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Alim. Nutr., Araraquara v.16, n.3, p. 285-292, jul./set.

2005

ISSN 0103-4235

EFEITOS DO pH, SAL E DESNATURANTES NA HIDRLISE IN VITRO DA GLOBULINA PRINCIPAL DE GRO-DE-BICO (Cicer arietinum L.), var. IAC-Marrocos*
Valdir Augusto NEVES** RESUMO: As leguminosas caracterizam-se por apresentar alto teor protico que na sua grande totalidade so globulinas de reserva,e cujas caractersticas moleculares influenciam algumas de suas propriedades com destaque para sua hidrlise frente s enzimas digestivas. As fraes 7 e 11S, apesar de certa homologia estrutural, surgem como determinantes das propriedades nutritivas e funcionais das globulinas. Nesse trabalho a globulina principal de gro-de-bico (tipo legumina, 11S) foi isolada e purificada, verificando-se o efeito da exposio a diferentes fatores na hidrlise in vitro com as enzimas tripsina e quimotripsina. Comparada casena, a globulina principal na forma nativa, e na presena de NaCl 0,3 M, mostrou-se menos susceptvel hidrlise pelas enzimas. A exposio a pHs cidos extremos revela a retirada desse efeito protetor observado com o sal. As maiores alteraes ocorreram pela exposio ao pH 1,0, temperatura de 121C/15 min e presena de NaCl, no entanto ainda inferiores aos obtidos com a casena e para ambas enzimas. O tratamento alcalino apesar de aumentar a susceptibilidade s enzimas mostrou valores de hidrlise inferiores casena. A exposio a diferentes concentraes dos desnaturantes uria e hidrocloreto de guanidnio revelou que apenas o segundo teve pequeno efeito sobre a hidrlise pelas enzimas e, mesmo assim, em concentrao to alta como 8M. PALAVRAS-CHAVE: Gro-de-bico; Cicer arietinum L; globulina principal; hidrlise in vitro. total6. A globulina do tipo legumina (11S) compreende a maior frao no gro-de-bico e a tipo vicilina (7S) cerca de 30% do total das protenas de reserva6,7,16,37. Uma srie de trabalhos indica que as protenas de origem vegetal so menos susceptveis ao das enzimas proteolticas que as de origem animal, no entanto o baixo contedo de aminocidos sulfurados, a estrutura compacta da sua protena majoritria e a presena de fatores antifisiolgicos de natureza protica e no, tm sido apontados como fatores responsveis pelo baixo valor nutritivo4,13,33,34. Nesse aspecto, uma srie de evidncias tem demonstrado que a digestibilidade das globulinas nativas limitada pela estrutura compacta e a conformao estrutural dessa frao1,4,5,10,25,26,2932. Estudos qumicos e bioqumicos das sementes de gro-de-bico, disponveis na literatura, esto relacionados mais com seu contedo protico total no que diz respeito a composio de aminocidos, qualidade nutricional, alm de composio de carboidratos e mineral. No entanto, dados sobre suas fraes proticas so bem limitados3,5,6,7,16,27,33,37. Carbonaro et al.5 mostraram que a digestibilidade protica in vitro de feijo comum aumentada aps aquecimento, entretanto a de lentilha no sofria alterao enquanto de feijo fava diminuda. Estudos da digestibilidade in vivo confirmaram estas observaes in vitro demonstrando que as propriedades estruturais das protenas de reserva, 7 e 11S, poderiam representar importantes fatores limitantes da digesto protica enquanto os efeitos do aquecimento na conformao estrutural das protenas so ainda muito conflitantes5,10,11,25,26,33. Estudos recentes levados com protenas de tremoo, feijo fava, soja e gro-de-bico concluram que as razes principais para o baixo valor nutricional dessas farinhas de leguminosas estariam relacionados, de alguma forma desconhecida, estrutura qumica de sua frao globulina e aos efeitos adversos dessas protenas ou seus produtos de digesto mais do que a presena de fatores antinutricionais4,33,34. As condies de tratamento e do meio podem representar importante fator na estabilidade estrutural dessas protenas. Nesse sentido, as caractersticas de associaodissociao das globulinas de leguminosas em funo de variadas condies pode revelar informaes importantes sobre aspectos da conformao estrutural das molculas em soluo. O efeito de pH, fora ionica e temperatura,

Introduo As proteinas de leguminosas apresentam uma natureza complexa sendo majoritariamente constitudas de globulinas de reserva com a caracterstica de serem solveis em sal 5,8,35. Essa frao apresenta dois componentes principais com coeficientes de sedimentao em ultracentrfuga de 7S e 11S, cuja proporo varia de espcie para espcie8,24,40. O gro-de-bico em comum com outras sementes de leguminosas contm relativamente alta concentrao de globulinas e prvios estudos tm indicado que essa frao representa cerca de 60% de sua protena
*

Trabalho elaborado com o auxlio financeiro do Programa de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico da Faculdade de Cincias Farmacuticas da UNESP e da FAPESP. ** Departamento de Alimentos e Nutrio - Faculdade de Cincias Farmacuticas - UNESP -14801-902 - Araraquara SP Brasil.

286 separados e em conjunto, podem influenciar de diferentes formas o comportamento das protenas quanto aos aspectos dependentes de sua estrutura e conformao, tais como a hidrlise enzimtica e suas propriedades funcionais11,18,19,20,21,22,32. Enquanto tais caractersticas das globulinas tem sido estudadas em algumas leguminosas, tais como: feijo10, soja15,22, ervilha18,19 e lentilha26,27, os registros sobre a frao globulina de gro-de-bico so escassos. Nesse sentido a proposta desse trabalho foi estudar os efeitos de pH, fora ionica, temperatura e desnaturantes qumicos na estrutura e os reflexos na hidrlise in vitro da globulina majoritria (tipo legumina, 11S) isolada de gro-de-bico. volumes de soluo de enzima e estabelecida uma proporo enzima:substrato de 1:10. Para cada ensaio foram preparadas, em triplicata, solues de enzima-substrato, substrato sem enzima e soluo de enzima (controle), em tampo fosfato de potssio 20 mM pH 7,8, seguido de incubao em banho-maria a 37oC/60 minutos em tubos individuais selados com parafilme. A cada tempo, os tubos selados eram retirados do banho, diludos dez vezes seu volume com tampo, seguido de armazenamento em banho de gelo e imediata determinao da extenso de hidrlise. Para efeito de comparao soluo de casena, nas mesmas condies citadas para as amostras, foi utilizada como padro de referncia no clculo da extenso de hidrlise. A hidrlise (grau/extenso) foi acompanhada pelo doseamento do nitrognio -amino com cido trinitrobenzenosulfonico (TNBS), de acordo com o mtodo de Fields14, conforme modificao realizada por Spadaro et al.38. As absorvncias registradas (420 nm) com as amostras de enzima e substrato no tempo zero de incubao (incio) foram subtradas dos valores obtidos para as amostras nos diferentes tempos de incubao. Para o clculo da percentagem de hidrlise (Nn/ Nt 100) foi utilizado o coeficiente de absortividade molar de 16500 para os -trinitrofenil-derivados, e 113 g/Mol como peso molecular mdio dos resduos de aminocidos nas protenas. Os clculos foram expressos para o tempo de 120 minutos de hidrlise. Nos ensaios de hidrlise foi verificado o efeito na protelise, considerando-se os seguintes tratamentos: Efeito da temperatura, pH e fora inica na hidrlise enzimtica da globulina A globulina isolada-liofilizada foi dissolvida em tampo fosfato de potssio 20 mM, pH 7,8 (4,0 mg/mL), e tampo fosfato de potssio 10 mM, pH 7,8, contendo 0,3 M de NaCl (4,0 mg/mL). Os pHs das solues ajustados ao pH 1,0 e 5,0, com adio de HCl 2N, e a pH 9,0 com adio de NaOH 2N, e feita incubao temperatura de 4oC por 15 min. Aps incubao, o pH e concentrao de protenas foram ajustados para a hidrlise com as enzimas tripsina (pH 7,8) e quimotripsina (pH 7,8). Para determinao do efeito de pH e temperatura, solues de protena foram preparadas conforme descrito, aquecidas separadamente, s temperaturas de 121,1oC e em banho-maria fervente por perodo de 15 minutos, seguido de resfriamento, ajuste de pH e concentrao de protena para as hidrlises com as enzimas. Para todos ensaios de hidrlise na presena e ausncia de NaCl; a protena, nativa (no aquecida) ou aquecida, e nos diferentes pHs foi utilizada a relao enzima:substrato de 1:10. Efeito de tratamento alcalino na hidrlise enzimtica da globulina A globulina isolada-liofilizada foi dissolvida em NaOH 0,02 N, sem ajuste de pH, incubada temperatura de 35oC/2 hs e dialisada, extensamente (12 hs), contra

Material e mtodos Material As sementes de gro-de-bico, var. Marrocos, foram obtidas junto seo de leguminosas do IAC-Instituto Agrnomico de Campinas. As sementes, aps seleo, foram limpas de sujidades, embebidas em gua destilada (18h/ 4oC), feita remoo do tegumento (manualmente) e secas temperatura de 40oC com circulao de ar. Os cotildones secos foram modos em moinho de bolas e tamisados at passagem em malha de 60 mesh. O material foi desengordurado com hexano temperatura ambiente, utilizando-se uma relao massa x volume de 1:8, seguido de agitao por perodo de 4 horas, filtrao e secagem temperatura ambiente. Esta farinha de cotildones desengordurada foi utilizada para extrao de protenas.

Mtodos Extrao, isolamento e purificao da globulina principal Globulina principal do gro-de-bico (Cicer arietinum L.), cultivar IAC-Marrocos, foi isolada e purificada em coluna de Sepharose CL-6B, conforme procedimento descrito por Ganesh Kumar & Venkataraman16 e Neves et al.28. Determinao de protenas Protenas foram determinadas pelo mtodo de Lowry et al.23 e por medida de absorvncia a 280nm na eluio cromatogrfica e por determinao de nitrognio total2. Hidrlise enzimtica in vitro A globulina principal isolada, seguido de separao cromatogrfica em gel de Sepharose CL-6B, foi submetida hidrlise enzimtica in vitro com as enzimas tripsina e quimotripsina, separadamente. As solues de protenas foram preparadas em tampo fosfato de potssio 20 mM, pH 7,8, em concentraes de 1-3 mg/mL. Alquotas foram tomadas, contendo 0,5-1,0 mg de protena, e adicionado

287 tampo fosfato de potssio 50 mM, pH 7,8. O teor de protenas foi determinado, aps dilise (5,8 mg/mL de protena), e a concentrao ajustada (1,0 mg/mL) para os ensaios de hidrlise com as enzimas tripsina e quimotripsina, conforme descrito para os ensaios de efeito de pH. A relao enzima:substrato utilizada foi 1:10. Efeito do tratamento com desnaturantes na hidrlise enzimtica da globulina Efeito do tratamento com uria e hidrocloreto de guanidnio Solues da globulina principal isolada-liofilizada foram preparadas em tampo fosfato de potssio 50 mM, pH 7,8, seguido de adio de uria e/ou guanidinio-HCl s concentraes de 0, 2, 4, 6 e 8 M, separadamente. As solues foram incubadas a 37oC/1 h, e aps incubao, o desnaturante foi removido por dilise extensa contra o tampo. O pH e a concentrao protica foram ajustados, e ento submetido hidrlise, conforme descrito para os ensaios de pH. Determinao de acares O contedo de acares na globulina principal antes e aps tratamento alcalino foi determinado por mtodo colorimtrico segundo Dubois et al.12, utilizando-se uma curva padro de glicose. Resultados e discusso O teor de protena no gro-de-bico varia entre 12,6 e 30,5%6. A cultivar IAC-Marrocos apresentou teor protico de 23,99%, lipdeos 8,6%, fibra bruta 1,05% e cinzas 2,73% situando-se prximo aos valores registrados para variedades cultivadas em diferentes localidades 3,37. A globulina principal representou 20,93% da protena total da farinha correspondendo a 50% da globulina total. Submetida eletroforese em gel de poliacrilamida apresentou uma nica banda protica. Seu peso molecular foi estimado em 325 kDa em coluna de Sephadex G-200 e o teor de carboidratos calculado em 0,90%37. O peso molecular da frao legumina em diferentes leguminosas situa-se neste intervalo: 350 kDa para Vicia faba, 360 kDa para Pisum sativum, 340 kDa para Phaseolus vulgaris, 330 kDa para Phaseolus aureus8 e 375 kDa para Lens culinaris26. Hidrlise enzimtica in vitro da frao globulina O fato da digestibilidade das protenas de leguminosas estar associado, entre outros fatores, a caractersticas estruturais de sua protena majoritria, a globulina, motivou o enfoque nestes aspectos estruturais aliado a ausncia de dados na literatura10,11,29,30. Em trabalho recente verificamos que o efeito de NaCl 0,30M na hidrlise trptica e quimotrptica da globulina principal de gro-debico acarretava em reduo da susceptibilidade hidrlise de sua forma nativa, em maior grau, e das aquecidas, em menor. Muito embora os valores absolutos obtidos na hidrlise da protena aquecida, na ausncia e presena de NaCl, no se diferenciem, os percentuais em relao casena so reduzidos28. Os resultados indicaram que o efeito do aquecimento; banho-maria fervente e 121,1 oC/15 minutos, no foram suficientes para elevar a hidrlise da protena aos nveis obtidos com a casena. Diferentes estudos mostram o efeito da fora inica no processo de associao-dissociao das fraes 11S e 7S de leguminosas, e embora grande parte dos trabalhos tenham se concentrado na frao 7S (feijo, ervilha, soja), esses indicam um comportamento dependente das caractersticas estruturais de cada protena. Gueguen18, Gueguen et al.19 e Koshiyama22 observaram sensveis alteraes da frao 11S de ervilha e de soja, respectivamente, em funo do pH e fora inica. O aumento da concentrao salina a pH neutro e/ou levemente alcalino acarretou em maior estabilidade conformacional das globulinas; caracterizado pelo maior empacotamento da estrutura e com reflexos na susceptibilidade proteoltica9,28,30,36. Efeito de pH, temperatura e fora inica na hidrlise pelas enzimas O efeito de pH e fora inica na hidrlise da globulina principal nativa de gro-de-bico pela tripsina e quimotripsina pode ser verificado na Tabela 1. Na ausncia de sal, observa-se aumento na hidrlise trptica para pH 1,0 e reduo para os pHS 9,0 e 5,0, enquanto, praticamente, no houve alterao com a quimotripsina. A globulina nativa, na presena de 0,3 M de NaCl, sofreu reduo de sua protelise com as enzimas e observou-se um efeito estabilizador na estrutura da protena ao pH 7,8; por outro lado o aumento da fora inica acarretou em maior hidrlise pelo efeito da incubao nos diferentes pHs, em especial ao pH 1 e para ambas enzimas. Mesmo assim esses valores foram inferiores aqueles obtidos na ausncia de NaCl. Essa resistncia da frao legumina ao ataque enzimtico na presena, e sua hidrlise na ausncia de NaCl, tem se mostrado uma caracterstica dessa frao protica verificado em ervilha31 e soja22. Plumb et al.31 explicam a resistncia da legumina T de ervilha tripsinlise pela influncia das ligaes hidrofbicas dado o conhecido efeito do aumento da concentrao de sal na promoo dessas interaes na molcula, com a legumina adquirindo uma estrutura mais compacta em meios com alta fora inica o que reduz os stios de ataque pelas enzimas. Os resultados obtidos com a globulina de gro-de-bico so coerentes com o observado para protena de outras espcies de leguminosas onde uma correlao entre flexibilidade estrutural e susceptibilidade proteoltica tem sido revelado20. Na Tabela 2 podemos observar o efeito de NaCl 0,3M e diferentes pHs na hidrlise da protena aquecida em banhomaria fervente. O aquecimento seguido de incubao aos pHs 5 e 9

288 Tabela 1- Hidrlise in vitro da globulina principal de gro-de-bico na forma nativa* frente tripsina e quimotripsina. HIDRLISE (%)** ENZIMA pH 1 5 9 Sem tratamento TRIPSINA Ausncia de sal 73,4 2,6 77,3 0,6 64,8 1,3 63,1 1,2

NaCl 0,3 M QUIMOTRIPSINA Ausncia de sal NaCl 0,3 M

48,7 0,7 79,5 1,4 52,8 0,9

67,8 1,1 76,2 1,3 74,1 2,1

56,3 0,9 76,9 2,0 54,6 0,4

53,8 0,8 76,0 1,3 56,6 2,3

*Conforme descrito na metodologia. Valores representando a mdia de ensaios em triplicata **em relao casena (100%).

Tabela 2 - Hidrlise in vitro da globulina principal de gro-de-bico aquecida*frente tripsina e quimotripsina.

ENZIMA Sem tratamento TRIPSINA Ausncia de sal NaCl 0,3 M QUIMOTRIPSINA Ausncia de sal NaCl 0,3 M 81,6 0,6 74,2 1,6 84,2 0,9 52,7 1,6

HIDRLISE (%)** pH 1 5

82,6 1,3 84,5 2,1 75,0 1,8 73,0 2,5

61,9 1,4 65,6 1,9 74,4 1,7 69,9 2,4

65,3 2,3 69,3 1,2 75,3 1,9 75,6 1,8

**Conforme descrito na metodologia. Banho-maria fervente/15 min.. Valores representando a mdia de ensaios em triplicata. **em relao casena (100%).

no alterou a hidrlise da globulina com a tripsina na ausncia de sal, contrrio ao observado para o pH 1,0. Na presena de NaCl 0,3M, embora sem efeito em relao sua ausncia, mostra sensvel melhora na hidrlise em relao protena nativa sob mesma condio e para todas as situaes em estudo. A protena sem tratamento ao pH foi mais hidrolisada pela tripsina, quando aquecida em banho-maria/15 min do que a forma nativa, independente da fora inica (Tabelas 1 e 2). Apesar da somatria de efeitos de pH, temperatura e fora inica acarretar em maior hidrlise da globulina pela tripsina, em nenhum caso esses percentuais de hidrlise alcanaram aqueles obtidos com a casena. Independente da presena de NaCl a globulina no sofreu aumento significativo na hidrlise com a quimotripsina aps aquecimento em banho-maria fervente/ 15 min, exceto nos pHs 5 e 9 em que o sal exerce efeito protetor na forma nativa, com uma pequena reduo de 10% e contrrio ao observado para a tripsina (Tabelas 1 e 2). Pode ser verificado na Tabela 3 que o aquecimento a 121oC/ 15 min. provoca sensvel aumento de hidrlise pelas enzimas, independente de pH ou fora inica. Essa observao sugere que o aquecimento retira o efeito estabilizante do sal na estrutura conformacional da globulina

de gro-de-bico. Embora o efeito dos pHs (1,0; 5,0 e 9,0) tenha provocado alteraes na globulina majoritria e com reflexos distintos na hidrlise com as enzimas, como funo de aumento de temperatura e fora inica, as maiores alteraes observadas ocorreram pela ao do pH 1,0; temperatura de 121oC/15 min e presena de NaCl, alcanando percentuais de hidrlise at 32% e 16,5% superiores aos obtidos com a protena nativa e ausncia de sal, para as enzimas tripsina e quimotripsina, respectivamente, porm ainda inferiores casena nativa. Dados sobre a organizao estrutural de protenas 11S de diferentes espcies de leguminosas tm demonstrado alta homologia8,29,30,39,40. No entanto, e apesar desse fato, as leguminas (11S) podem responder de forma diferente fora inica na regio de pH no-desnaturante, o que se observou com a protena 11S de ervilha em relao glicinina da soja19. As alteraes conformacionais das protenas 11S de diferentes leguminosas a pHs na faixa cida revelam que a protena experimenta dissociao, seguido de abertura das cadeias polipeptdicas 8,19,22,39. Apesar de constatada a ausncia desses estudos de associao-dissociao em funo de pH e fora inica na estrutura da globulina majoritria

289 Tabela 3 - Hidrlise in vitro da globulina principal de gro-de-bico aquecida* frente tripsina e quimotripsina.

ENZIMA Sem tratamento TRIPSINA Ausncia de sal NaCl 0,3 M QUIMOTRIPSINA Ausncia de sal NaCl 0,3 M 90,0 1,2 84,1 2,1 84,3 1,8 77,2 0,8

HIDRLISE (%)** pH 5 1

81,2 0,6 98,5 2,3 64,4 0,8 89,2 0,5

85,3 1,4 81,0 1,9 80,8 1,4 71,9 0,9

81,8 1,3 82,5 2,4 83,1 1,1 75,4 0,6

*Conforme descrito na metodologia. 121C/15 min.. Valores representando a mdia de ensaios em triplicata. **em relao casena (100%).

de gro-de-bico, os resultados obtidos do reflexo destas variveis na estrutura de outras protenas 11S parecem seguir comportamento semelhante, como observado por Grinberg et al17. Os resultados obtidos da hidrlise da globulina principal nativa de gro-de-bico, aps tratamento nos diferentes pHs e fora inica de 0,3 M, reforam esta observao, pois o aumento da ltima associado ao do pH acima de pH 5,0, traduz-se em menores percentuais de hidrlise tanto para tripsina quanto quimotripsina. Efeito do tratamento alcalino A globulina principal tratada com NaOH 0,02 N sofreu maior hidrlise que sua forma nativa, com todas as enzimas estudadas como podemos observar nas Figuras 1 e 2, no entanto estes valores mostraram-se ainda inferiores (80 %) hidrlise obtida com a casena nativa. O maior percentual de aumento foi observado com a quimotripsina (12 %) em relao tripsina (9 %). A percentagem de hidrlise obtida ps-tratamento alcalino foi semelhante ao aquecimento (banho-maria e 121oC/15 min), no caso da tripsina, e superior (18 %) para a quimotripsina. A despeito da similaridade estrutural entre as protenas 7S e 11S, Ahn et al.1 observaram um aumento de hidrlise da faseolina aps tratamento alcalino com NaOH 0,02 N/35oC/2 hs, com as enzimas tripsina, quimotripsina e pepsina. A faseolina ps-tratamento mostrou-se mais hidrofbica que a nativa e o espectro diferencial de UV revelou uma estrutura protica ao acaso; evidenciando a desestabilizao da estrutura terciria, conforme observado por Fukushima15 com a protena da soja. Efeito do tratamento com desnaturantes na hidrlise O tratamento com uria praticamente no alterou a extenso de hidrlise da globulina de gro-de-bico nativa com a tripsina, como pode ser visto na Figura 1, inclusive com valores de hidrlise inferiores aos observados aps aquecimento e tratamento alcalino. Situao semelhante ocorreu sob ao da quimotripsina aps tratamento, nesse caso somente concentrao de 8,0 M foi registrada alterao na extenso

% HIDRLISE (Nn/Nt 100)

100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8
URIA GUA NIDNIO

TRATAMENTO

FIGURA 1 - Efeito do tratamento com uria e guanidnioHCl na hidrlise in vitro da globulina principal de gro-de-bico pela tripsina. Proporo enzima:substrato, 1:10. Incubao da globulina com uria/guanidina-HCl 0, 2, 4, 6, e 8 M (1 a 5), pH 8,0; 35C/1 h e dilise, (6) banho-maria fervente /15 min., (7) autoclavado 121C/15 min., (8) tratamento alcalino. Reao: 60 min/37C. Expresso em % em relao casena. Ensaios e clculos descritos em Material e Mtodos. de hidrlise (11% aumento), com valores superiores ao aquecimento e iguais ao tratamento alcalino (Figura 2). Os resultados sugerem que alteraes conformacionais semelhantes ocorreriam nestas condies. Os resultados indicam que mesmo a concentrao de 4,0M, a uria no alterou a conformao estrutural da globulina o suficiente para afetar sua hidrlise com as enzimas, no entanto concentrao de 8,0M a pepsina foi mais eficiente na hidrlise em relao protena nativa (dados no mostrados). Resultados semelhantes foram obtidos com a faseolina do feijo1. Esses resultados sugerem que a retirada do desnaturante acarreta numa reorganizao estrutural da molcula protica, no chegando a afetar a ao das enzimas pancreticas, semelhana do observado com a forma nativa. Para a quimotripsina no houve alterao no percentual de hidrlise da globulina com aumento da concentrao de guanidnio-HCl, e os valores obtidos

290
100
% HIDRLISE (Nn/Nt 100)

80 60 40 20 0

URIA GUANIDNIO

TRATAMENTO

FIGURA 2 - Efeito do tratamento com uria e guanidinaHCl na hidrlise in vitro da globulina principal de grode-bico pela quimotripsina. Proporo enzima:substrato, 1:10. Incubao da globulina com uria/guanidnio-HCl 0, 2, 4, 6, e 8 M (1 a 5), pH 8,0; 35oC/1h e dilise; (6) banho-maria fervente /15 min., (7) autoclavado 121C/ 15 min., (8) tratamento alcalino. Reao: 60 min/37oC. Expresso em % em relao casena. Ensaios e clculos descritos em Material e Mtodos. assemelham-se aqueles registrados na digesto da protena nativa na ausncia de sal (Tabela 2). A concentrao de 8,0M de guanidnio provocou leve reduo nas hidrlises, coincidente com a queda na quantidade de protena que penetra no gel na eletroforese em gel de poliacrilamida (dados no mostrados). Foi observado que quanto maior a concentrao do desnaturante maior era a frao insolubilizada. As alteraes estruturais ocorridas pela exposio da globulina principal guanidnio-HCl parecem ter envolvido extensivo rompimento da estrutura das cadeias polipeptdicas, aps a retirada do desnaturante por dilise, o que poderia ter acarretado em formao de complexos insolveis com conseqente agregao, conforme observado em todas as concentraes de desnaturante. Os valores de percentual de hidrlise sugerem que esses agregados afetaram em maior grau a digesto pela tripsina, que apresentaram percentuais de hidrlise pouco inferiores aqueles da protena nativa e ausncia de sal (Tabelas 1, 2). Contrrio ao observado com a globulina principal de gro-de-bico, a frao 7S do feijo1 apresentou hidrlise aumentada com as enzimas, aps tratamento com guanidnio-HCl acima de 5M. A facilidade do rompimento da estrutura molecular das protenas 11S de leguminosas indica, segundo Derbyshire et al. 8 , que as ligaes intercadeias so de natureza no-covalente, ou seja pontes de hidrognio. Este fato relevante no caso da globulina de gro-de-bico, j que a protena apresentou somente trs pontes dissulfeto aps tratamento com 2-mercaptoetanol e 8,0 M de uria16.

na sua forma nativa quando comparado casena, mesmo quando submetida a certas condies que afetam sua estrutura nativa, tais como: pH, temperatura, aumento de fora ionica, tratamento alcalino e desnaturantes qumicos. A presena de NaCl 0,3 M estabilizou sua conformao nativa refletindo-se em menor susceptibilidade ao das enzimas. Os resultados sugerem que a exposio da globulina principal a pHs cidos extremos retira o efeito protetor do NaCl na estrutura conformacional da protena, como demonstrado pelos valores absolutos semelhantes obtidos na sua hidrlise, na ausncia e presena do sal. O tratamento alcalino (NaOH 0,02N) aumentou a ao proteoltica independente da enzima utilizada e da presena de carboidratos na molcula. A exposio da globulina aos desnaturantes uria e guanidnio-HCl no afetou significativamente sua susceptibilidade hidrlise pelas enzimas utilizadas. Na presena de guanidnio-HCl 8,0M, os dados sugerem que desnaturao seguiu-se uma agregao das cadeias desnaturadas formando complexos insolveis de digestibilidade levemente inferior. Agradecimentos O autor agradece Maraiza Aparecida da Silva, mestre em Cincia de Alimentos do Departamento de Alimentos e Nutrio FCF-UNESP. NEVES, V. A. Effects of pH, salt and denaturants on the in vitro hydrolysis of the principal globulin from chickpea (Cicer arietinum L.), var. IAC-Marrocos. Alim. Nutr., Araraquara, v.16, n.3, p. 285-292, jul./set. 2005. ABSTRACT: Leguminous seeds are characterized by a high protein content of mostly storage globulins. The molecular characteristics of these proteins determine their properties particularly to the hydrolysis by digestive enzymes. The 7S and 11S fractions, despite their structural homology, appear as determinants of the nutritive and functional properties of the globulins. In this work the principal globulin from chickpea, IACMarrocos (legumin type, 11S) was isolated, purified and different factors on the in vitro hydrolysis with trypsin and chymotrypsin verified. Compared to casein the principal globulin in the native form and in the presence of 0.3M NaCl showed to be less susceptible to the hydrolysis by the enzymes. Exposure to extreme acid pHs removed the protecting effect of the salt. The high alterations occurred by the exposition to the pH 1.0, temperature of 121C/15 min and presence of NaCl, however the hydrolysis was still lower than that obtained with casein and for both enzymes. The alkaline treatment also showed values lower than for casein, although increasing the susceptibility to hydrolysis by the enzymes. Exposure to the denaturants urea and guanidine-HCL revealed that only the latter had a little effect on the enzyme hydrolysis and yet at concentrations as high as 8M.

Concluses A globulina principal apresentou resistncia hidrlise enzimtica pelas enzimas tripsina e quimotripsina

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