hacer una pausa. En se 2 hebras de ADN se encuentran y pueden aparejarse. merasa se dissocia entonces de la matrz y una de las RN formado se libera.
raduccin en las rias
cia Shine-Dalgarno (SD):
acin del ribosoma utiliza el codn de iniciacin de la AUG) y una secuencia de 3 a 9 nucletidos situadas 1 nucletido encima del codn de iniciacin. Esta e denomina Shine-Dalgarno (SD) y es complementaria ad 3' del ARN 16S de la E. coli. La secuencia s UAAGGAGG. El enlace del ribosoma al ARN es el cruze entre la secuencia SD del ARNm y la e la extremidad 3' del ARN 16S
a continuacin
esin de genes de mamferos en la E. coli
bacterianas son extremadamente tiles para la ctiva de protenas de mamferos, immunolgicamente
Otro problema es que las proteinas producidas por sto pueden presentar modificaciones post-tranduccionales formacin incorrecta de enlaces disulfuros, glucosilacin fosforilacin, oligomerizacin protelisis. Modificacion han sido efectuadas por las clulas bacterianas. Este pr particularmente agudo cuando se busca la expresin de de superficie, hormonas extracelulares y ciertas enzima
e fusin mpuestas, formadas de una porcin amino-terminal a beta-galactosidasa (LacZ) fusionada en protenas on utilizadas para preparar anticuerpos policlonales s. Estos anticuerpos se pueden usar para purificar r cromatografa de afinidad, para diagnosticar y veles de protenes, para localizar protenas en en tejidos y en clulas individuales y en combinacin nicas como la immunofluorescencia.
La expresin de gen de mamferos en la E. coli necesita resolver los problemas siguientes:
1. los promotores eucariotas no son reconocidos por la polimerasas bacterianas. 2. los gens eucariotas contienen intrones.
3. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducido ribosomas bacterianos ;
tactas nativas nas intactas nativas han sido ya producidas en grandes n la E. coli para realizar estudios funcionales. En otros ran cantidad de protenas eucariotas han sido a partir de bacterias pero con replicacin de manera poco eficz y con poca actividad biolgica.
4. las protinas presentes en grandes cantidades en las forman cuerpos de inclusin insolubles
5. las protenas eucariotas pueden ser reconocidas com extraos (foreign bodies) por las proteasas de la bacte degradadas.
protenas de fusin
ector pUR278:
lonar un gen se utilizan plsmidos disponibles en el do para ser usados en biologa molecular. As como uchos de plsmidos comerciales, escogeramos uno: mido pUR278. Insertamos el gen de la protena en la e clonaje. La protena de fusin ser precedida de la alactosidasa (lacZ). El plsmido as transformado se ce en una bacteria a la que se le ha suprimido el gen
un gen de inters en 3' (= arriba) en un gen de con lacZ, ofrece tres ventajas:
otena de fusin se puede producir en grandes ades puesto que los sitios de iniciacin de la ipcin y de la traduccin son secuencias normales E. coli.
3. las protenas de fusin son ms grADNes que la may protenas de la E. coli y fciles de identificar en un gel d poliacrilamida. La porcin del gel que contiene la proten recuperarse y ser utilizada para immunizar animales po
protenas de fusin son ms estables que las nas extraas nativas.
odificar la rejilla de lectura. El ltimo codon del primer gen ido por el primer codon del segundo. Hacen falta varios realizar esta continuidad. En efecto, cada vector posee cion colocados para resolver este problema.
disponibles como el plsmido pUR278, posen una serie de ccin que permiten la introduccin de un fragmento de ADN entradas posibles en la parte 3' del gen lacZ. En ciertos truccin del gen de fusin necesitar ya sea rellenar tremo adhesivo.
a continuacin
pMAL:
ding protin (MBP) inding protin (MBP) es una protena periplsmica. El s puede tambin ser clonado en el vector pMAL a lo malE de la E. coli que codifica la protena de ligado a maltose binding protein, MBP). La MBP es una protena que participa al transporte de maltosa en la bacteria. omotor tac y a otras seales de iniciacin de la e la MBP, puede exprimir grandes cantidades de usin.
tac and IPTG: ac es un promotor hbrido trp-lac que puede ser el represor lac, inducido por el inductor IPTG. El gen fica el represor est presente en el plsmido.
acin alpha: polylinker utilizada para la insercin de ste ADN t situada en la parte amino-terminal del fragmento de sidasa (No representado en el esquema de derecha) a complementacin alpha, lo que le dona una blanco/azl a las colonias bacterianas obtenidas.
de la proteina: e fusin producida por plsmido recombinante se ferentes etapas, desde cromatografa de afinidad dad de la MBP por la amilosa. Luego se la libera de la diante la utilizacin de una solucin de maltosa. En la asos, la protena de fusin es soluble. Los rendimientos son del rden de 100 mg/L. As mismo, el vector pMAL ra que la protena de fusin obtenida presente una reconocimiento por una proteasa especfica, (Facteur ase ou thrombine) lo que permite de separar la nters de la MBP.
a continuacin
tenas no fusionadas
ET-3a (Stratagen).
s no fusionadas pueden tambin ser producidas en las e procede insertando el ADNc de inters en el vector a n promotor fuerte e inducible y tambin de una seal rmita una traduccin efficiente de la protena en los ribososmas de E. coli. Los niveles de expresin 1 y 30 % de protenas totales de la bacteria. En la os casos, sto significa un enriquecimiento de al menos en relacin a la produccin natural de la protena. El a es uno de los vectores.
r una de sas protenas, es necesario entonces ADNc, el vecteur pET-3a, la bacteria husped eventualmente el plsmido hte pLys.
T-3a (promoter T7). expresin pET-3a contiene un promotor fuerte, el bacterifago T7 (P T7). Este promotor es especfico de ol, no deja acceso del ARN pol de la E. coli al gen T7 ARN pol usa el gen de T7 que ha sido insertado en a de la bacteria husped. n del ADNc clonado es txico para la bacteria, los xpresin de la T7 ARN polimerasa son mantenidos muy o las bacteria se multiplican. Justo antes de cosechar se induce la expresin masiva de la T7 ARN pol.
husped (T7 ARN pol gene, IPTG controlado). a bacteria lisgena BL21 (DE3), en cuyo cromosoma se el gen que codifica la T7 ARN pol precedido del UV5. La expresin del gen de T7 ARN pol se controla promotor LacUV5. Este es un promotor del opern ucible por la IPTG. Slo muy dbiles niveles de T7 RNA pol se producen cuADNo ste no es inducido.
Si el ADNc se clona en el sitio NdeI, la protena expresa una protena de fusin. Se puede observar en el esquem prove el codn ATG del gen a clonar. Si al contrario, si la protena se clona al nivel de BamHI una protena de fusin. Si estudias cuidadosamente el e presentado, podrs ver que ella comienza por los prime aminocidos de la regin lder del gen 10 (ste gen cod regin lder de la protena principal de la cpside del ba T7). El plsmido pET-3 contiene tambin el terminador del b T7 (T T7).
pLys. ar ms estrictamente el nivel de la T7 ARN pol en la utiliza bacterias que contienen el plsmido pLys. Estos odifican la lisoenzima de T7 que es un inhibidor de la T7 asa. Ellas reducen la capacidad de sta polimerasa de DNc cuando el promotor lacUV5 no est inducido.
inters se clonan en el plsmido sea en el sitio Ndel
mHI.
a continuacin
KK240-11
e restriccin Nco I n promotor bacteriano, el segundo factor ms importante un gen eucariota en una bacteria, como la E. coli es el de eficiente de fijacin al ribosoma. Cuando se busca la un gen procariota, el sitio de fijacin del ribosoma de se udo suficiente. Se procede entonces a clonar el gen de go del promotor (fuerte inducible), utilizando un sitio de 5' de la secuencia Shine-Dalgarno, para obtener niveles de vados.
El ATG est includo en el sitio de restriccin NcoI. El plsmi entonces por NcoI y la extremidad adhesiva se rellena con e Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli.
A la extremidad derecha de ste arreglo se le puede aadir u de ADN que comienze por el segundo codn del gen a expri fragmento es fcilmente preparado por PCR utilizando la Pfu polimerasa. El vector pKK240-11 pose un promotor tac y un fijacin de ribosoma del gen LacZ y tambin los terminadore transcripcin T1 y T2 del gen 5S de E. coli.
cin al ribosoma se puede mejorar y hacer eficiente si se esin de gens eucariotas y procariotas con sitios de fijacin s. Esto se realiza insertADNo el gen de inters en un mo el pKK240-11, y asegurndose que el segundo codn de al codn ATG del vector.
QE de Quiagen a Histidina)
de purificacin de protenas recombinantes se basa en n de que un segmento de una protena constitudo de 6 histidina se une a metales de transicin mediante el dores.
codificante de la protena se clona an un plsmido o de una secuencia que codifica la 6 Histidina. Las cariotas producidas pueden representar hasta 50 % de celulares totales. Las bacterias son lisadas y ste eriano se deposita en una columna de resinas Ni++Tri-Acetic Acid). Los iones Ni++ complexados en los s de coordinacin por la resina tienen una alta afinidad dinas consecutivas fijadas a la protena.
ede fijar hasta 5 mg protena/ml de resina. La afinidad Ni++-NTA por las 6 Histidina es ms grADNe que la tre antgeno-anticuerpo. Por lo tanto no es influenciada denaturantes como la rea 8M el hidrocloruro de M. Debido a que hay slo un nmero limitado de NF6 presentan 8 histidinas consecutivas) que de ral se unan a metales de transicin, las protenas e secuencia 6 histidina pueden ser purificadas en una a protena pura se la obtiene aadiendo imidazol como etidor. El nivel de recuperacin es alto, an si slo 1% del total de protenas provenientes de la lsis
de las 6 Histidina no tienen carga a pH fisiolgico y muy raramente la conformacin de la protena a la cual servADNo la funcin de la otra protena. Adems no su secrecin y es poco immunognica en la mayora de salvo en el mono.
a continuacin
rpos de inclusin
racin elevada de protenas en la E. coli provoca a paricin de grnulos citoplasmticos cuerpos de olubles. Despus de la lsis de bacterias, los cuerpos se recuperan mediante centrifugacin y se lavan con (Triton X-100) y de EDTA. Para cada protena es
CuADNo la protena es por fin solubilizada, se debe enc manera adecuada de eliminar el agente denaturante y l recupere su conformacin original. Ejemplos de protenas de mamferos expresadas en E.
Algunas protenas de eucariotas, como la insulina y la h crecimiento humana son exprimidas de manera eficient costo en microorganismos.
apatar un protocolo apropiado. A menudo se utiliza el de guanidina (5 8 M), la rea (6 a 8 M), el SDS decyl Sulfate), un pH alcalino una mezcla de de propanol.
a continuacin
mplos
ulina
de la insulina: dicamento producido por ingenra gentica y con la cia de sta clase, es la insulina humana, destinada al de la diabtes. Este producto reemplaz a la insulina pncreas del cerdo y la vaca. A pesar de que sta biolgicamente activa en el hombre, su secuencia en no es idntica a aquella de la molcula humana. Es ciertos pacientes producen anticuerpos contra sta
ulina: egula el metabolismo de los azcares y es e secretada en la sangre por las clulas del pncreas. na de 108 aminocidos, con una secuencia hidrofoba seal (24 aminocidos) que le permite atravezar las ntracelulares y que se conoce como pre-proinsulina.
y peptido C su transporte, la secuencia seal de 24 aminocidos la cadena del polipptido, formando la pro-insulina, cena en vesculas que se lian a las membranas de las reticas. La pro-insulina es entonces replegada como una letra G, los 2 extremos del chorro sostenidos puentes disulfuros y entonces transformada en insulina vesculas pancreticas mediante la excisin e un segmento polipptidico de 33 aminocidos omo pptido
dura: madura est formada de 2 cadenas distintas, una de 21 (la cadena A) y la otra de 30 aminocidos (cadena B); uentes disulfuros iguales. La insulina no contiene ardicas.
in de la insulina usADNo E. coli : osmico de la insulina no puede ser utilizado para el a insulina en la bacteria, puesto que el codifica la preue tiene una subdependencia de secuencias eucariotas y adems contiene un intrn.
ue hubo que primero crear un ADNc de la proinsulina ia seal ni intrn) que pudiera ser unido a la extremidad DNc con un codn metionina (ATG) sintetizado e (en efecto, la AUG de la insulina se encuentra dentro cia seal). Este ADNc se inserta en un plsmido que mento del gen lacZ compuesto de un promotor y de la secuencia codante de la -galactosidasa, creando ena de fusin.
mido recombinado el que es introducido en la E. coli.
En la clula bacteriana, y bajo el control de secuencias regulacin del gen lacZ, de la ARNm es producido y tra protenas constitudas una parte de -galactosidasa fus la metionina suplementaria a la proinsulina. La insulina tratando la protena de fusin con bromuro de ciangen reactivo que corta las uniones peptdicas junto a los res metionina. La metionina no aparece en la secuencia de proinsulina nativa. La insulina recombinada se repliega estructura tridimensional gracias a la formacin de puen y el pptido C es cortado por proteasas dando lugar a la humana pura.
a continuacin
a hormona del crecimiento mano (hGH)
blema de la hGH: duccin de la hormona de crecimiento humano (hGH) . coli es otro ejemplo. La hormona de crecimiento mente producida en la hipfisis, es una protena de minocidos que regulan el crecimiento y desarrollo. Al ue la insulina, es una protena no glicosilada. ones frequentes de sta hormona estimulan el ento en nios con su deficiencia permitindoles ar una talla casi normal.
versa del caso de la insulina, las hormonas del ento de orgen animal son inefectivas en el hombre. e muchos aos se la extrajo de la hipfisis de eres humanos. Esta prctica adems de peligrosa n la infestacin de numerosos infantes con as de tipo prin. Como la insulina, la hGH es mente producida bajo forma de una protena sora portadora de una secuencia seal aminocidoal. La secuencia seal humana sinembargo no era cida por la maquinaria bacteriana de secrecin. Es e un gen hbrido se ide y construy de tal manera bacteria pudiera producir una versin casi normal de ena humana madura.
duction de hGH: gmento de ADN codificante de los aminocidos 1 a on sintetizados qumicamente. A lo bajo del primer un tripleto ATG se aadi. Por otro lado, un ADNc ante de los aminocidos 25 a 191 fueron obtenidos a e ARNm de las clulas hipofisarias humanas. Estos mentos de ADN fueron clonados abajo del promotor un plsmido. Este plsmido recombinado fu cido en la E. coli donde la produccin de la hormona cimiento humana se produj. o inconveniente de sta hormona recombinada era menzaba por una metionina que no era separada de ena restante del polipptido por las enzima de la a. Las bacterias sintetizaban entonces una protena
Adems, la protena deba seguir numerosas etapas pa purificacin y la separacin de las proteinas intracellular bacteria en questin. Otra manera de producir la proten bacteria entonces, era la de modificar la manera en que era secretada, ligando la secuencia codificante de la pro la secuencia seal de una de las protenas bacterianas La hormona de crecimiento producida por ste mtodo en el espacio periplsmico entre la membrana interna y la bacteria con la eliminacin frecuente de la seal pept proteasa bacteriana. La protena producida es finalment mediante alteraciones hipotnicas fuertes que rompen l externa. La hGH producida de sta manera no contiene iniciadora puesto que una proteasa bacteriana periplsm seal.
a desde todos los puntos a la original; incluyendo ad biolgica, a partir de una metionina iniciadora, que separaba.
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Jean-Pierre HERVEG y Maritza BARCIA-MACAY
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Cochabamba, Bolivia, abril 2006
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El Cuaderno de Por qu Biotecnologa n 49

Protenas recombinantes
Las herramientas de la biotecnologa
Durante la segunda mitad del siglo XX se lograron importantes avances en la biologa, que fueron estructura de doble hlice del ADN. Este hecho, que les vali a los investigadores James Watson caracteres de un individuo y cmo se transmiten de una generacin a la siguiente. A partir de est cdigo gentico comn. Esto significa que el ADN de un organismo est escrito en un cdigo qu
Se conoci que la informacin gentica en todas las clulas se traduce a protenas, componentes que catalizan (aceleran) reacciones qumicas en los seres vivos.
A comienzos de los aos 70 se descubrieron diversas enzimas en bacterias y virus, que fueron d
Endonucleasas de restriccin: enzimas bacterianas que reconocen secuencias especficas de el ADN en diferentes puntos (ver El Cuaderno N 34). ADN ligasas: enzimas que pegan fragmentos de ADN.
Transcriptasas inversas: enzimas virales que puede invertir la direccin normal de la transfere
ARN (cido ribonucleico) y luego se traduce a una protena. La transcriptasa inversa sintetiza AD
En ingeniera gentica o tecnologa del ADN recombinante, se utilizan estas enzimas para cortar clulas de un organismo distinto del inicial. En consecuencia, este organismo tendr ADN recomb denomina protena recombinante (ver El Cuaderno N 4, N 30 y N 34). Produccin de protenas recombinantes humanas
La recombinacin de genes humanos en el ADN de bacterias es una de las posibilidades que ofr humana obtenida a partir de la bacteria Escherichia coli. Esta tcnica es de gran valor porque las obtener en poco tiempo muchas copias del gen humano inserto en el ADN bacteriano, y producir A escala industrial, la produccin de protenas recombinantes involucra las siguientes etapas:
Fermentacin: las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que contienen Extraccin: las clulas son centrifugadas para recuperar las protenas de su interior. Purificacin: se separa la protena recombinante de las otras protenas bacterianas.
Formulacin: la protena recombinante es modificada para conseguir una forma estable y estr
Cada una de las fases de la elaboracin implica un manejo muy cuidadoso de los materiales y un Dependiendo del producto y del tipo de clula utilizada, la produccin de protenas recombinante producto, el valor nunca sobrepasar al gasto de aislar el compuesto desde su fuente original (po Productos biotecnolgicos destinados a la salud humana La ingeniera gentica permite que numerosas protenas potencialmente teraputicas, que antes
En la actualidad existen ms de 30 protenas aprobadas para su uso clnico, y cientos de genes d adecuacin clnica.
En Argentina, la autoridad regulatoria de la biotecnologa aplicada a la salud es la Comisin Naci Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa Mdica (ANMAT). Tiene como misin asesor Estudia y recomienda las normas vigentes que rigen el desarrollo, elaboracin y aprobacin de p
La tabla que aparece a continuacin enumera una diversidad de protenas recombinantes que ho pueden producirse antgenos y anticuerpos como protenas recombinantes, que se emplean en la
TABLA: Productos farmacuticos aplicados a la salud humana y que provienen de organismos ge Producto Factores de coagulacin Factor VIII Factor IX Factor VIIa Anticoagulantes Activador del plasmingeno tisular Activador del plasmingeno tisular Hirudina Hormonas Insulina Hormona de crecimiento Levaduras E. coli E. coli E. coli Levaduras Sistema de produccin
Cultivo de clulas de mam
Folculo-estimulante Paratiridea Gonadotrofina corinica Tirotrofina Luteinizante Calcitonina Glucagon Factores hematopoyticos Eritropoyetina (EPO) Interfern e interleuquinas Interfern alfa (IFN alfa) Interfern beta (IFN beta) Interfern gamma (IFN gamma 1b) Interleuquina 2 (IL-2) Vacunas Anti-hepatitis B Anti-hepatitis A Anti-enfermedad de Lyme Anticuerpos monoclonales recombinantes Anti-IgE (recombinante) Anti-TNF (recombinante) Anti-IL2 Otros productos recombinantes Protena morfognica del hueso-2 Galactosidasa Iaronidasa Protena C Beta-glucocerebrosidasa DNAsa Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 N8 La insulina: estructura y funcin
Cultivo de clulas de mam E. coli
Cultivo de clulas de mam E. coli Levaduras
Factor estimulante de colonias de granulocitos/macrfagos (GM-CSF) E. coli E. coli E. coli E. coli Levaduras Levaduras E. coli
Cultivo de clulas de mam E. coli
La insulina es una hormona producida por el pncreas. Tiene una estructura proteica y su funcin hasta que alcanza niveles elevados y puede causar diferentes complicaciones en el funcionamien una escasa o nula produccin de insulina, se puede regular el nivel de glucosa en la sangre (gluc
En 1921, los fisilogos canadienses Frederick G. Banting y Charles H. Best extrajeron por primer Estados Unidos. Luego, la insulina para diabticos se obtuvo a partir de pncreas de cerdos o va producir algunos problemas de reacciones inmunes adversas. Estructura de la insulina
La insulina es un hormona proteica constituida por 51 aminocidos. La sntesis de insulina atravie extremos. La mayora de la proinsulina se separa en dos partes: el pptido C" (conector) y la ins puentes disulfuro. La insulina recombinante
La insulina es el primer caso de protena producida por ingeniera gentica aprobada para uso en partir de bacterias como de levaduras, y sin ningn riesgo para la salud.
En la siguiente figura, se muestra un esquema general de la obtencin de insulina a partir de pn
En la siguiente figura, se muestra un esquema general de la obtencin de insulina a partir de pn
Si bien estos son los pasos a seguir para la obtencin de insulina recombinante, si se inserta en e estas dificultades se sintetizan qumicamente las secuencia de ADN correspondiente a las caden introducen en bacterias E. coli, donde se multiplican. Una vez purificadas las dos cadenas, se un final, la insulina humana biosinttica, es idntica en todos los aspectos a la insulina purificada del
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_49.asp
Uso de la biotecnologa en la fabricacin farmacutica

Las tcnicas de fabricacin farmacuticas modernas confan con frecuencia sobre biotecnologa.
Contenido
1 Insulina humana 2 Hormona humana del crecimiento 3 Factores de coagulacin de la sangre humana
4 Animales del campo de Transgenic 5 Referencias
Insulina humana
Entre las aplicaciones ms tempranas de la biotecnologa en la fabricacin farmacutica est el uso de DNA recombinant tecnologa a modificarse escherichia coli bacterias para producir a ser humano insulina, en que fue realizado Genentech en 1978.[1] Antes del desarrollo de esta tcnica, la insulina fue extrada de pncreas glndulas de ganados, de cerdos, y de otros animales del campo. Mientras que generalmente es eficaz en el tratamiento de diabetes, la insulina animal-derivada no es indistinguible de la insulina humana, y puede por lo tanto producir reacciones alrgicas.[2] Los investigadores de Genentech produjeron artificial genes para cada uno de los dos protena cadenas que abarcan la molcula de la insulina. Los genes artificiales entonces fueron insertados en plasmids entre un grupo de genes se "[3] se activan cerca lactosa. As, la insulina que produca genes tambin fue activada por la lactosa. El recombinant plasmids fueron insertados en las bacterias de coli de Escherichia, se indujo que que produjeran 100.000 molculas de insulina del ser humano de la cadena A o de la cadena B.[4] Las dos cadenas de la protena entonces fueron combinadas para producir las molculas de la insulina.
Hormona humana del crecimiento

Antes del uso de la tecnologa de DNA recombinant de modificar bacterias para producir hormona humana del crecimiento, la hormona fue fabricada por la extraccin del glndulas pituitarias de cadavers, como hormonas animales del crecimiento no tenga ningn valor teraputico en seres humanos. La produccin de la fuente de un solo ao de la hormona humana del crecimiento requiri hasta cincuenta glndulas pituitarias[5], creando las escaseces significativas de la hormona.[6] En 1979, los cientficos en Genentech produjeron la hormona humana del crecimiento insertando la codificacin de la DNA para la hormona humana del crecimiento en un plasmid que fue implantado en las bacterias de coli de escherichia. El gene que fue insertado en el plasmid fue creado cerca transcripcin reversa del mRNA encontr en glndulas pituitarias a la DNA complementaria. HaeIII, un tipo de enzima de la restriccin que acte en la restriccin localiza en los 3 ' regin noncoding[7] y en el 23ro codon en DNA complementaria para la hormona humana del crecimiento, fue utilizado producir un fragmento de la DNA de 551 pares bajos que incluye las secuencias de codificacin para los aminocidos 24 - 191 de HGH.[8] Entonces adaptador fragmento de una DNA qumicamente sintetizada que contiene un codon de la iniciacin de ATG[9] fue producido con los codons para los primeros con 23ro aminocidos en hormona humana del crecimiento. Los dos fragmentos de la DNA [eran] combinado para formar un gene hbrido sinttico-natural.[10] El uso de mtodos enteramente sintticos de produccin de la DNA de producir un gene que sera traducido a la hormona humana del crecimiento en los escherichia coli habra sido excesivamente laborioso debido a la longitud significativa de la secuencia del aminocido en hormona humana del crecimiento. Sin embargo, si el revs del cDNA transcrito del mRNA para la hormona humana del crecimiento fuera insertado directamente en el plasmid insertado en los escherichia coli, las bacterias traduciran las regiones del gene que no se traducen en
seres humanos, de tal modo produciendo una pre-hormona que contiene los aminocidos de un suplemento 26[11] cul pudo ser difcil de quitar.
Factores de coagulacin de la sangre humana

Antes del desarrollo y de la aprobacin del FDA del medios de producir sangre humana coagulacin los factores usando tecnologas de DNA recombinant, los factores de coagulacin de la sangre humana fueron producidos de la sangre donada para la cual fue defendido inadecuado VIH. As, la infeccin del VIH plante un peligro significativo a los pacientes con hemofilia quin recibi factores de coagulacin de la sangre humana: La mayora de los informes indican que 60 a 80 por ciento de los pacientes con hemofilia que fueron expuestos a los concentrados del factor VIII entre 1979 y 1984 son seropositivos para el VIH por [] el anlisis occidental de la mancha blanca /negra. En el da mayo de 1988, ms de 659 pacientes con hemofilia tenan SIDA[12] El factor de coagulacin de la primera sangre humana que se producir en las cantidades significativas que usaban tecnologa de DNA recombinant era Factor IX, que era el usar producido transgenic Clulas chinas del ovario del hmster en 1986.[13] Careciendo un mapa del genoma humano, los investigadores obtuvieron una secuencia sabida del RNA para el factor IX examinando aminocidos en el factor IX: Microsequencing de purificado altamente [Factor IX] suficiente secuencia rendida del aminocido para construir puntas de prueba del oligonucleotide.[14] La secuencia sabida del RNA del factor IX entonces fue utilizada para buscar para la codificacin del gene para el factor IX en una biblioteca de la DNA encontrada en el hgado humano, puesto que era sabido que los factores de coagulacin de la sangre son producidos por el hgado humano[15]: Un oligonucleotide nico homlogo al mRNA del factor IX fue sintetizado y etiquetado La punta de prueba resultante fue utilizada para defender una biblioteca double-stranded del cDNA del hgado humano Termine las secuencias dos-trenzadas de la DNA del cDNA [relevante] contuvo todo el COOH-terminal de la secuencia de codificacin del undcimo codon (11) y ' - de la secuencia sin traducir entera 3.[16] Esta secuencia del cDNA fue utilizada para encontrar las secuencias restantes de la DNA el abarcar del gene del factor IX buscando la DNA en el cromosoma de X: Una biblioteca genomic de un cromosoma humano fue preparada y pantalla [ed] con una punta de prueba del cDNA del factor IX. El phage recombinant del cruzamiento por hibridacin fue aislado, placa-purificado, y la DNA aislada. El traz de la restriccin, anlisis meridional, y DNA que ordena la identificacin permitida de cinco rellenos phage-que contienen recombinant que, cuando est traslapado en las secuencias comunes, cifradas 35kb el gene entero del factor IX.[17] Los Plasmids que contenan el gene del factor IX, junto con plasmids con un gene que cifra para la resistencia al methotrexate, fueron insertados en las clulas chinas del ovario del hmster va el transfection. Transfection implica la insercin de la DNA en una clula eukaryotic. Desemejante del proceso anlogo de la transformacin en
bacterias, transfected la DNA no se integra ordinariamente en el genoma de la clula, y por lo tanto se pasa no generalmente encendido a las generaciones subsecuentes va la divisin de clula. As, para obtener un transfection estable, un gene que confiere una ventaja significativa de la supervivencia debe tambin estar transfected, causando las pocas clulas que integraron transfected la DNA en sus genomas para aumentar a su poblacin como clulas que no integraron la DNA se elimina. En el caso de este estudio, crezca [el th] en concentraciones de aumento del methotrexate[18] promovi la supervivencia de estable transfected las clulas, y disminuy la supervivencia de otras clulas. Las clulas chinas del ovario del hmster que estaban estable transfected cantidades significativas producidas de factor IX, que fue demostrado para tener caractersticas substanciales del coagulante, aunque de un poco grado que el factor IX producido de sangre humana: La actividad especfica del factor recombinant IX fue medida en base de la medida directa de la actividad del coagulante La actividad especfica del factor recombinant IX era 75 units/mg comparado a 150 units/mg midi para el factor plasma-derivado IX[19] En 1992, el FDA aprob el factor VIII las clulas chinas transgenic producidas del ovario del hmster que usaban, las primeras tal factor de coagulacin de la sangre producido usando la tecnologa de DNA recombinant que se aprobar.[20]
Animales del campo de Transgenic

Las tcnicas Recombinant de la DNA tambin se han empleado para crear transgenic animales del campo que pueden producir los productos farmacuticos para el uso en seres humanos. Por ejemplo, se han creado los cerdos que producen la hemoglobina humana. Mientras que la sangre de tales cerdos no se podra emplear directamente para la transfusin a los seres humanos, la hemoglobina se podra refinar y emplear para fabricar un substituto de la sangre.[21]
Referencias
1. ^ Insulina humana: Agarrando el Plasmid de oro ", noticias de la ciencia, 9/16/1978, volumen 114, edicin 12, pgina 195, 2p 2. ^ Brar, Deepinder: LA HISTORIA DE LA INSULINA http://www.med.uni-giessen.de/itr/history/inshist.html, tenido acceso el 14 de junio de 2006 3. ^ Insulina humana: Agarrando el Plasmid de oro ", noticias de la ciencia, 9/16/1978, volumen 114, edicin 12, pgina 195, 2p 4. ^ ibid 5. ^ Lazo de los laboratorios para la hormona humana del crecimiento, noticias de la ciencia, 7/14/1979, vol. 116 edicin 2, p22
6. ^ Walgate, Roberto: Hormona humana del crecimiento: La depresin pituitaria ", naturaleza, volumen 290, el 5 Mar de 1981, pagina 6-7 7. ^ Goeddel y otros: La expresin directa en los Escherichia coli de una codificacin de la secuencia de la DNA para la hormona humana del crecimiento, naturaleza, volumen 281, el 18 Oct de 1979, pagina 544-548 8. ^ ibid 9. ^ ibid 10. ^ ibid 11. ^ ibid 12. ^ White y otros: Uso del factor antihemoflico Recombinant en el tratamiento de dos pacientes con hemofilia clsica, el diario de Nueva Inglaterra de la medicina, volumen 320, no. 3, el 19 Ene de 1989, pgina 166 13. ^ Kaufman y otros: Expresin, purificacin, y caracterizacin de Recombinant? - El factor IX de Carboxylated sintetiz en clulas chinas del ovario del hmster, el diario de la qumica biolgica, volumen 261, no 21, el 25 de julio de 1986, pginas 9622-9628 14. ^ Toole y otros: La reproduccin molecular de un cDNA que codifica factor antihemoflico humano, el volumen 312, el 22 de noviembre de 1984 de la naturaleza, pagina 342 - 347, pgina 343 15. ^ ibid 16. ^ Kaufman y otros: Expresin, purificacin, y caracterizacin de Recombinant? - El factor IX de Carboxylated sintetiz en clulas chinas del ovario del hmster, el diario de la qumica biolgica, volumen 261, no 21, el 25 de julio de 1986, pginas 9622-9628, pgina 9622 17. ^ ibid, pginas 9622-9623 18. ^ ibid, pgina 9623 19. ^ ibid, pgina 9626 20. ^ Alimento de Estados Unidos y administracin de la droga: El licenciar del primer factor de coagulacin DNA-derivado recombinant, http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00312.html, tenido acceso el 17 de junio de 2006 21. ^ O'Donnell y otros: Produccin de la hemoglobina humana en los cerdos de Transgenic: Un acercamiento a un substituto de la sangre ", a la deteccin y a la prevencin 1993 del cncer; 17 (2): 307-312
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INGENIERA GENTICA Y MEDICINA Las biotecnologas, y muy en especial la ingeniera gentica, encuentran un amplio y alentador campo de aplicacin en la medicina. De ello ha resultado la creacin de una especialidad, la biomedicina, cuyo objetivo es el tratamiento de las enfermedades mediante determinadas sntesis de la estructura gentica del paciente. La posibilidad de inducir la sntesis de determinada protenas (por ejemplo anticuerpos) a partir de procedimientos de ingeniera gentica y de la informacin contenida en genoma de las clulas del individuo, permitir sin duda la creacin de vacunas, facilitar los procesos diagnsticos y lograr la sntesis de sustancias de extrema importancia, por ejemplo, la molcula de la insulina en los diabticos. Asimismo, la biomedicina aparece en la actualidad como el nico campo alentador para el tratamiento de las enfermedades genticas, hasta el momento imposibles de combatir de una forma etimolgica. 1. - Qu es la Ingeniera gentica? Mtodo que modifica las caractersticas hereditarias de un organismo en un sentido predeterminado mediante la alteracin de su material gentico. Suele utilizarse para conseguir que determinados microorganismos como bacterias o virus, aumenten la sntesis de compuestos, formen compuestos nuevos, o se adapten a medios diferentes. Otras aplicaciones de esta tcnica, tambin denominada tcnica de ADN recombinante, incluyen la terapia gnica, la aportacin de un gen funcionante a una persona que sufre una anomala gentica o que padece enfermedades como sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o cncer. La ingeniera gentica consiste en la manipulacin del cido desoxirribonucleico, o ADN. En este proceso son muy importantes las llamadas enzimas de restriccin producidas por varias especies bacterianas. Las enzimas de restriccin son capaces de reconocer una secuencia determinada de la cadena de unidades qumicas (bases de nucletidos) que forman la molcula de ADN, y romperla en dicha localizacin. Los fragmentos de ADN as obtenidos se pueden unir utilizando otras enzimas llamadas ligasas. Por lo tanto, las enzimas de restriccin y las ligasas permiten romper y reunir de nuevo los fragmentos de ADN. Tambin son importantes en la manipulacin del ADN los llamados vectores, partes de ADN que se pueden autorreplicar (generar copias de ellos mismos) con independencia del ADN de la clula husped donde crecen. Estos vectores permiten obtener mltiples copias de un fragmento especfico de ADN, lo que hace de ellos un recurso til para producir cantidades suficientes de material con el que trabajar. El proceso de transformacin de un fragmento de ADN en un vector se denomina clonacin, ya que se producen copias mltiples de un fragmento especfico de ADN. Otra forma de obtener muchas copias idnticas de una parte determinada de ADN es la reaccin en cadena de la polimerasa, de reciente descubrimiento. Este mtodo es rpido y evita la clonacin de ADN en un vector-
Clonacin:
Clonar es una forma de reproduccin asexual que produce individuos genticamente idnticos. Podemos decir que hay dos mtodos de clonacin: natural y artificial. Un ejemplo de la primera clonacin natural es el caso de los gemelos provenientes de un vulo fecundado por un espermatozoide que en las primeras etapas de desarrollo se divide en dos individuos genticamente idnticos La existencia de individuos genticamente idnticos se da en muchos sistemas biolgicos, generalmente asociada a la reproduccin asexual: dos plantas iguales, cuyo origen es un gajo o esqueje. Tambin seres unicelulares, se multiplican asexualmente por simple divisin celular, tal sera el caso de las bacterias, las cuales el hombre usa como fines beneficiosos.
Los cientficos usan las bacterias para todo tipo de estudios genticos porque junto con los genes de la bacteria pueden clonarse otros genes. Desde el siglo pasado se sabe como clonar plantas a partir de una nica clula tomada de alguna de sus partes (hojas, tallo, raz etc.). Sin embargo a partir de 1967 John Gurdon logra los primeros resultados experimentando con ranas, porque sus vulos son grandes y abundantes, adems de ser su reproduccin externa. Pero las mismas moran antes de alcanzar el estado de renacuajo. Luego de miles de experimentos con ratones y otros mamferos se llega al nico caso exitoso hasta 1997, la tan famosa oveja Dolly creada por Wilmut. Dolly lleg a adulto - hasta tuvo cra - sta fue generada a partir de una clula de adulto mientras que en experimentos anteriores se realizaba con ncleos de clulas juveniles. Pero se plantea hoy el problema del envejecimiento veloz de sus cras.
ADN recombinante:
La tecnologa de DNA recombinante es una nueva ciencia que permite a los cientficos aislar y reproducir secciones especficas de la hlice del DNA. Con tcnicas de separacin se pueden obtener secciones deseadas de la cadena del DNA, como por ejemplo el gen de la hormona de crecimiento humano, que puede ser aislado e insertado en clulas y de esta forma programar la clula para que produzca una protena deseada. Se distinguen cuatro pasos: 1. Corte del ADN, mediante las enzimas de restriccin. 2. Unin de los fragmentos de ADN creados a una segunda pieza de ADN llamada vector. El resultado es un DNA recombinante que consiste de dos clases de DNA conectados uno con el otro en una pieza sencilla (muchas veces un anillo cerrado). Los vectores mas comnmente usados son los plsmidos. 3. Introduccin de la molcula recombinante a una clula husped, que sirve como una copiadora biolgica, haciendo muchas copias exactas de la molcula. La clula husped ms popular en la tecnologa es la bacteria Escherichia coli. 4. Identificacin de la clula con el gen deseado, utilizando anticuerpos u otros sistemas (hibridacin colonial) para identificar a la protena de inters. El resultado final es una parte oscura en una pelcula de rayos X encima del rea donde se encuentra el gene deseado. Mediante la tecnologa del ADN recombinante es posible introducir nuevos genes dentro de una cadena de ADN.
Enzimas de restriccin:
Las enzimas de restriccin, que son producidas por varios tipos de bacterias, reconocen secuencias especficas de ADN e interrumpen la doble cadena donde aparece dicha secuencia. El tratamiento del ADN de dos organismos diferentes con la misma enzima de restriccin produce fragmentos complementarios, o fragmentos con extremos que se acoplan. Estos se pueden combinar en una molcula de ADN hbrida, que si forma parte de una clula viva, expresa rasgos de ambos progenitores. 2. -LA OBTENCIN DE SUSTANCIAS DE INTERS MDICO. Una de las aplicaciones ms importantes de la ingeniera gentica en el sector sanitario es la obtencin a escala industrial de productos propios de los seres vivos que stos fabrican en cantidades muy pequeas, pero cuya carencia implica graves desajustes del funcionamiento del organismo. De este modo, protenas como la hormona del crecimiento o la insulina, que el hombre produce en cantidad apenas detectable, puede ser sintetizada por la bacteria Escherichia coli, previa manipulacin gentica, en una cantidad superior al 10% del total de las protenas celulares.
Los conocimientos referentes a la expresin de protenas mamferos en microorganismos se han desarrollado con gran rapidez y el nmero de protenas humanas producidas mediante manipulacin gentica de Escherichia coli va aumentando da a da en la actualidad. La tcnica utilizada para la obtencin de una protena concreta consiste en aislar el gen que esta en el origen de su sntesis, recombinarlo con un vector adecuado e introducirlo en una bacteria que siguiendo la informacin del gen insertado, producir la protena en cuestin.
Produccin de vacunas:
Otro aspecto que tiene relacin con el sector sanitario y ms concretamente con la industria farmacutica es la produccin de vacunas. La ingeniera gentica ofrece nuevas alternativas. Por ejemplo: puede obtenerse qumicamente el gen vrico de la Hepatitis B que determina la protena de la cpsula, introducirlo en un vector apropiado (en general un plsmido) e inyectarlo en levaduras que sintetizan la protena vrica en ausencia del virus y, por lo tanto, sin riesgo de infeccin. Actualmente estn siendo investigadas algunas vacunas como las de la hepatitis B, el herpes, la malaria, la caries dental, la rabia o el clera. Otra va de inters, aunque todava en fase de investigacin, consiste en manipular genticamente el virus conocido como virus de la vacuna. Se trata de un agente vrico que a perdido in vitro la capacidad infecciosa pero conserva la de inmunizar contra la viruela. En el proceso de manipulacin se le introducen genes que codifican protenas de otros virus, por ejemplo, de la hepatitis B, de este modo que el paciente adquirir inmunidad no solo contra la viruela, sino tambin contra la hepatitis cuando se la administre el virus manipulado. Se estn efectuando intentos para conseguir una vacuna universal insertando asta veinte genes extraos en el genoma del virus viccinia y conseguir de ese modo que una sola vacuna inmunice contra un amplio conjunto de enfermedades.
Anticuerpos quimricos:
Este tipo de anticuerpos merece mencin especial dentro del apartado de la obtencin de frmacos. En la estructura de cualquier anticuerpo se distingue una parte variable, donde reside su especificidad, y una parte constante con funciones no relacionadas con la especificidad. El mtodo de elaboracin de anticuerpos contra un antgeno consiste en inyectar ste animal de laboratorio. El organismo inyectado fabrica anticuerpos que, una vez purificados, podan utilizarse para proteger una persona, previa administracin de los mismos. Pero, por desgracia, un anticuerpo elaborado por una especie que no sea la propia presenta suficientes diferencias respecto a sta como para que el receptor lo reconozca como componente extrao y lo ataque. La ingeniera gentica hace posible fundir ambos tipos de anticuerpos de manera que el del animal de laboratorio aporte la porcin variable y, por la tanto, la especificidad de actuacin. El organismo humano, por su parte, contribuira con la porcin constante y se evitaran de este modo los problemas de rechazo. Se conocen ya algunos de los resultados exitosos. Pero todava hay ms: recientemente se ha sustituido la porcin variable de un anticuerpo quimrico por una enzima (la nucleasa de estafilococos) que destruye a las clulas con las que establece contacto. Imaginemos que el enzima que se incorpore sea especfico para determinadas clulas, por ejemplo, las tumorales. Ello significara que tendramos en la mano un arma mltiple y de gran potencialidad para destruir de modo especfico distintos agentes de la enfermedad.
Diagnstico y tratamiento de las enfermedades humanas:
Las tcnicas de diagnstico precoz disponibles en la actualidad (amniocentsis, cultivo de clulas amniticas, anlisis de sangre fetal) no son aplicables hasta el quinto mes de embarazo, cuando ya es demasiado tarde para proponer un aborto teraputico sin complicaciones. En el campo del diagnstico precoz y del tratamiento de enfermedades humanas, la ingeniera gentica ha hecho grandes progresos a travs de dos procedimientos bsicos: La tecnologa del ADN recombinante y los anticuerpos monoclonales.
Sondas de genes:
Se trata de fragmentos de ADN mediante los cuales se detecta la presencia de genes con secuencias complementarias a las de las sondas. Para obtener una sonda, se asla el ARN mensajero que se forma como intermediario entre el gen y la protena cuya sntesis codifica y se transcribe a ADN, de forma que los nucletidos que se aaden al medio para obtener este ADN estn marcados radiactivamente. De esta manera se consigue sealizar adecuadamente el ADN obtenido. Las sondas resultan de gran utilidad para seleccionar entre una gran cantidad de fragmentos de ADN el correspondiente al gen que se quiere identificar. La utilizacin de sondas permitir obtener el perfil gentico de una clula y este conocimiento proporciona, a su vez, informacin muy precisa de los cambios celulares a medida que avanza la enfermedad, lo cual es de vital importancia para su tratamiento. En el campo del diagnstico precoz, las sondas permiten detectar en el feto deficiencias hereditarias con la suficiente antelacin como para proponer un aborto teraputico.
Anticuerpos monoclonales:
Cesar Milstein y Georges Khler obtuvieron en 1975 un tipo de anticuerpos denominados monoclonales, caracterizados por su gran especificidad y por su reaccin con un solo antgeno. La obtencin de estos compuestos fue posible gracias a la fusin in vitro de dos clulas de ratn: la primera, extrada de la bilis, se encarga de producir el anticuerpo deseado, y la segunda es una clula cancerosa que con su capacidad ilimitada de reproduccin asegura la perpetuacin del cultivo de forma prcticamente indefinida. La clula resultante, o hibridoma, produce grandes cantidades de anticuerpo. La denominacin de monoclonal para este tipo de anticuerpos procede de su fabricacin que a medida que se divide produce un gran nmero de hibridomas idnticos. Gracias a estos anticuerpos ha sido posible aislar un buen nmero de antgenos concretos y proceder a su estudio. Esto no solo tiene importancia porque mejora el tratamiento de determinadas enfermedades infecciosas sino, sobre todo, porque permite conocer mejor la naturaleza de la superficie celular, la membrana, que es el lugar de reconocimiento entre antgeno y anticuerpo. Las posibilidades de utilizacin de los anticuerpos monoclonales en un futuro inmediato son muy numerosas. As, la informacin que nos suministra acerca de la estructura de los antgenos permitir construir los genes que fabriquen los anticuerpos que les hagan frente de manera especfica. Una vez obtenidos los genes pueden clonarse en Escherichia coli disponer de los anticuerpos para incorporarlos a las vacunas deseadas. Uno de los principales inconvenientes deriva del rechazo que este tipo de anticuerpos puede provocar ya que proceden de hibridomas obtenidos a partir de clulas de ratn. Esta limitacin es especialmente seria en tratamientos prolongados como los que se requieren para combatir el cncer.
Terapia gnica:
El pncreas de un diabtico no fabrica suficiente insulina y, por tanto, es incapaz de regular la cantidad de glucosa en sangre. La incapacidad para la sntesis de insulina se debe a que el gen que se ocupa del control de su secrecin es defectuoso. As pues, si se conoce qu gen es el defectuoso y cmo debe ser el gen correcto, y si se puede manipular el ADN, por qu no plantearse cambiar defectuoso por el normal? Esta es la pregunta que se formula la terapia gentica, esto es, el conjunto de tcnicas que permiten sustituir uno, o ms genes defectuosos del patrimonio gentico de un organismo por genes normales. Muchas enfermedades hereditarias humanas, ms de un millar de las aproximadamente tres mil quinientas descritas, son debidas a defectos en un nico gen. Cuando el individuo sufre una enfermedad gentica, la primera operacin que debe realizarse es construir una biblioteca de todo el conjunto de su material hereditario. Para ello es necesario trocear los genes con enzimas de restriccin, tan indispensables para un ingeniero gentico como las tijeras para un cirujano, y
clonarlos con el fin de disponer de un gran nmero de copias que permitan su consiguiente estudio. En la actualidad es posible preparar una biblioteca semejante en una semana. A partir de entonces se debe utilizar las sondas caractersticas de la enfermedad que se quiere localizar, para buscar dentro de una muestra de ADN del paciente una cadena que se adapte a ellas. Se han iniciado diversos ensayos clnicos de terapia gentica somtica celular destinados al tratamiento de cnceres o enfermedades sanguneas, hepticas, o pulmonares.
Beneficios :
La ingeniera gentica tiene un gran potencial. Por ejemplo, el gen para la insulina, que por lo general slo se encuentra en los animales superiores, se puede ahora introducir en clulas bacterianas mediante un plsmido o vector. Despus la bacteria puede reproducirse en grandes cantidades constituyendo una fuente abundante de la llamada insulina recombinante a un precio relativamente bajo. De esta forma, la produccin de insulina no depende del variable suministro de tejido pancretico animal. Otra aplicacin importante de la ingeniera gentica es la fabricacin de factor VIII recombinante, el factor de la coagulacin ausente en pacientes con hemofilia. Casi todos los hemoflicos que recibieron factor VIII antes de la mitad de la dcada de 1980 han contrado el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o hepatitis por la contaminacin viral de la sangre utilizada para fabricar el producto. Desde entonces se realiza la deteccin selectiva de la presencia de VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de la hepatitis C en los donantes de sangre, y el proceso de fabricacin incluye pasos que inactivan estos virus si estuviesen presentes. La posibilidad de la contaminacin viral se elimina por completo con el uso de factor VIII recombinante. Otros usos de la ingeniera gentica son el aumento de la resistencia de los cultivos a enfermedades, la produccin de compuestos farmacuticos en la leche de los animales, la elaboracin de vacunas, y la alteracin de las caractersticas del ganado.
Riesgos:
Mientras que los beneficios potenciales de la ingeniera gentica son considerables, tambin lo son sus riesgos. Por ejemplo, la introduccin de genes que producen cncer en un microorganismo infeccioso comn, como el influenzavirus, puede ser muy peligrosa. Por consiguiente, en la mayora de las naciones, los experimentos con ADN recombinante estn bajo control estricto, y los que implican el uso de agentes infecciosos slo se permiten en condiciones muy restringidas. Otro problema es que, a pesar de los rigurosos controles, es posible que se produzca algn efecto imprevisto como resultado de la manipulacin gentica. 3. - Aplicaciones en agricultura y ganadera: Recurso contra la hambruna, o prdica interesada de la industria alimentaria, la biotecnologa suscita todo orden de discusiones, especialmente en lo que concierne a los productos transgnicos: su repercusin en la salud, en el medio ambiente, y en la viabilidad de los agricultores con menos posibles. La distribucin de productos agrcolas y ganaderos sometidos a manipulacin gentica se eleva, por detrs de las aplicaciones biotcnicas en el mbito de la medicina, al segundo puesto en el mercado mundial. Empresas multinacionales como Monsanto aplican el control gentico tanto a plantas como a animales e inducen variedades transgnicas, sea en pro de la salud o del rpido crecimiento de los animales y de la mejora de sus productos (carne, leche lana...); sea procurando mayores grados de supervivencia, resistencia o tolerancia de las plantaciones vegetales frente a las inclemencias del tiempo o los ataques de insectos y herbicidas. La cuestin de s es o no sostenible la agricultura industrializada merece ser tratada con cautela El xito puede incrementarse mediante el refuerzo biotecnolgico, previa atencin a ciertos procedimientos de defensa o reclamo de que se sirven conjuntamente animales y plantas, tales como la dispersin en el aire de sustancias qumicas por las plantas heridas por insectos, que atraen a los depredadores rivales de estos ltimos. De otra parte, heladas, lluvias y sequas amenazan de continuo sembrados y cosechas. Los invernaderos actan como paliativos. Pero es la ingeniera gentica la que abre grandes esperanzas al incorporar resistencias de uno u otro orden en los cultivos. Descubrir cmo toleran algunas plantas el fro, podra incluso hacer posible modificar especies subtropicales para ser cultivadas en climas ms fros. En cuanto a la calidad del suelo, pudiera ser ms rentable a largo plazo la modificacin de la planta que la aplicacin en masa y repetida de los fertilizantes destinados a reponer el desgaste causado por la agricultura intensiva.
Por ltimo, la agricultura molecular aspira, entre otras cosas, a convertir los organismos en biorreactores o fbricas vivientes de produccin de frmacos, combustible o productos qumicos. Las plantas, de por s, generan compuestos naturales de los que se ha servido tradicionalmente la medicina, as como saborizantes, aceites, madera, etc. La ingeniera gentica eleva exponencialmente la explotacin de recursos al servicio de la industria. Uno de sus logros ampliamente extendidos es el de la creacin de algodones con distintas propiedades. En un centro de investigacin agrcola de la Columbia Britnica, en Canad, los investigadores han desarrollado una pelcula de plstico comestible a partir de algodn y protena de guisante y aceite de colza. Productos como ste podran llegar a ser utilizados para empaquetar comestibles como pasta para sopa; Ello permitira cocer el paquete entero y reducir el volumen de desperdicios. Plantas transgnicas abastecen el mercado de nuevos productos; as la colza transgnica se comporta como factora de hirudina, coagulante segregado naturalmente por las sanguijuelas. Gallinas, cerdos, vacas y corderos, sometidos a procedimientos manipuladores, se constituyen en fuentes abundantes de protenas derivadas al mbito mdico, a un coste de produccin relativamente bajo. La clara de huevo contiene lizosima, un antibacteriano; y la yema est abastecida de anticuerpos destinados a proteger al polluelo de posibles infecciones. La biotecnologa puede inmunizar a la gallina a partir de antgenos, con la seguridad de que los anticuerpos promovidos se viertan en la yema. Esta estrategia puede avanzar ahora otro paso produciendo gallinas transgnicias. A partir de genes de otras especies, estas gallinas podrn poner huevos con anticuerpos especficos correspondientes a enfermedades propias de, por ejemplo, cerdos, vacas o personas. 4. - El Proyecto Genoma Humano: Se basa principalmente en la elaboracin de un mapa gentico de la especie humana; esto significa el conocimiento de la cantidad de genes sabiendo la funcin y ubicacin de cada uno de ellos. Este proyecto consiste en la generacin de aparatos de laboratorios capaces de descifrar el cdigo en el que est escrito el mapa del cido desoxirribonucleico (ADN) que contiene el material gentico de las clulas. Se ha observado que la instrumentacin utilizada es cada ao ms potente, econmica y manejable, a pesar de la dificultad de encontrar un sistema de representacin digital que resulte aplicable a los genes humanos. La informacin que puede obtenerse es enorme. Actualmente hay un 7% de toda la informacin "maceada", pero hay que tener en cuenta que en los ltimos aos la recopilacin de la misma ha aumentado, estimando su finalizacin para el 2005. Uno de los beneficios que trae el manejo de estos datos es por ejemplo en Ingeniera Gentica, ya que se pude "arreglar" genes que provocan las enfermedades conociendo su funcin, tambin se puede conocer el perfil biogrfico de una persona a travs del anlisis de los genotipos. Sin duda este proyecto es muy beneficioso para la ciencia, pero tambin cabe destacar el gran riesgo que hay en el mismo. Esto se debe a la importancia y el valor de la informacin, ya que el uso que se le podra dar no siempre sera positivo o beneficioso. Un ejemplo cotidiano: Discriminar a quien dar un empleo o a quien no; en sntesis, usarlas con fines de lucro, fines inmorales o inescrupulosos. Luigi Cavalli-Sforza, genetista de la universidad de Standford, se dio cuenta de que muchas poblaciones aborgenes desaparecern en poco tiempo y con ellas se perdern sus genes. Por esta razn, este genetista encabeza un movimiento cientfico internacional para rescatar ese patrimonio gentico que desaparece da a da. Proyecto Genoma Humano ONU. ADOPCION DE LA DECLARACION UNIVERSAL SOBRE EL GENOMA HUMANO Y LOS DERECHOS HUMANOS ELABORADA POR LA UNESCO. Esta Declaracin se realiz con el impulso del COMIT INTERNACIONAL DE BIOETICA. Intenta regular la investigacin en materia de gentica para determinar la obligacin que tienen los pases de legislar sobre estos temas. El Comit propugna que el progreso cientfico y econmico que pueda derivarse de los nuevos descubrimientos del mapa completo del genoma humano, cuya culminacin est prevista para el ao 2.003, tenga que someterse a los derechos de la persona humana. En esta declaracin:
- el genoma humano es considerado "la base de la unidad fundamental de toda la familia humana y del reconocimiento de su dignidad intrnseca y diversidad" - establece que el genoma "en su estado natural, no puede dar lugar a beneficios pecuniarios". Esto significa que cada descubrimiento de un gen no se puede "patentar" y lucrar con ello. LA DECLARACION SOBRE GENOMA HUMANO NO OBLIGA A LOS PAISES, SINO QUE SU ACEPTACION ES VOLUNTARIA, Y EL COMIT DE BIOETICA, QUE VELARA PARA QUE SE RESPETE EN TODO EL MUNDO NO TIENE PODER SANCIONADOR. 9 10
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CAPTULO 2. LA REVOLUCIN DEL ADN RECOMBINANTE

Es el turno ahora de adentrarnos en aguas menos conocidas, en realidad, en profundidades inexploradas donde el inmenso poder de la nueva tecnologa plantear complicados problemas desconocidos hasta ahora para la humanidad. G.J.V. Nossal, Los lmites de la manipulacin gentica El cdigo gentico A comienzos de la dcada de los 50 no estaba, ni mucho menos, claro cmo el control gentico estaba de algn modo involucrado en la fabricacin de protenas. Estaba demostrado que el principio transformador y portador bsico de la herencia era el ADN, pero su funcionamiento era an muy oscuro. Incluso, en 1953, Alfred Hershey, que haba corroborado con sus fagos y su E. coli los experimentos de Avery, McLeod y McCarty, escribi que "el ADN no resultar ser un determinante nico de la especificidad gentica". Casi toda la evidencia sealaba al citoplasma, la zona de la clula fuera del ncleo, cmo el lugar donde se sintetizaban las protenas. Esto requera la existencia de un intermediario entre el ADN, que slo poda localizarse en el ncleo y los minsculos orgnulos donde se fabrican las protenas, denominados "ribosomas". Un candidato importante para este "mensajero" era otro cido nucleico, el ARN, presente en cantidades ms pequeas en las clulas. Durante los meses en que estuvo preocupado por el modelo del ADN, Watson haba pegado en la pared un folio donde haba escrito la frase: "ADN a ARN a protena". Crick se dirigi en 1957 al Simposio de la Sociedad de Biologa Experimental, que ese ao se reuna en Cambridge, llamando a la frase escrita en el papel de su laboratorio el "Dogma Central". Segn Horace Judson en su libro "El octavo da de la creacin", la eleccin de la palabra "Dogma" se basaba en un ligero desconocimiento de Crick del significado del trmino, cuyo sentido real es "una idea para la cul no existe demostracin razonable". Crick le dijo a Judson: "Yo no saba qu significaba exactamente dogma... era slo un trmino para atraer la atencin". En el mismo simposio, Crick hizo pblica la "Hiptesis de secuencia", segn la cul el orden en que aparecen los aminocidos en cada protena est determinado por un cdigo simple, contenido en la secuencia de ADN del gen que "codifica" dicha protena.
En los dos aos siguientes a la charla de Crick, rein la confusin en los intentos por definir los detalles del cdigo gentico; es decir, el lenguaje en el que estn escritas las instrucciones para determinar la secuencia de las protenas. El lenguaje del ADN estaba compuesto slo por cuatro letras, que deban traducirse a un lenguaje de veinte letras distintas, una por cada aminocido que entra a formar parte de las protenas. Era evidente que, por combinaciones de dos de las cuatro letras, slo se podan formar 16 palabras distintas, insuficientes para definir todos los aminocidos. Con tres letras, en cambio, existan 64 combinaciones, suficientes para codificar los diferentes aminocidos. Pero, funcionaba as la naturaleza? y qu tripletes especficos de bases nitrogenadas en el ADN codificaban cada aminocido? La elucidacin del cdigo gentico debe gran parte de su xito inusitadamente rpido a Marshall Warren Nirenberg y Johann Mathei, que trabajaban en los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) cerca de Washington D.C. Trabajando con un "sistema de sntesis proteica libre de clulas", recientemente publicado por Paul Zamecnik, descubrieron que cuando se aada a su sistema la enzima ribonucleasa, una enzima que destruye el ARN, pero no el ADN, la sntesis de protenas se detena inmediatamente; por el contrario, la adicin de una desoxirribonucleasa, que destrua slo el ADN, no impeda la sntesis hasta despus de unos 30 minutos. Esto confirmaba experimentalmente el "Dogma Central", ejerciendo el ARN el papel de mensajero entre el ADN y las protenas. Providencialmente, el jefe de su laboratorio era Leon Heppel, quien haba descubierto un modo de fabricar ARN artificial con una composicin definida y tena acumulada una "biblioteca" de tales ARNs. El 22 de mayo de 1961, Mathei decidi probar un ARN de Heppel que slo contena uracilo en la secuencia (un poliU), en su sistema libre de clulas. Comprob que la protena que se fabricaba entonces estaba compuesta nicamente de unidades de fenilalanina. El cdigo gentico estaba siendo descifrado! y la seal para aadir una fenilalanina a una cadena de protenas en crecimiento era una secuencia de 3? uracilos. Entretanto, Hans Gobind Khorana, en la Universidad de Wisconsin, haba perfeccionado la bioqumica necesaria para hacer largos trechos de ARN con secuencias repetidas de tres nucletidos. Slo bastaba ir probando con los ARNs de Khorana para llegar a conocer qu tripletes (o "codones") de nucletidos codificaban cada aminocido de las protenas. Adems, se dedujo qu codones permitan comenzar la sntesis de una cadena proteica y qu codones marcaban el punto final de la misma. El cdigo gentico se haba descifrado por completo en tan slo cuatro aos. Nirenberg y Khorana recibieron el premio Nobel en 1968. El genoma de cualquier organismo pudo, a partir de entonces, ser comprendido de un modo detallado, que ni hubiera podido soarse veinte aos antes. El genoma era un diccionario de palabras en cdigo, ahora traducido, que determinaba que protenas poda fabricar cada organismo. Era el centro de control de la clula. Las secuencias de aminocidos de algunas protenas y la de bases nitrogenadas de algunas molculas de ARN haban sido concretamente analizadas por las cientficos. Si pudiese descubrirse la secuencia de bases nitrogenadas del ADN, esto es, "secuenciarlo", se conocera el conjunto completo de genes de un organismo. La molcula promedio de ADN en una clula humana es de unos 140 millones de pares de nucletidos de longitud. A pesar de los increbles avances que haban conducido a la comprensin de la naturaleza del gen, cualquier intento por determinar la secuencia completa de nucletidos de cualquier genoma completo, y mucho ms del humano, hubiera sido descabellado. Una dcada ms tarde, ya no sera impensable. La biologa molecular abrira un nuevo captulo de la ciencia, en el que el gen se transformara en una entidad que poda ser
aislada, reproducida en el laboratorio y llevada de un organismo a otro. Haba comenzado la era de la ingeniera gentica.
Una bacteria con pies de sapo En 1966, varios investigadores eminentes haban dejado la gentica molecular por la disciplina naciente y enigmticamente apasionante de la neurobiologa. Entre ellos, Francis Crick, que se haba convertido una dcada antes en el lder intelectual de toda una generacin de cientficos. Crick crea que las bases de la biologa molecular haban sido bien establecidas y slo restaba "llenar los muchos detalles". No previ, nadie poda haberlo hecho, que una verdadera avalancha de descubrimientos pronto inundara a la comunidad cientfica e iniciara un perodo de excitacin y logros que ha tenido pocos paralelos en la historia de la investigacin biolgica. Todo comenz cuando los bilogos echaron mano de la completa caja de herramientas enzimtica que haba proporcionado el estudio de la bioqumica bacteriana y viral. Hoy en da, varios cientos de estas enzimas estn rutinariamente disponibles en los laboratorios; se puede simplemente examinar un catlogo de suministros de biologa molecular, llamar por telfono y pedir cualquiera de ellas. La primera de las enzimas mgicas fue aislada en 1970 por Hamilton Smith, en la Universidad Johns Hopkins, a partir de la bacteria Haemophilus influenzae, esta bacteria ha sido culpada durante aos de producir la gripe, hecho al cual debe su nombre latino; hoy en da sabemos que esta frecuente enfermedad est en realidad causada por un virus. Smith y sus colaboradores pronto comprobaron que la enzima, a la que denominaron Hind II, por ser la segunda enzima capaz de cortar el ADN que se localizaba en H. influenzae, era muy distinta de su predecesora, en cuanto a que slo cortaba el ADN cuando reconoca una determinada secuencia de nucletidos y nunca en otro lugar. An ms extraordinario era la enzima EcoR I, aislada poco despus por Robert Yoshimori, en UCSF, a partir de una cepa de la familiar E. coli. Esta enzima introdujo rupturas que cortaban las dos hlices del ADN en sitios distintos, separados por cuatro nucletidos, por lo que dejaban un extremo sobresaliente en los trozos as obtenidos. En 1972, Janet Mertz y Ronald E. Davis, de la Universidad de Stanford, informaron que el ADN cortado con EcoR I puede volver a aparearse entre s y puede quedar unido permanentemente por la enzima ADN-ligasa, aislada del fago T4. Las posibilidades eran asombrosas. En 1973, A.C.Y. Chang y Stanley Cohen, de Stanford y Herbert Boyer y Robert Helling, de UCSF, informaron de la primera unin de dos molculas biolgicamente funcionales de dos organismos diferentes. Haban cogido el ADN de una cepa de E. coli, lo haban cortado con EcoR I y lo haban empalmado con ADN de otra cepa distinta de la misma bacteria. Tras transformar la segunda cepa con la nueva molcula as formada, el ADN resultaba completamente funcional. Los investigadores llamaron a su molcula ADN "quimera", en honor del ser mitolgico con cabeza de len, cuerpo de cabra y cola de serpiente. Hoy da, se prefiere el trmino ms tcnico y con menos simbolismo de ADN recombinante o, sencillamente, ADNr. No pareca muy espectacular el intercambio entre dos E. coli; al fin y al cabo, estas bacterias tambin intercambian de vez en cuando su ADN de forma natural, mediante un proceso denominado "conjugacin". Ms impresionantes resultaron los siguientes experimentos de
Cohen y Boyer: primero, introdujeron ADN de la peligrosa bacteria Staphylococcus en la E. coli; no contentos con eso, dieron un salto cualitativo importante, al cortar ADN de clulas eucariotas, procedentes de un sapo de uas africano, Xenopus laevis, empalmarlo con ADN de E. coli e introducirlo en la bacteria. El gen del sapo codificaba un ARN ribosmico eucaritico. Al introducirlo en las clulas bacterianas, stas obedientemente se ponan a sintetizar el ARN del sapo como si fuera propio! La mitologa haba cobrado vida. Una quimera animalbacteriana haba sido creada en el laboratorio. Las barreras naturales entre los reinos vivientes haban sido superadas. En realidad, el experimento del sapo no tena utilidad prctica alguna, aunque su nombre cientfico, Xenopus o "extraos pies" resultaba suficientemente extico para llamar la atencin. Las implicaciones prcticas eran realmente impresionantes, se podra insertar el gen de la insulina humana en E. coli para poder fabricarla en grandes cantidades? podra hacerse con la somatotropina, u hormona del crecimiento, y poder curar as el enanismo humano? Sin embargo, no todas las aplicaciones eran positivas, qu pasara si un gen peligroso, como la toxina botulnica, fuera introducido en una bacteria que puede vivir en el intestino humano y sta fuera liberada en las caeras de agua potable de un pas enemigo? Es conveniente indicar que todas las enzimas utilizadas en los procedimientos de la ingeniera gentica, as como los ADNs de partida, existan de forma natural en los organismos vivos, lo nico artificial que hay en el procedimiento es ponerlos juntos en un tubo de ensayo y hacer que reaccionen. El hombre haba liberado fuerzas de la naturaleza que an no comprenda muy bien. A partir de ese momento, tendra que aprender a manejarlas y a convivir con ellas.
La inesperada complejidad de los genomas eucariticos El genoma bacteriano es un nico cromosoma circular: una sola molcula de ADN cerrada por sus extremos. Los genes bacterianos (as como los de los virus) son, as mismo, bastante sencillos, consisten en un codn de iniciacin formado por la secuencia de tres bases ATG, seguido en la molcula por el conjunto de pares de bases correspondiente a los distintos aminocidos de la protena codificada por el gen (3 bases por cada aminocido), terminando en uno de los codones de terminacin, TAA, TGA o TAG. Eso es casi todo. nicamente cabra destacar una determinada secuencia delante de la secuencia codificante, denominada promotor, y que sirve para que la enzima ARN-polimerasa se una al ADN y lo transcriba hasta ARN mensajero para que pueda ser expresada la protena correspondiente. Por otra parte, el cromosoma bacteriano tiene asociada muy poca protena, al contrario que sus homlogos eucariticos. Se puede decir que es ADN prcticamente desnudo, situado en la zona central del citoplasma de la clula bacteriana. Nadie haba supuesto que el ADN eucaritico fuera muy diferente al bacteriano, excepto las salvedades obvias de que se encuentra aislado del resto de la clula por la membrana nuclear y de que la composicin de los cromosomas eucariticos, que se podan analizar por mtodos qumicos clsicos, mostraba que prcticamente el 60% de su peso son protenas, siendo el 40% restante el ADN. Tambin hay algo de ARN, es el ARN mensajero que se estaba sintetizando en el momento del anlisis, y que permanece unido al ADN por fuerzas intermoleculares, como los puentes de hidrgeno. Puesto que el cromosoma de E. coli mide unos 2 millones de bases y se supona que tena unos 2000 genes, con una meda de un gen por cada 1000 pares de bases (que formara una
protena media de 300 aminocidos de longitud), entonces el genoma humano, con ms de 3000 millones de pares de bases, contendra la friolera de ms de 3 millones de genes. La idea de llegar algn da a conseguir secuenciar y caracterizar los productos proteicos de semejante cantidad de genes era, sencillamente, descabellada. Pero no era sino el desconocimiento el que abrumaba a los cientficos. Las nuevas investigaciones llevaran a cambiar radicalmente la forma de pensar de los bilogos. Bsicamente, lo que se desprenda de los nuevos resultados experimentales era que el ADN eucaritico estaba formado en su mayor parte por secuencias repetidas sin capacidad codificadora; es decir, la mayor parte del ADN humano estaba formado por basura. Los genomas bacterianos tienden a ser extremadamente compactos. Esto es la consecuencia lgica de miles de billones de generaciones de bacterias, evolucionando rpidamente en un medio cambiante. Con el tiempo, se tiende a perder el "equipaje inservible" que pudieran haber llevado en sus cromosomas, de modo que actualmente los genes funcionales son, prcticamente, lo nico que les queda. En los eucariotas la evolucin es mucho ms lenta, debido fundamentalmente a dos razones: una es que su reproduccin tiene un ritmo mucho menor, por lo que el tiempo que transcurre entre una generacin y la siguiente puede llegar a ser muchsimo ms largo; la otra, es que las clulas eucariotas poseen mecanismos mucho ms eficaces para la reparacin de los errores de copia que se producen en el ADN durante su replicacin. Por ello, los genomas eucariticos presentan mucha ms inercia a los cambios. Parece que slo de un 3 a un 5% del genoma humano contiene instrucciones para fabricar protenas. Seguramente, parte del resto debe de tener alguna funcin reguladora de la actividad de los genes o intervenir en la organizacin de la estructura del cromosoma o en su replicacin. Pero la mayor parte del ADN humano, se estima que un 90%, no parece tener funcin alguna. En efecto, del 10 al 25% del total del ADN humano y de otros eucariotas superiores est formado por secuencias cortas de cinco a diez pares de bases, que se repiten en tndem miles de veces. En los cromosomas, estas "repeticiones cortas" se localizan en los centrmeros, lugar donde los dos cromosomas hermanos continan unidos tras la replicacin, hasta que se separan al dividirse la clula. Aparentemente, este rea del ADN tiene un papel estructural, ms que gentico, en la clula y, de algn modo, opera durante la replicacin y separacin. Tambin se encuentran repeticiones cortas en los extremos de los cromosomas, que son conocidos como telmeros. Otra gran parte del genoma est compuesto por repeticiones de secuencias ms largas, las llamadas "repeticiones largas", repartidas por todo el genoma, cuya funcin, si es que existe, permanece an desconocida. Por ltimo, otros componentes de este "ADN basura" son los "pseudogenes" (del griego "falsos genes"). Son secuencias que fueron funcionales como genes en estadios evolutivos anteriores, pero que han perdido su capacidad codificadora debido a diversos tipos de mutaciones. Estos pseudogenes pueden ser importantsimos a la hora de llevar a cabo una investigacin de la historia evolutiva del hombre. Adems de este ADN basura, en 1977, se hizo un descubrimiento inesperado. los patrones de fragmentos producidos por enzimas de restriccin en el ADN cromosmico revelaron que haba regiones dispersas dentro de los genes que no eran parte del gen en absoluto, ya que no se expresaban en protenas. Los genes eucariticos solan estar interrumpidos por una o varias
secuencias que no parecan tener funcin alguna, al contrario que los genes bacterianos, que eran siempre ininterrumpidos. Walter Gilbert, de la universidad de Harvard, quien haba ideado el primer mtodo til para la secuenciacin del ADN, llam "exones" a las secuencias del gen que se expresan en protenas e "intrones" a aquellas secuencias intermedias silenciosas que no se convierten en aminocidos. Los intrones aumentan extraordinariamente la longitud de los genes eucariticos, ya que la longitud total de los intrones incluidos en un gen puede ser muchsimo mayor que la longitud total de las secuencias codificadoras. Algunos genes humanos son realmente gigantes, como el de la distrofina, la protena que resulta defectuosa en los enfermos afectados de distrofia muscular de Duchenne, que puede extenderse a lo largo de dos millones de pares de bases y tener ms de sesenta intrones. Si todos los genes humanos fueran tan largos como el de la distrofina, an sin considerar la existencia del ADN basura, los tres mil millones de bases del genoma humano slo codificaran 1500 genes, un nmero menor que el nmero de genes que posee la bacteria ms sencilla. Cuando el ADN es copiado hasta ARN, los intrones son tambin copiados, de modo que el ARN sintetizado directamente del ADN (el llamado "transcrito primario") de la distrofina posee 2 millones de nucletidos. Una vez sintetizado, el transcrito primario madura en el ncleo, durante un proceso llamado de "corte y empalme" (traduccin del trmino ingls intraducible "splicing"), durante el cul son eliminados los intrones y se aade una cola de longitud variable de nucletidos de adenosina (la cola de poliA), antes de que el ARN mensajero, ya maduro, salga del ncleo al citoplasma para servir de patrn en la sntesis de protenas. Esto deja al ARN mensajero con el cdigo completo e ininterrumpido del gen, excludos los intrones. Este fenmeno apunta a dos problemas relacionados con la secuenciacin y el clonado (se llama as al proceso de introducir un gen exgeno en una bacteria para que lo exprese) de genes. El primero es que no se puede deducir directamente la secuencia exacta de la protena que se expresar a partir de la secuencia de ADN genmico (aunque existen ciertas secuencias encontradas repetidamente en algunos intrones, que han sido identificadas como las zonas que limitan el intrn y que son eliminadas durante el splicing, los intrones siempre parecen comenzar por el par de bases GT y acabar en AG). El otro problema es que un ADN recombinante que posea ADN genmico con intrones no expresar la protena correcta al ser introducido en una bacteria, ya que stas no poseen mecanismos para la eliminacin de los intrones. Se puede obviar este problema utilizando para el clonado del gen, no ADN genmico, sino una copia en ADN del ARN mensajero correspondiente, que no posee intrones. La copia del ARN mensajero se puede conseguir utilizando la enzima "transcriptasa inversa" o "retrotranscriptasa", aislada de algunos retrovirus (la familia a la que pertenece el virus del S.I.D.A.). Esta enzima permite copiar una cadena de ARN en su complementaria en ADN. El ADN as obtenido se conoce como ADN copia, ADN complementario o, sencillamente, ADNc. Con estos nuevos conocimientos, podemos realizar una nueva estimacin del nmero de genes que posee el genoma humano. En la actualidad se estima entre 50.000 y 100.000, un nmero adecuadamente pequeo como para poder pensar en su secuenciacin. Tras haber ledo los prrafos anteriores, no debe extraarnos semejante falta de precisin. sencillamente, no conocemos cul es el tamao medio de un gen humano. Acerca de esta falta de conocimientos, hay que tener en cuenta que, en fecha tan reciente como 1956, ni siquiera se saba el nmero exacto de cromosomas que componan el genoma humano. La mayora de los bilogos suponan que eran 48, hasta que las observaciones cuidadosas de Jo Hin Tjio y Albert
Levan demostraron que el nmero exacto era 46.
Repartiendo el genoma Las modernas tcnicas de la ingeniera gentica proporcionan una herramienta indispensable para el estudio de los genomas. A nadie se le ocurre ponerse a estudiar directamente un cromosoma humano completo; sencillamente, son demasiado largos como para poder ser manejados adecuadamente por nuestra caja de herramientas enzimtica. Si pusiramos a cortar uno de nuestros cromosomas con EcoR I, obtendramos miles de fragmentos de todos los tamaos, que se resistiran a nuestra capacidad de anlisis. En lugar de ello, los bilogos moleculares hacen uso de la vieja estrategia de "divide y vencers". Ninguno de los estudios actuales que se estn llevando a cabo sobre el genoma humano ha sido realizado sobre cromosomas humanos intactos. Por el contrario, se llevan a cabo sobre "genotecas" o "bibliotecas de genes", construidas mediante la tcnica que se detalla a continuacin. Las primeras genotecas eran construidas utilizando como huspedes bacterias, en concreto, nuestra incansable colaboradora E. coli. La idea consiste en tomar todo el genoma humano (o de cualquier otro organismo), cortarlo en cientos de miles de trozos con una enzima de restriccin que produzca extremos cohesivos y ligar los fragmentos de ADN as obtenidos en un vector gentico adecuado (los bacterifagos han demostrado sobradamente su capacidad). Con los vectores recombinantes as obtenidos, infectamos un cultivo de bacterias, cada una de las cuales ser transformada por uno o varios bacterifagos que depositarn en su interior uno o varios fragmentos del ADN humano que portan. Se pueden realizar as genotecas de ADN genmico o de ADNc. La tcnica en este ltimo caso es semejante, excepto que el material de partida es el conjunto de ARN mensajero que se est expresando en un determinado tejido celular. Se obtienen as genotecas sin intrones, listas para ser empleadas en la expresin heterloga de las protenas humanas. El problema, si tenemos en mente el estudio de un gen o de una protena en concreto, es saber cul de los cientos de miles de bacterias ha cogido el gen que nos interesa. Existen diversos mtodos de "screening" o sondeo, el ms extendido de los cuales consiste en rastrear la genoteca con una sonda de ARN marcada radiactivamente cuya secuencia sea anloga a la del gen que buscamos (por ejemplo, utilizando la secuencia de un gen conocido de un organismo relacionado, o la secuencia de la protena, obtenida mediante tcnicas de secuenciacin de protenas). La sonda de ARN se "hibridar" con el ADN del gen que buscamos, y la colonia de bacterias producida a partir de la bacteria que inicialmente contena el gen emitir radiactividad, que podremos detectar mediante una pelcula fotogrfica. Si no nos interesa ningn gen concreto, sino secuenciar todo el genoma, podemos entonces coger la bacteria que ms rabia nos d y ponernos a secuenciar la secuencia que transporta. Si hacemos esto con un nmero suficiente de bacterias, llegaremos a disponer de numerosos trozos de secuencia de ADN humano que, con un poco de suerte, se superpondrn entre s. A dichos trozos se les denomina "contigs" y, con ellos, en teora, se podra resolver, como un puzzle, todo la secuencia del genoma. El problema de las genotecas en bacterias es que los trozos que pueden almacenar los fagos y otros vectores bacterianos suelen ser de escasa longitud (hasta 20 kilobases). Se han desarrollado otros tipos de genotecas. Las ms utilizadas en la actualidad para el estudio del
genoma humano son las genotecas que utilizan como husped a la levadura Saccharomyces cerevisiae. Las levaduras son clulas eucariotas, como los humanos, pero extremadamente sencillas y que, al igual que las bacterias, pueden crecer fcil y rpidamente en medios de cultivo lquidos. La S. cerevisiae, dado su elevado uso en la investigacin actual, ha sido llamada, por J. D. Watson, "la E. coli de las clulas eucariotas". Los vectores adecuados para las levaduras se denominan YACs, que es la abreviatura de "cromosoma artificial de levadura", desarrollados en 1987 por David T. Burke, George F. Carle y Maynard V. Olson, en la Universidad de Washington. Pueden contener fragmentos de ADN mucho mayores, los modernos "MegaYACs" pueden albergar fragmentos de un milln de bases. Basta con 3000 de estos MegaYACs para completar una genoteca humana. A mediados de los ochenta, los bilogos disponan de tcnicas apropiadas, lo suficientemente potentes como para pensar en realizar la herclea tarea de cartografiar las posiciones de los genes en el genoma humano, como paso previo para descifrar el conjunto de instrucciones genticas esparcidas aqu y all en la secuencia de pares de bases de los cromosomas. Los posibles beneficios de semejante esfuerzo eran tan abrumadoramente numerosos como para que los cientficos pusieran todo su empeo en llevarlo a cabo.
Insulina
De Wikipedia, la enciclopedia libre Saltar a: navegacin, bsqueda Para otros usos de este trmino, vase Insulinoterapia.
Insulina
HUGO Smbolo
6081 INS Datos genticos
Locus
Cr. 11 p15.5 Bases de datos
Entrez OMIM RefSeq UniProt
3630 176730 NM_000207 P01308
La insulina (del latn insula, "isla") es una hormona polipeptdica formada por 51 aminocidos,1 producida y secretada por las clulas beta de los islotes de Langerhans del pncreas. La insulina interviene en el aprovechamiento metablico de los nutrientes, sobre todo con el anabolismo de los carbohidratos. Su dficit provoca la diabetes mellitus y su exceso provoca hiperinsulinismo con hipoglucemia. La sntesis de la insulina pasa por una serie de etapas. Primero la preproinsulina es creada por un ribosoma en el retculo endoplasmtico rugoso (RER), que pasa a ser (cuando pierde su secuencia seal) proinsulina. Esta es importada al aparato de Golgi, donde se modifica, eliminando una parte y uniendo los dos fragmentos restantes mediante puentes disulfuro.
Gran nmero de estudios demuestran que la insulina es una alternativa segura, efectiva, bien tolerada y aceptada para el tratamiento a largo plazo de la diabetes tipo 1 y la diabetes tipo 2, incluso desde el primer da del diagnstico.2 Frederick Grant Banting, Charles Best, James Collip, y J.J.R. Macleod de la Universidad de Toronto, Canad, descubrieron la insulina en 1922. El Doctor Banting recibi el Premio Nobel de Fisiologa o Medicina por descubrir esta hormona aunque se demostro que el verdadero descubridor fue Nicolae Paulescu en 1921.
Contenido
[ocultar]

1 Funciones 2 Gentica 3 Estructura 4 Sntesis 5 Liberacin de la insulina 6 Clasificacin o 6.1 Nuevos tipos de insulina 6.1.1 Insulina inhalada 6.1.2 Noticias sobre la insulina 7 Vase tambin 8 Referencias 9 Enlaces externos
[editar] Funciones
La insulina es una hormona "anablica" por excelencia: permite disponer a las clulas del aporte necesario de glucosa para los procesos de sntesis con gasto de energa. De esta glucosa, mediante gluclisis y respiracin celular se obtendr la energa necesaria en forma de ATP. Su funcin es la de favorecer la incorporacin de glucosa de la sangre hacia las clulas: acta siendo la insulina liberada por las clulas beta del pncreas cuando el nivel de glucosa en sangre es alto. El glucagn, al contrario, acta cuando el nivel de glucosa disminuye y es entonces liberado a la sangre. Por su parte, la Somatostatina, es la hormona encargada de regular la produccin y liberacin tanto de glucagn como de insulina. La insulina se produce en el Pncreas en los "Islotes de Langerhans", mediante unas clulas llamadas Beta. Una manera de detectar si las clulas beta producen
1.Preproinsulina (Lgua, B cadena, C cadena, A cadena); proinsulina consiste BCA, sin L 2.plegamiento espontneo 3.Cadenas A y B unidas por puentes sulfuros 4.Gua y la cadena C son cortadas 5.Restos de insulina
insulina, es haciendo una prueba, para ver si existe pptido C en sangre. El pptido C se libera a la sangre cuando las clulas Beta procesan la proinsulina, convirtindola en insulina. Cuando slo entre un 10% y un 20% de las clulas Beta estn en buen estado, comienzan a aparecer los sntomas de la diabetes, pasando primero por un estado previo denominado luna de miel, en el que el pncreas an segrega algo de insulina. La insulina tiene una importante funcin reguladora sobre el metabolismo, sobre el que tiene los siguientes efectos:

Estimula la glucogenognesis. Inhibe la gluconeognesis y la glucogenolisis. Promueve la gluclisis. Favorece la sntesis de triacilgleceroles (triglicridos). Para ello, estimula la produccin de acetil-CoA (por ejemplo, al acelerar la gluclisis), y tambin estimula la sntesis de cidos grasos (componentes de los triacilgliceroles) a partir de la acetil-CoA. Estimula la sntesis de protenas.
[editar] Gentica
La proinsulina, precursora de la insulina, es codificada por el gen INS,3 4 5 localizado en el cromosoma 11p15.5.6 Se han identificado una variedad de alelos mutantes en la regin que codifica al gen. Tambin se han descrito varias secuencias reguladoras a nivel de la regin promotora del gen de la insulina humana sobre la cual se unen los factores de transcripcin. En general, se sabe que las cajas A se unen a factores Pdx1, que las cajas E se unen a NeuroD, las cajas C sobre MafA y que las secuencias denominadas elementos de respuesta al cAMP se unen sobre los factores de transcripcin CREB. Se han descubierto tambin varios silenciadores genticos que inhiben la transcripcin de la insulina.
Secuencias reguladoras y sus factores de transcripcin para el gen de la insulina.7 Secuencias reguladoras ILPR Caja A5 Elemento regulatorio negativo (NRE)8 Caja Z (sobrepuesto a NRE y C2) C2 E2 A3 Factores de transcripcin Par1 Pdx1 Receptor glucocorticoide, Oct1 ISF Pax4, MafA(?) USF1/USF2 Pdx1
A2
CAAT enhancer binding (CEB) (parcialmente sobrepuesto a A2 y C1) C1 E1 A1 G1 E2A, NeuroD1, HEB Pdx1 -
[editar] Estructura
Ilustracin de la configuracin hexamrica de la insulina, es decir, producida por agregados de tres pares de hormonas unidas entre s a travs de la cadena B en presencia de zinc, en forma antiparalela, no covalente, pero estable.9
Entre los vertebrados, la insulina conserva una ntima similitud estructural. Por ejemplo, la insulina bovina difiere de la humana en solo tres aminocidos, mientras que la porcina difiere solo en uno, por lo tanto, las insulinas de procedencia animal tienen la misma efectividad que la humana.10 La insulina de ciertas especies de peces es lo suficientemente similar a la humana que es clnicamente efectiva para uso en humanos. An la insulina del invertebrado Caenorhabditis elegans una nematoda, es muy similar en estructura, tiene efectos celulares muy parecidos y se produce de manera anloga a la de los humanos. De modo que es una protena que se ha preservado a lo largo de la evolucin del tiempo, sugiriendo su rol fundamental en el control metablico animal. El pptido C, producto del desdoblamiento de la proinsulina, difiere considerablemente entre las diferentes especies, por lo que, aunque es tambin una hormona, tiene un papel secundario. La conformacin estructural de la insulina es esencial para su actividad como hormona. La insulina es sintetizada y almacenada en el cuerpo en forma de un hexmero, es decir, una unidad compuesta por seis insulinas, mientras que su forma activa es la de una
hormona monomrica, es decir, la molcula de insulina sola.10 Seis molculas de insulina permancen inactivas por largo tiempo en su forma hexamrica, como forma de almacenamiento de disponibilidad rpida y proteccin de la altamente reactiva molcula de insulina. Dentro del aparato de Golgi, la proinsulina es enviada al interior de vesculas secretoras y de almacenamiento ricas en Zn2+ y Ca2+. Una vez en la vescula se forman especies hexamricas de la proinsulina con dos tomos de zinc por cada hexmero de proinsulina: (Zn2+)2(Ca2+)(Proin)6, las cuales son posteriormente convertidas en el hexmero de insulina: (Zn2+)2(Ca2+)(In)6por accin de enzimas proteolticas y produciendo tambin la protena C.11 La conversin entre la forma hexamrica y la monomrica es una de las caractersticas fundamentales de las frmulas de inyeccin de la insulina. El hexmero es mucho ms estable que la hormona sola, por lo que sera una presentacin ms prctica, sin embargo, el monmero es la forma ms reactiva de la hormona porque su difusin es mucho ms rpida haciendo que no se tenga que administrar varios minutos (30-60) antes de las comidas.12 La presentacin con la insulina ms reactiva le da a los diabticos la opcin de tener comidas diarias en horas ms flexibles. Ciertos preparados de insulina tienen variaciones en al menos dos aminocidos de modo que cuando la insulina se inyecta, sta tenga una menor tendencia de formar agregados hexamricos y su accin sea rpida y su efecto breve.
[editar] Sntesis
Variaciones en los niveles de glucosa e insulina antes y despus de las comidas diarias en un sujeto sano.
La insulina se sintetiza en las clulas beta del pncreas y se libera bajo la influencia de varios estmulos, entre ellos, la ingesta de protenas y glucosa y su paso a la sangre a partir de los alimentos digeridos. Muchos carbohidratos producen glucosa, aumentando sus niveles en el plasma sanguneo y estimulando de inmediato la liberacin de insulina a la circulacin portal.9 Tambin se ha demostrado que la hormona de crecimiento es capaz de aumentar la secrecin de insulina humana.13 En las clulas diana principalmente en el hgado, msculo y tejido adiposose inicia una transduccin de seales cuyo efecto es el incremento en la captacin de glucosa y su posterior almacenamiento, evitando as un ascenso excesivo de la glucemia postprandial.14 Con la reduccin de la concentracin circulante de glucosa, se degrada la insulina secretada, finalizando as la respuesta unas 2 o 3 horas despus de la ingesta.9
La porcin exocrina del pncreas est conformada por acinos serosos que representan la mayor parte de la masa de la glndula. Las clulas beta hacen parte de los islotes de Langerhans (Las clulas beta son el 70% de todas las clulas endocrinas) que constituyen la porcin endocrina del pncreas (2% de todo el parnquima), haciendo entonces que el pncreas sea fundamentalmente una glndula mixta. En las clulas beta, la insulina se sintetiza a partir de proinsulina, una molcula precursora, por accin de enzimas proteolticas conocidas como convertasas prohormonas, especficamente la convertasa proprotena 1 y la convertasa proprotena 2, as como la exoproteasa carboxipeptidasa E.15 Ciertas modificaciones ejercidas sobre la proinsulina le eliminan una regin del centro de la molcula denominada pptido C quedando libres los extremos C-terminal y N-terminal. Estos extremos libres tienen 51 aminocidos en total y se denominan cadenas A (21 aminocidos) y B (30 aminocidos), los cuales terminan unidas entre s por medio de enlaces disulfuro.9 De modo que la proinsulina consta de las cadenas B-C-A y los grnulos secretorios liberan las tres cadenas simultneamente. La produccin endgena de insulina es regulada en varios pasos a lo largo de una ruta sinttica. Primero sobre la transcripcin del ADN, especficamente a nivel del gen de la insulina. Luego a nivel de la estabilidad del ARNm y a nivel de la traduccin del ARNm. Finalmente, tambin se regula a nivel de las modificaciones postransduccin. Se ha demostrado que la insulina y sus protenas relacionadas son producidas tambin dentro del cerebro y que niveles muy reducidas de estas protenas pueden estar asociadas a la enfermedad de Alzheimer.16 17 18
[editar] Liberacin de la insulina
Mecanismo de liberacin de insulina dependiente de glucosa en las clulas del pncreas.
Las clulas beta de los islotes de Langerhans liberan la insulina en dos fases. La primera fase de la liberacin de insulina se desencadena rpidamente en respuesta al aumento de los niveles de glucosa en la sangre. La segunda fase produce una liberacin sostenida y lenta de de las recin formadas vesculas que se activan independientemente de la cantidad de azcar en la sangre. En la primera fase la liberacin de la insulina ocurre de manera inmediata:19
1. La glucosa entra en la clulas beta a travs del transportador de glucosa GLUT212 2. La glucosa pasa a la gluclisis y el ciclo respiratorio, donde se producen, por oxidacin, varias molculas de ATP de alta energa 3. Los canales de potasio (K+) dependientes de los niveles de ATP y, por tanto, de los niveles de glucosa en sangre, se cierran y la membrana celular se despolariza12 19 4. Con la despolarizacin de la membrana, los canales de calcio (Ca2+) dependientes de voltaje se abren y el calcio entra la clula19 5. Un aumento en el nivel de calcio intracelular produce la activacin de fosfolipasa C, que desdobla los fosfolpidos de membrana fosfatidil inositol 4,5-bifosfato en inositol 1,4,5-trifosfato y diacilglicerol20 6. El inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) se une a los receptores proteicos sobre la membrana del retculo endoplsmico (RE). Esto permite la liberacin de Ca2+ del RE a travs de los canales IP3 aumentando ms an la concentracin intracelular de calcio 7. Estas cantidades significativamente mayores de calcio dentro de las clulas provoca la activacin de la sinaptotagmina, que ayuda a la liberacin de la insulina previamente sintetizada y almacenada en las vesculas secretoras.
Este es el principal mecanismo para la liberacin de insulina. Cierta liberacin de insulina ocurre adems con la ingesta de alimentos, no slo de glucosa o hidratos de carbono, y las clulas beta son tambin en cierta medida influenciadas por el sistema nervioso autnomo. Los mecanismos de sealizacin que controlan estos vnculos no son del todo comprendidos. Otras sustancias que pueden estimular la liberacin de insulina incluyen los aminocidos de las protenas ingeridas, la acetilcolinaliberada de las terminaciones nervio vago (sistema nervioso parasimptico), la colecistoquininasecretada por clulas enteroendocrinas de la mucosa intestinaly el pptido insulinotrpico dependiende de glucosa (GIP). Tres aminocidos (alanina, glicina y arginina) actan de manera similar a la glucosa alterando el potencial de membrana de la clula beta. La acetilcolina desencadena la liberacin de insulina a travs de la fosfolipasa C, mientras que la colecistoquinina acta a travs del mecanismo de adenilato ciclasa. El sistema nervioso simptico, a travs de la estimulacin de receptores adrenrgicos alfa 2, como lo demuestran los agonistas de la clonidina o la metildopa, inhiben la liberacin de insulina. Sin embargo, cabe sealar que la adrenalina circulante activar los receptores Beta 2 en las clulas beta de los islotes pancreticos para promover la liberacin de insulina. Esto es importante ya que los msculos no pueden beneficiarse de los incrementos de glucosa en la sangre como consecuencia de la estimulacin adrenrgica (aumento de la gluconeognesis y glucogenolisis con los niveles bajos de la insulina en sangre: por el glucagn) a menos que la insulina est presente para permitir la translocacin GLUT-4 a nivel de los tejidos. Por lo tanto, comenzando con la inervacin directa, la noradrenalina inhibe la liberacin de insulina a travs de los receptores alfa2 y, subsecuentemente, la adrenalina circulante proveniente de la mdula suprarrenal estimular los receptores beta2-promoviendo as la liberacin de insulina. Cuando el nivel de glucosa se reduce al valor fisiolgico normal, la liberacin de insulina de las clulas beta frena o se detiene. Si los niveles de glucosa en sangre se vuelven inferior a ese nivel, especialmente a niveles peligrosamente bajos, la liberacin de hormonas hiperglicmicas, la ms prominente de las cuales es el glucagn de los mismos islotes de Langerhans pero de clulas alfa, obligan a la liberacin de glucosa en la sangre a partir de los almacenes celulares, principalmente el almacenamiento de
glucgeno en las clulas del hgado. Mediante el aumento de glucosa en la sangre, las hormonas hiperglucmicas previenen o corrigen la hipoglucemia que pone en peligro la vida del individuo. La liberacin de insulina est fuertemente inhibida por la hormona del estrs noradrenalina, lo que conduce a un aumento de los niveles de glucosa en sangre durante momentos de estrs. Pruebas de alteracin de la primera fase de liberacin de insulina se pueden detectar en la prueba de tolerancia a la glucosa, demostrado por una sustancial elevacin de nivel de glucosa en sangre en los primeros 30 minutos, un marcado descenso durante los siguientes 60 minutos, y un constante ascenso de nuevo a los niveles de referencia en las siguientes horas.
[editar] Clasificacin
Artculo principal: Insulinoterapia
Normalmente las insulinas sintticas se sintetizan por medio de ingeniera gentica a travs de ADN. Hay un cierto desacuerdo sobre la eficacia de la insulina sinttica comparada con la insulina derivada de las fuentes animales. En la diabetes tipo I, y en algunos casos en la tipo II se hace necesaria la inyeccin de insulina para mantener un nivel correcto de glucosa en sangre. Existen los siguientes tipos de insulinas:

Insulinas de accin rpida de tapa verde. Insulinas de accin corta de tapa morada llamada cristalina. Insulinas de accin intermedia o NPH. Insulinas de accin prolongada.
En muchos casos se combina el tratamiento con estos tipos de insulina. Tambin por su zona de inyeccin las podemos clasificar como:

Insulinas subcutneas: Cualquier insulina, ya sea de accin rpida o retardada. Insulinas endovenosas: Solo las insulinas de accin rpida que no poseen retardantes.
Dependiendo del retardante utilizado podemos clasificar las insulinas de la siguiente manera:

Insulinas que utilizan zinc como retardante. Insulinas que utilizan otras protenas como la protamina como retardantes.
[editar] Nuevos tipos de insulina
Los cientficos han intentado por todos los medios conseguir tipos de insulina que no tengan que ser inyectados, procurando as hacer la vida de los enfermos algo ms fcil. [editar] Insulina inhalada En enero de 2006 se aprob por la Comisin Europea la primera versin de insulina inhalada para el tratamiento de la diabetes tipo 1 y tipo 2. Se trataba de la primera
opcin teraputica inhalada y por tanto no inyectable desde el descubrimiento de la insulina. Se plante como una alternativa para aquellos pacientes que por diversas razones no toleraban aceptablemente un tratamiento mediante inyecciones o pastillas. Desde su introduccin, no se consider por algunos tan eficaz como la tradicional (subcutnea), ya que sta se mide en centmetros cbicos (cc) y la actual, en unidades (UI). Adems al ser inhalada, no se sabe la cantidad exacta que se absorbe. Este tipo de insulina podra mejorar la calidad de vida del paciente diabtico y disminuir las inyecciones y lo invasivo que resultan. No est recomendada en nios ni en ancianos. Por otra parte, no excluira de todas las inyecciones de insulina; los diabticos insulinodependientes deberan seguir pinchndose algunas veces, siguiendo la pauta de su mdico. La utilidad y valor de la insulina inhalada era ms clara para quienes disfrutan de menos inyecciones en las piernas, brazos, abdomen, etc. Sin embargo, en octubre de 2007, apenas a unos meses de haber comenzado su comercializacin en Espaa, Pfizer, laboratorio responsable de Exubera (nombre comercial de la insulina inhalada), decidi la retirada del mercado mundial del producto por no haber satisfecho sus expectativas econmicas. [editar] Noticias sobre la insulina ltimamente se ha descubierto que en las clulas madre del cordn umbilical se produce insulina. Un estudio realizado por investigadores estadounidenses y britnicos concluye que las clulas madre obtenidas del cordn umbilical de recin nacidos pueden ser manipuladas para producir insulina y que en el futuro es posible que se empleen para tratar la diabetes. La investigacin fue dirigida por el Dr. Randall Urban, de la University of Texas Medical Branch (Estados Unidos), quien explican que fueron los primeros en conseguir cultivar grandes cantidades de clulas madre y dirigirlas para que se asemejaran a clulas beta productoras de insulina. A juicio del Dr. Urban, "este descubrimiento nos muestra que tenemos el potencial de producir insulina a partir de clulas madre adultas para ayudar a las personas con diabetes". El estudio se publica en "Cell Proliferation" y, segn los investigadores, ofrece una alternativa al uso de clulas madre embrionaria.
Diabetes Tipo I. - Cuando se ingiere alimentos, se activan reacciones en cadena para la sntesis de insulina que al unirse a clulas del cuerpo promueven el paso de glucosa a la clula, que es su principal combustible.
- Como un polcia que acelera el trfico en un tnel.
"A falta de estos policas se provoca un caos va en la sangre"... Actualmente basndose en ingeniera gentica se ha logrado la sntesis exacta de la insulina humana a travs de microorganismos como bacterias o levaduras o inclusive en tejidos humanos aislados, esto se podra visualizar mejor como tener una huerta donde se cosecha insulina. A las protenas que son obtenidas en un husped diferente a donde se utilizan o donde originalmente se sintetizan se llaman Protenas Recombinantes, ya que se basan en la combinacin de ADN (el elemento esencial de la vida), el de la protena que se desea obtener y el de la maquinara necesaria para poder fabricarla, es decir, si estamos en una fbrica, necesitamos materia prima
(ADN para la protena) y jornaleros o maquinaria que trabajen para convertir esa materia prima (ADN del husped) as tenemos montada una fabrica que es llamada Vector de Expresin o Plsmido y es el factor indispensable para poder obtener la protena que deseemos. As mismo como la cantidad de materia prima es igual a la cantidad de producto final que se obtiene, a mayor nmero de copias de ADN mayor nmero de protenas al final, igualmente la calidad y el tipo de trabajadores influye tanto en la rapidez y funcionalidad del proceso de obtencin.
Una vez que tenemos nuestra fbrica instalada y en perfectas condiciones para iniciar la obtencin es necesaria la aplicacin de pasos posteriores para la utilizacin del producto, y estos son:
Fermentacin: proceso mediante el cual se da la obtencin del producto, crecimiento y aumento en la cantidad de organismos huspedes.
Extraccin: en este paso actualmente se ha eliminado debido a que se ha logrado que la protena sea secretada por el propio husped.
Purificacin y formulacin: son los ltimos detalles que se le dan a la protena para que se pueda utilizar sin ningn problema posterior.
Si regresamos al ejemplo de la insulina humana obtenida por bacterias tenemos que se necesita: (Ilustracin 3):
Ilustracin2. Esquema de la obtencin de la Insulina Recombinante. Fuente: http://www.porquebiotecnologia.com.ar/
El ADN de la insulina en humanos
El ADN de la bacteria que convierta el ADN en insulina

Hacer trabajar la fbrica
Extraerla, purificarla y darle una presentacin.
As es como una gran mayora de protenas son obtenidas actualmente, es como ordenar a la carta, aunque no siempre es tan sencillo, se requiere la secuencia de la protena y un husped adecuado. A continuacin se puede observar las principales protenas recombinantes usadas en la industria farmacutica.
Y de la industria alimenticia:
En la vida actual, existe un aumento en la presencia como el dao que causan las enfermedades pero tambin la tecnologa ha avanzado para desarrollar tcnicas que faciliten la labor diaria de los sistemas de salud como de la calidad de vida de un enfermo. La industria farmacutica est cada vez especializndose ms, es un hecho que actualmente ya se crean medicamentos a la carta, especialmente diseado para cada individuo, uno de ellos son las protenas recombinantes. Enfermedades como Diabetes, Anemia y hepatitis ahora son ms fcilmente tratadas con una mayor disposicin de medicamento lo que implica un menor costo y procesos
de la industria alimenticia como obtencin de quesos y vinos son ms rpidamente obtenidos gracias a la aplicacin de esta tecnologa.
Las protenas son una parte primordial en el desarrollo de la vida y de la calidad de sta, pero sobre todo han formado parte muy importante en la prevencin y lucha en contra de diversas enfermedades, el profundizar en el conocimiento de stas, sobre todo en su obtencin, es una herramienta poderosa que est de moda en nuestro pas.

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Publicado por cantor676 @ 11:00 PM Comentarios (0) Comentarios Aadir comentario

xpressin de genes clonados en E.

transcripcin ores (t)

cin en los procariotas cia Shine-Dalgarno (SD)

nscripcin en las bacterias

uccin: La transcripcin en general

anscribe a partir de una de las dos cadenas del ADN.

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La efficiencia de la terminacin en sitios r-independient entre menos de 25 % a ms de 75 %.

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raduccin en las rias

cia Shine-Dalgarno (SD):

esin de genes de mamferos en la E. coli

bacterianas son extremadamente tiles para la ctiva de protenas de mamferos, immunolgicamente

La expresin de gen de mamferos en la E. coli necesita resolver los problemas siguientes:

3. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducido ribosomas bacterianos ;

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protenas de fusin son ms estables que las nas extraas nativas.

inters se clonan en el plsmido sea en el sitio Ndel

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mido recombinado el que es introducido en la E. coli.

a hormona del crecimiento mano (hGH)

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xpressin de genes clonados en E.

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El Cuaderno de Por qu Biotecnologa n 49

Cultivo de clulas de mam

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Cultivo de clulas de mam E. coli

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Cultivo de clulas de mam E. coli Levaduras

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En la siguiente figura, se muestra un esquema general de la obtencin de insulina a partir de pn

En la siguiente figura, se muestra un esquema general de la obtencin de insulina a partir de pn

Uso de la biotecnologa en la fabricacin farmacutica

4 Animales del campo de Transgenic 5 Referencias

Hormona humana del crecimiento

Factores de coagulacin de la sangre humana

Animales del campo de Transgenic

Diagnstico y tratamiento de las enfermedades humanas:

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CAPTULO 2. LA REVOLUCIN DEL ADN RECOMBINANTE

Levan demostraron que el nmero exacto era 46.

6081 INS Datos genticos

Cr. 11 p15.5 Bases de datos