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Captulo 19 Fosforilao Oxidativa e Fotofosforilao A fosforilao oxidativa o estgio final do metabolismo produtor de energia nos organismos aerbicos. Todas as etapas oxidativas na degradao dos carboidratos, gorduras e aminocidos convergem para esse estgio final da respirao celular onde, a energia proveniente da oxidao responsvel pela sntese de ATP. A fotofosforilao o meio pelo qual os organismos fotossintticos capturam a energia da luz solar a fonte fundamental de energia na biosfera e a usam para produzir ATP. A fosforilao oxidativa e a fotofosforilao em conjunto, so responsveis pela maioria do ATP sintetizado por vrios organismos aerbicos na maior parte do tempo. Nos eucariotos, a fosforilao oxidativa ocorre nas mitocndrias e a fotofosforilao, nos cloroplastos. A fosforilao oxidativa envolve a reduo do O2 a H2O com eltrons doados pelo NADH e FADH2, e ocorre igualmente na presena de luz ou na escurido. A fotofosforilao envolve a oxidao da H2O a O2, onde o NADP+ o aceptor de eltrons e absolutamente dependente da energia luminosa. Apesar das diferenas, estes dois processos conversores de energia, altamente eficientes, apresentam mecanismos fundamentalmente semelhantes. Nosso entendimento atual da sntese do ATP na mitocndria e cloroplastos est baseado na hiptese, introduzida por Peter Mitchell em 1961, de que as diferenas na concentrao transmembrana de prtons so os reservatrios para a energia extrada das reaes de oxidao biolgicas. Esta teoria quimiosmtica tem sido aceita como um dos grandes princpios unificadores da biologia no sculo XX. Ela permite a compreenso dos processos de fosforilao oxidativa e fotofosforilao e para transdues de energia aparentemente distintas tais como o transporte ativo atravs de membranas e o movimento dos flagelos das bactrias. A fosforilao oxidativa e a fotofosforilao so mecanisticamente similares em trs aspectos: (1) Ambos os processos envolvem o fluxo de eltrons atravs de uma cadeia de transportadores ligados membrana. (2) A energia livre disponvel atravs deste fluxo de eltrons montanha abaixo (exergnico), est acoplada ao transporte de prtons montanha acima, atravs de uma membrana impermevel ao prton, conservando a energia livre da oxidao dos combustveis como um potencial eletroqumico transmembrana (pg. xxx). (3) O fluxo transmembrana de prtons no sentido do seu gradiente de concentrao atravs de canais proticos especficos, fornece a energia livre para a sntese do ATP, que catalisada por um complexo proteico ligado membrana (ATP sintase) e que acopla o fluxo de prtons fosforilao do ATP.

Este captulo comea com a fosforilao oxidativa. Inicialmente sero descritos os componentes da cadeia de transporte de eltrons, a sua organizao em grandes complexos funcionais na membrana interna da mitocndria, a seqncia do fluxo de eltrons atravs deles e os movimentos de prtons que acompanham este fluxo. O prximo tpico o notvel complexo enzimtico que, atravs da catlise rotacional captura a energia do fluxo de prtons na forma de ATP. Ento, sero considerados os mecanismos regulatrios que coordenam a fosforilao oxidativa atravs das vrias vias catablicas que oxidam combustveis. Com este entendimento da fosforilao oxidativa mitocondrial, ser abordada ento a fotofosforilao, comeando com a absoro da luz por pigmentos fotossintticos, seguido pelo fluxo de eltrons, direcionado pela luz, da H2O para o NADP+ e a base molecular para o acoplamento do fluxo de eltrons e prtons. Finalmente, sero abordadas as similaridades de estrutura e mecanismo entre as ATP sintases dos cloroplastos e mitocndrias bem como as bases evolutivas para essa conservao do mecanismo.

Albert L. Lehninger 1917 1986

Fosforilao Oxidativa Reao de Transferncia de Eltrons na Mitocndria A descoberta em 1948, por Eugene Kennedy e Albert Lehninger, de que as mitocndrias so os stios da fosforilao oxidativa nos eucariotos, marcou o incio da fase moderna dos estudos das transdues de energia biolgica. As mitocndrias, tais como as bactrias gramnegativas, possuem duas membranas (Fig. 19-1). A membrana mitocondrial externa facilmente permevel a pequenas molculas (Mr , 5000) e ons que se movem livremente atravs de canais transmembrana formados por uma famlia de proteinas integrais de membrana chamadas porinas. A membrana interna impermevel maioria das molculas pequenas e ons, incluindo prtons (H+). As nicas espcies que atravessam a membrana interna so aquelas para as quais existem transportadores especficos. A membrana interna contm os componentes da cadeia respiratria e a ATP sintase. A matriz mitocondrial cercada pela membrana interna, contm o complexo da piruvato desidrogenase e as enzimas do ciclo do cido ctrico, a via da -oxidao dos cidos graxos e as vias de oxidao dos aminocidos. Em resumo, ela contm todas as vias da oxidao dos combustveis, exceto a gliclise que ocorre no citosol. A membrana interna, seletivamente permevel, segrega os intermedirios e as enzimas das vias metablicas

citoslicas atravs de processos metablicos que ocorrem na matriz. Entretanto, transportadores especficos carregam piruvato, cidos graxos e aminocidos ou seus derivados -ceto para o interior da matriz garantindo o acesso maquinaria do ciclo do cido ctrico. Semelhantemente, o ADP e o Pi so transportados especificamente para o interior da matriz medida que o ATP recm-sintetizado transportado para fora.

figura 19-1 Anatomia bioqumica de uma mitocndria. As circunvolues (cristas) da membrana interna proporcionam uma superfcie muito grande. A membrana interna de uma nica mitocndria do fgado pode ter mais de 10.000 conjuntos de sistemas de transferncia de eltrons (cadeias respiratrias) e molculas de ATP sintase, distribudas sobre toda a superfcie da membrana. Mitocndrias do corao, que apresentam cristas muito abundantes e portanto uma rea de membrana interna muito maior, contm cerca de trs vezes mais conjuntos de sistemas de transferncia de eltrons que as mitocndrias do fgado. O reservatrio mitocondrial das coenzimas e intermedirios est funcionalmente separado do reservatrio citoplasmtico. As mitocndrias dos invertebrados, plantas e microrganismos eucariotos so semelhantes s mostradas aqui, embora haja muita variao no tamanho, na forma e no grau de enrolamento da membrana interna. Veja o Captulo 2 para outros detalhes da estrutura mitocondrial.

Os eltrons so canalizados para transportadores universais de eltrons A fosforilao oxidativa comea com a entrada de eltrons na cadeia respiratria. Muitos desses eltrons so provenientes da ao de desidrogenases que coletam eltrons das vias catablicas e os canalizam para aceptores universais de eltrons nucleotdeos de nicotinamida (NAD+ ou NADP+) ou nucleotdeos de flavina ((FMN ou FAD). Desidrogenases associadas a nucleotdeo de nicotinamida catalisam reaes reversveis dos seguintes tipos gerais: Substrato reduzido + NAD+ substrato oxidado + NADH + H+ Substrato reduzido + NADP+ substrato oxidado + NADPH + H+ A maioria das desidrogenases que atuam no catabolismo so especficas para o NAD+ como receptor de eltrons (Tabela 19-1). Algumas esto no citosol, outras nas mitocndrias e outras ainda apresentam isoenzimas citoslica e mitocondrial.

As desidrogenases ligadas ao NAD removem dois tomos de hidrognio dos seus substratos. Um deles transferido como um on hidreto (:H-) ao NAD+ e o outro liberado como H+ no meio (veja Fig. 14-15). O NAD+ tambm pode coletar equivalentes redutores de substratos trabalhados pelas desidrogenases ligadas ao NADP. Isto possvel devido piridina nucleotdeo transidrogenase, que catalisa a reao: NADPH + NAD+ NADP+ + NADH O NADH e o NADPH so transportadores de eltrons hidrossolveis que se associam reversivelmente com as desidrogenases. O NADH carrega os eltrons derivados das reaes catablicas at o seu ponto de entrada na cadeia respiratria, o complexo da NADH desidrogenase, descrito a seguir. O NADPH geralmente fornece eltrons para as reaes anablicas. Nem o NADH nem o NADPH podem atravessar a membrana interna da mitocndria, mas os eltrons que elas carregam podem ser lanados atravs dela, como ser visto adiante.

tabela 19-1 Algumas reaes importantes catalisadas por desidrogenases ligadas ao NAD(P)H Reao* Ligadas ao NAD -Cetoglutarato + CoA + NAD+ succinil-CoA + CO2 + NADH + H+ L-Malato + NAD+ oxaloacetato + NADH + H+ Piruvato + CoA + NAD+ acetil-CoA + CO2 + NADH + H+ Gliceraldeido-3-fosfato + Pi + NAD+ 1,3-difosfoglicerato + NADH + H+ Lactato + NAD+ piruvato + NADH + H+ -hydroxiacil-CoA + NAD+ -cetoacil-CoA + CO2 + NADH + H+ Ligadas ao NADP Glicose-6-fosfato + NADP+ 6-fosfogluconato + NADPH + H+ Ligadas ao NAD ou NADP L-glutamato + H2O + NAD(P)+ -cetoglutarato + NH4+ + NAD(P)H Isocitrato + NAD(P)+ -cetoglutarato + CO2 + NAD(P)H + H+ * Estas reaes e suas enzimas foram discutidas nos Captulos 15 a 18. mitocndria; C, citosol. M MeC M designa C M MeC M C C M Localizao

As flavoprotenas apresentam um nucleotdeo flavina, o FMN ou o FAD, fortemente ligado, s vezes at covalentemente (veja Fig. 14-16). O nucleotdeo de flavina oxidado pode

aceitar um eltron (dando origem a uma forma semiquinona) ou dois (originando FADH2 ou FMNH2). A transferncia de eltrons ocorre porque a flavoprotena tem um potencial de reduo maior que o do composto oxidado. O potencial de reduo padro de um nucleotdeo de flavina, diferente daquele do NAD ou NADP, depende da protena qual ele est associado. Interaes locais com grupos funcionais na protena distorcem os orbitais dos eltrons no anel da flavina, alterando as estabilidades relativas das formas oxidadas e reduzidas. Assim, o potencial de reduo padro relevante o da flavoprotena especfica e no o do FAD ou FMN isolado. O nucleotdeo de flavina deveria ser considerado parte do stio ativo das flavoprotenas e no um reagente ou produto na reao de transferncia de eltrons. Como as flavoprotenas podem participar tanto na transferncia de um como de dois eltrons, elas podem funcionar como intermedirios entre reaes onde dois eltrons so doados (como nas desidrogenaes) e aquelas onde um eltron aceito (como na reduo de uma quinona a hidroquinona, descrita a seguir).

Os eltrons passam atravs de uma srie de transportadores ligados membrana A cadeia respiratria mitocondrial consiste de uma srie de transportadores de eltrons que atuam seqencialmente, a maioria dos quais so protenas integrais de membrana que apresentam grupos prostticos capazes de aceitar ou doar um ou dois eltrons. Na fosforilao oxidativa ocorrem trs tipos de transferncia de eltrons: (1) transferncia direta de eltrons, tal como na reduo do Fe3+ a Fe2+; (2) transferncia como um tomo de hidrognio (H+ + e-) e (3) transferncia como um on hidreto (:H-), que possui dois eltrons. O termo equivalente redutor usado para designar um nico equivalente de eltron transferido na reao de oxidao-reduo. Alm do NAD e das flavoprotenas, trs outros tipos de molculas transportadores de eltrons funcionam na cadeia respiratria: uma quinona hidrofbica (ubiquinona) e dois tipos diferentes de protenas que contm ferro (citocromos e ferro-enxofre protenas).

figura 19-2 Ubiquinona (Q ou coenzima Q). A reduo completa da ubiquinona requer dois eltrons e dois prtons e ocorre em duas etapas atravs de um intermedirio radicalar semiquinona. A ubiquinona (tambm chamada de coenzima Q, ou simplesmente Q) uma benzoquinona lipossolvel que apresenta uma longa cadeia lateral isoprenide (Fig. 19-2). A

plastoquinona (encontrada nos cloroplastos das plantas) e a menaquinona (encontrada nas bactrias) so compostos muito parecidos e desempenham papis anlogos ao da ubiquinona, transportando eltrons atravs de cadeias de transferncia de eltrons associadas membrana. A ubiquinona pode aceitar um eltron, originando o radical semiquinona (QH), ou dois eltrons para formar ubiquinol (QH2) (Fig. 19-2). Semelhantemente aos transportadores flavoprotenas, ela de atuar na juno entre um doador de dois eltrons e um receptor de um eltron. Como a ubiquinona pequena e hidrofbica, ela se difunde livremente na camada lipdica da membrana interna mitocondrial e pode transportar equivalentes redutores entre outros transportadores de eltrons menos mveis na membrana. Como ela carrega tanto prtons quanto eltrons, ela desempenha um papel central no acoplamento do fluxo de eltrons ao movimento de prtons. Os citocromos so protenas que apresentam como caracterstica uma intensa absoro da luz, devido aos seus grupos prostticos heme, que contm ferro (Fig. 19-3). As mitocndrias contm trs classes de citocromos designados por a, b e c que podem ser distinguidos por diferenas nos seus espectros de absoro de luz. Cada tipo de citocromo no seu estado reduzido (Fe2+) possui trs bandas de absoro na regio do visvel (Fig. 19-4). A banda de maior comprimento de onda est prxima de 600 nm nos citocromos do tipo a, prxima de 560 nm no tipo b, e prxima de 550 nm no tipo c. Para se distinguir entre citocromos muito parecidos de um tipo, algumas vezes se usa o valor exato do mximo de absoro nos seus nomes, como no citocromo b562.

figura 19-3 Grupos prostticos dos citocromos. Cada um deles consiste de quatro anis de cinco tomos, contendo nitrognio numa estrutura cclica chamada de porfirina. Os quatro tomos de nitrognio esto coordenados com um on Fe central que pode estar na forma Fe2+ ou Fe3+. A ferro protoporfirina IX encontrada nos citocromos do tipo b, na hemoglobina e mioglobina (veja Fig. 6-17). O heme C est covalentemente ligado protena do citocromo c atravs de ligaes tiosteres de dois resduos de Cis. O heme A, encontrado nos citocromos do tipo a, possui uma longa cauda isoprenide ligada a um dos anis de cinco tomos. O sistema de dupla ligao conjugada (sombreada em vermelho) do anel da porfirina responsvel pela absoro da luz visvel por estes hemes. Os cofatores heme dos citocromos a e b esto fortemente, mas no-covalentemente, ligados s suas protenas associadas; os grupos heme dos citocromos do tipo c esto ligados covalentemente atravs de resduos de Cis (Fig. 19-3). Similarmente s flavoprotenas, o potencial de reduo padro do tomo de ferro no heme de um citocromo depende da sua

interao com as cadeias laterais da protena e portanto, diferente para cada citocromo. Os citocromos do tipo a e b e alguns do tipo c so protenas integrais da membrana interna da mitocndria. Uma notvel exceo o citocromo c da mitocndria, uma protena solvel que se associa com a superfcie externa da membrana interna da mitocndria atravs de interaes eletrostticas. Ns abordamos o citocromo c nas discusses iniciais da evoluo das protenas (ver Adendo 5-2) e na estrutura de protena (ver Fig. 6-18a).

figura 19-4 Espectro de absoro do citocromo c nas suas formas oxidada (vermelho) e reduzida (azul). Tambm esto marcadas as bandas , e caractersticas da forma reduzida.

Helmut Beinert Nas ferro-enxofre protenas, inicialmente descobertas por Helmut Beinert, o ferro est presente no no heme, mas associado a tomos de enxofre inorgnico ou tomos de enxofre de resduos de Cis na protena, ou ambos. Esses centros de ferro-enxofre (Fe-S) variam desde estruturas simples com um nico tomo de Fe coordenado a quatro grupos CisSH at centros Fe-S mais complexos com dois ou quatro tomos de Fe (Fig. 19-5). As protenas ferro-enxofre Rieske (denominadas aps sua descoberta) so uma variao neste tema, onde um tomo de Fe est coordenado a dois resduos de His ao invs de dois resduos de Cis. Todas as protenas ferro-enxofre participam de transferncias de um eltron onde cada tomo de ferro do arranjo ferro-enxofre est oxidado ou reduzido. Pelo menos oito protenas ferro-enxofre funcionam na transferncia de eltrons da mitocndria. O potencial de reduo das protenas ferro-enxofre varia de 0.65 V a +0.45 V, dependendo do microambiente do ferro na protena.

figura 19-5 Centros Fe-S. Os centros Fe-S das protenas ferro-enxofre podem ser simples como em (a), com um nico Fe rodeado por tomos de S de quatro resduos de Cis. Outros centros incluem tanto tomos inorgnicos e tomos de S de Cis, como nos centros 2Fe-2S (b) ou 4Fe-4S (c). A ferredoxina da cianobactria Anabaena 7120 (d) possui um centro 2Fe-2S. (Observe que apenas os tomos S inorgnicos esto contados nestas designaes. Por exemplo, no centro 2Fe-2S (b), cada on Fe est de fato rodeado por quatro tomos de S). O potencial de reduo

padro exato do ferro nestes centros depende do tipo de centro e da sua interao com as protenas associadas. Na reao completa catalisada pela cadeia respiratria mitocondrial, os eltrons se movem do NADH, succinato ou algum outro doador primrio de eltrons atravs das flavoprotenas, ubiquinona, protenas ferro-enxofre, citocromo e finalmente para o O2. A anlise dos mtodos usados para determinar a seqncia onde esses carregadores atuam instrutiva, uma vez que a mesma abordagem geral tem sido usada para estudar outras cadeias de transporte de eltrons, tais como as dos cloroplastos. Primeiro, o potencial de reduo padro de cada um dos carregadores de eltrons foi determinado experimentalmente (Tabela 19-2). Espera-se que os carregadores funcionem em ordem crescente do potencial de reduo, uma vez que os eltrons fluem espontaneamente dos carregadores de menor Eo para carregadores com Eo maiores. A ordem dos carregadores deduzida por este mtodo NADH Q citocromo b citocromo c1 citocromo c citocromo a citocromo a3 O2. Note contudo que a ordem dos potenciais de reduo padro no necessariamente a mesma que a dos potenciais de reduo verdadeiros em condies celulares, que dependem da concentrao das formas reduzida e oxidada. Um segundo mtodo para determinar a sequncia dos carregadores de eltrons envolve a reduo experimental da cadeia completa de carregadores quando se fornece uma fonte de eltrons, mas nenhum aceptor de eltrons (sem O2). Quando o O2 introduzido abruptamente no sistema, a velocidade com que cada transportador de eltrons se oxida (medida espectroscopicamente) mostra a ordem na qual os transportadores funcionam. O transportador mais prximo do O2 (na extremidade da cadeia) libera seu eltron primeiro, o segundo transportador a partir da extremidade o prximo a ser oxidado e assim por diante. Tais experimentos confirmaram a seqncia deduzida a partir dos potenciais de reduo padro.

tabela 19-2 Potenciais de reduo padro da cadeia respiratria e dos transportadores de eltrons relacionados Reao redox (meia-reao) 2H+ + 2e- H2 NAD+ + H+ + 2e- NADH Eo (V) -0,414 -0,320

NADP + H + 2e- NADPH

+ +

-0,324 -0,300 0,045 0,077 0,220 0,254 0,290 0,550 0,816

NADH desidrogenase (FMNH2) + 2 H+ + 2e- NADH desidrogenase (FMNH2) Ubiquinona + 2H+ + 2e- ubiquinol Citocromo b (Fe3+) + e- citocromo b (Fe2+) Citocromo c1 (Fe3+) + e- citocromo c1 (Fe2+) Citocromo c (Fe3+) + e- citocromo c (Fe2+) Citocromo a (Fe3+) + e- citocromo a (Fe2+) Citocromo a3 (Fe3+) + e- citocromo a3 (Fe2+) O2 + 2H+ + 2e- H2O

Para uma confirmao final, agentes que inibem o fluxo de eltrons atravs da cadeia tm sido usados combinados com medidas do grau de oxidao de cada transportador. Na presena de O2 e um doador de eltrons os transportadores que atuam antes da etapa inibida ficam totalmente reduzidos e, aqueles que atuam depois do bloqueio, ficam completamente oxidados (Fig. 19-6). Usando-se vrios inibidores que bloqueiam a cadeia em diferentes locais, a seqncia completa foi deduzida e, ela a mesma prevista pelas duas abordagens anteriores.

figura 19-6 Mtodo para determinar a sequncia dos transportadores de eltrons. Este mtodo mede os efeitos de inibidores da transferncia de eltrons sobre o estado de oxidao de cada transportador. Na presena de um doador de eltrons e de O2, cada inibidor produz um padro caracterstico de transportadores oxidados/reduzidos: aqueles que esto antes do bloqueio ficam reduzidos (azul) e aqueles que esto depois do bloqueio ficam oxidados (vermelho).

Os transportadores de eltrons funcionam em complexos multienzimticos Os transportadores de eltrons da cadeia respiratria esto organizados em complexos supramoleculares embebidos na membrana que podem ser fisicamente separados. O tratamento brando da membrana mitocondrial interna com detergentes permite a resoluo de quatro nicos complexos transportadores de eltrons, cada um capaz de catalisar a transferncia de eltrons atravs de uma parte da cadeia (Fig. 19-7; Tabela 19-3). Os

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complexos I e II catalisam a transferncia de eltrons para a ubiquinona a partir de dois doadores de eltrons diferentes: o NADH (complexo I) e o succinato (complexo II). O complexo III transporta eltrons da ubiquinona at o citocromo c e, o complexo IV completa a seqncia transferindo eltrons do citocromo c para o O2. Vamos agora analisar com mais detalhes a estrutura e a funo de cada complexo da cadeia respiratria mitocondrial.

figura 19-7 Separao dos complexos funcionais da cadeia respiratria. A membrana mitocondrial externa inicialmente removida atravs de tratamento com o detergente digitonina. Fragmentos da membrana interna so ento obtidos por ruptura osmtica da mitocndria e, os fragmentos so cuidadosamente dissolvidos em um segundo detergente. A mistura resultante das protenas da membrana interna resolvida, atravs de cromatografia de troca inica, nos diferentes complexos (I at IV) da cadeia respiratria, cada um com sua composio protica nica (ver Tabela 19-3) e, a enzima ATP sintase (algumas vezes chamada de complexo V). Os complexos (I a IV) isolados catalisam as transferncias entre doadores (NADH e succinato), transportadores intermedirios (Q e citocromo c) e O2, conforme mostrado. In vitro, a ATP sintase apresenta apenas a atividade de hidrlise do ATP (ATPase) mas no a de sntese do ATP.

tabela 19-3 Componentes proticos da cadeia de transferncia de eltrons da mitocndria

Complexo enzimtico

Massa (kDa)

Nmero de subunidades* 42 (14) 5 1 1 13 (3-4)

Grupo prosttico FMN, Fe-S FAD, Fe-S Heme, Fe-S Heme Hemes, CuA, CuB

I NADH desidrogenase II Succinato desidrogenase III Ubiquinona: citocromo oxidorredutase Citocromo c IV Citocromo oxidase

850 140 c 250 13 160

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*Nmero de subunidades em bactria entre parnteses.

Citocromo c no parte de um complexo enzimtico, mas se move livremente entre os

complexos III e IV como uma protena solvel.

Complexo I: NADH at ubiquinona A Figura 19-8 ilustra a relao entre os complexos I, II e a ubiquinona. O complexo I, tambm chamado de NADH: ubiquinona oxidorredutase, uma grande molcula de enzima composta por 42 cadeias polipeptdicas diferentes, incluindo uma flavoproteina ligada a FMN e pelo menos seis centros Fe-S (Tabela 19-3). A microscopia eletrnica de alta resoluo mostra que o complexo I tem a forma de L, com um brao do L na membrana e o outro prolongando-se em direo da matriz. Conforme mostrado na Figura 19-9, o complexo I catalisa simultnea e obrigatoriamente dois processos acoplados: (1) a transferncia exergnica de um on hidreto do NADH para a ubiquinona e um prton da matriz: NADH + H+ + Q NAD+ + QH2 (19-1)

e (2) a transferncia endergnica de quatro prtons da matriz para o espao intermembranoso. Entretanto, o complexo I uma bomba de prton movida pela energia da transferncia de eltrons e, a reao que ela catalisa vetorial: ela movimenta os prtons em uma direo especfica de um local (a matriz, que se torna negativamente carregada com a sada de prtons) para outro (o espao intermembranoso, que se torna positivamente carregado). Para enfatizar natureza vetorial do processo, a reao global geralmente escrita com subscritos que indicam a localizao dos prtons: P para o lado positivo da membrana interna (o espao intermembranoso), N para o lado negativo (a matriz). NADH + 5H+N + Q NAD+ + QH2 + 4 H+P (19-2)

O amital (uma droga barbitrica), a rotenona (um produto vegetal comumente usado como inseticida) e a piericidina (um antibitico) inibem o fluxo de eltrons dos centros Fe-S do complexo I para a ubiquinona (Tabela 19-4) e por isso bloqueia todo o processo de fosforilao oxidativa. O ubiquinol (QH2, a forma completamente reduzida, Figura 19-2) difunde-se na membrana interna, do complexo I at o complexo III, onde oxidado a Q em um processo que envolve o movimento de prtons para o lado externo (da matriz para o citosol).

Complexo II: succinato at ubiquinona No Captulo 15 encontramos o complexo II com o nome de succinato desidrogenase; a nica enzima do ciclo de Krebs que ligada

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membrana. Embora menor e mais simples que o complexo I, ele contm dois tipos de grupos prostticos e pelo menos quatro protenas diferentes (Tabela 19-3). Uma protena possui um FAD ligado covalentemente e um centro Fe-S com quatro tomos de Fe; uma segunda protena ferro-enxofre tambm est presente (ver frontispcio). Os eltrons passam do succinato para o FAD e ento, atravs dos centros Fe-S, para a ubiquinona (Fig. 19-8).

figura 19-8 Via dos eltrons do NADH, succinato, acil-CoA graxo e glicerol-3-fosfato at a ubiquinona. Eltrons do NADH passam por uma flavoprotena e uma srie de protenas ferro-enxofre (no complexo I) e depois vo para Q. Os eltrons do succinato passam por uma flavoprotena e vrios centros Fe-S (no complexo II) em seu caminho para Q. O glicerol-3fosfato doa eltrons para uma flavoprotena (glicerol-3-fosfato desidrogenase) na superfcie externa da membrana mitocondrial interna, da qual eles passam para Q. A acil-CoA desidrogenase (a primeira enzima na -oxidao) transfere os eltrons para a flavoprotena transferidora de eltrons (ETF). A partir da, os eltrons passam para Q via ETF-ubiquinona oxidorredutase.

figura 19-9 NADH:ubiquinona oxidorredutase (complexo I). O complexo I catalisa a transferncia de um on hidreto do NADH para o FMN, do qual dois eltrons passam atravs de uma srie de centros Fe-S para a protena ferro-enxofre N-2 no brao da matriz do complexo. A transferncia de eltrons da N-2 para a ubiquinona no brao da membrana forma QH 2, que difunde para a bicamada lipdica. Ela tambm dirige a expulso de quatro prtons por par de eltrons, da matriz. O mecanismo detalhado que acopla a transferncia de eltrons e prtons no complexo I ainda no conhecida mas, provavelmente envolve um ciclo Q similar quele no complexo III onde QH2 participa duas vezes por par de eltron (ver Fig. 19-11). Este fluxo de prtons produz um potencial eletroqumico atravs da membrana mitocondrial interna (lado N negativo, lado P positivo), que conserva alguma energia liberada pelas reaes de transferncia de prtons. Este potencial eletroqumico dirige a sntese de ATP.

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Outros substratos para as desidrogenases mitocondriais tambm passam eltrons para a cadeia respiratria ao nvel da ubiquinona, mas no atravs do complexo II. A primeira etapa na -oxidao dos acil-CoA graxo, catalisada pela flavoprotena acil-CoA desidrogenase, envolve a transferncia de eltrons do substrato para o FAD da desidrogenase, depois para uma flavoprotena transferidora de eltrons (FTE) que, por sua vez passa seus eltrons para a FTE-ubiquinona oxidorredutase (Fig. 19-8). Esta enzima, passa os eltrons para a cadeia respiratria reduzindo a ubiquinona. O glicerol-3-fosfato, formado atravs da liberao do glicerol devido degradao dos triacilglicerois ou atravs da reduo da diidroxiacetona formada na via glicoltica, oxidado pela glicerol-3-fosfato desidrogenase (veja Fig. 17-4). Esta enzima uma flavoprotena localizada na superfcie externa da membrana mitocondrial interna e, tal como a succinato desidrogenase e a acilCoA desidrogenase, ela canaliza eltrons para a cadeia respiratria reduzindo a ubiquinona (Fig. 19-8). O importante papel da glicerol-3-fosfato desidrogenase em transportar equivalentes redutores do NADH citoslico para a matriz mitocondrial ser descrito posteriormente (ver Fig. 19-27). O efeito de cada uma destas enzimas transferidoras de eltrons contribuir para o reservatrio de ubiquinona reduzida. A QH2 de todas estas reaes reoxidada pelo complexo III, o componente seguinte da cadeia de transferncia de eltrons da mitocndria.

tabela 19-4 Alguns agentes que interferem com a fosforilao oxidativa e a fotofosforilao Tipo de interferncia Inibio eltrons da transferncia Composto de Cianeto Monxido de carbono Antimicina A Bloqueia a transferncia de Alvo/modo de ao Inibe a citocromo oxidase

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eltrons do citocromo b para o citocromo c Mixotiazol Rotenona Amital Piericidina A DCMU Inibio da ATP sintase Aurovertina Oligomicina Venturicidina DCCD Desacoplamento da fosforilao da FCCP transferncia de eltrons DNP Valinomicina Termogenina Bloqueia o fluxo de prtons atravs de Fo e CFo Carregadores hidrofbicos de prtons Ionforo para K+ Forma poros condutores de prtons na membrana interna nas mitocndrias de tecido gorduroso marron Inibio da troca ATP-ADP Atractilosdeo Inibe a adenina nucleotdeo translocase Compete com QB pelo stio de ligao em FSIII Inibe F1 Inibe Fo e CFo Impede a transferncia de eltrons do centro Fe-S para a ubiquinona

Complexo III: ubiquinona at citocromo c O complexo III, o prximo complexo respiratrio e tambm chamado de complexo dos citocromos bc1 ou ubiquinona-citocromo c oxidorredutase, acopla a transferncia de eltrons do ubiquinol (QH2) para o citocromo c com o transporte vetorial de prtons da matriz para o espao intermembranoso. A determinao das estruturas desse enorme complexo (Fig. 19-10) e do complexo IV (abaixo) atravs de cristalografia de raios X em 1995-1998 foram marcos no estudo da transferncia de eltrons mitocondriais, propiciando a armao estrutural para integrar as inmeras observaes bioqumicas sobre a funo dos complexos.

figura 19-10

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Complexo do citocromo bc1 (complexo III). O complexo um dmero de monmeros idnticos, cada um deles com 11 subunidades diferentes. (a) Estrutura do monmero. O centro funcional formado por trs subunidades: o citocromo b (verde) com seus dois hemes (bH e bL; vermelho claro), a protena ferro-enxofre Rieske (prpura) com seu centro 2Fe-2S (amarelo) e o citocromo c1 (azul) com seu heme (vermelho). (b) A unidade funcional dimrica. O citocromo c1 e a proteina ferro-enxofre Rieske se projetam a partir da superfcie P e podem interagir com o citocromo c (mostrado aqui, mas no como parte do complexo funcional) no espao intermembranoso. O complexo apresenta dois stios de ligao distintos para a ubiquinona, QN e QP, que correspondem aos stios de inibio por duas drogas que bloqueiam a fosforilao oxidativa. A antimicina A, que bloqueia o fluxo de eltrons do heme bH para Q, se liga a QN, prximo ao heme bH no lado N (matriz) da membrana. O mixotiazol, que impede o fluxo de eltrons de QH2 para a protena ferro-enxofre Rieske, se liga a QP, prximo ao centro 2Fe-2S e ao heme bL no lado P da membrana. A estrutura dimrica essencial para o funcionamento do complexo III. A interface entre os monmeros forma duas cavidades, cada uma contendo um stio QP de um monmero e um stio QN do outro. O movimento dos intermedirios da ubiquinona ocorre dentro dessas cavidades protegidas. O complexo III se cristaliza em duas conformaes distintas (no mostradas). Em uma delas, o centro ferro-enxofre Rieske est prximo do seu aceptor de eltrons, o heme do citocromo c1, mas relativamente distante do citocromo b e do stio de ligao QH2, atravs do qual ele recebe os eltrons. Na outra configurao, o centro Fe-S se afastou do citocromo c1 em direo ao citocromo b. Acredita-se que a protena Rieske oscila entre estas duas conformaes onde ela primeiramente reduzida e depois oxidada. Baseado na estrutura do complexo III e nos estudos bioqumicos detalhados da reaes redox, foi proposto um modelo razovel para a passagem dos eltrons e prtons atravs deste complexo. A equao global para as reaes redox deste ciclo Q (Fig. 19-11) : QH2 + 2 cit c1(oxidado) + 2H+N Q + 2 cit c1(reduzido) + 4H+P (19-3)

O ciclo Q acomoda o comutador entre o carregador de eltrons (ubiquinona) e os carregadores de um eltron (citocromos b562, b566 e c1) e explica a estequiometria de quatro prtons translocados por par de eltrons que passa atravs do complexo, para o citocromo c. Embora o caminho dos eltrons atravs deste segmento da cadeia respiratria complicado, o efeito global da transferncia simples: QH2 oxidado a Q e duas molculas de citocromo c so reduzidas.

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O citocromo c (Fig. 6-18) uma protena solvel do espao intermembranoso. Aps o seu nico heme aceitar um eltron do complexo III , o citocromo c se move em direo do complexo IV para doar o eltron para um centro de cobre binuclear nesta enzima.

figura 19-11 O ciclo Q. O caminho dos eltrons atravs do complexo III mostrado pelas setas azuis. No lado P da membrana, duas molculas de QH2 so oxidadas at Q no stio QP, liberando quatro prtons no espao intermembranoso. Cada QH2 doa um eltron (via centro Fe-S Rieske) ao citocromo c1 e um eltron (via citocromo b) para a molcula de Q no stio QN, reduzindo-o em duas etapas a QH2. Esta reduo tambm utiliza dois prtons captados da matriz.

Complexo IV: Citocromo c at O2 No passo final da cadeia respiratria, o complexo IV, tambm chamado citocromo oxidase, transporta dois eltrons do citocromo c para o oxignio molecular, reduzindo-o a H2O. O complexo IV uma protena grande (13 subunidades; Mr 204.000) da membrana mitocondrial interna. As bactrias apresentam uma forma mais simples, com somente trs ou quatro subunidades, mas ainda capaz de catalisar tanto a transferncia de eltrons como o bombeamento de prtons. A comparao dos complexos da mitocndria e da bactria sugere que trs subunidades so crticas para a funo (Fig. 19-12). A subunidade II mitocondrial contm dois ons cobre complexados aos grupos SH de dois resduos de Cis em um centro binuclear (CuA) (Fig. 19-12b) que lembram as protenas de centros 2Fe-2S. A subunidade I contm dois grupos heme designados a e a3 e um outro ons cobre (CuB). O heme a3 e o CuB formam um segundo centro binuclear que aceita eltrons do heme a e ento os transfere para o O2 ligado ao heme a3. A transferncia de eltrons atravs do complexo IV ocorre do citocromo c para o centro CuA, do heme a para o heme a3-centro CuB e, finalmente para o O2 (Fig. 19-13). Para cada quatro eltrons que passam atravs deste complexo, a enzima consome quatro substratos H+ da matriz (lado N) convertendo o O2 em 2 H2O. Ela tambm usa a energia desta reao redox para bombear um prton para o espao intermembranoso (lado P) para cada eltron transportado, aumentando o potencial eletroqumico produzido pelo transporte de prtons, induzido pelas reaes redox, atravs dos complexos I e III. A reao global catalisada pelo complexo IV : 4 cit c(reduzido) + 8H+N + O2 4 cit c(oxidado) + 4H+P + 2H2O (19-4)

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Esta reduo de quatro eltrons do O2 envolve centros redox que transportam apenas um eltron de cada vez e, ela deve ocorrer sem gerar intermedirios incompletamente reduzidos, tais como o perxido de hidrognio ou radicais hidroxila livres, que so espcies muito reativas que podem danificar os componentes celulares. Os intermedirios permanecem fortemente ligados ao complexo at serem completamente convertidos em gua.

figura 19-12 Subunidades crticas da citocromo oxidase (complexo IV). mostrado o complexo bovino. (a) O centro do complexo IV apresenta trs subunidades. A subunidade I (amarela) tem dois grupos heme, a e a3 (vermelho) e um on cobre, CuB (esfera verde). O heme a3 e o CuB formam um centro Fe-Cu binuclear. A subunidade II (azul) contm dois ons Cu (esferas verdes) complexadas com os grupos SH de dois resduos de Cis em um centro binuclear, CuA, que se assemelha aos centros 2Fe-2S das protenas ferro-enxofre. Este centro binuclear e o stio de ligao do citocromo c esto localizados em um domnio da subunidade II que se projeta do lado P da membrana interna para o espao intermembranoso. A subunidade III (verde claro) aparentemente essencial para o funcionamento do complexo IV, mas o seu papel no bem conhecido. (b) O centro binuclear do CuA. Os ons Cu (esferas verdes) compartilham igualmente os eltrons. Quando o centro reduzido, eles apresentam cargas formais Cu1+Cu1+ e quando oxidados, Cu1,5+Cu1,5+. Os ligante ao redor dos ons Cu incluem duas His (azul escuro), duas Cis (amarelo), um Asp (vermelho) e uma Met (alaranjado).

figura 19-13 O caminho dos eltrons atravs do complexo IV. As trs protenas crticas para o fluxo dos eltrons so I, II e III. O contorno mais claro inclui as outras dez protenas do complexo. A transferncia de eltrons atravs do complexo IV comea quando cada uma das duas molculas de citocromo c reduzido doam um eltron para o centro binuclear CuA. Os eltrons ento passam, atravs do heme a, para o centro Fe-Cu (citocromo a3 e CuB). O oxignio ento se liga ao heme a3 e reduzido at seu derivado perxido (O22-) por dois eltrons do centro Fe-Cu. A liberao de mais dois eltrons do citocromo c converte o O22- em duas molculas de gua, consumindo quatro substratos prtons da matriz. Simultaneamente, quatro outros prtons so bombeados da matriz atravs de um mecanismo ainda desconhecido.

figura 19-14

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Resumo do fluxo de eltrons e prtons atravs dos quatro complexos da cadeia respiratria. Os eltrons alcanam Q atravs dos complexos I e II. QH2 funciona como um transportador mvel de eltrons e prtons. Ela transfere eltrons para o complexo III, que os transfere para uma outra conexo mvel, o citocromo c. O complexo IV transfere ento os eltrons do citocromo c reduzido para o O2. O fluxo de eltrons atravs dos complexos I, III e IV acompanhado por um fluxo de prtons da matriz para o espao intermembranoso. Lembrar que os eltrons da -oxidao dos cidos graxos tambm podem entrar na cadeia respiratria atravs de Q (ver Fig. 19-8).

A energia da transferncia dos eltrons conservada eficientemente em um gradiente de prtons A transferncia de dois eltrons do NADH, atravs da cadeia respiratria, para o oxignio molecular pode ser escrita como: NADH + H+ + O2 NAD+ + H2O (19-5)

Esta reao global altamente exergnica. Para o par redox NAD+/NADH, Eo 0,320V e, para o par O2/H2O, Eo 0,816V. Portanto, o Eo para esta reao +1,14V e, a variao de energia livre padro (Eq.14-5) : Go = nFEo = (2)(96,5kJ/V.mol)(1,14V) = 220 kJ/mol (de NADH) Essa mudana de energia livre padro baseada na considerao de que as concentraes de NADH e NAD+ so iguais (1 M). Na mitocndria que respira ativamente, a ao de vrias desidrogenases mantm a relao NADH/NAD+ acima da unidade e, a verdadeira mudana de energia livre para a reao mostrada na Eq. 19-5 de fato, substancialmente maior (mais negativa) que 220 kJ/mol. Um clculo semelhante para a oxidao do succinato mostra que a transferncia de eltrons do succinato (Eo do fumarato/succinato = 0,031V) para o O2 tem uma variao de energia livre padro menor, mas ainda negativa, da ordem de 150 kJ/mol. A maior parte dessa energia usada para bombear os prtons para fora da matriz. Para cada par de eltrons transferidos para o O2, quatro prtons so bombeados para fora pelo complexo I, quatro pelo complexo III e dois pelo complexo IV (Fig. 19-14). Portanto, a equao vetorial para o processo : NADH + 11 H+N + O2 NAD+ + 10 H+P + H2O (19-7) (19-6)

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A energia eletroqumica inerente a essa diferena na concentrao de prtons e separao de cargas representa uma conservao temporria da maior parte da energia da transferncia dos eltrons. A energia armazenada nesse gradiente, denominada fora prton motriz, apresenta dois componentes: (1) a energia potencial qumica devido a diferena na concentrao de uma espcie qumica (H+) em duas regies separadas pela membrana e, (2) a energia potencial eltrica que resulta da separao de carga quando um prton se move atravs da membrana sem um contra on (Fig. 19-15).

figure 19-15 Fora prton motriz. A membrana interna da mitocndria separa dois compartimentos de diferente [H+], resultando em diferenas na concentrao qumica (pH) e distribuio de carga () atravs da membrana. O efeito global a fora prton motriz (G) que pode ser calculada como mostrado. Isto explicado com mais detalhes no texto.

Conforme mostrado no Captulo 12, a mudana de energia livre para a criao de um gradiente eletroqumico por uma bomba de ons : G= -RT ln (C2/C1) + ZF (19-8)

onde C2/C1 a razo entre as concentraes para o on que se desloca; Z o valor absoluto da sua carga (1 para o prton) e a diferena de potencial eltrico transmembrana, dada em volts. Para prtons a 25oC, ln (C2/C1)= 2,3(log [H+]P - log [H+]N)= 2,3(pHN - pHP)= 2,3 pH e a Eq, 19-8 se reduz a: G= - 2,3 RT pH + F (19-9)

=(5,70 kJ/mol) pH + (96,5 kJ/mol) Em uma mitocndria que respira ativamente, o medido 0,15-0,2 V e o pH da matriz cerca de 0,75 unidades mais alcalino que o do espao intermembranoso, de tal modo que a mudana de energia livre calculada para bombear prtons para fora da ordem de + 20 kJ/mol (de H+), a maior parte da qual proveniente da poro eltrica do potencial eletroqumico. Uma vez que a transferncia de dois eltrons do NADH para o O2 acompanhada pelo bombeamento para fora de 10 H+ (Eq. 19-7) aproximadamente 200 kJ

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dos 220 kJ liberados pela oxidao de um mol de NADH, so conservados no gradiente de prtons. Quando os prtons se deslocam espontaneamente a favor do seu gradiente eletroqumico, a energia disponibilizada para produzir trabalho. Nas mitocndrias, cloroplastos e bactrias aerbicas, a energia eletroqumica no gradiente de prtons direciona a sntese de ATP a partir de ADP e Pi. Ns voltaremos energtica e estequiometria da sntese de ATP direcionada pelo potencial eletroqumico no gradiente de prtons, posteriormente neste captulo.

As mitocndrias das plantas tm mecanismos alternativos para oxidar o NADH A mitocndrias das plantas fornecem ATP durante os perodos de baixa iluminao ou escurido atravs de mecanismos inteiramente anlogos aqueles usados pelos organismos no fotossintticos. Na luz, a principal fonte de NADH mitocondrial a reao onde a glicina produzida pela fotorespirao convertida em serina (Fig. 20-39): 2 Glicina + NAD+ serina + NADH + H+ + CO2 + NH+4 Por razes discutidas no Captulo 20, as plantas devem efetuar esta reao mesmo quando no tm necessidade de usar NADH para produzir ATP. Para regenerar o NAD+ a partir de NADH desnecessrio, a mitocndria das plantas transfere eltrons do NADH diretamente para a ubiquinona e da ubiquinona diretamente para o O2, desviando-os dos complexos III e IV e suas bombas de prtons. A energia em NADH dissipada na forma de calor, que algumas vezes pode ser de valor para a planta (Adendo 19-1). Contrariamente citocromo oxidase (complexo IV), a QH2 oxidase alternativa no inibida por cianeto. A oxidao do NADH resistente ao cianeto, de fato uma marca caracterstica dessa via de transporte de eltrons em plantas.

Adendo 19-1 Vias Respiratrias Alternativas e Calor, Plantas mal cheirosas Muitas plantas floridas atraem insetos polinizadores liberando molculas odorferas que mimetizam uma fonte de alimento natural de insetos ou locais potenciais de postura de ovos. As plantas polinizadas por moscas ou escaravelhos que normalmente ali se alimentam ou pem seus ovos em esterco ou carne podre, algumas vezes usam compostos com mau cheiro para atrair esses insetos. Uma famlia de plantas malcheirosas a Araceae, que inclui os filodendros, os copos-de-lrio e de uma espcie de couve mau cheirosa. Essas plantas apresentam folhas

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delgadas densamente empacotadas em uma estrutura ereta chamada espdice, rodeada por uma folha modificada chamada espata. A espdice libera odores de carne putrefata ou esterco. Antes da polinizao a espdice tambm se aquece, em muitas espcies de 20 at 40C acima da temperatura ambiente. A produo de calor (termognese) ajuda a evaporao das molculas odorferas para uma melhor disperso. Como a carne putrefata e o esterco so geralmente quentes devido ao metabolismo hiperativo dos micrbios carniceiros, o prprio calor tambm pode atrair insetos. No caso da couve mau cheirosa (Fig.1), que floresce no final do inverno ou no comeo da primavera quando a neve ainda cobre o solo, a termognese permite que a espdice cresa atravs da neve. Como esta espcie de couve aquece sua espdice ? Embora as mitocndrias das plantas, fungos e eucariotos unicelulares apresentam sistemas de transporte de eltrons que so essencialmente os mesmos que os dos animais, elas apresentam uma via respiratria alternativa. Nesta via, a QH2 que resistente ao cianeto, transfere os eltrons do reservatrio de ubiquinona diretamente para o oxignio, desviando-os das duas vias de translocao de prtons dos complexos III e IV (Fig. 2). A energia que poderia ser conservada como ATP liberada como calor. A mitocndria das plantas tambm apresenta uma NADH desidrogenase alternativa que insensvel rotenona, um inibidor do complexo I (ver Tabela 19-4), que transfere eltrons do NADH na matriz diretamente para a ubiquinona, desviandoos do complexo I e seu associado bombeamento de prtons. As mitocndria das plantas apresentam ainda uma outra NADH desidrogenase, na face externa da membrana interna, que fica defronte ao espao intermembranoso e transfere os eltrons do NADPH ou NADH para a ubiquinona, desviando-os novamente do complexo I. Assim, quando os eltrons entram na via respiratria alternativa atravs da NADH desidrogenase insensvel a rotenona, a NADH desidrogenase externa, ou succinato desidrogenase (complexo II) e passam para o O2 via oxidase alternativa resistente ao cianeto, a energia no conservada como ATP, mas liberada como calor. A couve mau cheirosa pode usar o calor para derreter a neve, produzir um fedor podre ou atrair escaravelhos ou moscas. figura 1 Espcie de couve oriental mau cheirosa figura 2 Carregadores de eltrons da membrana interna da mitocndria das plantas. Os eltrons podem fluir atravs dos complexos I, III e IV, como na mitocndria dos animais ou atravs de carregadores alternativos especficos de plantas pelas vias mostradas com setas azuis.

A Sntese de ATP

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Como o gradiente de concentrao de prtons transformado em ATP ? Vimos que a transferncia de eltrons libera e, a fora prton motriz conserva energia livre mais que suficiente (cerca de 200 kJ) por mol de pares de eltrons para formar um mol de ATP que requer 50 kJ (veja Adendo 14-2). Portanto, a fosforilao oxidativa mitocondrial no representa nenhum problema termodinmico. Vamos agora considerar o mecanismo qumico que acopla o fluxo de eltrons com a fosforilao. O modelo quimiosmtico proposto por Peter Mitchell o paradigma para este mecanismo. De acordo com o modelo (Fig. 19-6), a energia eletroqumica inerente da diferena na concentrao de prtons e da separao de cargas atravs da membrana mitocondrial interna, a fora prton motriz, dirige a sntese de ATP medida que os prtons fluem passivamente de volta para a matriz atravs de um poro de prtons associado ATP sintase. Para enfatizar esse papel crucial da fora prton motriz, a equao da sntese do ATP dada por: ADP + Pi + nH+P ATP + H2O + nH+N Peter Mitchel 1920-1992 (19-10)

A definio operacional de acoplamento mostrada na Figura 19-17. Quando mitocndrias isoladas so suspensas em uma soluo tampo contendo ADP, Pi e um substrato oxidvel como o succinato, ocorrem trs processos facilmente mensurveis: (1) o substrato oxidado (succinato produz fumarato), o O2 consumido e (3) o ATP sintetizado. O consumo de oxignio e a sntese de ATP dependem da presena de um substrato oxidvel (neste caso, o succinato) bem como de ADP e Pi.

figura 19-16 O modelo quimiosmtico. Nesta representao simples da teoria quimiosmtica aplicada mitocndria, os eltrons do NADH e outros substratos oxidveis passam atravs de uma cadeia de carregadores arranjados simetricamente na membrana interna. O fluxo de eltrons acompanhado por uma transferncia de prtons atravs da membrana produzindo um gradiente qumico (pH) e um gradiente eltrico (). A membrana interna da mitocndria impermevel aos prtons e eles podem voltar para a matriz somente atravs de canais especficos para prtons (Fo). A fora prton motriz que direciona os prtons de volta para a matriz propicia a energia para a sntese de ATP que catalisada pelo complexo F 1 associado a Fo.

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figura 19-17 Acoplamento da transferncia de eltrons e sntese de ATP na mitocndria. Em experimentos para demonstrar o acoplamento, as mitocndria so suspensas em um meio tamponado e um eletrodo de O2 usado para monitorar o consumo de O2. Em intervalos de tempo determinados, so removidas amostras que so analisadas para se verificar a presena de ATP. (a) A adio de apenas ADP e Pi resulta em um pequeno ou nenhum aumento tanto da respirao (consumo de O2, preto) como da sntese de ATP (vermelho). Quando o succinato adicionado, a respirao comea imediatamente e o ATP sintetizado. A adio de cianeto (CN), que bloqueia a transferncia de eltrons entre a citocromo oxidase e o O2, inibe tanto a respirao quanto a sntese de ATP. (b) Mitocndrias supridas com succinato respiram e sintetizam ATP apenas quando o ADP e o Pi forem adicionados. A adio subseqente de venturicidina ou oligomicina, inibidores da ATP sintase, bloqueia tanto a sntese de ATP quanto a respirao. O dinitrofenol (DNP) um desacoplador e permite que a respirao continue sem a sntese de ATP. Como a energia da oxidao do substrato dirige a sntese do ATP na mitocndria, no inesperado que inibidores do transporte de eltrons para o O2 (cianeto, monxido de carbono, antimicina A) bloqueiem a sntese de ATP (Fig. 19-17a). Mais surpreendente o achado de que o inverso tambm verdade: inibio da sntese de ATP bloqueia a transferncia de eltrons na mitocndria intacta. Este acoplamento obrigatrio pode ser demonstrado em mitocndrias isoladas suprindo-as de O2 e substratos oxidveis, mas no ADP (Fig. 19-17b). Nestas condies no ocorre nenhuma sntese de ATP e a transferncia de eltrons para o O2 no acontece. O acoplamento da oxidao e fosforilao tambm pode ser demonstrado usando-se oligomicina ou veturicidina, antibiticos txicos, que se ligam ATP sintase na mitocndria. Estes compostos so potentes inibidores da sntese de ATP e da transferncia de eltrons atravs da cadeia de carregadores para o O2 (Fig. 19-17b). Como j conhecido que a oligomicina no interage diretamente com os carregadores de eltrons, mas somente com a ATP sintase, a transferncia de eltrons e a sntese de ATP so obrigatoriamente acopladas, isto , uma no ocorre sem a outra. A teoria quimiosmtica explica prontamente a dependncia da sntese de ATP na mitocndria do transporte de eltrons. Quando o fluxo de prtons para o interior da matriz, atravs do canal de prtons da ATP sintase bloqueado (com oligomicina por exemplo), no existe nenhum caminho para o retorno dos prtons para a matriz e, a contnua extruso de prtons provocada pela atividade da cadeia respiratria gera um grande gradiente de prtons. A fora prton motriz aumenta at que o custo (energia livre) do bombeamento de prtons

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para fora da matriz contra esse gradiente se iguale ou exceda a energia liberada pela transferncia dos eltrons do NADH para o O2. Neste ponto, o fluxo de eltrons cessa, a energia livre do processo de fluxo de eltrons acoplado ao bombeamento de prtons torna-se zero e o equilbrio estabelecido. Entretanto, certas condies e reagentes podem desacoplar a oxidao da fosforilao. Quando mitocndrias intactas so rompidas com detergentes ou cisalhamento fsico, os fragmentos de membrana resultantes ainda podem catalisar a transferncia de eltrons do succinato ou NADH para o O2 mas nenhuma sntese de ATP acoplada a esta respirao. Certos compostos qumicos causam o desacoplamento sem romper a estrutura mitocondrial. Entre os desacopladores qumicos esto includos o 2,4-dinitrofenol (DNP) e a carbonilcianeto-p-trifluormetoxi fenilhidrazina (FCCP) (Tabela 19-4; Fig. 19-18), ambos cidos fracos com propriedades hidrofbicas. A hidrofobicidade destes compostos permite que eles se difundam rapidamente atravs da membrana da mitocndria. Aps entrarem na matriz mitocondrial na forma protonada, eles podem liberar um prton, dissipando assim o gradiente de prtons. Ionforos tais como a valinomicina (ver Fig. 12-37; tabela 19-4) permitem que ons inorgnicos passem facilmente atravs das membranas. Os ionforos desacoplam a transferncia de eltrons da fosforilao oxidativa dissipando a contribuio eltrica do gradiente eletroqumico atravs da membrana da mitocndria.

figura 19-18 Dois desacopladores qumicos da fosforilao oxidativa. Tanto o DNP como o FCCP possuem um prton dissocivel e so muito hidrofbicos. Eles carregam prtons atravs da membrana mitocondrial interna, dissipando o gradiente de prtons. Eles tambm desacoplam a fotofosforilao (pg. xxx). Se o papel da transferncia de eltrons na sntese de ATP mitocondrial apenas bombear prtons para criar o potencial da fora prton motriz, um gradiente de prtons criado artificialmente deveria ser capaz de substituir a transferncia de eltrons para dirigir a sntese de ATP. Essa predio do modelo quimiosmtico foi testada e confirmada experimentalmente (Fig. 19-19). Mitocndria manipuladas de modo a se impor uma diferena de concentrao de prtons e uma separao de cargas atravs da membrana interna sintetizam ATP na ausncia de um substrato oxidvel. A fora prton motriz sozinha suficiente para conduzir a sntese de ATP.

figura 19-19

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Evidncia do papel do gradiente de prton na sntese

de ATP. Um gradiente

eletroqumico imposto artificialmente comanda a sntese de ATP na ausncia de um substrato oxidvel como um doador de eltrons. Neste experimento de duas etapas, mitocndrias isoladas so inicialmente incubadas em um tampo de pH 9 contendo KCl 0,1 M. (a) Um lento vazamento do tampo e do KCl para o interior da mitocndria eventualmente provoca um equilbrio da matriz com o meio circunvizinho. No esto presentes quaisquer substratos oxidveis. (b) As mitocndrias so agora separadas do tampo de pH 9 e ressuspensas em um tampo de pH 7 contendo valinomicina mas no KCl. A mudana de tampo cria uma diferena de duas unidades de pH atravs da membrana interna da mitocndria. O fluxo de K+ para fora, sem o seu contraon e contra o seu gradiente de concentrao, promovido pela valinomicina cria um desbalanceamento de cargas atravs da membrana (matriz negativa). A soma do potencial qumico, devido diferena de pH, com o potencial eltrico, devido separao de cargas, uma fora prton motriz suficientemente grande para suportar a sntese de ATP na ausncia de um substrato oxidvel.

Efraim Racker 1913-1991

A ATP sintase tem dois domnios funcionais, Fo e F1 A ATP sintase mitocondrial uma ATPase do tipo F (veja Fig. 12-31c; Tabela 12-4), similar na estrutura e mecanismo s ATP sintases de cloroplastos e bactrias. Esse grande complexo enzimtico da membrana mitocondrial interna catalisa a formao de ATP a partir de ADP e Pi acompanhado do fluxo de prtons do lado P para o N da membrana (Eq. 19-10). A ATP sintase, tambm chamada complexo V, apresenta dois componentes distintos: F1, uma protena perifrica de membrana e Fo que uma protena integral de membrana. A letra o subscrita em Fo significa sensvel oligomicina. F1 foi o primeiro fator identificado como essencial para a fosforilao oxidativa. Ele foi identificado e purificado a partir da membrana mitocondrial interna por Efraim Racker e seus colegas no incio dos anos 60. In vitro, pequenas vesculas formadas a partir da membrana mitocondrial interna promovem a sntese de ATP acoplada transferncia de eltrons. Quando F1 extrado cuidadosamente dessas vesculas, as vesculas despojadas ainda contm as cadeias respiratrias intactas e a poro Fo da ATP sintase. Estas vesculas podem catalisar a transferncia de eltrons do NADH para o O2 mas no podem produzir um gradiente de prtons: Fo apresenta um poro de prtons atravs do qual esses prtons vazam to rapidamente quanto so bombeados pela transferncia de eltrons e, sem um gradiente de prtons as vesculas desprovidas do

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componente F1 no podem fazer ATP. Isoladamente, o componente F1 catalisa a hidrlise do ATP (o reverso da sntese) e por isso foi originalmente chamado F1ATPase. Quando purificado e adicionado s vesculas despojadas ele se reassocia com o componente Fo fechando seu poro de prtons e restaurando a capacidade da membrana de acoplar a transferncia de eltrons e a sntese de ATP.

O ATP estabilizado em relao ao ADP, na superfcie de F1 Experimentos de troca isotpica usando F1 purificado revela um fato notvel sobre o mecanismo cataltico da enzima: na sua superfcie, a reao ADP + Pi ATP + H2O rapidamente reversvel, isto , a variao da energia livre para a sntese de ATP prxima de zero ! Quando o ATP hidrolisado por F1 (o reverso da sntese de ATP) em gua marcada com 18O, o Pi que formado apresenta o tomo 18O. Medidas cuidadosas do teor de 18O no Pi formado in vitro pela hidrlise enzimtica do ATP catalisada pela F1 revelam que o Pi contm no um mas trs ou quatro tomos de 18O (Fig. 19-20). Isto indica que a ligao pirofosfato terminal do ATP quebrada e refeita repetidamente antes que o Pi deixe a superfcie da enzima. Com o Pi livre para se movimentar em seu stio de ligao, cada hidrlise insere ao acaso o 18O em cada uma das quatro posies no Pi. Esta reao de troca ocorre nos complexos FoF1 no energizados (sem nenhum gradiente de prtons) e com o complexo F1 isolado pois no requer aplicao de energia.

figura 19-20 Mecanismo cataltico de F1: experimento de troca com 18O. F1 solubilizado de membrana mitocondrial incubado com ATP na presena de gua marcada com 18O. Em intervalos de tempo definidos uma mostra retirada da soluo e analisada para a incorporao do 18O no Pi produzido pela hidrlise do ATP. Em minutos, o Pi apresenta trs ou quatro 18O indicando que tanto a hidrlise quanto a sntese do ATP ocorreram vrias vezes durante o perodo de incubao. Estudos cinticos das velocidades de sntese e hidrlise do ATP confirmam a concluso de que o Go para sntese do ATP na enzima prxima de zero. Atravs de medidas de velocidade de hidrlise (k1= 10 s-1) e sntese (k-1= 24 s-1), a constante de equilbrio calculada para a reao: k1 Enz-ATP Enz-(ADP + Pi) k-1

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: Keq= k-1/ k1= 24 s-1/10 s-1= 2,4 A partir desta Keq, o Go prximo de zero. Isto contrasta com a Keq da ordem de 105 (Go= - 30,5 kJ/mol) para o ATP livre em soluo (no na superfcie da enzima). O que explica essa enorme diferena ? A ATP sintase estabiliza o ATP em relao ao ADP + Pi ligando mais fortemente o ATP e liberando energia suficiente para contrabalanar o custo de fazer ATP. Medidas cuidadosas das constantes de ligao mostram que a FoF1 liga o ATP com uma afinidade muito grande (Kd 10-12 M) e o ADP com uma afinidade muito menor (Kd 10-8). Esta diferena no Kd corresponde a uma diferena de cerca de 40 kJ/mol na energia de ligao e, essa energia de ligao desloca o equilbrio na direo da formao do produto ATP.

O gradiente de prtons comanda a liberao de ATP da superfcie da enzima Embora a ATP sintase equilibra o ATP com o ADP + Pi sintetizado de novo, o ATP no pode deixar a superfcie da enzima na ausncia de um gradiente de prtons. este gradiente de prtons que ajuda a enzima a liberar o ATP formado em sua superfcie. O diagrama de coordenadas de reao do processo (Fig. 19-21) ilustra a diferena entre o mecanismo da sntese do ATP e aquele de vrias outras enzimas que catalisam reaes endergnicas. Para a sntese contnua de ATP, a enzima deve oscilar entre a forma que liga o ATP muito fortemente e a forma que libera o ATP. Estudos qumicos e cristalogrficos da ATP sintase mostraram a base estrutural para essa alternncia de funo.

figura 19-21 Diagrama de coordenadas da reao para a ATP sintase e uma enzima tpica. Em uma reao catalisada por uma enzima tpica (esquerda) alcanar o estado de transio () entre o substrato e o produto a maior barreira de energia a ser sobrepujada. Na reao catalisada pela ATP sintase (direita), a liberao do ATP da enzima e no a formao do ATP, a maior barreira de energia. Embora a mudana de energia livre para a formao do ATP a partir do ADP + Pi em soluo aquosa, grande e positiva, a forte ligao do ATP enzima garante energia de ligao suficiente para levar a energia do ATP ligado enzima prxima aquela do ADP + Pi. Na superfcie da enzima, a reao portanto rapidamente reversvel e a constante de equilbrio aproximadamente 1. A energia livre requerida para a liberao do ATP garantida pela fora prton motriz.

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John E. Walker

Cada subunidade da ATP sintase pode assumir trs configuraes diferentes A F1 mitocondrial apresenta nove subunidades de cinco tipos diferentes, com a composio 33. Cada uma das trs subunidades apresenta um stio cataltico para a sntese do ATP. A determinao cristalogrfica da estrutura de F1 por John E. Walker e colegas, revelou detalhes estruturais muito teis para explicar o mecanismo cataltico da enzima. A parte de F1 em forma de maaneta, uma esfera achatada de 8 mm de altura e 10 mm de espessura, consistindo de subunidades e alternadas arranjadas semelhantemente aos gomos de uma laranja (Fig. 19-22a, b, c). Os polipeptdeos que formam o caule na estrutura cristalina de F1 esto arranjados assimetricamente, com um domnio de uma nica subunidade que caracteriza uma haste que atravessa F1 e um outro domnio de primariamente associado a uma das trs subunidades , designada -vazia (Fig. 19-22c). Embora a sequncia de aminocidos das trs subunidades sejam idnticas, as suas conformaes so diferentes, em parte devido associao da subunidade com apenas um das trs. As estruturas das subunidades e no foram reveladas nesses estudos cristalogrficos. As diferenas conformacionais entre as subunidades se ampliam para diferenas nos stios de ligao do ATP/ADP. Quando os pesquisadores cristalizaram a protena na presena de ADP e App(NH)p, um anlogo estrutural muito parecido com o ATP que no pode ser hidrolisado pela atividade ATPase de F1, o stio de ligao de uma das trs subunidades foi ocupado pelo App(NH)p, o segundo foi ocupado pelo ADP e o terceiro ficou vazio (Fig. 19-22c). As correspondentes conformaes da subunidade foram designadas -ATP, -ADP e -vazia. Essa diferena na ligao do nucleotdeo entre as trs subunidades crtica para o mecanismo desse complexo. App(NH)p (-imidoadenosina-5Ligao - no hidrolizvel trifosfato)

figura 19-22

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Complexo da ATP sintase mitocondrial. (a) Estrutura do complexo F1 deduzida a partir de estudos cristalogrficos e bioqumicos. Na F1, trs subunidades e trs esto arranjadas como os gomos de uma laranja, com alternncia das subunidades (sombreado cinza) e (sombreado prpura) ao redor de uma haste central, a subunidade (verde). (b) Estrutura cristalina de F1 vista de lado. Duas subunidades e uma foram removidas para mostrar a haste central (subunidade ) e os stios de ligao para o ATP (vermelho) e ADP (amarelo) nas subunidades . As subunidade e no esto mostradas aqui. (c) F1 vista por cima (isto , do lado N da membrana), mostrando as trs subunidades , as trs e a haste central (subunidade ). Em cada subunidade , perto da sua interface com a subunidade vizinha existe um stio de ligao para o nucleotdeo que crtico para a atividade cataltica. A nica subunidade se associa fundamentalmente com um dos trs pares , forando cada uma das trs subunidades a assumirem conformaes ligeiramente diferentes, com diferentes stios de ligao para nucleotdeos. Na enzima cristalina, uma subunidade (-ADP) apresenta o ADP (amarelo) em seu stio de ligao, a prxima (-ATP) contm o ATP (vermelho) e, a terceira (-vazia) no contm nenhum nucleotdeo ligado. O complexo Fo que constitui o poro de prtons composta de trs subunidades a, b e c em uma proporo ab2c10-12. A subunidade c um polipeptdio pequeno (Mr 8.000) muito hidrofbico, constitudo fundamentalmente por duas hlices transmembrana, com uma pequena volta se projetando do lado da matriz na membrana. A estrutura cristalina da FoF1 de levedura, deduzida em 1999, mostra o arranjo das subunidades c. Existem 10 subunidades c nas leveduras, cada uma com duas hlices transmembrana quase perpendiculares ao plano da membrana e arranjadas em dois crculos concntricos (Fig. 19-22d, e). O crculo interior composto das hlices amino-terminal de cada subunidade c. O crculo exterior, de cerca de 55 de dimetro, formado pelas hlices caboxila-terminais. As subunidades e de F1 formam uma perna-e-p que se projeta do fundo (membrana) da F1 e se apoia firmemente no anel das subunidades c. Um desenho esquemtico (Fig. 19-22f) combina a informao estrutural dos estudos da FoF1 bovina e de levedura.

figura 19-22 (continuao) (d) Vista lateral da estrutura da FoF1. Trata-se de uma composio, onde as coordenadas cristalogrficas da F1 mitocondrial bovina (sombras prpuras e cinzas) foram combinadas com as da Fo mitocondrial de levedura (sombras amarelo e laranja). As subunidades a, b, e no fazem parte da estrutura cristalina mostrada aqui. (e) Estrutura da FoF1 de levedura vista a partir do fim na direo do lado P para o lado N. As estruturas maiores visveis nesta

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seo transversal so as duas hlices transmembranas de cada uma das dez subunidades c arranjadas em crculos concntricos. (f) Estrutura do complexo FoF1 deduzida a partir de estudos bioqumicos e cristalogrficos. As duas subunidades b de Fo se associam firmemente s subunidades e de F1, mantendo-as fixas em relao membrana. Em Fo, o cilindro de subunidades c, enterrado na membrana, est ligado haste constituda pelas subunidades e de F1. medida que os prtons fluem atravs da membrana do lado P para o lado N via Fo, o cilindro e a haste rodam e as subunidades de F1 mudam de conformao medida que a subunidade se associa a cada uma delas.

Paul Boyer A catlise rotacional a chave para o mecanismo de mudana de ligao para a sntese do ATP Baseado em detalhados estudos cinticos e de associao de ligantes, da reao catalisada pela FoF1, Paul Boyer props um mecanismo onde os trs stios ativos de F1 giram catalisando a sntese de ATP (Fig. 19-23). Uma subunidade comea na conformao ADP, que liga ADP + Pi do meio circunvizinho. A subunidade muda ento de conformao, assumindo a forma -ATP, que liga fortemente e estabiliza o ATP, efetuando um equilbrio imediato do ADP + Pi com o ATP na superfcie da enzima. Finalmente, a subunidade muda para a conformao -vazia, que tem baixa afinidade pelo ATP e, o recm sintetizado ATP deixa a superfcie da enzima. Uma nova rodada da catlise comea quando esta subunidade assume a forma -ADP e liga ADP + Pi. As mudanas conformacionais fundamentais para este mecanismo so dirigidas pela passagem dos prtons atravs da poro Fo da ATP sintase. A corrente de prtons atravs do poro Fo provoca a rotao do cilindro de subunidades c e da subunidade a ele ligada, ao redor do eixo da subunidade , que perpendicular ao plano da membrana. A subunidade atravessa o centro do esferide 33 que mantido estacionrio em relao superfcie da membrana pelas subunidade b2 e (Fig. 19-22f). A cada 120 de rotao, entra em contato com uma subunidade diferente e esse contato fora esta subunidade a assumir a conformao -vazia. As trs subunidades interagem de tal modo que quando uma assume a conformao -vazia, a sua vizinha de um lado deve assumir a forma -ADP e a outra vizinha, a forma ATP. Desse modo, uma rotao completa da subunidade provoca uma mudana da

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subunidade nas trs conformaes possveis e, a cada rotao completa, trs ATP so sintetizados e liberados na superfcie da enzima. Uma forte predio deste modelo de mudana de ligao que a subunidade deve rodar em uma direo quando FoF1 est sintetizando ATP e na direo oposta quando a enzima est hidrolisando ATP. Esta predio foi confirmada atravs de experimentos elegantes nos laboratrios de Masamitsu Yoshida e Kazuhiko Kinoshita Jr. A rotao de em uma nica molcula de F1 foi detectada microscopicamente ligando-se um longo, fino e fluorescente polmero de actina e aguardando ela se mover em relao a 33 imobilizada em uma lmina de microscpio, medida que o ATP era hidrolisado. Quando todo o complexo FoF1 (e no apenas F1) foi usado em um experimento similar, o anel de subunidade c girou com (Fig. 19-24). A haste girou na direo prevista de 360. A rotao no foi to regular, mas ocorreu em trs discretos passos de 120. Conforme j calculado a partir da velocidade de hidrlise do ATP por uma molcula de F1 e o arraste friccional no longo polmero de actina, a eficincia deste mecanismo em converter energia qumica em movimento quase 100%. Segundo Boyer, ela uma esplndida mquina molecular.

figura 19-23 Modelo da mudana de ligao para a ATP sintase. O complexo F1 tem trs stios no equivalentes para a ligao dos nucleotdeos de adenina, um para cada par de subunidades e . Em um dado momento, um destes stios est na conformao -ATP (que liga ATP fortemente), um segundo est na conformao -ADP (ligao frouxa) e um terceiro est na conformao -vazia (ligao muito frouxa). A fora prton motriz provoca a rotao da haste central (a subunidade , mostrada como uma ponta de flecha verde) que entra em contato com cada um dos pares de subunidades sucessivamente. Isto acarreta uma mudana conformacional cooperativa onde o stio -ATP convertido na conformao -vazia e o ATP liberado. O stio -ADP convertido na conformao -ATP que promove a condensao de ADP + Pi, ligados a ela, para formar ATP. A conformao -vazia se transforma em um stio -ADP, que liga frouxamente ADP + Pi provenientes do solvente. O modelo, baseado em resultados experimentais, requer que

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pelo menos dois dos trs stios catalticos se alternem em atividade. O ATP no pode ser liberado de um stio se e at que o ADP + Pi estejam ligados ao outro.

figura 19-24 Demonstrao experimental da rotao de F1 e F1 geneticamente construda contendo um certo nmero de resduos de His adere fortemente a uma lmina de microscpio coberta com um complexo de Ni. A biotina ligada covalentemente subunidade c. A proteina avidina, que se liga fortemente biotina, ligada covalentemente a longos filamentos de actina marcados com uma sonda fluorescente. A ligao da biotina avidina, une os filamentos de actina com a subunidade c. Quando o ATP adicionado para estimular a atividade ATPase da F1, observa-se o filamento marcado girar continuamente em uma direo demonstrando que o cilindro de subunidades c de Fo gira. Em outro experimento (no mostrado), a ligao do filamento de actina diretamente na subunidade mostrou que ela tambm gira. Provavelmente o cilindro e a haste se movem como uma unidade.

O acoplamento quimiosmtico acarreta uma estequiometria no inteira de consumo de O2 e sntese de ATP Antes da aceitao geral do modelo quimiosmtico para a fosforilao oxidativa, assumia-se que a equao da reao global teria a seguinte forma: ADP + Pi + x()O2 + xH+ + xNADH ATP + xH2O + xNAD+ (19-11)

onde o valor de x, s vezes chamado razo P/O ou razo P/2e, sempre era um nmero inteiro. Quando mitocndrias intactas so suspensas em uma soluo contendo um substrato oxidvel tal como o succinato ou NADH e fornecido O2, a sntese de ATP bem como a diminuio do O2 podem ser medidas rapidamente. Entretanto, a medida de P/O complicada pelo fato de que a mitocndria intacta consome ATP em muitas reaes que ocorrem na matriz e consome O2 para propsitos outros que no a fosforilao oxidativa. A maioria dos experimentos produzem razes P/O (ATP para O2) maiores que 2 quando o NADH o doador de eltrons e maiores que 1 quando o succinato o doador. Consideradose que P/O deve ser um valor inteiro, a maioria dos pesquisadores concordaram que a razo P/O deveria ser 3 para o NADH e 2 para o succinato. Durante anos estes valores foram encontrados em artigos de pesquisas e livros textos. Com a introduo do paradigma quimiosmtico para o acoplamento da sntese do ATP transferncia de eltrons, no existe nenhum requisito terico para a razo P/O ser

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inteira. As questes relevantes sobre a estequiometria tornam-se: quantos prtons so bombeados para fora atravs da transferncia de eltrons de um NADH para o O2 e quantos prtons devem entrar atravs do complexo FoF1 para proporcionar a sntese de uma molcula de ATP ? A medida do fluxo de prtons tecnicamente complicada. Deve-se levar em considerao a capacidade tamponante da mitocndria, o vazamento no produtivo de prtons atravs da membrana interna e o uso do gradiente de prtons para funes diferentes da sntese de ATP, como por exemplo o transporte de substratos atravs da membrana mitocondrial (descrito a seguir). O valor de consenso para os prtons bombeados para fora por par de eltrons 10 para o NADH e 6 para o succinato. O valor experimental mais aceito para o nmero de prtons requeridos para proporcionar a sntese de uma molcula de ATP 4, dos quais 1 usado para transportar Pi, ATP e ADP atravs da membrana mitocondrial (veja a seguir). Se 10 prtons so bombeados para fora por molcula de NADH e 4 devem entrar para produzir um ATP, a razo P/O baseada em prtons 2,5 para o NADH como doador de eltrons e 1,5 (6/4) para o succinato. Sero usados os valores de P/O de 2,5 e 1,5 ao longo deste livro, mas os valores 3,0 e 2,0 ainda so encontrados na literatura bioqumica. A palavra final acerca da estequiometria de prtons provavelmente no ser escrita at que os detalhes completos do mecanismo de reao da FoF1 sejam conhecidos.

A fora prton motriz energiza o transporte ativo Embora o papel primrio do gradiente de prtons na mitocndria fornecer energia para a sntese do ATP, a fora prton motriz tambm comanda vrios processos de transporte essenciais fosforilao oxidativa. A membrana mitocondrial interna geralmente impermevel a espcies carregadas, exceto para dois sistemas especficos da membrana, o transporte de ADP e Pi para dentro da matriz e o do ATP para fora, no citosol (Fig. 19-25). A adenina nucleotdeo translocase, embebida na membrana interna, liga o ADP3- no espao intermembranoso e o transporta para a matriz, trocando-o com uma molcula de ATP4-, que transportada simultaneamente para fora (veja Fig. 14-1 para as formas inicas do ATP e ADP). Como esse contra transporte desloca quatro cargas negativas para fora, para cada trs transportadas para dentro, sua atividade favorecida pelo gradiente eletroqumico transmembrana, que acarreta uma carga negativa lquida matriz. A fora prton motriz direciona a troca ATP-ADP. A adenina nucleotdeo translocase especificamente inibida pelo atractilosdio, um glicosdio txico formado por uma espcie de cardo. Se o transporte de ADP para dentro da mitocndria e o do ATP para fora inibido, o ATP citoslico no pode ser regenerado a partir do ADP, explicando a toxicidade do atractilosdio (Tabela 19-4). Um segundo sistema de transporte de membrana essencial para a fosforilao oxidativa a fosfato translocase, que promove o co-transporte de um H2PO-4 e um H+ para dentro da

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matriz. Este processo de transporte tambm favorecido pelo gradiente de prtons transmembrana (Fig. 19-25). Observe que ele requer um prton para se mover do lado P para o lado N da membrana interna, consumindo uma parte da energia do transporte de eltrons.

figura 19-25 Adenina nucleotdeo e fosfato translocases. Os sistemas de transporte da membrana mitocondrial interna transportam ADP e Pi para dentro da matriz e o ATP recm-sintetizado para o citosol. A adenina nucleotdeo translocase uma contra transportadora, isto , a mesma protena desloca o ADP para dentro da matriz e o ATP para fora. O efeito de substituir o ATP4- pelo ADP3- o efluxo lquido de uma carga negativa, que favorecida pela diferena de carga atravs da membrana interna (lado externo positivo). Em pH 7, o Pi est presente como HPO42- e H2PO4- e, a fosfato translocase especfica para o H2PO4-. No h fluxo lquido de carga durante o co-transporte do HPO42- e H+, mas a concentrao relativamente baixa de prtons na matriz favorece o movimento dos ons H+ para dentro. Assim, a fora prton motriz responsvel por fornecer energia tanto para a sntese do ATP bem como para transportar substratos (ADP e Pi) para dentro e o produto (ATP) para fora da matriz mitocondrial.

Sistemas de lanadeiras so requeridos para a oxidao mitocondrial do NADH citoslico A NADH desidrogenase da membrana mitocondrial interna das clulas animais pode aceitar eltrons apenas do NADH na matriz. Sabendo que a membrana interna no permevel ao NADH, como o NADH gerado pela gliclise, no citoplasma, pode ser reoxidado a NAD+ pelo O2 via cadeia respiratria ? Sistemas especiais de lanadeiras transportam os equivalentes redutores do NADH citoslico para dentro da mitocndria por uma rota indireta. A lanadeira de NADH mais ativa, que funciona nas mitocndrias do fgado, rim e corao, a lanadeira malato-aspartato (Fig. 19-26). Os equivalentes redutores do NADH citoslico so inicialmente transferidos ao oxaloacetato citoslico produzindo malato, pela ao da malato desidrogenase citoslica. O malato formado passa atravs da membrana interna para a matriz, atravs do transportador malato--cetoglutarato. Na matriz, os equivalentes redutores so passados para o NAD+, pela ao da malato desidrogenase matricial, formando o NADH. Este NADH pode ento transferir os seus eltrons diretamente para a cadeia respiratria. Cerca de 2,5 molculas de ATP so geradas medida que este par de eltrons transferido para o O2. O oxaloacetato citoslico deve ser

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regenerado atravs de reaes de transaminao para a atividade dos transportadores de membrana comear um outro ciclo. O msculo esqueltico e o crebro utilizam uma lanadeira de NADH diferente, lanadeira do glicerol-3-fosfato (Fig. 19-27). Ela difere da lanadeira malato-aspartato pelo fato de ceder os equivalentes redutores do NADH (via ubiquinona) para o complexo III e no o I (Fig. 19-8), fornecendo assim energia suficiente para sintetizar apenas 1,5 molculas de ATP para cada par de eltrons. As mitocndrias das plantas superiores possuem uma NADH desidrogenase orientada externamente, que pode transferir os eltrons diretamente do NADH citoslico para a cadeia respiratria, ao nvel da ubiquinona. Uma vez que essa via desvia esses eltrons da NADH desidrogenase e do movimento de prtons a ela associado, a produo de ATP a partir do NADH citoslico menor que a do NADH gerado na matriz (Adendo 19-1).

figura 19-26 A lanadeira malato-aspartato. Esta lanadeira para transportar equivalentes redutores do NADH citoslico para a matriz mitocondrial usada no fgado, rins e corao. O NADH citoslico (espao intermembranoso) cede dois equivalentes redutores para o oxaloacetato, produzindo malato. O malato transportado atravs da membrana interna pelo transportador malato--cetoglutarato. Na matriz, o malato cede dois equivalentes redutores ao NAD+ e o NADH resultante oxidado pela cadeia respiratria. O oxaloacetato formado a partir do malato no pode passar diretamente para o citosol. Ele primeiramente transaminado a aspartato , que passa para o citosol atravs do transportador glutamatoaspartato . O oxaloacetato regenerado no citosol , completando o ciclo.

figura 19-27 A lanadeira glicerol-3-fosfato. Este meio alternativo de deslocar equivalentes redutores do citosol para a matriz mitocondrial opera no msculo esqueltico e no crebro. No citosol, a diidroxiacetona fosfato aceita dois equivalentes redutores do NADH numa reao catalisada pela glicerol-3-fosfato desidrogenase citoslica. Uma isoenzima da glicerol-3-fosfato desidrogenase ligada superfcie externa da membrana interna, transfere dois equivalentes redutores do glicerol-3-fosfato localizado no espao intermembranoso at a ubiquinona. Observe que esta lanadeira no envolve sistema de transporte atravs da membrana.

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Regulao da Fosforilao Oxidativa A fosforilao oxidativa produz a maioria do ATP produzido nas clulas aerbicas. A oxidao completa de uma molcula de glicose at CO2 produz trinta ou trinta e dois ATP (Tabela 19-5). Por comparao, em condies anaerbicas (fermentao lctica) a gliclise produz apenas dois ATP por glicose. Assim, o surgimento da fosforilao oxidativa acarretou um tremendo aumento na eficincia energtica do catabolismo. A oxidao completa do palmitoil-CoA, at CO2, que tambm ocorre na matriz mitocondrial, produz 108 ATP (veja Tabela 17-1). Um clculo similar pode ser feito para o ATP produzido pela oxidao de cada um dos aminocidos (Captulo 18). As vias de oxidao aerbicas que resultam na transferncia de eltrons para o O2 so responsveis pela maior parte do ATP sintetizado no catabolismo. Desse modo, a regulao da produo de ATP pela fosforilao oxidativa para garantir as necessidades flutuantes da clula por ATP absolutamente essencial.

tabela 19-5 Produo de ATP a partir da oxidao completa da glicose Processo Gliclise Produto direto 2 NADH (citoslico) 2 ATP Oxidao do piruvato (2 por glicose) Oxidao do Acetil-CoA no ciclo do cido ctrico (2 por glicose) 2 NADH (matriz mitocondrial) 6 NADH (matriz mitocondrial) 2 FADH2 2 ATP ou 2 GTP Produo total por glicose mitocndria. 30 ou 32 * O nmero depende do tipo do sistema de lanadeira que transfere equivalente redutores na ATP final 3 ou 5* 2 5 15

A fosforilao oxidativa regulada pelas necessidades energticas celulares A velocidade da respirao (consumo de O2) na mitocndria fortemente regulada. Ela geralmente limitada pela disponibilidade do ADP como substrato para a fosforilao. A dependncia da velocidade de consumo de O2 em relao disponibilidade do aceptor de Pi, o ADP (veja Fig.19-17b), chamada controle aceptor da respirao pode ser dramtica. Em

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alguns tecidos animais, o quociente do controle aceptor, a razo entre a velocidade mxima do consumo de O2 induzida pelo ADP e a velocidade basal na ausncia do ADP, pelo menos 10. A concentrao intracelular do ADP uma medida do estado energtico das clulas. Uma outra medida relacionada o quociente da ao das massas do sistema ATP-ADP: [ATP]/([ADP][Pi]). Normalmente este quociente muito alto, de tal modo que o sistema ATP-ADP est quase totalmente fosforilado. Quando a velocidade de algum processo que requer energia (sntese de protenas, por exemplo) aumenta, a velocidade de transformao do ATP em ADP e Pi aumenta, diminuindo o quociente da ao das massas. Com mais ADP disponvel para a fosforilao oxidativa, a velocidade da respirao aumenta, provocando a regenerao do ATP. Isto continua at que o quociente da ao das massas retorna ao seu alto nvel normal, instante em que a respirao diminui novamente. A velocidade da oxidao dos combustveis celulares regulada com tal sensibilidade e preciso de tal modo que o quociente [ATP]/([ADP][Pi]) varia apenas ligeiramente na maioria dos tecidos, mesmo durante variaes extremas na demanda energtica. Em resumo, o ATP formado to rpido quanto usado na velocidade em que usado nas atividades celulares que requerem energia.

As mitocndrias desacopladas no tecido adiposo marrom produzem calor H uma extraordinria e instrutiva exceo regra geral de que a respirao diminui quando o suprimento de ATP for adequado. A maioria dos mamferos recm nascidos, incluindo o homem, apresenta um tipo de tecido chamado tecido adiposo marrom, onde a oxidao dos combustveis ao invs de produzir ATP serve para gerar calor para manter o recm nascido aquecido. Este tecido adiposo especializado marrom devido a presena de um grande nmero de mitocndrias e, portanto de grandes quantidades de citocromos, cujos grupos heme absorvem intensamente a luz visvel. As mitocndrias do tecido adiposo marrom so similares quelas de outras clulas dos mamferos em todos os aspectos, exceto que elas apresentam uma notvel protena em suas membranas internas. A termogenina, tambm chamada de protena desacopladora (Tabela 19-4) proporciona uma via para os prtons retornarem matriz sem passar atravs do complexo FoF1 (Fig. 19-28). Como resultado deste desvio de prtons, a energia da oxidao no conservada pela formao do ATP mas dissipada como calor, que contribui para manter a temperatura corporal do recm nascido. Os animais que hibernam tambm dependem das mitocndrias desacopladas do tecido adiposo marrom para gerar o calor durante o longo perodo de dormncia (veja Adendo 17-1).

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figura 19-28 Gerao de calor pela mitocndria desacoplada. A protena desacopladora (termogenina) das mitocndrias do tecido adiposo marrom, fornecendo uma via alternativa para os prtons reentrarem na matriz mitocondrial, faz com que a energia conservada pelo bombeamento dos prtons seja dissipada como calor.

As vias de produo do ATP so reguladas de uma maneira coordenada As principais vias catablicas possuem mecanismos reguladores coordenados e ajustados, que lhes permitem funcionar conjuntamente de uma maneira econmica e auto-reguladora para produzir ATP e os precursores biossintticos. As concentraes relativas de ATP e ADP controlam no apenas as velocidades da transferncia de eltrons e a fosforilao oxidativa, mas tambm as velocidades do ciclo do cido ctrico, a oxidao do piruvato e a gliclise (Fig. 19-29). Toda vez que o consumo de ATP aumenta, a velocidade da transferncia de eltrons e da fosforilao oxidativa aumenta. Simultaneamente, a velocidade da oxidao do piruvato via ciclo do cido ctrico aumenta, aumentando desta forma o fluxo de eltrons na cadeia respiratria. Esses eventos podem, por sua vez, provocar um aumento na velocidade da gliclise, aumentando a velocidade da formao do piruvato. Quando a converso do ADP em ATP diminui a concentrao do ADP, o controle aceptor diminui a transferncia de eltrons e, portanto a fosforilao oxidativa. A gliclise e o ciclo do cido ctrico tambm diminuem, uma vez que o ATP um inibidor alostrico da fosfofrutoquinase-1 (veja Fig. 1518) e da piruvato desidrogenase (veja Fig. 16-15). A fosfofrutoquinase-1 inibida no apenas pelo ATP, mas pelo citrato, o primeiro intermedirio do ciclo do cido ctrico. Quando o ciclo est ocioso, o citrato se acumula dentro da mitocndria e ento extravasa para o citoplasma. Quando as concentraes do ATP e do citrato esto elevadas, eles produzem uma inibio alostrica combinada da fosfofrutoquinase-1, que maior que a soma dos seus efeitos individuais, desacelerando a gliclise.

figura 19-29 Regulao das vias produtoras de ATP. Este diagrama mostra a regulao coordenada da gliclise, da oxidao do piruvato, do ciclo do cido ctrico e fosforilao oxidativa pelas concentraes relativas do ATP, ADP e AMP e pelo NADH. Altas [ATP] (ou baixas [ADP] e [AMP]) produzem baixas taxas da gliclise, oxidao do piruvato, oxidao do acetato via ciclo do cido ctrico e fosforilao oxidativa. Todas estas quatro vias so aceleradas quando

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a utilizao do ATP e a formao do ADP, AMP e Pi, aumentam. A coordenao da gliclise e do ciclo do cido ctrico pelo citrato que inibe a gliclise, suplementa a ao do sistema da adenina nucleotdeo. Alm disso, nveis elevados de NADH e de acetil-CoA tambm inibem a oxidao do piruvato a acetil-CoA. Quocientes [NADH]/[NAD+] elevados inibem as reaes das desidrogenases do ciclo do cido ctrico (veja Fig. 16-15).

Mutaes nos genes mitocondriais causam doena humana As mitocndrias possuem o seu prprio genoma, uma molcula circular de DNA de fita dupla. O cromossomo mitocondrial humano (Fig.19-30) contm 37 genes (16.569 pares de bases), incluindo 13 que codificam protenas da cadeia respiratria (Tabela 19-6). Os genes restantes codificam molculas de RNA ribossmico e de transferncia, essenciais para a maquinaria sintetizadora de protenas da mitocndria. Muitas das protenas mitocondriais esto codificadas por genes nucleares, sintetizadas nos ribossomos citoplasmticos e, ento importadas pos-translacionalmente e montados dentro da mitocndria (veja Fig.27-39). Um crescente nmero de doenas humanas pode ser atribudo a mutaes nos genes mitocondriais. Estas doenas so invariavelmente herdadas da me, uma vez que todas as mitocndrias de um embrio em desenvolvimento so derivadas do vulo da me. Uma doena rara chamada neuropatia ptica hereditria de Leber (LHON) afeta o sistema nervoso central, incluindo os nervos pticos, causando a perda bilateral da viso no incio da maioridade. Uma nica base alterada no gene mitocondrial ND4 (Fig. 19-30a) provoca a troca de um resduo de Arg por um de His na cadeia polipeptdica do complexo I e o resultado uma mitocndria parcialmente deficiente na transferncia de eltrons do NADH para a ubiquinona. Embora essas mitocndrias podem produzir algum ATP atravs da transferncia de eltrons do succinato, elas aparentemente no podem suprir ATP suficiente para suportar o metabolismo muito ativo dos neurnios. Como conseqncia, o nervo ptico lesado, levando cegueira. Uma nica mudana de base no gene mitocondrial para citocromo b, um componente do complexo III, tambm produz LHON demonstrando que a patologia resulta de uma reduo geral da funo mitocondrial e no especificamente de um defeito no transporte de eltrons atravs do complexo I.

figura 19-30

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Genes mitocondriais e mutaes. (a) Mapa do DNA mitocondrial humano, mostrando os genes que codificam as protenas do complexo I, a NADH desidrogenase (ND1 a ND6); o citocromo b do complexo III (Cit b); as subunidades da citocromo oxidase (complexo IV) (COI a COIII) e duas subunidades da ATP sintase (ATPase 6 e ATPase 8). As cores dos genes correspondem quelas dos complexos mostrados na Figura 19-7. Tambm esto includos os genes para os RNAs ribossmicos (rRNA) e para vrios RNAs de transferncia especficos para mitocndria. A especificidade dos RNAs de transferncia (tRNA) est indicada pelos cdigos de uma letra para os aminocidos. As setas indicam as posies das mutaes causadoras da neuropatia ptica hereditria de Leber (LHON) e a epilepsia mioclnica e a doena da fibra vermelha rasgada (MERRF). Os nmeros em parnteses indicam a posio nos nucleotdeos alterados (o nucleotdeo nmero 1 est no topo do crculo). (b) Micrografia eletrnica presentes na mitocndria mutante. de uma mitocndria anormal do msculo de um indivduo com MERRF, mostrando as incluses de protenas paracristalinas algumas vezes

Epilepsia mioclnica e doena da fibra vermelha rasgada A epilepsia mioclnica, MERRF, causada por uma mutao no gene mitocondrial que codifica um tRNA especfico para leucina (leucina-tRNA). Esta doena, caracterizada por um espasmo muscular incontrolvel, aparentemente resulta da produo defeituosa de vrias protenas sintetizadas usando os tRNA mitocondriais. As fibras musculares esquelticas de indivduos com MERRF possuem mitocndrias de forma anormal que algumas vezes contm estruturas paracristalinas (Fig. 19-30b). Mutaes no gene do leucina-tRNA mitocondrial so uma das causas do desencadeamento do diabetes mellitus em adultos. Outras mutaes nos genes mitocondriais so consideradas responsveis pela progressiva fraqueza muscular que caracteriza a miopatia mitocondrial bem como o crescimento e deteriorao do msculo cardaco (cardiomiopatia hipertrfica). De acordo com a hiptese das mudanas progressivas que acompanham o envelhecimento, o acmulo de mutaes no DNA mitocondrial durante uma vida de exposio a agentes que danificam esse DNA, resulta em uma mitocndria que no pode produzir ATP eficientemente para uma funo celular normal.

tabela 19-6 Protenas respiratrias codificadas pelo cromossomo mitocondrial humano Complexo Nmero total de subunidades Nmero de subunidades codificadas pelo DNA

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mitocondrial I NADH desidrogenase II Succinato desidrogenase III Ubiquinona-citocromo C oxidorredutase IV Citocromo oxidase V ATP sintase 13 12 3 2 > 25 4 9 7 0 1

figura 19-31 Cadeia respiratria das bactrias. Esto mostrados os carregadores da membrana interna da E. coli. A Eubactria apresenta uma forma mnima do complexo I, contendo todos os grupos prostticos normalmente associados ao complexo mitocondrial, mas apenas 14 polipeptdios. Esse complexo da membrana plasmtica transporta o NADH para a ubiquinona ou menaquinona, o equivalente da ubiquinona na bactria, enquanto bombeia prtons para fora, criando assim um potencial eletroqumico que governa a sntese do ATP.

As mitocndrias provavelmente surgiram de bactrias endossimbiticas O fato de a mitocndria conter o seu prprio DNA, ribossomos e tRNA suporta a teoria da origem endossimbitica da mitocndria (veja Fig. 2-15). Esta teoria supe que os primeiros organismos capazes de realizar o metabolismo aerbico, incluindo a produo de ATP ligada respirao, seriam procariotos. Os eucariotos primitivos que viviam anaerobicamente (por fermentao) adquiriram a habilidade de realizar a fosforilao oxidativa quando estabeleceram uma relao simbitica com bactrias que viviam no seu citosol. Depois de muita evoluo e da movimentao de muitos genes bacterianos para o ncleo do eucarioto hospedeiro, a bactria endossimbionte eventualmente tornou-se mitocndria. Esta teoria pressupe que os primeiros procariotos de vida livre iniciais tinham a maquinaria enzimtica para a fosforilao oxidativa. Ela prediz que os descendentes procariotos modernos apresentam cadeias respiratrias muito parecidas com as dos eucariotos modernos. De fato, elas apresentam. As bactrias aerbicas realizam a transferncia de eltrons ligados ao NAD dos substratos at o O2, acoplada fosforilao do ADP citoslico. As desidrogenases esto localizadas no citosol das bactrias e a cadeia respiratria est na membrana plasmtica. Os transportadores de eltrons so semelhantes a alguns carregadores de eltrons da mitocndria (Fig. 19-31). Eles translocam prtons para fora atravs da membrana plasmtica medida que os eltrons so transferidos para o O2.

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Bactrias como a E. coli, possuem complexos FoF1 na membrana plasmtica: a parte F1 estende-se para o citosol e catalisa a sntese de ATP a partir do ADP e Pi, medida que os prtons retornam para dentro da clula atravs do canal de prtons da Fo. A extruso de prtons ligada respirao, atravs da membrana plasmtica da bactria, proporciona a fora motriz para outros processos. Certos sistemas de transporte em bactrias realizam a captao de nutrientes extracelulares (lactose, por exemplo) contra um gradiente de concentrao, em um co-transporte com os prtons (veja Fig. 12-35). O movimento rotatrio dos flagelos das bactrias, dotado de turbinas de prtons, motores rotatrios moleculares impulsionados no pelo ATP, mas diretamente pelo potencial eletroqumico transmembrana gerado pelo bombeamento de prtons ligados respirao (Fig. 19-32). muito provvel que o mecanismo quimiosmtico surgiu antes do aparecimento dos eucariotos.

figura 19-32 Rotao do flagelo da bactria pela fora prton motriz. A haste e os anis na base do flagelo constituem um motor rotatrio que tem sido chamado de turbina de prtons. Os prtons ejetados pela transferncia de eltrons fluem de volta para a clula atravs da turbina, provocando rotao da haste do flagelo. Este movimento difere fundamentalmente do movimento do msculo ou do flagelo e clio dos eucariotos, onde a fonte de energia a hidrlise do ATP.

Fotossntese: Captando a Energia Luminosa Passamos agora para uma outra seqncia de reaes onde o fluxo de eltrons est acoplado sntese do ATP: a fosforilao comandada pela luz. A captao da energia solar pelos organismos fotossintetizadores e a sua converso em energia qumica de compostos orgnicos reduzidos a fonte fundamental de quase toda energia biolgica. Os organismos fotossintetizadores e os heterotrficos vivem em um estado estacionrio balanceado na biosfera (Fig. 19-33). Os organismos fotossintetizadores captam a energia solar e sintetizam ATP e NADPH, que usam como fonte de energia para sintetizar carboidratos e outros compostos orgnicos a partir de CO2 e H2O. Simultaneamente, eles liberam O2 na atmosfera. Os heterotrficos aerbicos (os humanos, por exemplo) usam o O2 assim formado para degradar os produtos orgnicos energeticamente ricos da fotossntese at CO2 e H2O, gerando ATP para as suas prprias atividades. O CO2 formado pela respirao nos heterotrficos retorna atmosfera, para ser usado novamente pelos organismos fotossintetizadores. Desta forma, a energia solar fornece a fora impulsionadora para a

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reciclagem contnua do CO2 e O2 atmosfrico atravs da biosfera e fornece os substratos reduzidos (combustveis), como a glicose, da qual dependem os organismos que no fazem fotossntese. A fotossntese ocorre em uma grande variedade de bactrias e eucariotos unicelulares (algas) bem como em plantas superiores. Embora nestes organismos o processo difere em detalhes, o mecanismos bsicos so extraordinariamente simples e, muito do nosso conhecimento acerca da fotossntese nas plantas superiores derivado de estudos dos organismos mais simples. A equao geral para a fotossntese nas plantas superiores descreve uma reao de oxidao-reduo onde a H2O doa eltrons (como hidrognio) para a reduo do CO2 at o carboidrato (CH2O): luz CO2 + H2O O2 + (CH2O)

figura 19-33 A energia solar a fonte fundamental de toda energia biolgica. Os organismos fotossintetizadores usam a energia do sol para produzir glicose e outros produtos orgnicos que as clulas heterotrficas usam como fontes de carbono e energia.

Caractersticas Gerais da Fotofosforilao Ao contrrio do NADH (o principal doador de hidrognio na fosforilao oxidativa), a H2O um doador de eltrons pobre. Seu potencial de reduo padro de +0,82V, comparado com 0,32V para o NADH. A fotofosforilao difere da fosforilao oxidativa por requerer energia na forma de luz para criar um bom doador de eltrons. Na fotofosforilao, os eltrons fluem atravs de uma srie de transportadores ligados membrana, incluindo citocromos, quinonas e protenas ferro-enxofre, enquanto prtons so bombeados atravs de uma membrana para criar um potencial eletroqumico. A transferncia dos eltrons e o bombeamento dos prtons so catalisados por complexos de membrana homlogos, em estrutura e funo, ao complexo III da mitocndria. O potencial eletroqumico que eles produzem a fora motriz para a sntese de ATP a partir de ADP e Pi pelo complexo da ATP sintase associado membrana, muito semelhante quele da fosforilao oxidativa. Nas plantas superiores, a fotossntese abrange dois processos: as reaes dependentes da luz ou reaes luminosas, que ocorrem apenas quando as plantas so iluminadas, e as reaes de assimilao ou de fixao do carbono, algumas vezes erroneamente chamadas de reaes escuras, que so governadas por produtos das reaes

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luminosas (Fig. 19-34). Nas reaes luminosas, a clorofila e outros pigmentos das clulas fotossintetizadoras absorvem a energia luminosa e a conservam na forma de ATP e NADPH. Simultaneamente, o O2 produzido. Nas reaes de fixao do carbono, o ATP e o NADPH so usados para reduzir o CO2 para formar triose fosfatos, amido, sacarose e outros produtos derivados deles. Neste captulo estamos preocupados apenas com as reaes luminosas que levam sntese de ATP e NADPH. A reduo do CO2 descrita no Captulo 20 juntamente com outras vias de sntese de carboidratos.

figura 19-34 As reaes luminosas geram NADPH e ATP, ricos de energia, s custas da energia solar. Esses produtos so usados nas reaes fixadoras de carbono, que ocorrem na luz ou na escurido, para reduzir o CO2 e formar trioses e compostos mais complexos (como a glicose) derivados das trioses.

Nas plantas superiores a fotossntese ocorre nos cloroplastos Nas clulas eucariticas fotossintetizadoras, tanto as reaes de fixao do carbono quanto as luminosas, ocorrem nos cloroplastos (Fig. 19-35), organelas intracelulares associadas membrana e geralmente de alguns microns de dimetro (Fig. 2-7b). Similarmente s mitocndrias, eles so envolvidos por duas membranas, uma externa que permevel a pequenas molculas e ons e uma interna, que encerra o compartimento interno. Esse compartimento contm muitas vesculas ou sacos achatados e envoltos por membranas, ddenominados de tilacides, usualmente arranjados em pilhas chamadas grana (Fig. 1935b). Embebidos nas membranas dos tilacides esto os pigmentos fotossintetizadores e os complexos enzimticos que promovem as reaes luminosas e a sntese do ATP. O estroma (fase aquosa encerrada pela membrana interna) contm a maioria das enzimas requeridas para as reaes de assimilao do carbono.

figura 19-35 Cloroplasto. (a) Diagrama esquemtico. (b) Micrografia eletrnica com grande aumento, mostrando a grana, pilhas de membrana tilacides.

A luz comanda o fluxo de eltrons nos cloroplastos

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Em 1937, Robert Hill descobriu que quando extratos de folhas contendo cloroplastos eram iluminados, eles (1) produziam O2 e (2) reduziam um aceptor no biolgico de eltrons adicionado ao meio, de acordo com a reao de Hill: luz 2 H2O + 2A 2 AH2 + O2

onde A o aceptor artificial de hidrognio ou reagente de Hill. Um dos reagentes de Hill, o corante 2,6-diclorofenolindofenol, azul quando oxidado (A) e incolor quando reduzido (AH2). Quando o extrato de folha, suplementado com o corante foi iluminado, o corante azul tornou-se incolor e o O2 foi produzido. No escuro, no ocorreu nem a produo de O2 nem a reduo do corante. Esta foi a primeira evidncia de que a energia luminosa absorvida provoca um fluxo de eltrons da H2O para um aceptor de eltrons. Alm disso, Hill observou que o CO2 no era requerido nem reduzido a uma forma estvel nestas condies. A produo do O2 pode ser dissociada da reduo do CO2. Vrios anos depois, Severo Ochoa mostrou que o NADP+ o receptor biolgico de eltrons nos cloroplastos, de acordo com a equao:

luz 2H2O + 2NADP+ 2NADPH + 2H+ + O2 Para compreender este processo fotoqumico, devemos inicialmente considerar os efeitos da absoro luminosa na estrutura molecular.

Absoro da Luz A luz visvel uma radiao eletromagntica de comprimentos de onda de 400 at 700 nm, uma pequena parte do espectro eletromagntico (Fig. 19-36), indo do violeta at o vermelho. A energia de um nico fton (um quantum de luz) maior na extremidade violeta do espectro que na extremidade vermelha. Comprimentos de onda menores (e freqncias elevadas) correspondem a energias maiores. A energia de um mol de ftons (um einstein; 6 1023 ftons) de luz visvel da ordem de 170 a 300 kJ, quase uma ordem de grandeza maior que os 30 a 50 kJ requeridos para sintetizar um mol de ATP a partir do ADP e Pi. Quando um fton absorvido, um eltron da molcula que o absorveu (cromforo) deslocado para um nvel superior de energia. Isto um evento tudo-ou-nada. Para ser absorvido, o fton deve conter uma quantidade de energia (um quantum) que iguale exatamente a energia da transio eletrnica. Uma molcula que absorveu um fton est em

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um estado excitado, que geralmente instvel. Um eltron deslocado para um orbital superior de energia usualmente retorna rapidamente ao seu orbital de menor energia. A molcula excitada decai para o estvel estado fundamental, fornecendo o quantum absorvido como luz ou calor ou usando-o para realizar um trabalho qumico. A emisso de luz que acompanha o decaimento das molculas excitadas (chamada fluorescncia) sempre de um comprimento de onda maior (energia menor) que o da luz absorvida. Um modo alternativo de decaimento, importante na fotossntese, envolve a transferncia direta da energia de excitao de uma molcula excitada para uma molcula vizinha.

figura 19-36 O espectro da radiao eletromagntica e a energia dos ftons no intervalo visvel do espectro. Um einstein equivale a 6 1023 ftons.

A clorofila absorve energia luminosa para a fotossntese Os mais importantes pigmentos que absorvem luz nas membranas tilacides so as clorofilas, pigmentos verdes com estruturas policclicas planas, que se assemelham protoporfirina da hemoglobina (veja Fig. 7-1), exceto que o Mg2+ e no o Fe2+, ocupa a posio central (Fig. 19-37). Todas as clorofilas apresentam uma longa cadeia lateral fitol, esterificada com um grupo carboxlico substituinte no anel IV. Os quatro tomos de nitrognio da clorofila, orientados para dentro, so coordenados com o Mg2+. O sistema heterocclico de anis de cinco tomos que envolve o Mg2+ apresenta um prolongamento com estrutura polinica, com alternncia de ligaes simples e duplas. Esses polienos apresentam caracteristicamente uma forte absoro na regio visvel do espectro (Fig. 19-38). Usualmente os cloroplastos apresentam coeficientes de extino molar altos (veja Adendo 51) e por isso so muito apropriados para absorver a luz visvel durante a fotossntese.

figura 19-37 Fotopigmentos primrios e secundrios. (a) As clorofilas a e b e a bacterioclorofila so os coletores primrios da energia luminosa. (b) a ficoeritrobilina e a ficocianobilina (ficobilinas) so os pigmentos antena na cianobactria e nas algas vermelhas. (c) o caroteno (um carotenide) e a (d) luteina (tambm chamada xantofila) so pigmentos acessrios nas plantas. As reas que apresentam um sombreamento rseo so os sistemas conjugados (alternncia de simples e duplas ligaes) que fundamentalmente so responsveis pela absoro da luz visvel.

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Os cloroplastos das plantas superiores contm tanto a clorofila a como b (Fig. 1937a), Embora ambas sejam verdes, os seus espectros de absoro so suficientemente diferentes (Fig. 19-38) permitindo que elas complementem o intervalo de absoro da luz na regio do visvel. A maioria das plantas superiores contm duas vezes mais clorofila a que clorofila b. Os pigmentos nas algas e bactrias fotossintetizadoras incluem clorofilas que diferem apenas ligeiramente dos pigmentos das plantas. A clorofila geralmente est associada a protenas especficas, formando os complexos coletores de luz (CCL), onde as molculas de clorofila esto fixas umas em relao s outras, a outros complexos proteicos e membrana. A estrutura detalhada de um complexo coletor de luz foi determinada a partir de cristalografia de raios X (Fig. 19-39). Ele contm sete molculas da clorofila a, cinco da clorofila b e duas do pigmento acessrio luteina (veja a seguir). Figura 19-38 Absoro da luz visvel pelos fotopigmentos. As plantas so verdes porque os seus pigmentos absorvem luz das regies vermelha e azul do espectro, deixando fundamentalmente que a luz verde seja refletida ou transmitida. Compare os espectros de absoro dos pigmentos com o espectro da luz solar que atinge a superfcie da terra. A combinao das clorofilas (a e b) e dos pigmentos acessrios capacita as plantas a captarem a maior parte da energia disponvel da luz solar. As quantidades relativas de clorofila e pigmentos acessrios so caractersticas para as diferentes espcies de plantas. A variao na proporo desses pigmentos responsvel pela diversidade das cores dos organismos fotossintetizadores, desde o azul esverdeado escuro das agulhas dos abetos at o verde esverdeado das folhas da acercea ou ento s cores vermelha, marron ou prpura de algumas espcies de algas multicelulares e folhas certas de plantas decorativas. As cianobactrias e as algas vermelhas, utilizam as ficobilinas, tal como a ficoeritrobilina e a ficocianobilina (Fig. 19-37b), como pigmentos coletores de luz. Estes tetrapirris lineares apresentam o prolongamento polinico encontrado nas clorofilas, mas no a estrutura cclica nem o Mg2+ central. As ficobilinas esto ligadas covalentemente protenas especficas formando as ficobiliprotenas, que se associam em complexos altamente ordenados chamados ficobilisomos (Fig. 19-40) que constituem as estruturas coletoras primrias de energia nestes microrganismos.

figura 19-39 Um complexo coletor de luz, CCLII. A unidade funcional um CCL trmero contendo 36 molculas de clorofila e 6 de luteina. A figura mostra um monmero visto no plano da

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membrana. Existem trs segmentos em -hlice transmembrana, sete molculas de clorofila a (verde), cinco molculas de clorofila b (vermelho) e duas molculas do pigmento acessrio luteina (amarelo) que formam um brao cruzado interno.

figura 19-40 Um ficobilisomo. Nestas montagens altamente estruturadas, encontradas nas cianobactrias e algas vermelhas, os pigmentos ficobilinas ligados protenas especficas formam complexos denominados ficoeritrina (FE), ficocianina (FC) e aloficocianina (AF). A energia dos ftons absorvidos pela FE e FC transmitida atravs da AF (protena ligadora de ficocianobilina) para a clorofila a do centro de reao atravs de um processo chamado transferncia de excitom, que ser discutido a seguir.

Os pigmentos acessrios ampliam o intervalo de absoro da luz Alm das clorofilas, as membranas tilacides contm pigmentos secundrios que absorvem luz (pigmentos acessrios), os carotenides. Os carotenides podem ser amarelos, vermelhos ou prpuros. Os mais importantes so o -caroteno (Fig. 19-37c), um composto isoprenide vermelho-alaranjado, e o carotenide amarelo luteina (Fig. 19-37d). Os pigmentos carotenides absorvem luz em comprimentos de onda no absorvidos pelas clorofilas (Fig. 19-38) e desse modo, so receptores suplementares de luz. A determinao experimental da eficcia da luz de diferentes cores em promover a fotossntese produz um espectro de ao (Fig. 19-41), geralmente til na identificao do pigmento primariamente responsvel por um efeito biolgico da luz. Ao captar a luz em uma regio do espectro no utilizada por outros organismos, o fotossintetizador pode reivindicar um nicho ecolgico mpar. Por exemplo, as ficobilinas das algas vermelhas e cianobactrias, absorvem na regio de 520 a 630 nm, permitindo que esses organismos ocupem nichos onde a luz de maiores e menores comprimentos de onda foi filtrada pelos pigmentos de outros organismos que vivem na gua acima deles ou ento pela prpria gua.

figura 19-41 Duas maneiras de se determinar o espectro de ao na fotossntese. (a) Os resultados de um experimento clssico feito por T.W. Englemann, em 1822, para determinar qual comprimento de onda da luz era mais eficaz para a fotossntese. Englemann colocou uma alga filamentosa fotossintetizadora em um microscpio e a iluminou com a luz de um prisma, de forma que as clulas numa parte do filamento receberam principalmente luz azul,

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uma outra parte, a amarela e uma outra, a vermelha. Para determinar quais clulas realizavam a fotossntese mais ativamente, tambm foram colocadas na lmina do microscpio bactrias que migram para regies com maior concentrao de O 2. Aps um perodo de iluminao, a distribuio das bactrias mostrou que os maiores nveis de O2 (produzidos pela fotossntese) estavam nas regies iluminadas com luz violeta e vermelha. (b) Um experimento semelhante, usando tcnicas modernas (um eletrodo seletivo de oxignio) para medir a produo de O2, deu o mesmo resultado. Um espectro de ao descreve a velocidade relativa de fotossntese para a iluminao com um nmero constante de ftons de diferentes comprimentos de onda. O espectro de ao til uma vez que, atravs da comparao com o espectro de absoro (como aqueles na figura 19-38), sugere quais so os pigmentos capazes de canalizar a energia para a fotossntese. A clorofila canaliza a luz absorvida para os centros de reao atravs da transferncia de excitons Os pigmentos que absorvem a luz das membranas tilacides ou das bactrias, esto arranjados em conjuntos funcionais chamados fotossistemas. Nos cloroplastos do espinafre, por exemplo, cada fotossistema contm cerca de 200 molculas de clorofilas e cerca de 50 molculas de carotenides. Todas as molculas dos pigmentos em um fotossistema podem absorver ftons, mas apenas algumas poucas molculas de clorofila associadas ao centro de reao fotoqumico so especializadas para transformar a luz em energia qumica. As molculas dos outros pigmentos num fotossistema so chamadas de molculas coletoras de luz ou molculas antenas. Elas absorvem a energia luminosa e a transmite rpida e eficientemente para o centro de reao (Fig. 19-42).

figura 19-42 Organizao dos fotossistemas nas membranas tilacides. Os fotossistemas so empacotados compactamente na membrana tilacide, com vrias centenas de clorofilas antenas e pigmentos acessrios rodeando um centro de fotorreao. A absoro de um fton por qualquer clorofila antena provoca a excitao do centro de reao atravs da transferncia de excitons. Tambm esto embebidas na membrana tilacide o complexo do citocromo b6f e a ATP sintase (veja Fig. 19-47). As molculas de clorofila nos complexos coletores de energia apresentam propriedades de absoro de luz que so ligeiramente diferentes daquelas da clorofila livre. Quando as molculas de clorofila isoladas so excitadas pela luz, in vitro, a energia absorvida rapidamente liberada como fluorescncia e calor. Entretanto, quando a clorofila nas folhas intactas excitada pela luz visvel (Fig. 19-3, etapa ), uma pequena

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fluorescncia observada. Ao invs disto, a molcula de clorofila antena excitada transfere a energia diretamente para uma molcula de clorofila vizinha, que se torna excitada enquanto a primeira molcula retorna ao seu estado fundamental (etapa ). Esta transferncia de energia, tambm chamada transferncia de exciton, se estende para uma terceira, quarta ou subseqente molcula vizinha, at que um par especial de molculas de clorofila a no centro de reao fotoqumico seja excitada (etapa ). Nesta molcula de clorofila excitada, um eltron promovido para um orbital de energia superior. Este eltron ento passa para um receptor de eltrons vizinho, que parte da cadeia de transferncia de eltrons, deixando o centro de reao da clorofila com um orbital vazio (uma cela do eltron) (etapa ). O aceptor de eltrons adquire uma carga negativa nesta transao. O eltron perdido pelo centro de reao da clorofila substitudo por um eltron de uma molcula doadora de eltrons vizinha (etapa ), que se torna positivamente carregada. Desta forma, a excitao pela luz provoca separao de carga eltrica e inicia uma cadeia de oxidao-reduo.

figura 19-43 A transferncia de exciton. Este esquema generalizado mostra a converso da energia de um fton absorvido na separao das cargas no centro de reao. As etapas so descritas com mais detalhes no texto. Observe que a etapa pode ser repetida vrias vezes entre sucessivas molculas antenas at que um centro de reao da clorofila seja alcanado. O asterisco (*) representa o estado de excitao de uma molcula antena.

O Evento Fotoqumico Central: o Fluxo de Eltrons Impulsionado pela Luz

A transferncia de eltrons impulsionada pela luz nos cloroplastos das plantas realizada por sistemas multienzimticos na membrana tilacide. A atual concepo dos mecanismos fotossintetizadores uma composio baseada em estudos de cloroplastos de plantas e de uma variedade de bactrias e algas. A determinao das estruturas moleculares dos complexos fotossintetizadores das bactrias (por cristalografia de raios X) tem proporcionado uma melhoria do conhecimento dos eventos moleculares da fotossntese.

As bactrias apresentam um ou dois tipos de centros de reao fotoqumicos simples

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Uma observao importante apareceu em 1952 a partir dos estudos de bactrias fotossintetizadoras, quando Louis Duysens observou que a iluminao das membranas fotossintetizadoras da bactria prpura Rhodospirillum rubrum com pulsos de luz de comprimento de onda especfico (870 nm) causou uma diminuio temporria da luz naquele comprimento de onda. O pigmento foi descorado pela luz de 870 nm. Estudos posteriores de Bessel Kok e Horst Witt mostraram um branqueamento similar de pigmentos de cloroplastos de plantas por luz de 680 e 700 nm. Alm disso, a adio do aceptor (no biolgico) de eltrons [Fe(CN)6]3- causou o descoramento nesses comprimentos de onda sem iluminao. O descoramento dos pigmentos foi devido a perda de um eltron de um centro de reao fotoqumico. Esses pigmentos foram nomeados a partir do comprimento de onda do mximo descoramento: P870, P680 e P700. As bactrias fotossintetizadoras apresentam uma maquinaria de fototransduo relativamente simples, com um ou dois tipos gerais de centro de reao. Um deles (encontrado na bactria prpura) passa os eltrons para uma quinona atravs da feofitina (clorofila sem o on Mg2+ central). O outro (nas bactrias sulfurosas verdes) passa os eltrons para um sistema ferro-enxofre atravs de uma quinona. As cianobactrias e as plantas superiores apresentam dois fotossistemas (FSII e FSIII), um de cada tipo, que atuam em srie. Estudos bioqumicos e biofsicos da maquinaria fototransdutora da bactria, tem revelado muitos detalhes moleculares dos centros de reao. Estes sistemas das bactrias servem contudo como prottipos para os sistemas de fototransduo mais complexos das plantas superiores.

O centro de reao feofitina-quinona (centro de reao tipo II) A maquinaria fotossintetizadora na bactria prpura consiste de trs mdulos bsicos (Fig. 19-44a): um nico centro de reao (P870), um complexo de transferncia de eltrons, citocromo bc1, similar ao complexo III da cadeia de transporte de eltrons da mitocndria e uma ATP sintase, tambm similar da mitocndria. A iluminao impulsiona os eltrons atravs da feofitina e quinona para o complexo do citocromo bc1. Aps passar atravs do complexo, os eltrons fluem atravs do citocromo c2 de volta para o centro de reao, restabelecendo seu estado de pr iluminao. Este fluxo cclico de eltrons impulsionados pela luz propicia a energia para o bombeamento de prtons pelo complexo do citocromo bc1. Com a energia resultante do gradiente de prtons, o mdulo ATP sintase produz ATP exatamente como na mitocndria. As estruturas tridimensionais dos centros de reao da bactria prpura (Rhodopseudomonas viridis e Rhodobacter sphaeroides) deduzidas a partir de cristalografia de raios X, elucidam como a fototransduo ocorre no centro de reao feofitina-quinona. O

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centro de reao da R. viridis (Fig. 19-45a) um grande complexo proteico contendo quatro subunidades polipeptdicas e 13 cofatores: dois pares de clorofilas da bactria, um par de feofitina, duas quinonas, um ferro no heme e quatro hemes no citocromo tipo c associado. A sequncia extremamente rpida de transferncia de eltrons mostrada na Figura 1945b, foi deduzida a partir de estudos fsicos dos centros feofitina-quinona da bactria, usando pulsos curtos de luz para disparar a fototransduo e uma variedade de tcnicas espectroscpicas para seguir o fluxo dos eltrons atravs dos vrios carregadores. Um par de bactrioclorofilas o par especial, designado (Clo)2 o stio da fotoqumica inicial no centro de reao. A energia do fton absorvido por uma das muitas molculas de clorofila antena que rodeiam o centro de reao atingem o centro de reao (Clo)2 por transferncia de excitons. Quando estas duas molculas de clorofila, to prximas que seus orbitais de ligao se superpem, absorvem um exciton, uma delas abandona um eltron fracamente ligado, que passa atravs do monmero de clorofila vizinha para a feofitina (Feo). Isto produz dois radicais, um possivelmente carregado positivamente (o par especial de clorofilas) e um carregado negativamente (a feofitina). (Clo)2 + 1 exciton (Clo)2* (Clo)2* + Feo (Clo)2 +

(excitao)

+ Feo +

(separao de carga)

O radical feofitina transfere seu eltron para uma molcula de quinona fortemente ligada membrana (QA), convertendo-a em um radical semiquinona que imediatamente doa esse eltron extra uma segunda quinona (QB) fracamente ligada membrana. Estas duas transferncias de eltrons convertem QB em sua forma completamente reduzida QBH2, que difunde livremente na bicamada da membrana para longe do centro de reao: 2 Feo + + 2H+ + QB 2 Feo + QBH2

(reduo da quinona)

A hidroquinona (QBH2), que carrega em suas ligaes qumicas alguma energia dos ftons que originalmente excitaram o P870, entra em um reservatrio de quinona reduzida (QH2), dissolvido na membrana e se move atravs da fase lipdica da bicamada at o complexo do citocromo bc1. Similarmente ao homlogo complexo III na mitocndria, o complexo do citocromo bc1 da bactria prpura transporta os eltrons de um doador quinol (QH2) at um aceptor de eltrons, usando a energia da transferncia de eltrons para bombear os prtons atravs da membrana e produzir uma fora prton motriz. Acredita-se que o caminho do fluxo dos eltrons atravs deste complexo muito similar ao que ocorre atravs do complexo III

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mitocondrial, envolvendo o ciclo Q (Fig. 19-11), onde os prtons so consumidos em um dos lados da membrana e liberados no outro. O aceptor de eltrons final na bactria prpura uma forma do P870 desprovida de eltrons (Clo2 +) (Fig. 19-44a). Os eltrons se movem do complexo do citocromo bc1 para o P870 atravs de um citocromo tipo c solvel, o citocromo c2. O processo de transferncia de eltrons completa o ciclo e o centro de reao retorna ao seu estado no descorado que, absorve rapidamente um outro exciton de uma clorofila antena.

figura 19-44 Mdulos funcionais da maquinaria fotossintetizadora nas bactrias prpura e sulfurosa verde. (a) na bactria prpura, a energia luminosa impulsiona os eltrons do centro de reao P870 atravs da feofitina (Feo), uma quinona (Q) e o complexo do citocromo bc1 e ento, atravs do citocromo c2, de volta para o centro de reao. O fluxo de eltrons atravs do complexo do citocromo bc1 provoca o bombeamento de prtons, criando um potencial eletroqumico que promove a sntese de ATP. (b) a bactria sulfurosa verde apresenta duas vias para os eltrons impulsionados pela excitao do P840. Uma rota cclica passa atravs de uma quinona para o complexo do citocromo bc1 e, de volta para o centro de reao, atravs do citocromo c. Uma rota no cclica passa do centro de reao, atravs da ferredoxina (Fd), uma protena do tipo ferro-enxofre, e ento para o NAD+ em uma reao catalisada pela NAD-ferredoxina redutase.

figura 19-45 Centro de fotorreao da bactria prpura Rhodopseudomonas viridis. (a) o sistema tem quatro componentes: trs subunidades H. M e L (marron, azul e cinza, respectivamente), com um total de 11 segmentos de hlice transmembrana e, uma quarta protena, o citocromo c (amarelo) associado ao complexo na superfcie da membrana. As subunidades L e M so protenas transmembranas emparelhadas que juntas formam uma estrutura cilndrica com uma simetria bilateral ao redor do seu eixo longitudinal. Os grupos prostticos que participam dos eventos fotoqumicos so mostrados como estruturas bolas-ebastes. Dois pares de molculas de bactrioclorofila (verde) esto ligados s cadeias L e M. Um dos pares (o par especial, verde escuro) o stio das primeiras mudanas fotoqumicas aps a absoro da luz. Tambm est incorporado um par de molculas de feofitina a (Feo a, azul claro); duas quinonas, a menaquinona (QA) e a ubiquinona (QB) (amarelo), tambm arranjadas com simetria bilateral e, um nico Fe no heme (vermelho) localizado aproximadamente no eixo de simetria entre as quinonas. No topo da figura esto mostrados

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quatro grupos heme (vermelho) associados ao citocromo tipo c do centro de reao. O centro de reao de uma outra bactria prpura, Rhodobacter sphaeroides, muito similar exceto que o citocromo c no parte do complexo cristalino. (b) sequncia de eventos aps a excitao do par especial de bactrioclorofilas e a escala de tempo da transferncia de eltrons (entre parnteses, ps= picosegundos). O par especial excitado transfere um eltron para a feofitina , da qual o eltron se move rapidamente para a menaquinona QA que est fortemente ligada membrana . Esta quinona passa os eltrons muito mais vagarosamente para a difusvel ubiquinona, QB, atravs do Fe no heme . Enquanto isso, a cela de eltrons no par especial preenchida por um eltrons do grupo heme do citocromo c .

O centro de reao Fe-S (centro de reao tipo I) A fotossntese nas bactrias sulfurosas verdes envolve os mesmos trs mdulos como na bactria prpura, mas o processo difere em vrios aspectos e envolve reaes enzimticas adicionais (Fig. 19-44b). A excitao provoca um movimento dos eltrons do centro de reao para o complexo do citocromo bc1. A excitao provoca o movimento dos eltrons do complexo do citocromo bc1 via transportador quinona. A transferncia de eltrons atravs deste complexo, acarreta o transporte de prtons e cria a fora prton motriz usada na sntese de ATP, tal como na bactria prpura e na mitocndria. Entretanto, em contraste com o fluxo cclico de eltrons na bactria prpura, alguns eltrons fluem do centro de reao para uma protena no heme, ferredoxina, que ento passa os eltrons via ferredoxina-NAD redutase produzindo NADH. Os eltrons retirados do centro de reao para reduzir o NAD+ so substitudos pela oxidao do H2S a HSO4- (Fig. 19-44b), na reao que define a bactria sulfurosa verde. Esta oxidao do H2S pela bactria quimicamente anloga oxidao da gua pelas plantas superiores.

Fatores cinticos e termodinmicos previnem a dissipao de energia pela converso interna A construo complexa dos centros de reao o produto da seleo evolutiva para a eficincia do processo fotossinttico. O estado excitado (Clo)2* em princpio pode decair para o estado fundamental atravs de converso interna, um processo muito rpido (10 ps; ps= 10-12 s) onde a energia absorvida do fton convertida em calor (movimento molecular). Os centros de reao so construdos para prevenir a ineficincia que poderia resultar no caso de converso interna. As protenas do centro de reao mantm as bactrioclorofilas, as bactriofeofitinas e as quinonas em uma orientao fixa em relao s demais. Todavia, as reaes fotoqumicas entre estes componentes ocorre em um estado virtualmente slido. Isto contribui para a alta eficincia e rapidez das reaes, pois no

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dependem das colises ao acaso ou difuso randmica. A transferncia do exciton da clorofila antena para o par especial do centro de reao ocorre em menos de 100 ps com uma eficincia maior que 90%. Trinta picosegundos aps a excitao do P870, a feofitina j recebeu um eltron, tornando-se um radical negativamente carregado. Menos de 200 ps aps, o eltron j atingiu a quinona QB (Fig. 19-45b). As reaes de transferncia de eltrons no so apenas rpidas mas termodinamicamente morro abaixo. O par especial excitado (Clo)2* um doador de eltron muito bom (Eo -1 V) e cada transferncia de eltrons sucessiva sempre para um aceptor com Eo substancialmente mais negativo. A mudana de energia livre padro para o processo portanto negativa e grande. Lembrar do Captulo 14 que Go= - nFEo, onde Eo a diferena entre os potenciais de reduo padro das duas semi-reaes: (1) (Clo)2* (Clo)2 + + e(2) Q + 2H+ + 2 e- QH2

Eo= -1 V Eo= - 0,045 V

Assim, Eo= -0,045 V (-1V) 0,95 V e, Go= -2(96,5 kJ/V.mol)(0,95V)= -180 kJ/mol A combinao de uma cintica rpida com uma termodinmica favorvel, torna o processo virtualmente irreversvel e altamente eficiente. A energia total produzida pelo processo (a porcentagem da energia do fton conservada em QH2) maior que 30%, sendo que o restante da energia dissipado como calor.

Nas plantas superiores, dois centros de reao atuam em sequncia O aparelho fotossintetizador das cianobactrias modernas, algas e plantas superiores mais complexo que o sistema bacteriano de um centro e, parece que ele se desenvolveu a partir da combinao de dois fotocentros bacterianos mais simples. As membranas tilacides dos cloroplastos apresentam dois tipos diferentes de fotosistemas, cada um com seu prprio centro de reao fotoqumico e um conjunto de molculas antena. Os dois sistemas possuem funes distintas e complementares (Fig. 19-46). O fotossistema II (FSII) um sistema feofitina-quinona (semelhante ao nico fotossistema da bactria prpura) que contm quantidades aproximadamente iguais de clorofila a e b. A excitao do centro de reao P680 impulsiona os eltrons atravs do complexo do citocromo b6f com o movimento concomitante dos prtons atravs da membrana tilacide. O fotossistema I (FSI), do tipo ferredoxina, estrutural e funcionalmente relacionado com o centro de reao da bactria sulfurosa verde. Ele apresenta um centro de reao denominado P700 e uma proporo elevada de clorofila a em relao b. Quando excitado, o P700 passa os eltrons para a

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protena ferredoxina Fe-S e ento para o NADP , produzindo NADPH. As membranas tilacides de um nico cloroplasto de espinafre possuem muitas centenas de cada tipo de fotossistema. Nas plantas, estes dois centros de reao atuam em sequncia para catalisar o movimento dos eltrons da H2O para o NADP+, impulsionados pela luz (Fig. 19-46). Os eltrons so transportados entre os dois fotossistemas pela protena solvel plastocianina, um carregador de um eltron funcionalmente similar ao citocromo c da mitocndria. Para substituir os eltrons que se movem de FSII atravs de FSI para o NADP+, as cianobactrias e as plantas oxidam a H2O (como a bactria sulfurosa verde oxida o H2S), produzindo O2 (Fig. 19-46, esquerda inferior). O processo chamado fotossntese oxignica para diferencia-la da fotossntese no oxignica das bactrias purpura e sulfurosa verde. Toda clula fotossintetizadora produtora de O2 aquelas das plantas superiores, algas e cianobactria contm tanto o FSI como o FSII. Organismos com apenas um fotossistema no produzem O2. O diagrama na Figura 19-46, geralmente chamado esquema Z devido sua forma geral, esboa a via do fluxo dos eltrons entre os dois fotossistemas e as relaes de energia nas reaes luminosas. Portanto, o esquema Z descreve a rota completa atravs da qual os eltrons fluem da H2O para o NADP+ de acordo com a equao: 2H2O + 2NADP+ + 8 ftons O2 + NADPH + 2H+ Para cada dois ftons absorvidos (um para cada fotossistema), um eltron transferido da H2O para o NADP+. Para forma uma molcula de O2, que requer a transferncia de quatro eltrons de duas H2O para dois NADP+, um total de oito ftons devem ser absorvidos, quatro para cada fotossistema. Os detalhes mecansticos das reaes fotoqumicas em FSI e FSII so essencialmente similares queles dos dois fotossistemas bacterianos. A excitao do P680 (em FSII) produz P680*, um excelente doador de eltrons que, em picosegundos transfere um eltron feofitina, fornecendo-lhe uma carga negativa (Feo-) (Fig. 19-46, lado esquerdo). Com a perda do seu eltron, o P680* transformado num radical catinico, designado P680+. A Feo- transfere rapidamente seu eltron extra para a plastoquinona, PQA, uma proteina de membrana que, por sua vez transfere o eltron para outra plastoquinona, PQB, mais fracamente ligada membrana. Quando PQB adquire dois eltrons, atravs de duas transferncias de PQA e dois prtons da gua, ela passa para a sua forma quinol totalmente reduzida, PQBH2. A reao global iniciada pela luz em FSII : 4 P680 + 4H+ + 2PQB + 4 ftons 4 P680+ + 2PQBH2 (19-12)

Eventualmente, os eltrons em PQBH2 passam atravs do complexo do citocromo b6f. O stio de ligao para a plastoquinona o local de ao de muitos herbicidas comerciais que matam

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as plantam bloqueando a transferncia de eltrons atravs do complexo do citocromo b6f e impedindo a produo de ATP atravs da fotossntese.

figura 19-46 Integrao dos fotossistemas I e II nos cloroplastos. Este esquema Z mostra a via da transferncia de eltrons da H2O (esquerda inferior) para o NADP+ (direita) na fotossntese no cclica. A posio de cada carregador de eltron na escala vertical reflete o seu potencial de reduo padro. Para aumentar a energia dos eltrons derivados da H2O ao nvel requerido para reduzir o NADP+ a NADPH, cada eltron deve ser erguido duas vezes (flechas grossas) pelos ftons absorvidos em FSI e FSII. Cada eltron requer um fton em cada fotossistema. Aps a excitao, os eltrons de alta energia fluem morro abaixo atravs da cadeia de carregadores mostrada na figura. Os prtons se movem atravs da membrana tilacide durante a reao de quebra da gua bem como durante a transferncia de eltrons atravs do complexo do citocromo b6f produzindo um gradiente de prtons que fundamental para a formao de ATP. A seta tracejada a via da transferncia cclica do eltron (discutida posteriormente no texto) onde somente FSI est envolvido. Os eltrons retornam a FSI atravs da via cclica ao invs de reduzir o NADP+ a NADPH. Os eventos fotoqumicos que ocorrem aps a excitao de FSI (no centro de reao P700) so exatamente similares aos de FSII. O centro de reao P700* excitado perde um eltron para um aceptor Ao (acredita-se que uma forma especial de clorofila, funcionalmente anloga feofitina de FSII), originando Ao- e P700+ (Fig. 19-46, lado direito). Novamente a excitao resulta em uma separao de carga no centro fotoqumico de reao. O P700+ um forte agente oxidante, que rapidamente adquire um eltron da plastocianina, uma protena de transferncia de eltrons, solvel e que contm cobre. Ao- um agente redutor excepcionalmente forte que passa seu eltron atravs de uma cadeia de transportadores que leva ao NADP+. Inicialmente, a filoquinona (A1) aceita um eltron e o transfere para uma protena ferro-enxofre (atravs de trs centros Fe-S em FSI). A partir da, o eltron se move para a ferredoxina (Fd), uma outra ferro-enxofre protena fracamente associada membrana tilacide. A ferredoxina do espinafre (Mr 10700) contm um centro 2Fe-2S (Fig. 19-5) que sofre oxidao de um eltron e reaes de reduo. O quarto carregador de eltrons na cadeia a flavoprotena ferredoxina-NADP+ oxidoredutase, que transfere os eltrons da ferredoxina reduzida (Fdred) para o NADP+: 2Fdred + 2H+ + NADP+ 2Fdox + NADPH + H+ Essa enzima homloga ferredoxina-NAD redutase da bactria sulfurosa verde (Fig. 1944b).

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Filoquinona

figura 19-47 Localizao de FSI e FSII nas membranas tilacides. O complexo coletor de luz CCLII e a ATP sintase esto localizados tanto na regio empacotada (lamela granal) como na regio no empacotada (lamela estromal) da membrana tilacide e tm rpido acesso ao ADP e NADP+ no estroma. O fotossistema II (FSII) encontrado quase que exclusivamente nas regies empacotadas e o fotossistema I (FSI) quase que exclusivamente nas regies no empacotadas expostas ao estroma. O CCLII o adesivo que mantm as lamelas empacotadas juntas (veja fig. 19-48).

A separao espacial dos fotossistemas I e II impede a fuga de excitons A energia requerida para excitar FSI (P700) menor que a requerida para excitar FSII (P680) (comprimento de onda menor corresponde a energia maior). Se FSI e FSII estivessem fisicamente contguos, os excitons originrios do sistema antena de FSII migrariam para o centro de reao de FSI, deixando FSII cronicamente sub-excitado e interferindo com a operao do sistema de dois centros. Essa fuga impedida pela separao de FSI e FSII na membrana tilacide (Fig. 19-47). FSII fica localizado quase que exclusivamente no conjunto de membranas firmemente justapostas da grana tilacide (lamela granal) e o seu associado complexo coletor de luz (CCLII) medeia a forte associao das membranas adjacentes na grana. FSI e a ATP sintase esto localizados quase que exclusivamente nas membranas tilacides no empacotadas (a lamela estromal), onde ambos tm acesso ao contedo do estroma, incluindo ADP e NADP+. O complexo do citocromo b6f est presente em todas as partes da membrana tilacide. A associao do CCLII com o FSII regulada pela intensidade e comprimento de onda da luz. Na luz do sol brilhante (com grande componente de luz azul), FSII absorve mais luz que FSI e produz plastoquinona reduzida (plastoquinol, PQH2) mais rpido que FSI consegue oxid-lo. O resultante acmulo de PQH2 ativa uma protena quinase que fosforila um resduo de Tre do CCLII (Fig. 19-48). A fosforilao diminui a interao entre CCLII e FSII e, uma parte do CCLII se dissocia e se move para a lamela estromal. Ali ela captura prtons para FSI, aumenta a velocidade de oxidao de PQH2 e reverte o desequilbrio entre o fluxo de eltrons em FSI e FSII. Na presena de luz menos intensa, com mais vermelho (na sombra), FSI oxida PQH2 mais rpido que FSII possa sintetiza-lo e, o aumento resultante da concentrao de PQ dispara a desfosforilao de CCLII, revertendo o efeito da fosforilao.

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figura 19-48 A modulao do empacotamento granal iguala o fluxo de eltrons em FSI e FSII. Um domnio hidrofbico do complexo coletor de luz CCLII em uma lamela tilacide se insere em uma lamela vizinha e mantm as duas membranas firmemente justapostas (lamela granal). O acmulo de plastoquinol estimula uma protena quinase que fosforila um resduo de Tre no domnio hidrofbico de CCLII que por sua vez, reduz a sua afinidade pela membrana tilacide vizinha, convertendo a lamela granal em lamela estromal. Uma protena fosfatase especfica reverte essa fosforilao reguladora quando a concentrao de PQ aumenta.

O complexo do citocromo b6f une os fotossistemas I e II Os eltrons temporariamente armazenados no plastoquinol resultantes da excitao do P680 em FSII, so transportados para o P700 de FSI atravs do complexo do citocromo b6f e da proteina solvel plastocianina (Fig. 19-46, centro). Similarmente ao complexo III da mitocndria, o complexo do citocromo b6f (Fig. 19-49) contm um citocromo tipo b com dois grupos heme (denominados bH e bL), uma protena ferro-enxofre Rieske (Mr 20000) e o citocromo tipo c, c552, comumente chamada citocromo f (do Latin frons, significando folha). Os eltrons fluem atravs do complexo do citocromo b6f, do PQBH2 para o citocromo f e ento para a plastocianina. Finalmente atingem o P700, reduzindo-o. Tal como o complexo II da mitocndria, o citocromo b6f transporta eltrons da quinona reduzida um carregador mvel de dois eltrons, solvel em lipdeo (Q na mitocndria e PQB nos cloroplastos) para uma protena solvel que transporta um eltron (citocromo c na mitocndria, plastocianina nos cloroplastos). Tal como na mitocndria, a funo desse complexo envolve um ciclo Q (Fig. 19-11), onde os eltrons passam, um de cada vez, do PQBH2 para o citocromo b6. Este ciclo resulta no bombeamento de prtons atravs da membrana. Nos cloroplastos, a direo do movimento de prtons do compartimento estromal para o lmem tilacide e, cerca de quatro prtons se movem para cada par de eltrons. O resultado a produo de um gradiente de prtons atravs da membrana tilacide medida que os eltrons passam de FSII para FSI. Uma vez que o lmem das membranas tilacides achatadas pequeno, o influxo de um pequeno nmero de prtons tem um efeito significativo no pH lumenal. A diferena de pH medida entre o estroma (pH 8) e o lmem tilacide (pH 5,0) representa uma variao de 1000 vezes na concentrao dos prtons uma poderosa fora motriz para a sntese de ATP.

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figura 19-49 Fluxo de eltrons e prtons atravs do complexo do citocromo b6f. O plastoquinol (PQH2) formado em FSII oxidado pelo citocromo b6f em vrias etapas similares s do ciclo Q no complexo do citocromo bc1 (complexo III) da mitocndria (veja Fig. 19-11). Um eltron passa para centro Fe-S da protena Rieske (prpura) enquanto os outros, para os hemes do citocromo b6 (verde). O efeito global a passagem de eltrons de PQH2 para a plastocianina, uma protena solvel, que ento os transporta para FSI.

A cianobactria utiliza o complexo do citocromo b6f fosforilao oxidativa e como na fotofosforilao

e o citocromo c tanto na

A cianobactria pode sintetizar ATP pela fosforilao oxidativa ou fotofosforilao, embora ela no tenha nem mitocndria nem cloroplastos. A maquinaria enzimtica para ambos os processo est em uma membrana plasmtica altamente retorcida (veja Fig. 2-5). Dois componentes proteicos funcionam em ambos os processos (Fig. 19-50). O complexo do citocromo b6f bombeador de prtons transporta eltrons da plastoquinona para o citocromo c na fotossntese. Ele tambm transporta eltrons da ubiquinona para o citocromo c na fosforilao oxidativa, papel esse desempenhado pelo complexo do citocromo bc1 nas plantas superiores. O citocromo c, que na mitocndria transporta eltrons do complexo III para o complexo IV, realiza a mesma funo na cianobactria. Entretanto, ele tambm transporta eltrons do complexo do citocromo b6f para FSI, um papel desempenhado pela plastocianina nas plantas superiores. Desse modo, pode-se notar a homologia funcional entre o complexo do citocromo b6f da cianobactria e o complexo do citocromo bc1 das plantas bem como entre o citocromo c da cianobactria e a plastocianina das plantas.

figura 19-50 O duplo papel do citocromo b6f e citocromo c na cianobactria. Estes organismos utilizam citocromo b6f, citocromo c e plastoquinona na fosforilao oxidativa e na fotofosforilao. (a) na fotofosforilao os eltrons fluem da gua para o NADP+. (b) na fosforilao oxidativa, os eltrons fluem do NADH para o O2. Ambos os processos so acompanhados pelo movimento de prtons atravs da membrana, terminando por um ciclo Q.

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A gua quebrada pelo complexo produtor de oxignio A principal fonte de eltrons que passam para o NADPH na fotossntese das plantas (oxignico) a gua. Tendo doado um eltron para a feofitina, o P680+ (de FSII) precisa adquirir um eltron para voltar ao seu estado fundamental preparando-se para capturar um outro fton. Em princpio, o eltron requerido deve ser proveniente de compostos orgnicos ou inorgnicos. A bactria fotossintetizadora utiliza uma variedade de doadores de eltrons para este propsito acetato, succinato, malato ou sulfito dependendo qual deles est disponvel em um dado nicho ecolgico. H cerca de trs milhes de anos, a evoluo da bactria fotossintetizadora primitiva (progenitores da cianobactria moderna) produziu um fotossistema capaz de tomar eltrons de um doador sempre disponvel, a gua. Neste processo, duas molculas de gua so quebradas produzindo quatro eltrons, quatro prtons e oxignio molecular: 2H2O 4H+ + 4e + O2

Um nico fton de luz visvel no tem energia suficiente para quebrar as ligaes da gua. Quatro ftons so requeridos nesta reao de quebra fotoltica. Os quatro eltrons subtrados da gua no so transferidos diretamente para o P680+, que pode aceitar apenas um eltron de cada vez. Por outro lado, um extraordinrio mecanismo molecular, o complexo produtor de oxignio (tambm chamado complexo de ciso da gua), transfere quatro eltrons, um de cada vez, para o P680+ (Fig. 19-51). O doador de eltrons imediato ao P680+ um resduo de Tir (geralmente designado, Z ou TirZ) em uma subunidade protica do centro de reao de FSII. O resduo de Tir perde um prton e um eltron, gerando um radical livre Tir eletricamente neutro, Tir . 4 P680+ + 4 Tir 4 P680 + 4 Tir

(19-13)

O radical Tir recupera seu eltron e prton oxidando um arranjo de quatro ons mangans no complexo de ciso da gua. Atravs de cada transferncia de um nico eltron, o arranjo Mn se torna mais oxidado e, as quatro transferncias de um nico eltron, cada uma correspondendo absoro de um fton, produzem uma carga de +4 no complexo Mn (Fig. 19-51): 4 Tir + [complexo Mn]o 4 Tir + [complexo Mn]4+

(19-14)

Neste estado, o complexo Mn pode receber quatro eltrons de um par de molculas de gua, liberando 4 H+ e O2: [complexo Mn]4+ + 2H2O [complexo Mn]o + 4H+ + O2 (19-15)

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Uma vez que os quatro prtons produzidos na reao so liberados no lmem tilacide, o complexo produtor de oxignio atua como uma bomba de prtons, impulsionada pela transferncia de eltrons. A somatria das Equaes 19-12 e 19-15 : 2H2O + 2PQB + 4 ftons O2 + 2 PQBH2 (1916)

Tem sido excepcionalmente difcil purificar esta atividade de ciso da gua que est associada ao centro de reao de FSII. Acredita-se que uma protena perifrica de membrana (Mr 33000) do lado lumenal da membrana tilacide, estabiliza o complexo Mn. A estrutura detalhada do arranjo Mn ainda no conhecida. Como o mangans pode existir nos estados de oxidao estveis desde +2 at +7, esse arranjo de quatro ons certamente pode doar ou aceitar 4 eltrons. O mecanismo mostrado na Fig. 19-51 consistente com fatos experimentais. Entretanto, at que as estruturas qumicas exatas de todos os intermedirios do arranjo de Mn sejam conhecidas, o mecanismo permanece elusivo.

figura 19-51 Atividade de ciso da gua do complexo produtor de oxignio. mostrado o processo que produz um agente oxidante de quatro eltrons, considerado um centro multinuclear com vrios ons Mn, no complexo de quebra da gua de FSII. A absoro sequencial de quatro ftons, cada um provocando a perda de um eltron do centro Mn, produz um agente oxidante que pode aceitar quatro eltrons de duas molculas de gua, produzindo O2. Os eltrons perdidos pelo centro Mn so transferidos, um de cada vez, para um resduo oxidado de Tir na protena FSII.

A Sntese de ATP pela Fotofosforilao A atividade combinada dos dois fotossistemas das plantas move os eltrons da gua para o NADP+, conservando alguma energia da luz absorvida como NADPH (Fig. 19-46). Simultaneamente, prtons so bombeados atravs da membrana tilacide e a energia conservada como um potencial eletroqumico. Ns veremos agora o processo pelo qual esse gradiente de prtons dirige a sntese de ATP, o outro produto que conserva a energia das reaes dependentes da luz.

Daniel Arnon Em 1954, Daniel Arnon e seus colegas descobriram que o ATP gerado a partir de ADP e Pi durante a transferncia de eltrons fotossintetizadora em cloroplastos de espinafre iluminados. O suporte para esses achados veio do trabalho de Albert Frenkel, onde foi

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detectado que a produo de ATP dependente da luz em estruturas membranosas contendo pigmentos chamadas cromatforos, era proveniente de bactria fotossintetizadora. Os investigadores concluram que alguma energia luminosa capturada pelos sistemas fotossintetizadores destes organismos transformada na energia da ligao fosfato do ATP. Este processo chamado fotofosforilao, para diferencia-lo da fosforilao oxidativa na mitocndria que respira.

Um gradiente de prtons acopla o fluxo de energia e a fosforilao Vrias propriedades da transferncia de eltrons fotossintetizadores e da fotofosforilao nos cloroplastos indicam que o gradiente de prtons tem o mesmo papel que na fosforilao oxidativa da mitocndria. (1) os centros de reao, os transportadores de eltrons e as enzimas formadoras de ATP esto localizados em uma membrana impermevel a prtons, a membrana tilacide, que deve permanecer intacta para suportar a fotofosforilao. (2) a fotofosforilao pode ser desacoplada do fluxo de eltrons por reagentes que promovem a passagem dos prtons atravs da membrana tilacide. (3) a fotofosforilao pode ser bloqueada pela venturicidina e compostos similares que inibem a formao do ATP, pela ATP sintase mitocondrial, a partir do ADP e Pi (Tabela 19-4). (4) a sntese de ATP catalisada pelos complexos FoF1, localizados na superfcie externa das membranas tilacides, que so muito semelhantes em estrutura e funo aos complexos FoF1 da mitocndria. As molculas que transferem eltrons na cadeia dos transportadores conectando FSII e FSI esto orientadas assimetricamente na membrana tilacide, de forma que o fluxo de eltrons fotoinduzido resulta em uma movimento lquido de prtons atravs da membrana, do lado estromal para lmem tilacide (Fig. 19-52). Em 1966, Andr Jagendorf mostrou que um gradiente de pH atravs da membrana tilacide (alcalino do lado externo) poderia fornecer a fora motriz para gerar ATP. As observaes iniciais de Jagendorf forneceram algumas das mais importantes evidncias experimentais em apoio hiptese quimiosmtica de Mitchell. Ele incubou cloroplastos no escuro e em tampo de pH 4. O tampo penetrou lentamente no compartimento interno dos tilacides, diminuindo o seu pH interno. Ele adicionou ADP e Pi suspenso escura de cloroplastos e, subitamente, elevou o pH do meio externo at 8, criando momentaneamente um grande gradiente de pH atravs da membrana. medida que os prtons se movimentavam para fora dos tilacides at o meio externo, o ATP era gerado a partir do ADP e Pi. Como a formao do ATP ocorreu no escuro (sem nenhuma entrada de energia luminosa), este experimento mostrou que um gradiente de pH atravs da membrana um

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estado de alta energia que pode, como na fosforilao oxidativa mitocondrial, mediar a transduo de energia da transferncia de eltrons para a energia qumica do ATP.

figura 19-52 Circuitos dos prtons e dos eltrons nos tilacides. Os eltrons (setas azuis) se movem da H2O atravs de FSII, a cadeia intermediria de transportadores FSI e finalmente para o NADP+. Os prtons (setas vermelhas) so bombeados para o lmem tilacide pelo fluxo de eltrons atravs da cadeia de transportadores entre FSII e FSI e entram novamente no estroma atravs dos canais de prtons formados pela poro Fo da ATP sintase, designada CFo na enzima do cloroplasto. A subunidade F1, CF1, catalisa a sntese do ATP.

Andr Jagendorf

A estequiometria aproximada da fotofosforilao j foi estabelecida medida que os eltrons se movem da gua para o NADP+, cerca de 12 H+ se movem do estroma para o lmem tilacide, para cada quatro eltrons que passam (isto , para cada dois O2 formados). Quatro desses prtons so transportados pelo complexo produtor de oxignio e cerca de oito, pelo complexo do citocromo b6f. O resultado mensurvel uma diferena de 1000 vezes na concentrao dos prtons atravs da membrana tilacide (pH= 3). Lembrese que a energia armazenada no gradiente de prtons (o potencial eletroqumico) apresenta dois componentes: uma diferena de concentrao de prtons (pH) e um potencial eltrico () devido a separao de carga. Nos cloroplastos, o pH o componente dominante. O movimento dos contra ons aparentemente dissipa a maior parte do potencial eltrico. Nos cloroplastos iluminados, a energia armazenada no gradiente de prtons por mol de prtons : G = RT ln pH + Z F = - 17 kJ/mol Assim, o movimento de 12 mols de prtons atravs da membrana tilacide representa a conservao de cerca de 200 kJ de energia, energia suficiente para dirigir a sntese de vrios mols de ATP (Go= 30,5 kJ/mol). Medidas experimentais produziram valores de ATP por O2 de cerca de 3. Pelo menos oito ftons devem ser absorvidos para impulsionar quatro eltrons da H2O para o NADP+ (um fton por eltron em cada centro de reao). A energia nos oito ftons da luz visvel mais que suficiente para a sntese de trs molculas de ATP.

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A sntese de ATP no somente uma reao de conservao de energia da fotossntese. O NADPH formado no final da transferncia de eltrons tambm energeticamente rico, similarmente ao seu anlogo NADH. A equao global para a fotofosforilao no cclica (veja a seguir) : 2H2O + 8 ftons + 2NADP+ + 3ADP + 3Pi O2 + ~3ATP + 2NADPH (19-17)

O fluxo cclico de eltrons produz ATP mas no NADPH ou O2 Uma via alternativa do fluxo de eltrons induzido pela luz permite aos cloroplastos variarem a razo NADPH e ATP formados na presena da luz. Ela chamada fluxo cclico de eltrons para se diferenciar do ciclo normalmente unidirecional ou fluxo no cclico de eltrons da H2O para o NADP+. O fluxo cclico de eltrons (Fig. 19-46) envolve somente FSI. Os eltrons transportados do P700 para a ferredoxina no continuam para o NADP+, mas voltam atravs do complexo do citocromo b6f para a plastocianina. O caminho dos eltrons se equipara ao da bactria sulfurosa verde (Fig. 19-44b). A plastocianina doa os eltrons para o P700, que os transfere para a ferredoxina quando iluminada. Desse modo, na luz, FSI pode causar um movimento cclico dos eltrons para fora do centro de reao de FSI e depois voltando para ele. Cada eltron impelido ao redor do ciclo pela energia produzida pela absoro de um fton. O fluxo cclico dos eltrons no acompanhado pela formao real de NADPH ou evoluo de O2. Entretanto, ele acompanhado pelo bombeamento de prtons pelo complexo do citocromo b6f e pela fosforilao do ADP em ATP, que denominada fotofosforilao cclica. A equao geral para o fluxo cclico de eltrons e fotofosforilao simplesmente: luz ADP + Pi ATP + H2O

Regulando a partio de eltrons entre o NADP+ e a fotofosforilao cclica, a planta ajusta a relao de ATP e NADPH produzidos nas reaes dependentes de luz igualar as suas necessidades em relao a esses produtos nas reaes de assimilao de carbono. Conforme ser visto no Captulo 20, as reaes de assimilao de carbono requerem ATP e NADPH em uma relao de 3:2.

A ATP sintase dos cloroplastos similar da mitocndria A enzima responsvel pela sntese do ATP nos cloroplastos um grande complexo com dois componentes funcionais, CFo e CF1 (o C denota a sua origem nos cloroplastos). CFo um poro de prtons transmembrana composto de vrias protenas integrais de membrana e

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homlogo Fo mitocondrial. CF1 um complexo protico perifrico de membrana muito semelhante F1 mitocondrial em relao composio em subunidades, estrutura e funo. A microscopia eletrnica de cloroplastos secionados mostra complexos da ATP sintase como projees semelhantes a maanetas na superfcie externa (estromal) das membranas tilacides. Estes complexos correspondem ao complexo da ATP sintase vistos projetando-se na superfcie interna (matriz ou N) da membrana mitocondrial interna. Desta forma, tanto a orientao da ATP sintase como a direo do bombeamento dos prtons nos cloroplastos, so opostas quelas na mitocndria. Em ambos os casos, a poro F1 da ATP sintase est localizada no lado mais alcalino (N) da membrana, atravs do qual os prtons fluem na direo do seu gradiente de concentrao. A direo do fluxo de prtons relativo a F1 a mesma nos dois casos: P e N (Fig. 19-53). Acredita-se que o mecanismo da ATP sintase do cloroplasto tambm seja essencialmente idntico quele da sua anloga mitocondrial. O ADP e o Pi se condensam rapidamente para formar o ATP na superfcie da enzima e, a liberao deste ATP ligado enzima requer uma fora prton motriz. A catlise rotacional emprega seqencialmente cada uma das trs subunidades da ATP sintase na sntese e liberao do ATP e na ligao do ADP + Pi (Fig. 19-23, 19-24).

figura 19-53 Comparao da topologia do movimento dos prtons e da orientao da ATP sintase nas membranas da mitocndria, cloroplastos e bactria E. coli. Em cada caso, a orientao do gradiente de prtons em relao ATP sintase a mesma.

Os cloroplastos provavelmente surgiram de cianobactrias endossimbiticas Da mesma forma que as mitocndrias, os cloroplastos contm o seu prprio DNA e a sua maquinaria sintetizadora de protenas. Algumas protenas do cloroplasto so codificadas pelos genes dos cloroplastos e sintetizadas nos cloroplastos, enquanto outras so codificadas por genes nucleares, sintetizadas fora dos cloroplastos e importadas (veja Fig. 27-39b). Quando as clulas das plantas crescem e se dividem, os cloroplastos do origem a novos cloroplastos por diviso, durante a qual o seu DNA replicado e dividido entre cloroplastos filhos. A maquinaria e o mecanismo para a captura de luz, fluxo de eltrons e sntese de ATP nas bactrias fotossintetizadoras so similares em muitos aspectos queles dos cloroplastos das plantas superiores. Estas observaes levam hiptese, agora largamente aceita, de que os progenitores evolutivos das modernas clulas das plantas foram eucariotos primitivos que

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engolfaram as bactrias fotossintetizadoras e estabeleceram relaes endossimbiticas estveis com elas (Fig. 2-15). Atravs de vrios critrios, o FSII das plantas pode ter derivado do centro de reao da bactria prpura enquanto o FSI pode ter derivado da bactria verde. Os proclorofitos, bactrias fotossintetizadoras que contm a clorofila a e a b, mas no ficobilinas, so os provveis progenitores dos cloroplastos das atuais plantas superiores. Comparaes das seqncias de DNA em genes que codificam protenas do fotossistema nas plantas superiores e nos proclorofitos, suportam essa relao evolutiva. A cianobactria utiliza a clorofila a e ficobilinas para coletar luz e provavelmente so os progenitores dos cloroplastos das atuais algas vermelhas, que tambm usam a clorofila a e ficobilinas.

Diversos organismos fotossintetizadores usam doadores de hidrognio diferentes da H2O Pelo menos metade da atividade fotossintetizadora na Terra ocorre em microrganismos tais como algas, outros eucariotos fotossintetizadores e bactrias fotossintetizadoras. A cianobactria apresenta os sistemas FSII e FSI em sequncia e o sistema FSII apresenta uma atividade de ciso da gua, muito parecida com aquela das plantas. Entretanto, os outros grupos de bactrias fotossintetizadoras apresentam um nico centro de reao e no quebram a gua ou produzem O2. Muitas so anaerbicos restritos e no toleram O2. Elas devem usar como doador de eltron, algum composto diferente da gua. Algumas bactrias fotossintetizadoras usam compostos inorgnicos como doadores de eltrons (e hidrognio). Por exemplo, a bactria sulfurosa verde utiliza H2S: luz 2 H2S + CO2 (CH2O) + H2O + 2 S Estas bactrias, ao invs de produzir O2 molecular, produzem enxofre elementar como produto de oxidao do H2S. Outras bactrias fotossintetizadoras usam compostos orgnicos tal como o lactato como doadores de eltrons. luz 2 Lactato + CO2 (CH2O) + H2O + 2 piruvato A similaridade fundamental entre fotossntese das plantas e a das bactrias, apesar das diferenas nos doadores de eltrons que elas empregam, torna-se mais obvia quando a equao da fotossntese escrita em uma forma mais geral: luz

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2 H2D + CO2 (CH2O) + H2O + 2 D onde H2D um doador de eltrons (hidrognio) e D a sua forma oxidada. H 2D pode ser gua, sulfeto de hidrognio, lactato ou algum outro composto orgnico, dependendo das espcies. muito provvel que a bactria que primeiro desenvolveu habilidade fotossintetizadora utilizou H2S como fonte de eltrons e que, somente aps o desenvolvimento posterior da fotossntese oxignica (h cerca de 2,3 bilhes de anos) que o oxignio tornou-se uma significativa proporo da atmosfera terrestre. Com esse desenvolvimento, a evoluo do sistema de transferncia de eltrons que usa O2 como seu principal aceptor de eltrons tornou-se possvel, culminando com a extrao de energia altamente eficiente da fosforilao oxidativa.

Na bactria haloflica, uma nica protena absorve luz e bombeia prtons para dirigir a sntese de ATP

A bactria haloflica (que gosta de sal) Halobacterium salinarum, uma arquebactria derivada de um progenitor evolutivo muito antigo, capta a energia da luz solar atravs de um processo muito diferente do mecanismo fotossintetizador j descrito. Essa bactria vive somente em lagoas de salmoura e lagos salgados (Grande Lago Salgado ou Mar Morto, por exemplo), onde a alta concentrao salina, que pode exceder 4M, resulta da perda de gua por evaporao. De fato, a holobactria no consegue viver em concentraes de NaCl menores que 3M. Estes organismos so aerbicos e normalmente usam o O2 para oxidar as molculas orgnicas combustveis. Entretanto, a solubilidade do O2 to baixa nas lagoas de salmoura, que algumas vezes o metabolismo oxidativo deve ser suplementado pela luz solar como uma fonte alternativa de energia. A membrana plasmtica da H. salinarum contm regies de pigmentos que absorvem luz, bacteriorrodopsina, que contm o retinal (aldedo derivado da vitamina A, veja Fig. 11-19) como grupo prosttico. Quando as clulas so iluminadas, o trans-retinal (retinal com todas as suas duplas ligaes na forma trans) ligado a bacteriorrodopsina absorve um fton e sofre fotoisomerizao para 13-cis-retinal. A restaurao do trans-retinal acompanhada pela liberao de prtons para fora da clula atravs da membrana plasmtica. A bacteriorrodopsina, com apenas 247 resduos de aminocidos a mais simples bomba de prtons impulsionada pela luz. A diferena na estrutura tridimensional da bacteriorrodopsina no escuro e aps iluminao (Fig. 19-54a) sugere uma via atravs da qual uma srie ajustada de saltos de prtons pode mover efetivamente um prton atravs da membrana medida que a modificao conformacional ocorre. O cromforo retinal fica ligado ao grupo -amino

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da lisina atravs de uma ligao do tipo base de Schiff. No escuro, o N desta base de Schiff protonado mas, a fotoisomerizao do retinal diminui o pKa deste grupo e ele libera seu prton para um resduo Asp nas proximidades, iniciando uma srie de saltos de prtons que fundamentalmente resultam na liberao de um prton na superfcie externa da membrana (Fig. 19-54b). O potencial eletroqumico resultante impulsiona os prtons de volta para a clula atravs do complexo ATP sintase ligado membrana que muito similar ao da mitocndria e do cloroplasto. Assim, a holobactria pode usar a luz como fonte para suplementar o ATP sintetizado pela fosforilao oxidativa quando o O2 limitado. Entretanto, a holobactria no produz O2 nem efetua a fotorreduo do NADP+. Sua maquinaria fototransdutora contudo mais simples que a da cianobactria e plantas superiores. Todavia, o mecanismo de bombeamento de prtons usado por esta nica protena representa o prottipo de muitas outras, mais complexas, bombas de ons.

figura 19-54 Bombeamento de prtons dirigido pela luz pela bacteriorrodopsina (a) A bacteriorrodopsina (Mr 26000) tem sete hlices que atravessam a membrana. O cromforo trans retinal (prpura) est ligado covalentemente via base de Schiff a um grupo -amino de um resduo de Lis mergulhado no interior da membrana. Espalhados ao longo da proteina esto vrios resduos de Asp e Glu e vrias molculas de gua intimamente associadas que, juntas proporcionam a via transmembrana de prtons (setas vermelhas). As etapas a indicam os movimentos de prtons descritos a seguir. (b) no escuro (painel a esquerdo), a base de Schiff protonada. A iluminao (painel a direita) fotoisomerisa o retinal forando mudanas conformacionais sbitas na protena que altera a distncia entre a base de Schiff e seus resduos de aminocidos vizinhos. A interao com estes vizinhos, diminui o pKa da base de Schiff e, ela doa seu prton para o grupo carboxlico de um Asp85 prximo (passo em (a)). Isto inicia uma srie ajustada de saltos de prtons entre as molculas de gua (veja Fig. 4-12) no interior da protena, que termina com o passo , a liberao de um prton que foi compartilhado pelo Glu194 e Glu204 prximo superfcie extracelular. A base de Schiff readquire o prton do Asp96 () que por sua vez toma um prton do citosol (). Finalmente, o Asp85 doa o seu prton, acarretando a protonao do par Glu204-Glu194 (). O sistema agora est preparado para um outro ciclo de bombeamento de prtons.

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Resumo A teoria quimiosmtica fornece o arcabouo intelectual para o entendimento de muitas transdues de energia biolgicas, incluindo os processos de fosforilao oxidativa e a fotofosforilao. O mecanismo de acoplamento da energia semelhante em ambos os casos: a energia do fluxo de eltrons conservada pelo bombeamento concomitante de prtons atravs da membrana, produzindo um gradiente eletroqumico, a fora prton motriz. Na mitocndria, os tomos de H removidos dos substratos pelas desidrogenases ligadas ao NAD doam eltrons para a cadeia respiratria (transferncia de eltrons), que os transferem ao O2 molecular, reduzindo-o a H2O. Sistemas de lanadeiras transferem os equivalentes redutores do NADH citoslico ao NADH mitocondrial. Os equivalentes redutores de todas as desidrogenaes ligadas ao NAD so transferidos NADH desidrogenase mitocondrial (complexo I). Eles ento passam atravs de uma srie de centros Fe-S para a ubiquinona que, transfere os eltrons ao citocromo b, o primeiro transportador no complexo III. Neste complexo, os eltrons passam atravs de dois citocromos do tipo b e do citocromo c1 antes de atingir um centro Fe-S. O centro Fe-S passa os eltrons, um de cada vez, atravs do citocromo c para o complexo IV, citocromo oxidase. Esta enzima que contm cobre e que tambm contm os citocromos a e a3, acumula eltrons, passando-os ento para o O2 que reduzido a H2O. Alguns eltrons entram nesta cadeia de carregadores atravs de vias alternativas. O succinato, por exemplo, oxidado pela succinato desidrogenase (complexo II), que contm uma flavoprotena (com FAD), que passa os eltrons para a ubiquinona, atravs de vrios centros Fe-S. Os eltrons derivados da oxidao dos cidos graxos passam para a ubiquinona atravs da flavoprotena de transferncia de eltrons (FTE). O fluxo de eltrons atravs dos complexos I, III e IV resulta no bombeamento de prtons atravs da membrana mitocondrial interna, tornando a matriz alcalina em relao ao espao intermembranoso. Este gradiente de prtons fornece a energia (fora prton motriz) para a sntese do ATP a partir do ADP e Pi pela ATP sintase da membrana interna (complexo FoF1). Esta enzima promove a catlise rotacional onde o fluxo de prtons atravs de Fo faz com que cada um dos stios de ligao dos nucleotdeos em F1 oscilem entre as configuraes (ADP+Pi) ligado, ATP ligado e vazia. A formao de ATP na enzima requer pouca energia e, o papel da fora prton motriz empurrar o ATP do seu stio de ligao na sintase. As bactrias realizam a fosforilao oxidativa por mecanismos essencialmente semelhantes, usando os transportadores de eltrons e uma ATP sintase, na membrana plasmtica. A fosforilao oxidativa, que produz a maioria do ATP requerido pelas clulas aerbicas, regulada pelas demandas de energia celular. No tecido adiposo marrom, que

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especializado para a produo do calor metablico, a transferncia de eltrons est desacoplada da sntese de ATP e, a energia da oxidao de cidos graxos , portanto, dissipada como calor. A fotofosforilao nos cloroplastos das plantas verdes e nas cianobactrias tambm envolve o fluxo de eltrons atravs de uma srie de transportadores ligados membrana. Nas reaes luminosas das plantas, a absoro de um fton excita as molculas de clorofila e outros pigmentos (acessrios) que canalizam a energia para os centros de reao nas membranas tilacides. Nos centros de reao, a fotoexcitao resulta em uma separao de carga que produz um bom doador de eltrons (agente redutor) e um bom aceptor de eltrons. As bactrias apresentam um nico centro de reao; nas bactrias prpuras ele do tipo feofitinaquinona e, na bactria sulfurosa verde, do tipo Fe-S. Estudos estruturais do centro de reao da bactria prpura proporcionaram informaes sobre o fluxo de eltrons impulcionados pela luz de um par especial excitado de molculas de clorofila, atravs da feofitina para as quinonas. Os eltrons ento passam das quinonas atravs do complexo do citocromo bc1 de volta para o centro de reao. Uma via alternativa, na bactria sulfurosa verde, envia eltrons das quinonas reduzidas para o NAD+. O fluxo de eltrons atravs do complexo do citocromo bc1 impulsiona os prtons atravs da membrana plasmtica criando uma fora prton motriz que fornece a energia para a sntese do ATP por uma ATP sintase similar da mitocndria. A cianobactria e as plantas apresentam dois centros de reaes diferentes que funcionam juntos. O fotossistema I das plantas, passa eltrons do seu centro de reao excitado, P700, atravs de uma srie de transportadores at a ferredoxina que ento reduz o NADP+ a NADPH. O centro de reao, P680, do fotossistema II passa eltrons para a plastoquinona e, os eltrons perdidos pelo P680 so substitudos por eltrons retirados da H2O (outros doadores de hidrognio, diferentes da H2O, so usados em outros organismos). Esta ciso da H2O provocada pela luz catalisada por um complexo protico contendo Mn, com produo de O2. A plastoquinona reduzida transporta eltrons para o complexo do citocromo b6f. Da eles passam para a plastocianina e ento para o P700 para substituir os eltrons perdidos durante a fotoexcitao. A ciso da gua e o fluxo de eltrons atravs do complexo do citocromo b6f so acompanhados pelo bombeamento de prtons atravs da membrana tilacide e, a fora prton motriz assim criada. dirige a sntese de ATP por um complexo CFoCF1, muito semelhante ao complexo FoF1 da mitocndria. Desta forma, este fluxo de eltrons atravs dos fotossistemas II e I produz NADPH e ATP em uma razo de 2:3. Um segundo tipo de fluxo de eltrons (fluxo cclico) produz apenas ATP e permite uma variabilidade nas propores de NADPH e ATP formados. A localizao de FSI e FSII entre as lamelas granal e estromal varivel e controlada indiretamente pela intensidade

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luminosa, otimizando a distribuio de excitons entre FSI e FSII para uma captura eficiente de energia. Tanto a mitocndria quanto os cloroplastos contm os seus prprios genomas, e acredita-se que eles tenham se originado de procariotos endossimbiontes das clulas eucariotas primitivas. A fosforilao oxidativa nas bactrias aerbicas e a fotofosforilao nas bactrias fotossintetizadoras so muito semelhantes, na maquinaria e no mecanismo, aos processos homlogos nas mitocndrias e nos cloroplastos. A cianobactria utiliza vrios complexos enzimticos tanto na fosforilao oxidativa quanto na fotofosforilao, ilustrando a similaridade entre os dois processos. A bacteriorrodopsina a bomba de prtons impulsionada pela luz e o sistema fotossintetizador mais simples e melhor compreendida.

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Acoplamento da sntese do ATP ao fluxo de eltrons respiratrio Abrahams JP, Leslie AGW, Lutter R, & Walker JE (1994) The structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria determined at 2.8 resolution. Nature 370, 621-628. Bianchet MA, Hullihen J, Pedersen PL, & Amzel LM (1998) The 2.80 structure of rat liver F1-ATPase: configuration of a critical intermediate in ATP synthesis-hydrolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11065-11070. Um artigo de pesquisa que traz detalhes estruturais importantes que suportam o mecanismo cataltico. Boyer PD (1997) The ATP synthase a splendid molecular machine. Ann. Rev. Biochem. 66, 717-749. Uma narrativa sobre o desenvolvimento histrico e o estado atual do modelo da troca de ligao, escrita pelo seu principal arquiteto. Hinkle PC, Kumar MA, Resetar A, & Harris DL (1991) Mechanistic stoichiometry of mitochondrial oxidative phosphorylation. Biochemistry 30, 3576-3582. Uma cuidadosa anlise dos resultados experimentais e consideraes tericas sobre a questo das razes P/O no inteiras. Junge W, Lill H, & Engelbrecht S (1997) ATP synthase: an electrochemical transducer with rotatory mechanics. Trends Biochem. Sci. 22, 420-424. Uma descrio curta e clara da evidncia para o movimento rotatrio da ATP sintase. Khan S (1997) Rotary chemiosmotic machines. Biochim. Biophys. Acta 1322, 86-105. Uma reviso detalhada das estruturas que sustentam o movimento rotacional da ATP sintase e flagelos de bactria. Kinosita KJr, Yasuda R, Noji H, Ishiwata S, & Yoshida M (1998) F1ATPase: a rotary motor made of a single molecule. Cell 93, 21-24. Uma curta reviso da evidncia para a rotao da ATP sintase. Sambongi Y, Iko Y, Tanabe M, Omote H, lwamoto-Kihara A, Ueda I, Yanagida T, Wada Y, & Futai M (1999) Mechanical rotation of the c subunit oligomer in ATP synthase (FoF1): direct observation. Science 286, 1722-1724. Uma evidncia experimental para a rotao do cilindro completo das subunidades c em FoF1. Stock D, Leslie AGW, & Walker JE (1999) Molecular architecture of the rotary motor in ATP synthase. Science 286, 1700-1705.

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A primeira viso cristalogrfica da subunidade Fo na FoF1 de levedura. Veja tambm o comentrio editorial de R.H. Fillingame no mesmo volume do Science. Weber J & Senior AE (1997) Catalytic mechanism of F1-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1319, 19-58. Uma reviso avanada das evidncias cintica, estrutural e bioqumica para o mecanismo da ATP sintase. Yasuda R, Noji H, Kinosita JrK, & Yoshida M (1998) F1-ATPase is a highly efficient molecular motor that rotates with discrete 120 steps. Cell 93, 1117-1124. Demonstrao grfica da rotao da ATP sintase. Regulao da Fosforilao Oxidativa da Mitocndria Brand MD & Murphy MP (1987) Control of electron flux through the respiratory chain in mitochondria and cells. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 141-193. Uma descrio avanada do controle respiratrio. Harris DA & Das AM (1991) Control of mitochondrial ATP synthesis in the heart. Biochem. J 280, 561-573. Discusso avanada da regulao da ATP sintase by Ca2+ and outros fatores. Klingenberg M & Huang SG (1999) Structure and function of the uncoupling protein from brown adipose tissue. Biochim. Biophys. Acta 1415, 271-296. Doenas da Mitocndria Schapira AHV (1999) Mitochondrial disorders. Biochim. Biophys. Acta 1410, 99-102. Uma pequena introduo editorial a um volume completo (oito revises) sobre o papel da mitocndria em doenas humanas. Wallace DC (1997) Mitochondrial DNA in aging and disease. Sci. Am. 277 (Agosto), 40-47. Wallace DC (1999) Mitochondrial disease in man and mouse. Science 283, 1482-1487. Photosynthesis Coletando energia luminosa Cogdell RJ, Isaacs NW, Howard TD, McLuskey K, Fraser NJ, & Prince SM (1999) How photosynthetic bacteria harvest solar energy. J. Bacteriol. 181, 3869-3879. Uma pequena reviso de nvel mdio da estrutura e funo do complexo coletor de luz da bactria prpura e fluxo de exciton para o centro de reao. Green BR, Pichersky E, & Kloppstech K (1991) Chlorophyll a/b-binding proteins: an extended family. Trends Biochem. Sci. 16, 181-186. Uma descrio de nvel mdio das protenas que orientam as molculas de clorofila nos cloroplastos.

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Zuber H (1986) Structure of light-harvesting antenna complexes of photosynthetic bacteria, cyanobacteria and red algae. Trends Biochem. Sci. 11, 414-419. Fluxo de eltrons impulsionados pela luz Cogdell RJ, Isaacs NW, Howard TD, McLuskey K, Fraser NJ, & Prince SM (1999) How photosynthetic bactria harvest solar energy. J. Bacteriol. 181, 3869-3879. Reviso dos recentes desenvolvimentos na qumica e biologia dos coletores de luz das bactrias e do centro de fotorreao. Deisenhofer J & Michel H (1991) Structures of bacterial photosynthetic reaction centers. Annu. Rev. Cell Biol. 7, 1-23. A estrutura do centro de reao da bactria prpura e implicaes para a funo dos centros de reao das bactrias e plantas. Huber R (1990) A structural basis of light energy and electron transfer in biology. Eur. J. Biochem. 187, 283-305. Conferncia Nobel de Huber descrevendo a fsica e a qumica das fototransdues. Uma discusso excepcionalmente clara e bem ilustrada baseada em estudos cristalogrficos dos centros de reao. Jagendorf AT (1967) Acid-base transitions and phosphorylation by chloroplasts. Fed. Proc. 26, 1361-1369. O experimento clssico que estabeleceu a capacidade do gradiente de prton de comandar a sntese de ATP no escuro. Kerfeld CA & Krogmann DW (1998) Photosynthetic cytochromes c in cyanobacteria, algae, and plants. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 397-425. Complexo de Ciso da gua Rgner M, Boekema EJ, & Barber J (1996) How does photosystem 2 split water ? The structural basis of efficient energy conversion. Trends Biochem. Sci. 21, 44-49. Szalai VA & Brudvig GW (1998) How plants produce dioxygen. Am. Sci. 86, 542-551. Uma introduo bem ilustrada do complexo produtor de oxignio nas plantas. Bacteriorrodopsina Luecke H, Schobert B, Richter H.T, Cartailler JP, & Lanyi JK (1999) Structural changes in bacteriorodopsin during ion transport at 2 angstron resolution. Science 286, 255-264. Este artigo e um comentrio editorial, no mesmo nmero do Science, descrevem o modelo para a translocao de H+ atravs do salto de prtons.

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problemas 1. Reaes de oxidao-reduo O complexo da NADH desidrogenase da cadeia respiratria mitocondrial promove as seguintes sries de reaes de oxidao-reduo, onde o Fe3+ e o Fe2+ representam o Fe nos centros ferro-enxofre, Q a ubiquinona, QH2 o ubiquinol e E a enzima: 1) 2) 3) NADH + H+ + E-FMN NAD+ + E-FMNH2 E-FMNH2 + 2Fe3+ E-FMN + 2Fe2+ + 2H+ 2Fe2+ + 2H+ + Q 2Fe3+ + QH2

______________________________________________ Soma: NADH + H+ + Q NAD+ + QH2 Para cada uma das trs reaes catalisadas pelo complexo da NADH desidrogenase identifique: a) o doador de eltrons; b) o aceptor de eltrons; c) o par redox conjugado; d) o agente redutor; e) o agente oxidante. 2. Todas as partes da ubiquinona tm uma funo Na transferncia de eltrons, somente a poro quinona da ubiquinona sofre oxidao-reduo enquanto a poro isoprenide permanece inalterada. Qual a funo desta cadeia ? 3. O uso do FAD ao invs do NAD+ na oxidao do succinato Todos as desidrogenases da gliclise e do ciclo do cido ctrico usam NAD+ (Eo para o NAD+/NADH -0,32 V) como aceptor de eltrons, exceto a succinato desidrogenase, que usa o FAD covalentemente ligado (Eo para o FAD/FADH2 nesta enzima 0,05V). Porque o FAD um aceptor de eltrons mais apropriado que o NAD+ na desidrogenao do succinato baseado na comparao dos valores de Eo para o par fumarato/succinato (Eo = 0,03), NAD+/NADH e o FAD/FADH2 da succinato desidrogenase. 4. O grau de reduo dos transportadores de eltrons na cadeia respiratria O grau de reduo de cada transportador de eltrons na cadeia respiratria determinado pelas condies existentes na mitocndria. Por exemplo, quando o NADH e O2 forem abundantes, o grau de reduo de estado estacionrio dos transportadores diminui medida que os eltrons passam do substrato para o O2. Quando a transferncia de eltrons bloqueada, os transportadores antes do bloqueio tornam-se mais reduzidos enquanto aqueles alm do bloqueio tornam-se mais oxidados (veja Fig. 19-6). Para cada uma das condies abaixo, preveja o estado de oxidao da ubiquinona e dos citocromos b, c1, c e a + a3. a) NADH e O2 abundantes, mas na presena de cianeto.

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b) NADH abundante, mas com falta de O2. c) O2 abundante, mas com falta de NADH. d) NADH e O2 abundantes. 5. Efeito da rotenona e da antimicina A na transferncia de eltrons A rotenona, um produto natural txico de plantas, inibe fortemente a NADH desidrogenase mitocondrial de insetos e peixes. A antimicina A, um antibitico txico, inibe fortemente a oxidao do ubiquinol. a) Explique porque a ingesto de rotenona letal para algumas espcies de insetos e peixes. b) Explique porque a antimicina A um veneno. c) Assumindo que a rotenona e a antimicina A so igualmente efetivas no bloqueio dos seus respectivos stios na cadeia de transferncia de eltrons, qual seria o veneno mais potente? Explique. 6. Desacopladores da fosforilao oxidativa Na mitocndria normal a velocidade da transferncia de eltrons fortemente acoplada demanda de ATP. Quando a velocidade de utilizao do ATP for relativamente baixa, a velocidade da transferncia de eltrons baixa. Quando a demanda de ATP aumenta, a velocidade de transferncia de eltrons tambm aumenta. Nestas condies de forte acoplamento, o nmero de molculas de ATP produzidas por tomo de oxignio consumido, quando o NADH o doador de eltrons o quociente P/O cerca de 2,5. a) Preveja os efeitos de uma concentrao relativamente baixa e outra relativamente alta de um agente desacoplador na velocidade da transferncia de eltrons e no quociente P/O. b) A ingesto dos desacopladores provoca profunda sudorese e um aumento na temperatura corporal. Explique este fenmeno em termos moleculares. O que acontece com o quociente P/O na presena dos desacopladores? c) O desacoplador 2,4-dinitrofenol certa vez foi prescrito como droga redutora do peso corporal. Em princpio, como esta droga poderia funcionar na ajuda da reduo do peso corporal ? Tais agentes desacopladores no so mais prescritos devido a algumas mortes ocorridas aps o seu uso. Como a ingesto de desacopladores pode levar morte ? 7. Efeitos da valinomicina na fosforilao oxidativa Quando o antibitico valinomicina adicionado uma suspenso de mitocndrias que respiram ativamente, vrias coisas acontecem: o rendimento de ATP diminui, a velocidade de consumo de O2 aumenta, calor liberado e o gradiente de pH atravs da membrana mitocondrial interna aumenta. A

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valinomicina atua como um desacoplador ou um inibidor da fosforilao oxidativa ? Explique as observaes experimentais em termos da capacidade do antibitico transferir ons K+ atravs da membrana interna da mitocndria. 8. Modo de ao da diciclohexilcarbodiimida (DCCD) Quando a DCCD adicionada a uma suspenso de mitocndrias fortemente acopladas e que respiram ativamente, a velocidade da transferncia de eltrons (medida pelo consumo do O2) e a velocidade da produo de ATP diminuem drasticamente. Se uma soluo de 2,4-dinitrofenol adicionada preparao mitocondrial inibida, o consumo de O2 retorna ao normal mas a produo de ATP permanece inibida. a) Que processo na transferncia de eltrons ou na fosforilao oxidativa afetado pela DCCD ? b) Porque a DCCD afeta o consumo de O2 da mitocndria ? Explique o efeito do 2,4dinitrofenol na preparao mitocondrial inibida. c) Com quais dos seguintes inibidores a DCCD mais se assemelha na ao: a antimicina A, rotenona ou oligomicina ? 9. Compartimentao dos componentes do ciclo do cido ctrico A isocitrato desidrogenase encontrada somente na mitocndria, mas a malato desidrogenase encontrada tanto no citosol como na mitocndria. Qual o papel da malato desidrogenase citoslica ? 10. O sistema de transporte malato--cetoglutarato O transporte de malato e cetoglutarato atravs da membrana interna da mitocndria (Fig. 19-26) inibido pelo nbutilmalonato. Suponha que o n-butilmalonato seja adicionado a uma suspenso aerbica de clulas renais que usam a glicose como combustvel exclusivo. Preveja o efeito deste inibidor: a) na gliclise; b) no consumo de oxignio; c) na formao do lactato; d) na sntese do ATP. 11. A concentrao celular do ADP controla a formao do ATP Embora o ADP e o Pi so requeridos para a sntese do ATP, a velocidade de sntese depende principalmente da concentrao do ADP e no do Pi, porque ? 12. O efeito Pasteur Quando O2 adicionado a uma suspenso aerbica de clulas que consomem glicose em uma alta taxa, a velocidade de consumo da glicose declina dramaticamente medida que o O2 consumido e, o acmulo de lactato cessa. Este efeito, inicialmente observado por Louis Pasteur em 1860, caracterstico da maioria das clulas capazes de utilizar tanto o catabolismo aerbico como anaerbico da glicose. a) Porque o acmulo de lactato cessa aps a adio de O2 ?

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b) Porque a presena de O2 diminui a velocidade do consumo da glicose ? c) Como o incio do consumo do O2 diminui a velocidade do consumo da glicose ? Explique em termos de enzimas especficas. 13. Mutantes de levedura com respirao deficiente e produo de etanol Mutantes de levedura com respirao deficiente (p-, petites) podem ser produzidos atravs de progenitores selvagens atravs de tratamento com agentes mutagnicos. Os mutantes perdem a citocromo oxidase, uma deficincia que afeta marcantemente seu comportamento metablico. Um efeito extraordinrio que a fermentao no suprimida pelo O2, isto , os mutantes perdem o efeito Pasteur (ver problema 14). Algumas companhias esto muito interessadas em usar estes mutantes para fermentar cavacos de madeira em etanol para uso energtico. Explique as vantagens de se usar estes mutantes ao invs da levedura selvagem, na produo em larga escala de etanol. Porque a ausncia da citocromo oxidase elimina a efeito Pasteur ? 14. Quantos prtons em uma mitocndria ? A transferncia de eltrons transloca prtons da matriz mitocondrial para o meio externo, estabelecendo um gradiente de pH atravs da membrana interna (lado externo mais cido que o interno). A tendncia dos prtons em difundir de volta para o interior da matriz, a fora impulsora da sntese do ATP pela ATP sintase. Durante a fosforilao oxidativa por uma suspenso de mitocndria em um meio de pH 7,4, o pH interno da matriz medido foi 7,7. a) Calcule a [H+] no meio externo e na matriz nestas condies. b) Qual o relao da [H+] exterior: interior ? Comente sobre a energia inerente nesta concentrao. (Indicao: veja Eq. 12-3). c) Calcule o nmero de prtons em uma mitocndria de fgado respirando, assumindo que o seu compartimento matricial interno uma esfera de 1,5 m de dimetro. d) Considerando estes dados voc pensaria que o gradiente de pH sozinho seria suficiente para gerar o ATP ? e) Se no, voc pode sugerir como a energia necessria para a sntese do ATP se origina ? 15. Velocidade da renovao do ATP no msculo cardaco de rato O msculo cardaco de rato operando aerobicamente preenche mais que 90% das suas necessidades de ATP pela fosforilao oxidativa. Cada grama do tecido consome O2 em uma velocidade de 10 mol/min, usando a glicose fonte de energia. a) Calcule a velocidade com que o msculo cardaco consome glicose e produz ATP.

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b) Para uma concentrao estacionria de ATP de 5 mol/g de tecido muscular cardaco, calcule o tempo requerido (em segundos) para renovar completamente a concentrao celular de ATP. O que este resultado indica sobre a necessidade de uma forte regulao da produo de ATP ? (Observe: concentraes so expressas em micromols por grama de tecido muscular porque o tecido constitudo principalmente de gua.) 16. Velocidade da degradao do ATP no msculo de voar A produo de ATP nos msculos voadores do mosquito Lucilia sericata provm quase exclusivamente da fosforilao oxidativa. Durante o vo, 187 ml de O2/h.g de peso corporal so necessrios para manter uma concentrao de ATP em 7 mol/g do msculo de voar. Assumindo que o msculo de voar representa 20% do peso da mosquito calcule a velocidade na qual o ATP desse msculo se renova. Quanto tempo duraria o reservatrio do ATP na ausncia da fosforilao oxidativa ? Assuma que os equivalentes redutores so transferidos pela lanadeira do glicerol-3-fosfato e que o O2 esteja a 25C e 101,3 kPa (1atm). (Observe: as concentraes so expressas em micromols por grama de msculo de voar.) 17. Movimentao transmembrana dos equivalentes redutores Em condies aerbicas, o NADH extramitocondrial deve ser oxidado pela cadeia de transferncia de eltrons mitocondrial. Considere uma preparao de hepatcitos de ratos, contendo mitocndria e todas as enzimas do citosol. Se o [4-3H] NADH for adicionado, a radioatividade aparece rapidamente na matriz mitocondrial. Entretanto, se o [7-14C] NADH for adicionado, nenhuma radioatividade aparece na matriz. O que estas observaes revelam sobre a oxidao do NADH extramitocondrial pela cadeia de transferncia de eltrons ? 18. Reservatrios de NAD e atividades desidrogenases Embora a piruvato desidrogenase e a gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase usam NAD+ como aceptor de eltrons, as duas enzimas no competem pelo mesmo reservatrio celular de NAD. Porque ? 19. Eficincia fotoqumica da luz em diferentes comprimentos de onda A velocidade da fotossntese, medida pela produo de O2, maior quando uma planta verde iluminada com luz de comprimento de onda de 680 nm que com a luz de 700 nm. Entretanto, a iluminao com uma combinao de luz de 680 nm e 700 nm resulta em uma velocidade de fotossntese maior que a obtida com a luz de um dos comprimentos de onda isoladamente. Explique. 20. Balano de massa para a fotossntese Em 1804, Theodore de Saussure observou que a massa total de oxignio e matria orgnica seca produzida pelas plantas maior que a massa de dixido de carbono consumida durante a fotossntese. De onde provm essa massa extra ?

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21. Papel do H2S em algumas bactrias fotossintetizadoras Quando iluminada, a bactria sulfurosa prpura desenvolve a fotossntese na presena de H2O e
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CO2, mas

apenas se o H2S for adicionado e o O2 estiver ausente. Durante a fotossntese, medida pela formao do [14C] carboidrato, o H2S convertido em enxofre elementar, mas nenhum O2 produzido. Qual o papel da converso do H2S em enxofre ? Porque o O2 no produzido ? 22. Reforando o poder redutor do fotossistema I pela absoro de luz Quando o fotossistema I absorve a luz vermelha em 700 nm, o potencial de reduo padro do P700 muda de 0,4 para cerca de 1,2 V. Que frao da luz absorvida captada na forma de poder redutor ? 23. Sntese limitada de ATP no escuro Os cloroplastos do espinafre so iluminados na ausncia de ADP e Pi. Em seguida a luz desligada e ADP e Pi so adicionados. Nessas condies, o ATP sintetizado durante um curto intervalo de tempo no escuro. Explique este resultado. 24. Modo de ao do herbicida DCMU Quando os cloroplastos so tratados com o 3(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetiluria (DCMU ou Diuron), um potente herbicida, a produo de O2 e a fotofosforilao cessam. A produo de oxignio, mas no a fotofosforilao, pode ser restaurada pela adio de um aceptor de eltrons externo, ou reagente de Hill. Como o DCMU age como matador de erva daninha? Sugira uma localizao para a ao inibitria deste herbicida no esquema mostrado na Figura 19-46. Explique. 25. Bioenergtica da fotofosforilao As concentraes de estado estacionrio do ATP, ADP e Pi nos cloroplastos isolados de espinafre, sob iluminao total em pH 7,0, so 120, 6 e 700 M, respectivamente. a) Qual energia livre requerida para a sntese de 1 mol de ATP nestas condies ? b) A energia para a sntese de ATP fornecida pela transferncia dos eltrons induzidos pela luz nos cloroplastos. Qual a queda mnima de voltagem necessria (durante a transferncia de um par de eltrons) para sintetizar ATP nestas condies ? (Voc pode precisar se reportar Eq 11-6.) 26. Energia luminosa para uma reao redox Suponha que voc isolou um novo microrganismo fotossintetizador que oxida H2S e transfere os eltrons para o NAD+. Que comprimento de onda da luz garantir energia suficiente para o H2S reduzir o NAD+ em condies padres ? Considere que a eficincia do evento fotoqumico 100% e use Eo de 230 mV para o H2S e 320 mV para o NAD+. Veja a Figura 19-36 para os equivalentes de energia dos comprimentos de onda da luz.

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27. Constante de equilbrio para as reaes de ciso da gua A coenzima NADP o aceptor terminal de eltrons nos cloroplastos, de acordo com a reao 2H2O + 2NADP+ 2NADPH + 2H+ + O2 Use a informao na Tabela 19-2 para calcular a constante de equilbrio a 25C para esta reao (a relao entre Keq e G est discutida na pg. xxx). Como o cloroplasto contorna este equilbrio desfavorvel ? 28. Energtica da fototransduo Durante a fotossntese, oito ftons devem ser absorvidos (quatro em cada fotossistema) para cada molcula de O2 produzida: 2H2O + 2NADP+ + 8 ftons 2NADPH + 2H+ + O2 Assumindo que esses ftons apresentam um comprimento de onda de 700 nm (vermelho) e que a absoro e a utilizao da energia luminosa tenham uma eficincia de 100%, calcule a variao de energia livre para o processo. 29. Transferncia de eltrons para o reagente de Hill Os cloroplastos isolados de espinafre produzem O2 quando iluminados na presena de ferricianeto de potssio (reagente de Hill), de acordo com a equao 2H2O + 4Fe3+ O2 + 4H+ + 4Fe2+ onde o Fe3+ representa o ferricianeto e o Fe2+, o ferrocianeto. O NADPH produzido neste processo ? Explique. 30. Quo freqentemente uma molcula de clorofila absorve um fton ? A quantidade de clorofila a (Mr 892) em uma folha de espinafre cerca de 20 g/cm2 de folha. Na luz solar do meio dia (energia mdia de 5,4 J/cm2. min), a folha absorve cerca de 50% da radiao. Quo freqentemente uma nica molcula de clorofila absorve um fton ? Se a vida mdia de uma molcula de clorofila excitada in vivo de 1 ns, que frao das molculas de clorofila excitada em qualquer tempo ? 31. Efeito da luz monocromtica no fluxo de eltrons A extenso que um transportador de eltrons oxidado ou reduzido durante a transferncia de eltrons fotossintetizadores pode ser observada diretamente com um espectrofotmetro. Quando cloroplastos so iluminados com luz de 700 nm, o citocromo f, a plastocianina, e a plastoquinona so oxidados. Entretanto, quando os cloroplastos so iluminados com luz de 680 nm, estes transportadores de eltrons so reduzidos. Explique. 32. Funo da fotofosforilao cclica Quando o quociente [NADPH]/[NADP+] nos cloroplastos alto, a fotofosforilao predominantemente cclica (veja Fig. 19-46). O O2

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produzido durante a fotofosforilao cclica ? Explique. O NADPH produzido ? Explique. Qual a principal funo da fotofosforilao cclica ?