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ESCOLA SECUNDRI A ANTNIO GEDE O

FICHA FORMATIVA Protocolo do DNA do Fago Lambda DISCIPLINA BIOLOGIA NOME: UNIDADE II Patrimnio Gentico

DATA

1/2012

12. ANO
N: TURMA:

1. ENQUADRAMENTO TERICO

1.1. Bacterifago Lambda Os bacterifagos (ou fagos) so vrus que invadem bactrias. Para se reproduzirem, os fagos tm que assumir o comando da maquinaria celular da bactria (figura 1). O fago lambda infecta a bactria Escherichia coli. O fago possui dois ciclos de vida (figura 2) pode-se multiplicar dentro do hospedeiro e destru-lo (ciclo de vida ltico), ou pode inserir o seu DNA no cromossoma da bactria e permanecer inactivo durante vrias geraes (ciclo de vida lisognico). Alguns factores ambientais (p.e., radiaes UV) podem activar o vrus, conduzindo-o ao ciclo de vida ltico.
Figura 1 Fago lambda e alguns principais grupos dos 60 genes no seu genoma. O DNA pode ser linear ou circular.

1.2. Enzimas de Restrio (endonucleases de restrio) As enzimas de restrio (figura 3) so elementos do sistema imunitrio das bactrias, que restringem a proliferao dos vrus invasores ao cortar o DNA destes em locais especficos (quebra das ligaes fosfodiester e pontes de hidrognio). A bactria protege o seu DNA destas enzimas ao adicionar grupos metilo (-CH3) s bases azotadas (adenina ou citosina). O resultado da aco destas enzimas a obteno de fragmentos de DNA, muitos destes com extremidades protuberantes (coesivas).

Figura 2 Infeco da bactria E.coli pelo fago lambda. Ciclo de vida ltico e lisognico. Figura 3 Estes mapas de restrio mostram onde as enzimas Eco RI, BamHI e HindIII cortam o DNA lambda. Os nmeros so os tamanhos dos fragmentos, em bases azotadas (bp). Estas enzimas liofilizadas encontram-se nos tubos coloridos do Kit.

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1.3. Electroforese Numa electroforese fazse a separao de molculas com carga elctrica (figura 4). Estas, quando sujeitas a um campo elctrico, migram ao longo de um meio poroso, geralmente um gel de agarose.

1.3.1. Gel de Agarose A agarose um polmero composto de subunidades de galactose. um componente da parede celular de algas marinhas. Quando aquecida em gua quente e seguidamente arrefecida, a agarose toma consistncia gelatinosa, sendo esta propriedade utilizada em investigao laboratorial, medicina, culinria e indstria.

Figura 4 Representao esquemtica da electroforese.

Coloca-se o gel de agarose a 55-60C numa tina de electroforese (figura 5). Numa das extremidades do gel abremse ranhuras, os poos, onde se colocam, com pipetas apropriadas, as amostras das molculas que se pretendem separar.

Figura 5 Tina de electroforese com gel de agarose.

1.3.2. Soluo Tampo Uma soluo tampo (TBE, TAE) colocada sobre o gel, para conduzir a corrente elctrica e impedir a desidratao. Esta soluo deve cobrir os poos e entrar em contacto com os elctrodos.

1.3.3. Campo Elctrico (Elctrodos e Voltagem) Em cada uma das extremidades de uma tina so colocados elctrodos (figura 6): um negativo (ctodo) e outro positivo (nodo). Ligam-se os elctrodos bateria, deforma a que o plo negativo fique perto dos poos. Deve-se colocar a tampa sobre o tanque de electroforese para minimizar a evaporao.
Figura 6 Elctrodos (em fibra de carbono) colocados na extremidade da tina de electroforese.

1.3.4. Carregamento do Gel Pipetar a mistura (corante marcador da migrao e DNA) para um poo seleccionado (figura 7), colocando a ponta da micropipeta acima do poo mas dentro da soluo tampo. O azul de bromofenol um adiciona cor s amostras e aumenta a sua densidade (faz afundar no poo). Em valores baixos de pH este corante absorve radiao ultravioleta e azul.
Figura 7 Carregamento do gel com uma micropipeta.

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1.3.5. Corrida Electrofortica Quando se aplica a corrente elctrica, as molculas movemse do plo negativo para o positivo atravs do gel, mas a diferentes velocidades. Quanto mais negativa a molcula, mais rapidamente se movimenta do plo negativo para o plo positivo. Outro factor que afecta a velocidade das molculas o seu tamanho e a sua forma. Como as molculas se movem atravs dos poros do gel, as mais pequenas deslocamse mais rapidamente. Ao fim de um certo perodo de tempo, molculas ou fragmentos de molculas de diferentes tamanhos, de diferentes formas ou com diferente carga elctrica encontrarseo em zonas diferentes do gel.
Figura 8 Corrida electrofortica e colorao dos fragmentos do DNA

1.3.6. Localizao dos fragmentos de DNA A localizao dos fragmentos de DNA pode ser atravs da utilizao de um corante (Azure A) ou atravs de radiao ultravioleta.

2. MATERIAIS /SOLUES

MATERIAL Banho termostatizado Caneta Cartolina preta Cronmetro Frasco de Erlenmeyer Gerador e cabos elctricos Micropipetas Parafilme Placa elctrica para aquecimento Provetas graduadas Temporizador Termmetro Tina de electroforese Tinas de Vidro

SOLUOES Agarose gua destilada Azul-de-bromofenol DNA lambda liofilizado Enzimas de Restrio (EcoRI, BamHI, HindIII) Soluo tampo TBE

3. PROCESSOS A UTILIZAR (ACES) Hidratao do DNA / Digesto do DNA (Utilizao de enzimas de restrio) / Preparao do gel de electroforese/ Preparao da soluo-tampo / Colocar o gel na tina de electroforese / Criar os poos no gel / Colocar a soluo tampo / Criar um campo elctrico / Carregar o gel / Corar as bandas de DNA

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1. Rehidratao do DNA liofilizado a adicionar 100 L de gua destilada ao tubo com DNA lambda (tubo branco) b fechar o tubo e aguardar 5 minutos
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c Com o tubo bem fechado, segurar o topo e, com o indicador da outra mo, bater no tubo durante 1 minuto para misturar bem o seu contedo. d Repousa o tubo e esperar mais cinco minutos. A soluo de DNA dever apresentar-se ligeiramente opaca. e Aquando da recolha de amostras desta soluo, fazer subir e descer um pouco o mbolo para agitar o contedo na ponta da micropipeta

fundamental que o DNA esteja completamente dissolvido em gua

4.2. Digesto do DNA com as endonucleases de restrio a Colocar uma ponta nova na micropipeta. Colocar 20 L da soluo de DNA lambda no tubo enzimtico escolhido Misturar bem o contedo do tubo com a ajuda da micropipeta (aspirando e expelindo)

b Repetir o procedimento para os restantes tubos com enzimas e para o tubo controlo (vazio), usando sempre uma ponta nova em cada caso c fechar os tubos com a tampa respectiva e incub-los a 37C durante 30 a 45 minutos

4.3. Preparao do Gel de Agarose a Preparar a soluo-tampo TBE. Usar uma placa de aquecimento e uma tina com gua (fervente) para derreter a agarose (0,8% em soluo-tampo TBE) num frasco de Erlenmeyer. Assegurar que no ficam quaisquer fibras na agarose derretida. Selar o frasco com pelcula aderente e deixa-lo em banho-maria a 55-60C b Colocar a tina de electroforese sobre um quadrado de cartolina preta, numa superfcie perfeitamente nivelada. Posicionar o pente de 4 ou 6 dentes numa das extremidades da tina. c Depositar na cavidade central da tina 10 a 12 mL de agarose, de modo a cobrir os dentes do pente d Deixar o gel em repouso at ficar duro e opaco. e Cortar dois pedaos de fibra de carbono, cada com aproximadamente 4,2 x 2,2 cm

4.4. Carregamento do Gel a Vazar no tanque a soluo TBE at cobrir totalmente a agarose (1 2 mm acima da superfcie do gel) e preencher os espaos onde ficaro os elctrodos b Muito cuidadosamente, retirar o pente do gel. Procure NO DANIFICAR os poos. c Depois de por uma ponta nova na micropipeta, adicionar 2 L de corante (azul de bromofenol) ao tubo com a amostra que se pretende carregar. Misture bem com a ajuda da micropipeta. d Pipetar o contedo do tubo para o poo seleccionado, segurando na ponta da seringa acima do poo mas dentro da soluo. Tomar cuidado para no danificar o poo. e Escrever na tina, com uma caneta apropriada, a indicao da amostra colocada f Repetir os passos c a e para os outros tubos; trocar sempre as pontas das micropipetas.

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4.5. Corrida Electrofortica a Colocar os elctrodos nas extremidades da tina Verificar se a soluo-tampo cotacta (molha) os elctrodos

b Ligar os elctrodos s baterias usando os fios com os clips-crocodilo, de modo a que o plo negativo fique perto dos poos. A voltagem no deve exceder os 45 V. c Colocar a tampa sobre a tina (para minimizar a evaporao). Deixar o aparato em descanso durante 10 horas (dependendo da voltagem utilizada). d desligar os elctrodos das baterias assim que o corante azul atingir o fim do gel. e remover os elctrodos e passar os clips-crocodilo por gua destilada; sec-los bem para evitar a respectiva corroso.

4.6. Colorao dos fragmentos de DNA (bandas de DNA) a Com a ajuda de um seringa de 5 mL, remover a soluo tampo da tina b Envergar luvas de borracha e colocar depois cerca de 5 mL da soluo de Azure A sobre o gel. Aguardar exactamente 4 minutos c Remover o corante. Lavar a superfcie do gel com cerca de 5 mL de etanol a 70%, retirar o lcool e enxaguar cuidadosamente o gel 3 a 4 vezes com gua destilada d O corante que permanecer no gel ir corar as bandas de DNA, o que dever acontecer ao fim de 10-15 minutos (alcanam-se melhores resultados se o gel for deixado em repouso durante a noite)

5. RECOLHA DE DADOS 5.1. O primeiro passo para a anlise dos resultados medir a distncia percorrida por cada um dos fragmentos durante a eletroforese. Assim, com uma rgua, deve medir a distncia entre o poo e cada uma das bandas. 5.2. Registe todos os valores de distncia de migrao, na seguinte tabela:

Bandas

DNA Lambda Distancia pb estimado

B Distancia pb estimado

E Distancia pb estimado

H Distancia Pb Padrao 23,130 9,416 6,557 4,361 2,322 2,027 0,564 0,125

1 2 3 4 5 6 7 8
B = PstI (Digesto do DNA lambda) E = EcoRI (Digesto do DNA lambda) H = HindIII (Digesto do DNA lambda)

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5.3. A anlise dos resultados efetuada, comparando o tamanho dos fragmentos obtidos com o tamanho dos fragmentos do padro. 5.4. Construa uma recta de calibrao com os dados referentes ao padro de pesos moleculares (bandas obtidas da digesto do DNA com HindIII), utilizando papel semi-logartmico.

~ 5.5. Estime o tamanho das bandas geradas pelas as enzimas de restrio EcoRI e BamHI, com base na recta de calibrao obtida (com os fragmentos produzidos com HindIII).

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6. REGRAS DE SEGURANA/RISCOS ASSOCIADOS UTILIZAO DE MATERIAIS/REAGENTES

Fase do Procedimento Experimental

Smbolo de Perigo

Riscos

Sinais de Obrigao

1. Socorros

Escaldaduras - Arrefecer a zona com um jacto de gua fria 4.3. Preparao do Gel de Agarose Perigo Zonas Quentes A agarose fundida pode prococar escaldaduras (queimadura feita por um lquido muito quente). Queimaduras - colocar a zona queimada num - No rebentar as bolhas formadas

jacto de gua fria 4.5. Corrida electrofortica Perigo de Electrocusso Corre-se o risco de queimadura elctrica corrente ao usar a voltagem Usar Electrocusso - Afastar o fio ou condutor elctrico com um material no condutor bem seco, da vitima - Monitorizar os sinais 4.6. Colorao dos fragmentos de DNA Substncias Nocivas e Irritantes A soluo de Azure A pode irritar as mucosas e a pele. Evitar o contacto com a pele e os olhos. (ventilao frequncia cardiaca) - Efectuar Arrefecer as vitais e ou gua imersa em

(220

volts).

equipamento elctrico de baixa voltagem ( 36 volts). 4.6. Colorao dos fragmentos de DNA Substncias Inflamveis A soluo de Azure A inflamvel. Deve-se afast-la da chama.

queimaduras

7. FONTES E REFERNCIAS

http://www.cgomes.uac.pt/TE/Estagio/2003/AQ2/Nfqn2/AosAlu/MApoio_ficheiros/RSegLab.pdf http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/lambda.html http://www.oportalsaude.com/manualsos/primeiros-socorros_0808.pdf

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