Biotecnologa Vegetal

Cultivo in vitro de clulas, tejidos y rganos micropropagacin mejoramiento de plantas produccin de compuestos de inters comercial produccin de metabolitos secundarios produccin de protenas produccin de polmeros biodegradables establecimiento de plantas transgnicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metablicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composicin de protenas, aceites, etc. fitorremediacin remocin de xenobiticos remocin de metales pesados

Principales conceptos fisiolgicos aplicables a los cultivos in vitro

Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciacin / Rediferenciacin

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- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Fundamentos tericos y prcticos del cultivo de tejidos vegetales

La teora de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc. La desdiferenciacin consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta es la redifereciacin de las clulas previamente desdiferenciadas. Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

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Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

Micropropagacin vegetal Regeneracin de plantas (embriognesis y organognesis) Cultivo de meristemas Cultivo de suspensiones de clulas vegetales Cultivo de protoplastos Cultivo de anteras Cultivo de vulos y embriones

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Medios de cultivo: composicin general

Compuestos inorgnicos Macronutrientes: NO4- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotnico (C) Biotina Aminocidos Glicina

Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semislidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite pH 5,6 5,8 Esterilizacin 1 atmsfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Reguladores del crecimiento

Grupos bsicos de reguladores del crecimiento: - Auxinas - Citoquininas - Giberelinas - Acido abscsico - Etileno Generalidades: - Actan a bajas concentraciones - Interactan unos con otros (los resultados estn determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). - Los reguladores endgenos del crecimiento estn presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentracin flucta. Su concentracin relativa vara en funcin del estado fisiolgico de la planta y en cada uno de los rganos de sta. - Estn involucrados en numerosos procesos fisiolgicos.

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Auxinas: estos compuestos se emplean bsicamente como promotores de la proliferacin celular y la induccin de la morfognesis

OH N

Acido indol actico (AIA) (auxina endgena)

Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpica del coleoptile de gramneas. - Alargamiento y divisin celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formacin de races adventcias - Dominancia apical - Accin herbicida - Estimulacin de la produccin de etileno Se sintetizan en las yemas, hojas jvenes, frutos y en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.

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Su transporte es polar Auxinas sintticas: - Acido indol butrico (IBA) - Acido naftalen actico (ANA) - 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)

Citoquininas: en combinacin con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenticas

Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas: - Promocin de la divisin celular - Promocin de la organognesis (relacin auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia - Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citoquininas endgenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) Citoquininas sintticas: - Kinetina (Kin) - Benziladenina (BAP)

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Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran en todos los tejidos. La concentracin endgena en plantas vara entre 0,1 y 500 g/Kg. Su transporte es no polar.

Estructura qumica de las principales citoquininas

CH3 H N CH2 CH C CH2OH

Zeatina

CH3 H N CH2 CH C CH3

Isopenteniladenina (IP)

H H N N C H N

6-bencilaminopurina

Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo

O Acido giberlico (GA3) HO H CH3 C O H H COOH CH3 OH

Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinacin de semillas en dormicin - Floracin - Movilizacin de reservas en la semilla.

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Se sintetizan en hojas jvenes, yemas y en el embrin. Su transporte no es polar.

Etapas de la micropropagacin vegetal

Iniciacin
- Eleccin y fitoacondicionamiento de la planta madre - Eleccin del explanto inicial y de la formulacin del medio de cultivo - Desinfeccin superficial de los explantos - Establecimiento del cultivo in vitro

Multiplicacin
- Multiplicacin del material stock

Enraizamiento
- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

Rusticacin
- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo

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Existen dos posibles vas morfogenticas implicadas en la diferenciacin de novo de brotes y/o plantas completas

Posibles vas morfogenticas: - Organognesis - Embriognesis Diferencias entre las dos posibles vas:
- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de clulas del explanto inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas. - La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula del explanto se asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta completa.

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Propagacin vegetativa por embriognesis somtica

Explanto (disco de hoja) Callo Explanto (clulas vegetales)

REGENERACIN

Suspensin celular

Embriones somticos GERMINACIN ENCAPSULACIN

GERMINACIN

Semilla artificial

Embriognesis: Obtencin de semillas artificiales

Semillas sintticas de orqudea obtenidas por encapsulacin en alginato

Propagacin vegetativa a partir de yemas preexistentes

Proliferacin de yemas apicales o axilares

- Consiste en la multiplicacin de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleracin in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas. - La tasa de multiplicacin (t.m.) se calcula en base al nmero de brotes o vstagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestin, entre otras variables. - Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podran obtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao, a partir de una nica yema inicial.

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- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta tcnica.

Sistemas de micropropagacin vegetal Proliferacin de tejidos desdiferenciados

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Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro

Consideraciones generales:
- Callo: masa de clulas desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de hoja, meristema, clulas en suspensin, etc.) - Es posible regenerar brotes o vstagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagacin clonal a gran escala.

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Sistemas de propagacin vegetativa in vitro Regeneracin directa e indirecta

Sistemas de propagacin vegetativa in vitro

Propagacin vegetativa in vitro Regeneracin directa e indirecta

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Sistemas de micropropagacin vegetal Cultivo de meristemas

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Los meristemas son grupos de clulas indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta

Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes rganos

Posibilitan la micropropagacin de diferentes especies

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vegetales. Constituyen el explanto ideal para liberar de patgenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservacin y conservacin de germoplasma.

El cultivo de meristemas facilita la eliminacin de patgenos

- El domo meristemtico no est vascularizado (muchos patgenos se translocan por los tejidos de conduccin).

- El nmero de partculas virales es menor en los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de divisin celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicacin de un virus.

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- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemas fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

Alcances de la micropropagacin vegetal

Propagacin vegetativa rpida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicacin de plantas recalcitrantes a las tcnicas convencionales Reduccin en el tiempo de multiplicacin y en el espacio requerido para tal fin Mayor control sobre la sanidad del material propagado Introduccin rpida de nuevos cultivares

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Conservacin de germoplasma Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal

Sistemas de transferencia gentica en plantas

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Sistemas de transformacin vegetal: Agrobacterium tumefaciens

Sistemas de transformacin gentica en plantas

Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biolgicos

- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes. - Sistemas basados en virus vegetales.

Sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia por biobalstica. - Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporacin
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Biobalstica y otros sistemas de transferencia directa de ADN

- Transferencia con whiskers de carburo de silicio. - Transferencia por microinyeccin.

Biologa de Agrobacterium tumefaciens

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Sistemas de transformacin vegetal: Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

Tumor de tallo provocado por Agrobacterium tumefaciens

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Sistemas de transformacin vegetal: Agrobacterium tumefaciens

Mapa gentico del plsmido Ti de octopina

BI

BD

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Sistemas de transformacin vegetal: Agrobacterium tumefaciens

Estructura de la regin T de un plsmido Ti de octopina

Mecanismos moleculares implicados en la transformacin por Agrobacterium tumefaciens

Tomado de: Tzfira y Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002

Agrobacterium rhizogenes
Tumor de races producido por Agrobacterium rhizogenes en discos de remolacha

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Sistemas de transformacin vegetal: Agrobacterium tumefaciens

Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Agrobacterium rhizogenes

Cultivo de races de tabaco transformadas por Agrobacterium rhizogenes

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

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Sistemas de transformacin vegetal: Agrobacterium tumefaciens

Gentileza del Dr. Mark Tepfer

Potencial econmico de los metabolitos secundarios

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Cultivo de tejidos y metabolismo secundario

Concepto general

El metabolismo secundario regula muchas de las relaciones de la planta con el medio circundante

La produccin de metabolitos secundarios est estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.
- Generalmente no est asociada al crecimiento. - Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y rganos (races, tallos, hojas y glndulas). - La biosntesis y acumulacin suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos y de rganos.

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Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones de estrs o enfermedad.

- Factores biticos - Factores abiticos

Las plantas como fuente de metabolitos secundarios de inters comercial

- Insecticidas - Saborizantes - Colorantes

- Fragancias - Antimicrobianos - Enzimas

- Medicinas - Herbicidas - Proteasas

Potencial
- 75 % de las nuevas estructuras qumicas descubiertas provienen de las plantas. - Slo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta. - 25 % de los medicamentos de las industrias farmacuticas son de origen vegetal.

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- 75 % de la poblacin mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.

Algunas de las medicinas ms importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso teraputico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$ Hiosciamina, Alcaloides del tropano Anticolinrgicos Solanaceas escopolamina Camptotecina Alcaloide indlico Antineoplsico Camptotheca acuminata Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgsico local Codena, morfina Alcaloide opiceo Papaver somniferum Analgsico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Inhibidor coliesterasa Leucojum aestivum Pilocarpina Alcaloide imidazlico Pilocarpus jaborandi Colinrgico Nicotina Alcaloide pirrolidnico Terapia antitabaco Nicotiana spp. Quinina Alcaloide quinolnico Antimalrico Cinchona spp. Quinidina Alcaloide quinolnico Cardiotnico Cinchona spp. Reserpina Alcaloide indlico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrpico Vinblastina, Alcaloide indlico Catharanthus roseus Antineoplsico vincristina Yohimbina Alcaloide indlico Afrodisaco Apocynaceae, Rubiaceae Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpnica Artemisia annua Antimalrico Diosgenina, Esteroides Hormonas esteroidales Dioscorea spp. Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicsidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$ Digoxina, digitoxina Glicsidos esteroidales Cardiotnico Digitalis spp. Sennsidos A y B Antracenos Laxante Cassia angustifolia Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de Cephaelis Emtico ipecacuana ipecacuanha Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplsico

Produccin de metabolitos secundarios por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales: por qu?

- Independizarse de factores externos tales como: cambios de temperatura, sequas, plagas, variabilidad de la produccin, factores polticos y sociales, etc. - Evitar la extincin de especies vegetales. - Disponer de condiciones controladas en el proceso de produccin y extraccin. - Posibilitar el mejoramiento vegetal en tiempos mas cortos. - Hacer viable la produccin de compuestos complejos con uno o ms C quirales en forma ms econmica respecto de la sntesis qumica

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- Posibilitar la obtencin de nuevos compuestos no presentes en la planta madre. - Establecer procesos de biotransformacin slo realizables por enzimas provenientes de plantas.

Procesos industriales

Tipo de compuesto
Farmacuticos

Producto
Shikonina Berberina Sanguinarina Gingsensidos Taxol

Compaa
Mitsui Petrochemical Ind. Mitsui Petrochemical Ind. Vigont Researol Lab. Nitto Denko Co. Phyton USA Kibun Kyoto University Kanedo Co. Kanedo Co. Kanedo Co. Mitsui Petrochemical Ind.

Pigmentos Fragancias Saborizantes Depigmentadores

Cartamina Geraniol Citronerol Vanillina Arbutina

Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial

Condiciones econmicas:
- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg) - Alto rendimiento y productividad del cultivo comparado con la planta entera - Buen crecimiento en biorreactores - Crecimiento lento de la planta entera como fuente alternativa

Parmetros principales:
- Productividad: g de producto/L/da
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- Concentracin mxima de producto: g de producto/L - Rendimiento: g producto/g sustrato

Estrategias para incrementar la produccin de metabolitos secundarios

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Metodologas utilizadas para optimizar la produccin de metabolitos secundarios

Seleccin de especies vegetales apropiadas Seleccin de lneas celulares mejoradas Optimizacin de las condiciones de cultivo Agregado de precursores Tipo de cultivo: suspensiones, rganos o clulas inmovilizadas Uso de elicitores microbianos y estrs abitico Permeabilizacin y remocin in situ

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Metodologas utilizadas para optimizar la produccin de metabolitos secundarios

Screening y seleccin de lneas sobreproductoras

- Se facilita cuando el metabolito de inters es un pigmento, ya que puede hacerse una seleccin visual. - Es importante contar con un mtodo rpido y sencillo para seleccionar lneas ms productoras (por ejemplo, ELISA).

Optimizacin del medio de cultivo (variables ms ensayadas)

- Fuente de carbono - Limitacin en nitrgeno - Limitacin en fosfato - Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas) - Relacin C/N
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Agregado de precursores
- Bajo costo - Baja toxicidad - No muy alejado del producto final en la ruta metablica

Diferencias entre suspensiones de clulas vegetales y de clulas microbianas

Caracterizacin Clulas microbianas Clulas Individuales 2-10 m Clulas vegetales Agregados de 10-200 m y de hasta 2 mm de dimetro Lenta; td ~ 2-5 das Consecuencias para cultivos a gran escala Sedimentacin rpida; sensibilidad a fuerzas de corte; formacin de gradientes; dificultad para tomar muestras Largos tiempos de proceso; baja productividad Necesidad de grandes cantidades de inculo; escalado ms largo Bajas velocidades de agitacin Baja demanda de oxgeno: fermentadores con baja transferencia de oxgeno Permeabilizacin; remocin in situ
Tomado de: Scraag.. Plant Biotechnology, 1992.

Tamao y morfologa

Velocidad de crecimiento Densidad de inoculacin

Rpida; td ~ 1-2 h Pequea

5-20%

Sensibilidad a fuerzas de corte Aireacin

Insensible

Sensible / Tolerante Baja

Alta

Acumulacin del producto

Extracelular

Intracelular / a veces extracelular

Cultivos en suspensin

Problemas a considerar:
- Tasa de crecimiento - Volumen del inculo - Tamao y agregacin de las clulas - Oxigenacin - Agitacin

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Cultivo de rganos: races transformadas

Propiedad Forma de crecimiento Patrn de crecimiento Suspensiones Clulas simples-agregados Desorganizado; cada clula puede dividirse y expandirse 15 h-das 30-60 g Heterogneo Usualmente bajo Complejo; hormonas y vitaminas Intracelular- extracelular Batch; continuo, deben ser inmovilizadas Races transformadas Red de ramificaciones Divisin celular localizada; crecimiento linear con ramificaciones laterales 36 h-das 30-60 g Euploide Similares a la planta madre Simple, sales y azcar Intracelular- extracelular Batch o continuo, no hay necesidad de inmovilizar

Tiempo de duplicacin Biomasa final (peso seco/L) Background gentico Formacin inicial de producto Medio de crecimiento Localizacin del producto Tipo de proceso

Algunos metabolitos secundarios producidos por races transformadas

Metabolito
Alcaloide Alcaloides piridnicos Indoles Tropano

Gnero
Nicotiana Catharanthus Cinchona Duboisia Datura

Otros Betalaina Sesquiterpenos Poliacetilenos Tiofenos Glicsidos cardioactivos Antraquinonas Saponinas Polyines Lignanos

Beta Lippia Artemisia Coreopsis, Bidens Tagetes Digitalis Cassia Panax Chaenactis Podophyllum Linum Lithospermum Solanum

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Naftoquinonas Esteroides

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Patrn de flujo de dos diseos de propulsor

Agitador de paletas planas o Rushton Agitador de paletas inclinadas

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

Diseos alternativos para biorreactores con agitacin mecnica

Biorreactor de tambor rotatorio

Biorreactor de membranas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Tomado de: Bhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.

Biorreactores para el cultivo de races

Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las races
Inculo
Salida de aire Malla de inmovilizacin

Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor)

Adicin de nutrientes Bomba peristltica

Rotmetro

Filtro de aire

Bomba de aire

Generador de niebla Aire Aire Reservorio Intensidad On Off Controlador Condensador de niebla

Bomba

Cmara de cultivo

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Cultivo de tallos

Ventajas
- Cultivos gentica y bioqumicamente estables - Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos presentes en tallos y hojas (glndulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales - Niveles similares a los de la planta (no siempre se cumple).

Desventajas
- Slo para productos sintetizados en tallos y hojas - Vitrificacin

Compuesto

Planta Chrysanthemum spp. Digitalis spp. Artemisia annua Mentha spp. Pelargoium spp.

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Cultivos celulares

Piretrinas Cardenlidos Artemisinina Aceites esenciales Aceites esenciales

Elicitacin
Agentes biticos
- Extractos de paredes de hongos o bacterias - Acido araquidnico - Quitosano - Metil jasmonato

Agentes abiticos
- Metales pesados - Radiacin UV - Presin osmtica - Ultrasonido

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Liberacin del producto al medio

- DMSO - Shock trmico - Cambios de pH - Limitacin de fosfato y oxgeno - Elicitacin - Detergentes y aceites de siliconas

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- Electropermeabilizacin

Remocin de producto in situ

Lquido-lquido:
Compuestos inmiscibles en agua, como solventes orgnicos o lpidos (sistemas de dos fases agua-orgnico). Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano. Compuestos miscibles en agua, como sales o soluciones de polmeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG.

Slido-lquido:
La segunda fase es un material slido como resinas u otros absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

Requerimientos:
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Cultivos celulares

- Autoclavables - No txicos - Fcil separacin del producto de inters de la segunda fase - No modificacin del medio de cultivo - Permanencia de las clulas en la fase acuosa

Adaptaciones para la extraccin in situ del producto

Diagrama de un tanque de agitacin mecnica modificado para operar con remocin in situ del producto. 1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar races; 3: sensor de oxgeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador; 12: marco de la malla

Un bioreactor de agitacin por lquido con loop externo

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Secuencia en la optimizacin de un proceso para la produccin de metabolitos secundarios

Seleccin de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro

Establecimiento de cultivos in vitro

Estabilizacin y seleccin de cultivos in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto, liberacin al medio

Optimizacin de medio de cultivo para produccin por diseo factorial: nutrientes, precursores, elicitacin, liberacin y remocin in situ
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Optimizacin en bioreactores: escalado Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusin, en dos etapas. Extraccin y purificacin del producto

Estrategias para modificar el metabolismo secundario mediante manipulacin gentica

- Completar rutas metablicas mediante insercin de genes heterlogos. - Amplificar rutas normales. - Bloquear rutas alternativas. - Bloquear rutas normales. - Modificar la regulacin de rutas normales. - Modificar los mecanismos de secrecin y exportacin.

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- Bloquear rutas de degradacin.

Cultivos celulares

Ingeniera metablica del metabolismo secundario

Especie
Peganum harmala (suspensiones y races) Hyosciamus muticus (races transformadas) Catharanthus roseus (suspensiones)

Enzima
Triptofano decarboxilasa (TDC) Hiosciamina-6-hidroxilasa (H6H) Triptofano decarboxilasa (TDC) y estrictosidina sintasa (STR)

Producto
Serotonina

Observaciones
Incremento de 10-20 veces en producto Contenido de producto 4 veces superior a planta control Contenido de TIAs de 300 mg/L comparado con control 50mg/L. Lneas inestables Incremento de la concentracin de TIAs de 3 veces despus de agregar el precursor secologanina Incremento del flujo hacia la produccin de berberina de 15%

Escopolamina

Alcaloides indlicos (TIAs)

Catharanthus roseus (suspensiones)

ORCA3 (factor De transcripcin)

Alcaloides indlicos (TIAs)

Coptis japonica (suspensiones)

(S)-esculerina 9-Ometiltransferasa (SMT)

Berberina

Mentha spp. (planta) Zea mays (callos)

Desoxixilulosa fosfato reductoisomerasa (DXR) C1 y R (factores de transcripcin)

Aceites esenciales

Incremento del 50% ene l contenido de aceites esenciales Produccin de antocianinas y fenoles que no se producan en los callos sin transformar.

Antocianinas

Ejemplos de Ingeniera metablica en el metabolismo secundario

Problemas - Clonado de genes - Estabilidad - Compartimentalizacin - Transporte - Limitaciones y arquitectura de la ruta metablica

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Cultivos celulares

- Canales metablicos

Esquema de un proceso completo para la produccin de un metabolito secundario por cultivo in vitro de clulas y rganos vegetales

Produccin de shikonina por suspensiones celulares de Lithospermum erythrorhizon

Shikonina
Yamasaki Plant Photo Gallery

Planta entera
- La extraccin se realiza en plantas de aproximadamente 3 aos.

Suspensiones celulares
- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la produccin. - Las bajas concentraciones de nitrgeno y la elicitacin inducen la produccin de shikonina. - Se utilizan fermentadores de agitacin mecnica y tambor rotatorio. - La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Proceso para la produccin de shikonina a partir de clulas de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Produccin de taxol por Taxus spp

Schoepke Plant Image Gallery

Taxol

Planta entera
- La edad de los rboles para extraer el producto es de 50-100 aos.
- La concentracin de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco. - Este mtodo de produccin podra llevar a la extincin de la especie.

Semisntesis
- El material vegeta empleado presenta variacin en la concentracin de precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difcil la purificacin del taxol.

Conclusiones
Aspectos bioingenieriles
- Diseo de bioreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales - Instrumentacin y control de los bioprocesos - Diseo de bioreactores ms econmicos - Mtodos no letales para liberacin de los metabolitos secundarios - Mtodo adecuado para la remocin in situ

Aspectos Biolgicos
- Conocimiento de la regulacin de las rutas biosintticas: enzimas y factores de transcripcin - Conocimiento de la regulacin del transporte y acumulacin de los metabolitos secundarios - Conocimientos de los mecanismos de degradacin del producto

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Cultivos celulares

Expresin de protenas heterlogas en plantas (Molecular Farming)

bajos costos de produccin. tiempos menores para poner en el mercado. abastecimiento ilimitado. procesamiento correcto de protenas. seguridad.

Expresin de protenas heterlogas en plantas (Molecular Farming)

Fidelidad en la expresin de protenas humanas o animales en plantas.
Producto Hemoglobina y -interferon EPO Sero albumina humana Factor de crecimiento epidrmico Glucocerebrosidasa Hirudina NPI Defensina Uso Sustituto de la sangre Anti-cncer, antiviral Estimulador del crecimiento de glbulos rojos Planta husped tabaco arroz Clulas de tabaco papa Mitgeno Enfermedad de Gaucher Anticoagulante Antibitico tabaco tabaco canola tabaco Integridad estructural si si Actividad biolgica

si, (unin a O2/CO2) Actividad antiviral in vitro. si, (glicanos) Sin testear Sin testear Sin testear si, (glicanos) si si si si

si

Expresin de protenas heterlogas en plantas (Molecular Farming)

Plantas transgnicas Vectores virales
Perodos ms largos en el establecimiento Perodos cortos en la preparacin del de la lnea transgnica vector Niveles de expresin relativamente bajos Altos niveles de expresin Posibilidad de expresar en tejido especfico, expresarse en semillas o tubrculos con gran estabilidad de la protena. Ms estables Tamao de la protena no es limitante Plantas usadas: Tabaco, papa, tomate, banana. Fusin con protenas de la cpside pueden facilitar el downstream processing aislando las partculas virales. Dificultad para manipular material fresco (siempre se infecta sobre hojas) Tamao de la protena es limitante Virus usados: virus del mosaico del tabaco(TMV). Cowpea mosaic virus (CPMV)

Fitorremediacin

Ventajas
Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas contaminadas (10-20 % del costo de mtodos tradicionales): - las plantas emplean energa solar - el tratamiento es in situ Algunos procesos degradativos ocurren en forma ms rpida con plantas que con microorganismos. Es un mtodo apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminacin de reas restringidas en plazos largos. Es una metodologa con buena aceptacin pblica.

Agrobiotecnologa

Se generan menos residuos secundarios.

Fitorremediacin

Fitorremediacin

Limitaciones
El proceso se limita a la profundidad de penetracin de las races o a aguas poco profundas. La fitotoxicidad es un limitante en reas fuertemente contaminadas. Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados. La biodisponibilidad de los compuestos o metales es un factor limitante de la captacin. Deben considerarse potenciales contaminaciones de la cadena alimentaria y napas de agua.

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Se requiere comprender mejor la naturaleza de los productos de degradacin (fitodegradacin). Falta elaborar el marco regulatorio.

Biologa de la acumulacin de metales en plantas

Captacin por las races:

- Movilizacin de los metales Quelacin mediante fitosiderforos Unin a protenas quelantes Acidificacin por exudado de H+ - Captacin por la raz
Via apoplstica

Va simplstica

Transporte:
- Almacenamiento en raz y exportacin al tallo por xilema - Transporte por xilema o redistribucin por floema - Almacenamiento en vacuolas

Mecanismos de evasin o tolerancia:

- Captacin celular limitada (evasin) - Metabolismo resistente a metales pesados Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

- Detoxificacin por quelacin, compartimentalizacin o precipitacin

Mecanismos ms probables:
- Compartimentalizacin en vacuolas y quelacin con fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ ) - Precipitacin como fitatos (Zn2+)

Fitorremediacin

Tipos de plantas ms utilizadas

Freatfitas - Plantas de races profundas (lamo, sauce, algodonero). Pasturas - Por su tipo de raz retienen el suelo. Legumbres - Permiten enriquecer el suelo en N2. Acuticas - Permiten la degradacin de contaminantes en cinagas artificiales.

Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

Tipos de fitorremediacin

Fitoextraccin
Las plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte area).

Rizofiltracin
Las races de las plantas se usan para absorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes lquidos contaminados.

Fitoestimulacin
Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).

Fitoestabilizacin
Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterrneas o al aire.

Fitotransformacin
Agrobiotecnologa
Fitorremediacin

- Fitodegradacin: Las plantas acuticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgnicos para dar subproductos no txicos o menos txicos. - Fitovolatilizacin: Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgnicos y los liberan a la atmsfera con la transpiracin.

Tipos de fitorremediacin
Tipo Fitoextraccin Proceso involucrado Las plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte area). Las races de las plantas se usan para absorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes lquidos contaminados. Las plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterrneas o al aire. Contribuyen a estabilizar el suelo. Se usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos). Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgnicos y los liberan a la atmsfera con la transpiracin. Las plantas acuticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgnicos para dar subproductos no txicos o menos txicos. Contaminacin tratada Cd2+,Co2+,Cr2+,Ni2+,Hg2+,Pb2+,Se2+,Zn2+.

Rizofiltracin

Cd2+,Co2+,Cr2+,Ni2+,Hg2+,Pb2+,Se2+,Zn2+.

Fitoestabilizacin

Lagunas de deshecho de yacimientos mineros. Propuesto para fenlicos y compuestos clorinados. Hidrocarburos poliaromticos, benceno, tolueno, etil benceno, xileno, hidrocarburos del petrleo, perciorato, atrazina, ataclor, bifenilos policlorinados, otros compuestos orgnicos. Hg2+, Se2+ y solventes clorinados (tetraclorometano y triclorometano).

Fitoestimulacin

Fitovolatilizacin

Fitodegradacin

Explosivos (TNT, DNT, RDX, nitrobenceno, cido pcrico, nitrotolueno, nitrometano, nitroetano). Atrazina, solventes clorinados, bromuro de metilo, tetrabromoeteno, tetracloroetano, DDT, pesticidas fosfatados, bifenoles policlorinados, fenoles y nitritos.

Tomado de McCutcheon, PBI Bulletin 1998.