I.

Nomor Percobaan : VI
II. Nama Percobaan : Penentuan Kadar Protein Secara Biuret
III. Tujuan Percobaan : Untuk mengetahui kadar protein dalam suatu
sampel berdasarkan serapan cahaya melalui uji
biuret.

IV. Landasan Teori
Protein adalah salah satu biomolekul raksasa yang berperan sebagai
komponen utama penyusun makhluk hidup. Protein membawa kode-kode genetik
berupa DNA dan RNA. Beberapa makanan yang dapat menjadi sumber protein
adalah: daging, telur, ikan, susu, biji-bijian, kentang, kacang, dan polong-
polongan. Protein merupakan polimer alam yang tersusun dari asam-asam aminomelaluiikatan
peptida, sehingga protein juga disebut sebagai polipeptida.Di dalam tubuh kitaprotein berfungsi
sebagai zat pembangun, pengatur pertahanan, dan sebagai sumber energi setelah karbohidrat dan
lemak.Protein dapat digolongkan berdasarkanstrukturnya, bentuknya, dan fungsinya.
Protein Menunjukkan Berbagai Fungsi Biologi
Deret asam amino dari berjenis-jenis protein memungkinkan molekul ini
menjalankan berbagai fungsi, antara lain :
1. Enzim
Protein yang paling bervariasi dan mempunyai kekhususan tinggi adalah
protein yang mempunyai aktivitas katalisa, yakni enzim. Hampir semua reaksi
kimia biomolekul organic didalam sel dikatalisa oleh enzim. Lebih dari 2000 jenis
enzim, masing-masing dapat mengkatalisa reaksi kimia yang berbeda, telah
ditemukan didalam berbagai bentuk kehidupan.
2. Protein Transport
Protein transport didalam plasma darah mengikat dan membawa molekul
atau ion spesifik dari satu organ ke organ lain. Hemoglobin pada sel darah merah
mengikat oksigen ketika darah melalui paru-paru, dan membawa oksigen ini ke
jaringan periferi. Disini oksigen dilepaskan untuk melangsungkan oksidas nutrien
yang menghasilkan energi. Plasma darah mengandung lipoprotein, yang
membawa lipid dari hati ke ogan lain. Protein tranport lain terdapat didalam
membran sel dan menyesuaikan strukturnya untuk mengikat dan membawa
glukosa, asam amino, dan nutrien lain melalui membran menuju kedalam sel.
3. Protein Nutrien dan Penyimpan
Biji berbagai tumbuhan menyimpan protein nutrien yang dibutuhkan untuk
perumbuhan embrio tanaman. Terutama, contoh yang telah dikenal adalah protein
biji dari gandum, jagung, dan beras. Ovalbumin protein utama putih telur, dan
kasein, protein utama susu merupakan contoh lain dari protein nutrien. Ferritin
jaringan hewan merupakan protein penyimpan besi.
4. Protein Kontraktil atau Motil
Beberapa protein memberikan kemampuan kepada sel dan organisme untuk
berkontraksi, mengubah bentuk atau bergerak. Aktin dan miosin adalah protein
filamen yang berfungsi didalam sistem kontraktil otot kerangka dan juga didalam
banyak sel bukan otot. Contoh lain adalah tubulin, protein pembentuk mikrotubul.
Mikrotubul merupakan komponen penting dari fagela dan silia, yang dapat
menggerakkan sel.
5. Protein Struktural
Banyak protein sebagai filamen, kabel, atau lembaran penyanggah untuk
memberikan struktur biologi kekuatan atau proteksi. Komponen utama dari urat
dan tulang rawan adalah protein serabut kolagen, yang mempunyai daya tenggang
yang amat tinggi. Hampir semua komponen kulit adalah kolagen murni.
Persendian menganmdung elastin, suatu protein struktural yang mampu meregang
ke dua dimensi. Rambut, kuku, dan bulu burung/ayam terdiri terutama dari protein
tidak larut, yang liat, keratin. Komponen utama dari serat sutra dan jaring labah-
labah adalah protein fibroin.
6. Protein Pertahanan
Banyak protein mempertahankan organism dalam melawan serangan oleh
spesies lain atau melindungi organisme tersebut dari luka. Imunoglobulin atau
antibody pada vertebrata adalah protein khusus yang dibuat oleh limposit yang
dapat mengenali dan mengendapkan atau menetralkan serangan bakteri, virus,
atau protein asing dari spesies lain. Fibrinogen dan trombin merupakan protein
penggumpal darah yang menjaga kehilangan darah jika system pembuluh terluka.
Bisa ular, toksin bakteri, dan protein tumbuhan beracun, seperti risin, juga
tampaknya berfungsi didalam pertahanan tubuh.
7. Protein Pengatur
Beberapa protein membantu mengatur aktivitas seluler atu fisiologi.
Diantara jenis ini terdapat sejumlah hormon, seperti insulin, yang mengatur
metabolisme gula, dan kekurangannya, menyebabkan penyakit diabetes, hormon
pertumbuhan dari pituitary dan hormon paratiroid, yang mengatur transport Ca
2+

dan fosfat. Protein pengatur lain, yang disebut repressor mengatur biosintesa
enzim oleh sel bakteri.
8. Protein Lain
Terdapat banyak protein lain yang fungsinya agak eksotik dan tidak mudah
diklasifikasikan. Monelin, suatu protein tanaman dari afrka mempunyai rasa yang
amat manis. Protein ini sedang dipelajari sebagai pemanis makanan yang tidak
menggemukkan dan tidak beracun, untuk manusia. Plasma darah beberapa kan
Antartika mengandung protein antibeku yang melindungi darah ikan dari
pembekuan. Persendian sayap beberapa insekta dibuat dari protein resilin, yang
bersifat sempurna elastis.

Struktur Protein
Protein merupakan polipeptida yaitu hasil dari kondensasi dua molekul
asam amino. Asam amino mengandung gugus amino (-NH
2
) dan karboksil (-
COOH). Gugus karboksil bersifat asam karena dapat melepas proton (H
+
),
sedangkan gugus amino bersifat basa karena dapat mengikat proton (H
+
)
membentuk NH
3
+
.
Oleh karena itu, asam amino bersifat amfoter. Dalam larutan asam amino
membentuk ion zwitter (bermuatan ganda).
Denaturasi Protein
Denaturasi protein merupakan perubahan struktur protein akibat pengaruh
dari perubahan suhu, perubahan pH, radiasi, deterjen, dan perubahan jenis pelarut.
Protein yang terdenaturasi hamper selalu mengalami kehilangan fungsi biologis.
Hal ini paling mudah diperlihatkan oleh sifat protein. Jika larutan protein secara
perlahan-lahan dipanaskan sampai kira-kira 60 atau 70
o
C, larutan tersebut lambat
laun akan menjadi keruh dan membentuk koagulasi berbentuk seperti tali. Produk
yang terjadi tidak akan melarut lagi dengan pendinginan dan tidak membentuk
larutan jernih seperti semula sebelum dipanaskan. Pengaruh panas terjadi pada
semua protein globular, tanpa memandang ukuran atau fungsi biologinya,
walaupun suhu yang tepat bagi fenomena ini mungkin bervariasi . Protein dalam
keadaan alamiahnya disebut protein asli (natif); setelah perubahan menjadi protein
terdenaturasi.
Denaturasi protein dapat diakibatkan bukan hanya oleh panas, tetapi juga
pH ekstrim; oleh beberapa pelarut organic seperti alcohol atau aseton; oleh zat
terlarut tertentu seperti urea; oleh detergen; atau hanya dengan pengguncangan
intensif larutan protein dan bersingungan dengan udara sehingga berbentuk busa.
Protein Homolog dari Berbagai Spesies Mengandung Deret Homolog
Protein homolog adalah protein yang menjalankan fungsi yang sama pada
berbagai spesies; contohnya hemoglobin yang berfungsi melangsungkan transport
oksigen pada berbagai jenis vertebrat. Protein homolog dari berbagai spesies
biasanya mempunyai rantai polipeptida yang identik atau hamper identik
panjangnya.
Banyak posisi di dalam deret asam amino dari protein homolog yang
ditempati oleh asam amino yang sama pada semua spesies, dan karenanya di sebut
residu tetap. Pada posisi lain, terdapat variasi asam amino yang cukup besar dari
spesies satu ke yang lain; asam amino ini disebut residu tak tetap. Serangkaian
persamaan di dalam deret asam amino pada protein homolog seperti itu disebut
homologi deret; hal ini menunjukkan bahwa hewan yang mengandung protein
homolog tersebut mungkin mempunyai asal usul yang sama, tetapi mengalami
perubahan pada saat spesies berkembang selama evolusi.
Kesimpulan yang serupa diperoleh dari hasil penelitian spesifisitas antibody
terhadap antigen dari spesies homolog.
Protein Globular
Dalam protein globular, rantai polipeptida berlipat menjadi suatu bentuk
globular yang kompak. Konformasi globular lebih kompleks dibandingkan
dengan golongan protein serat, fungsi biologinya lebih beragam, dan aktivitasnya
pun tidak statis, tetapi bersifat dinamis. Hampir semua dari 2000 atau lebih enzim
merupakan protein globular. Protein globular yang lain berfungsi di dalam
transport oksigen, sari makanan dan ion inorganic di dalam darah; beberapa
protein globular bekerja sebagai antibody, yang lain merupakan hormone dan
yang lain lagi sebagai komponen membrane dan ribosom.
Terdapat dua bukti penting yang menunjukkan bahwa rantai polipeptida
protein globular berlipat-lipat dengan erat dan bahwa konformasi yang berlipat-
lipat itu penting bagi fungsi biologinya, yaitu:
1. Bahwa protein natif mengalami denaturasi dengan pemanasan, di dalam
lingkungan pH yang ekstrim, atau dengan penambahan urea.
Jika suatu protein globular mengalami denaturasi, struktur kerangka kovalen
tetap utuh, tetapi rantai polipeptidanya membuka membentuk acak, tidak
teratur, dan mengalami perubahan konformasi dalam ruang.
2. Berlipatnya protein globular dating dari perbandingan panjang rantai
polipeptida dengan ukuran makromolekular sebenarnya seperti diperlihatkan
oleh pengukuran fisiokimia.

Pada penentuan kadar protein secara biuret ini menggunakan dasar
pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang ungu warnanya.
Pengukuran serapan cahaya tersebut dengan menggunakan metode spektroskopi.
Spektroskopi adalah studi mengenai cahaya dengan atom dan molekul. Radiasi
cahaya atau lektromagnet dapat dianggap menyerupai gelombang atau
korpuskular. Beberapa sifat fisika cahaya paling baik diterangkan dengan sifat
partikel. Jadi, cahaya dapat dikatakan bersifat ganda. Warna-warna yang nampak
dan fakta bahwa orang bisa melihat, adalah akibat-akibat absorbsi energi oleh
senyawaan organik maupun organik. Penangkapan energi matahari oleh tumbuhan
dalam proses fotosintesis adalah suatu aspek lain dari antaraksi senyawaan
organik dengan energi cahaya. Yang merupakan perhatian primer bagi ahli kimia
organik ialah fakta bahwa panjang gelombang pada mana suatu senyawaan
organik menyerap energi cahaya, bergantung pada struktur senyawaan itu. Oleh
karena itu, teknik-teknik spektroskopi dapat digunakan untuk menentukan struktur
senyawaan yang tak diketahui dan untuk mempelajari karakteristik ikatan (dari)
senyawaan yang diketahui.

Radiasi Elektromagnetik
Radiasi elektromagnetik adalah energi yang dipancarkan menembus ruang dalam
bentuk gelombang-gelombang. Energi radiasi dapat dibayangkan sebagai medan-
medan listrik dan magnet yang berosilasi (bergoyang bolak-balik secara berirama)
secara tegak lurus pada arah rambatan. Cahaya nampak merupakan salah satu dari
beberapa jenis energi radiasi. Panjang gelombang cahaya nampak berkisar antara
400 sampai 750 nm (1nm = 10
-9
m).
Semua jenis energi radiasi merambat dengan kecepatan cahaya yang sama, c,
sebesar 3,00 x 10
8
m/s, tetapi frekuensi dan panjang gelombangnya berlainan.
Frekuensi, u , didefinisikan sebagai berapa daur gelombang melewati suatu titik
dalam suatu satuan waktu.
Radiasi elektromagnetik dipancarkan dalam bentuk paket-paket energi yang
menyerupai partikel, yang disebut foton atau kuantum. Energi suatu foton
berbanding terbalik dengan panjang gelombang (secara sistematis : E =

hv
),
dengan h = tetapan Planck). Radiasi dengan panjang gelombang lebih pendek
mempunyai energi yang lebih tinggi; oleh karena itu sebuah foton cahaya
ultraviolet berenergi lebih tinggi daripada sebuah foton cahaya nampak dan jauh
lebih tinggi daripada sebuah foton gelombang radio.
Sebaliknya, energi sebuah foton suatu radiasi berbanding lurus dengan
frekuensinya. Molekul menyerap hanya radiasi elektromagnetik dengan panjang
gelombang yang khusus (spesifik untuk molekul itu). Adsorbsi cahaya ultraviolet
(radiasi berenergi tinggi) mengakibatkan pindahnya sebuah elektron ke orbital
dengan energi yang lebih tinggi. Sedangkan adsorbsi radiasi cahaya inframerah
hanya mengakibatkan membesarnya amplitudo getaran atom-atom yang terikat
satu sama lain.
Karena dasar dari analisis spektroskopi itu sendiri adalah interaksi radiasi
dengan spesies kimia. Maka radiasi suatu sampel dibagi menjadi : adsorbsi,
pemendaran, emisi, dan penghamburan yang cara interaksinya tergantung pada
sifat materi tersebut.
1. Adsorbsi : yaitu suatu berkas radiasi elektromagnetik, bial dilewatkan
melalui sampel kimia, sebagian akan teradsorbsi. Energi elektromagnetik
ditransfer ke atom atau molekul dalam sampel, berarti partikel
dipromosikan dari tingkat yang lebih rendah ke tingkat energi yang lebih
tinggi, yaitu tingkat terksitasi.
2. Emisi radiasi: radiasi elektromagnetik dihasilkan bila ion, atom atau
molekul terksitasi kembali ke tingkat energi lebih rendah atau energi dasar.
3. Pendar Fluor atau pendar-fosfor, merupakan salah satu jenis proses emisi.
Atom atau molekul tereksitasi dengan adsorbsi radiasi elektromagnetik
dan suatu emsisi terjadi jika spesies tereksitasi kembali ke keadaan dasar.
4. Penghamburan : seperti pada proses adsorbsi emisi dan pemendaran maka
penghamburan radiasi elektromagnetik tidak memerlukan energi transisi.

Hukum Dasar Spektroskopi Adsorbsi
Jika suatu berkas sinar melewati suatu medium homogen, sebagian dari
cahaya datang (Po) diadsorbsi sebanyak (Pa), sebagian dapat diabaikan
dipantulkan (Pr), sedangkan sisanya ditransmisikan (Pt) dengan efek intensitas
murni sebesar :
Po = Pa + Pt + Pr,
Dimana : Po = intensitas radiasi yang masuk,
Pa = intensitas cahaya yang diadsorbsi
Pr = intensitas bagian cahaya yang dipantulkan
Pt = intensitas cahaya yang ditransmisikan.

Dalam hal ini berlaku hubungan Hukum Beer-Lambert :
T =
abc
Po
Pt

=10
b = jarak tempuh optik, c = konsentrasi
log (T) = log abc
Po
Pt
=
|
.
|

\
|

a = tetapan absortivitas, T = transmitansi
log A abc
Pt
Po
T
= =
|
.
|

\
|
=
|
.
|

\
|
log
1

A = adsorbansi
- log (T) i.e. A = abc

1
1

=
|
.
|

\
|
T
T
opasitas (tidak tembus cahaya)
A = abc
A = absorpsivitas (yakni tetap)
Hukum di atas dapat ditinjau sebagai berikut :
1. Jika suatu berkas radiasi monokromatik yang sejajar jatuh pada medium
pengadsorbsi pada sudut tegak lurus setiap lapisan yang sangat kecilnya
akan menurunkan intensitas berkas.
2. Jika suatu cahaya monokromatis mengenai suatu medium yang transparan,
laju pengurangan intensitas dengan ketebalan medium sebanding dengan
intensitas cahaya.
3. Intensitas berkas sinar monokromatis berkurang secara eksponensial bila
Konsentarsi zat pengadsorbsi bertambah.
Hal di atas, adalah persamaan yang mendasar untuk spektroskopi adsorbsi,
dikenal dengan hukum Beers Lambert atau Hukum Beer Bougar.
Karena : A = abc, A o c bila ab konstan
A o b bila ac konstan
A o bc bila a konstan.

Penyimpangan Dari Hukum Beer
Jika hukum Beer diikuti, maka kita akan menmperoleh garis lurus. Hal ini
terjadi bila, digunakan sinar yang monokromatis. Bila menggunakan sinar yang
polikromatis, maka akan menyebabkan melebarnya pita radiasi sehingga akan
terjadi penyimpangan yang besar. Penyimpangan juga jelas teramati pada
konsentrasi lebih besar pada kurva absorbansi terhadap konsentrasi. Kurva akan
mulai melengkung pada konsentrasi yang tinggi. Bila kurva absorbsi yang
diperoleh pada berbagai panjang gelombang yang digunakan bersifat datar, maka
diharapkan Hukum Beer berlaku. Penyimpangan negatif dari hukum Beer
menyebabkan kesalahan relatif yang makin membesar dari konsentrasi
sebenarnya.

V. Alat dan Bahan
Alat alat :
1. Pipet tetes
2. Beker gelas
3. Tabung reaksi
4. Rak tabung reaksi
5. Gelas ukur
6. Spektrofotometri UV
Bahan bahan :
1. Reagen Biuret
2. Larutan standar Protein
3. Aquades
4. Larutan sampel

VI. Prosedur percobaan
Mempipetir ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung
1 10 mg/ml. Menambahkan 4 ml reagen biuret. Mengocok dan mendiamkan
selama 30 menit pada suhu kamar. Membaca serapannya pada 540 nm. Untuk
blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan
selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk sampel adalah larutan putih telur dengan
perlakuan yang sama. Hukum Lambert-Beer berlaku untuk larutan-larutan protein
antara 1 10 mg/ml.

VII. Hasil Pengamatan
Data absorban dengan spektrometer UV dengan = 540 nm

Tabung Konsentrasi
(mg/ml)
Absorban
1 1 0.026
2 2 0,070
3 3 0,093
4 4 0,143
5 5 0,158
6 6 0,179
7 7 0,225
8 8 0,337
9 9 0,537
10 10 0,585
Sample 0,275

VIII. Persamaan Reaksi
O O
- C N CH C N CH - + Cu
2+ OH
O = C C = O
H R H R HN NH
RCH HCR
Cu
2+

O = C

C = O
HN NH
RCH HCR

Kompleks Ungu



IX. Analisa Data
Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban
Dengan : X = Konsentrasi protein (c)
Y = Absorbansi (A)
X Y XY X
2

1 0,026 0,026 1
2 0,070 0,14 4
3 0,093 0,279 9
4 0,143 0,572 16
5 0,158 0,79 25
6 0,179 1,074 36
7 0,225 1,575 49
8 0,337 2,696 64
9 0,537 4,833 81
10 0,585 5,85 100
E = 55 2,353 17,835 385

n . XY X . Y 10 (17,835) 55(2,353)
Slope (A) = =
n . X
2
(X)
2
10 (385) (55)
2

= 178,35 - 129,415
825
= 0,059

Y . X
2
XY . X 2,353 (385) 17,835 (55)
Intersept (B) = =
n . X
2
(X)
2
10 (385) (55)
2

= 905,905 980,925
825
= -0,09

Persamaan Regresi Linier :Y = 0,059X - 0,09
Kurva standar : Y = 0,059X - 0,09
X 0 2 4 6 8 10
Y -0,09 0,028 0,146 0,264 0,382 0,5

Konsentrasi protein yang sebenarnya dalam kasein :
Konsentrasi protein pada saat 1 mg/ml
Y = 0,026
0,026 = 0,059X - 0,09
X = 1,966 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 2 mg/ml
Y = 0,070
0,070 = 0,059X - 0,09
X = 2,711 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 3 mg/ml
Y = 0,093 mg/ml
0,093 = 0,059X - 0,09
X = 3,101 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 4 mg/ml
Y = 0,143
0,143 = 0,059X - 0,09
X = 3,949 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 5 mg/ml
Y = 0,158
0,158 = 0,059X - 0,09
X = 4,203 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 6 mg/ml
Y = 0,179
0,179= 0,059X - 0,09
X = 4,449 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 7 mg/ml
Y = 0,225
0,225= 0,059X - 0,09
X = 5,338 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 8 mg/ml
Y = 0,337
0,337 = 0,059X - 0,09
X = 7,237 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 9 mg/ml
Y = 0,537
0,537 = 0,059X - 0,09
X = 10,62 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 10mg/ml
Y = 0,585
0,585 = 0,059X - 0,09
X = 11,44 mg/ml
Konsentrasi sample
Y = 0,275
0,275 = 0,059X -0,09
X = 6,186


0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 2 4 6 8 10 12 14
Kurva Konsentrasi vs Absorbansi
Y-Values
X. Pembahasan
Percobaan kali ini berjudul penentuan kadar protein secara biuret yang
tujuannya untuk menentukan kadar protein dalam suatu larutan dengan
menggunakan pereaksi reagen biuret. Pada percobaan ini yang digunakan sampel
dan larutan standar protein. Protein yang digunakan pada percobaan ini adalah
Kasein. Pada percobaan ini digunakan larutan protein dengan konsentrasi yang
berbeda beda, yaitu dari 1-10mg/ml.
Setelah masing-masing larutan standar dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dan ditambahkan reagen biuret dan larutan NaOH maka larutan-larutan ini
dibiarkan selama 30 menit. Ini bertujuan agar proses pembentukan senyawa
kompleks berwarna dapat berlangsung dengan benar-benar sempurna. Setelah
senyawa kompleks berwarna terbentuk, baru dilakukan pengukuran dengan
spektrometer UV. Senyawa kompleks ini terlihat segera setelah penambahan
reagen biuret dan NaOH dengan terbentuknya warna ungu pada larutan. Warna
ungu ini terbentuk akibat reaksi antara Cu
2+
dalam reagen biuret dengan ikatan
peptida dari protein dalam larutan kasein tadi , tepatnya ikatan dengan NH dari
protein dalam suasana basa (dengan adanya ion OH
-
dari NaOH) seperti dalam
persamaan reaksi.
Pada percobaan ini digunakan metode spektroskopi yaitu pengidentifikasi
suatu objek dengan menggunakan kriteria warna. Dalam percobaan ini, kita
menggunakan kriteria warna ungu dari protein. Untuk mendapat warna, maka
larutan protein direaksikan dengan unsur tembaga dalam reagen Biuret dalam
lingkungan alkali. Sehingga didapatkan larutan protein yang berwarna ungu pada
masing-masing konsentrasi.
Warna dari larutan protein berbeda-beda dari berbagai konsentrasi.
Semakin besar konsentrasi yang digunakan maka semakin pekat warna yang
terbentuk, dan sebaliknya. Karena kita menggunakan panjang gelombang pada
daerah 540 nm, maka raddiasi sinar yang kita pakai adalah sinar UV_Visual.
Di dalam spektrofotometer, larutan protein mengadsorbsi cahaya yang
diberikan kepadanya. Hal ini merupakan wujud dari interaksi suatu atom dengan
cahaya. Dimana energi elektromagnetiknya ditransfer ke atom atau molekul
sehingga partikel dalam protein dipromosikan dari tingkat energi yang lebih
rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi, yaitu tingkat tereksitasi.
Dari hasil pengidentifikasian pada spektrofotometer, didapatlah harga
absorbansi pada masing-masing konsentrasi. Semakin besar konsentrasi maka
semakin banyak protein yang diserap atau diabsorbsi, sehingga harga absorbansi
yang didapat semakin besar juga.
Dari hasil data yang diperoleh, akan didapatkan suatu kurva antara
adsorbansi larutan protein dengan konsentrasinya. Kurva tersebut membentuk
suatu garis lurus yang linear. Ini dikarenakan larutan protein yang digunakan
merupakan larutan encer dengan konsentrasi yang kecil. Penyimpangan Hukum
Beer akan berlaku jika larutan protein yang digunakan mempunyai konsentrasi
yang besar, artinya apabila konsentrasi proteinnya besar, maka garis linear akan
membelok.
Namun, pada saat perbandingan antara larutan sampel dengan larutan
standar protein, menunjukkan perbedaan, hal ini mungkin dapat disebabkan akibat
dari kesalahan pengenceran pada larutan sampelnya, atau kesalahan pada
penggunaan alat spectrometer. Sample seharusnya menunjukkan konsentrasi ~8
mg/ml , tetapi pada kurva yang didapat, sample menunjukkan konsentrasi 6,186
mg/ml.

XI. Kesimpulan
a. Semakin tinggi konsentrasi protein yang terdapat dalam larutan maka
semakin pekat pula kompleks warna ungu yang dihasilkan.
b. Adsorban suatu larutan berbanding lurus dengan konsentrasinya,
sehingga semakin besar konsentrasi yang digunakan, maka semakin
besar pula adsorban yang digunakan.
c. Jika konsentrasi larutan yang digunakan besar akan terjadi
penyimpangan Hukum Beer, dimana kurva yang terbentuk tidak lagi
linear.


XII. Daftar Pustaka

Lehninger, Albert. 1995. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Wirahadikusumah, Muhammad. 1985. Biokimia Protein, Enzim, dan Asam
Nukleat. Bandung: ITB.
Fessenden dan Fessenden. 1999. Kimia Organik Edisi ketiga Jilid 2. Jakarta:
Erlangga.























XIII. Gambar Alat


Pipet Tetes


Beker gelas


Gelas Ukur


Tabung dan Rak Tabung Reaksi



Spektrofotometri UV




XIV. Pertanyaan Dan Jawaban

Pertanyaan:
1. Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein larutan protein yang
diberikan?
2. Berikan penjelasan tentang hukum lambert-beer!
3. Senyawa apa yang dapat mengganggu cara biuret seperti diatas
4. Mengapa reaksi tersebut disebut reaksi biuret?
5. Senyawa kompleks apa yang sebenarnya terjadi?
6. Apakah peptide juga memberi reaksi biuret. jika memberikan, berikalah
penjelasan dan bagaimana cara menentukan kadar protein yan tercampur
dengan peptide?

Jawaban
1. Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban
Dengan : X = Konsentrasi protein (c)
Y = Absorbansi (A)
X Y XY X
2

1 0,026 0,026 1
2 0,070 0,14 4
3 0,093 0,279 9
4 0,143 0,572 16
5 0,158 0,79 25
6 0,179 1,074 36
7 0,225 1,575 49
8 0,337 2,696 64
9 0,537 4,833 81
10 0,585 5,85 100
E = 55 2,353 17,835 385


n . XY X . Y 10 (17,835) 55(2,353)
Slope (A) = =
n . X
2
(X)
2
10 (385) (55)
2

= 178,35 - 129,415
825
= 0,059

Y . X
2
XY . X 2,353 (385) 17,835 (55)
Intersept (B) = =
n . X
2
(X)
2
10 (385) (55)
2

= 905,905 980,925
825
= -0,09

Persamaan Regresi Linier :Y = 0,059X - 0,09
Kurva standar : Y = 0,059X - 0,09
X 0 2 4 6 8 10
Y -0,09 0,028 0,146 0,264 0,382 0,5


-0.2
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8 10 12
Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs
Absorban

Konsentrasi protein yang sebenarnya dalam kasein :
Konsentrasi protein pada saat 1 mg/ml
Y = 0,026
0,026 = 0,059X - 0,09
X = 1,966 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 2 mg/ml
Y = 0,070
0,070 = 0,059X - 0,09
X = 2,711 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 3 mg/ml
Y = 0,093 mg/ml
0,093 = 0,059X - 0,09
X = 3,101 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 4 mg/ml
Y = 0,143
0,143 = 0,059X - 0,09
X = 3,949 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 5 mg/ml
Y = 0,158
0,158 = 0,059X - 0,09
X = 4,203 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 6 mg/ml
Y = 0,179
0,179= 0,059X - 0,09
X = 4,449 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 7 mg/ml
Y = 0,225
0,225= 0,059X - 0,09
X = 5,338 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 8 mg/ml
Y = 0,337
0,337 = 0,059X - 0,09
X = 7,237 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 9 mg/ml
Y = 0,537
0,537 = 0,059X - 0,09
X = 10,62 mg/ml
Konsentrasi protein pada saat 10mg/ml
Y = 0,585
0,585 = 0,059X - 0,09
X = 11,44 mg/ml


2. Penjelasan Hukum Lambert Beer :

Hukum Lambert Beer dengan mudah digabungkan menjadi pernyataan
yang sesuai. Diketahui bahwa dalam mempelajari akibat perubahan
konsentrasi terhadap absorbsi jarak jalan lewat larutan harus dibuat tetap.
Tetapi hasil-hasil yang diukur akan tergantung pada besarnya harga
tetapan. Dengan kata lain dalam hukum Beer seperti K
4
= f(b). Demikian
dalam hukum Lambert K
2
= f(c). Dimana kemudian substitusi hubungan
dasar ini ke dalam hukum Lambert-Beer:

log Po/P = f(c) b dan log Po/P = f(b) c
Kedua Hukum harus diberlakukan bersamaan pada setiap titik, sehingga
f (b) = f(b) c . Atau kalau dipisahkan variabelnya f(c)/c = f(b)/b
Agar dua fungsi variabel tak bergantungan dapat menjadi sama, adalah
bahwa keduanya sama dengan suatu tetapan.
F(c) / c = f(b) b = K

Substitusi ke dalam pernyataan Lambert-Beer menghasilkan pendapat
yang sama yaitu:
log Po/P = f(c) b = K.b.c
log Po/P = f(b) c = K.b.c

3. Senyawa yang dapat mengganggu yaitu senyawa yang membentuk
endapan hitam atau merah pada reagen biuret yaitu garam Amonia.

4. Reaksi ini disebut dengan reaksi biuret karena pada penentuan kadar
protein ini digunakan reagen biuret yang mana biuret memberikan warna
violet dengan CuSO
4
. Dan pada reaksi ini terbentuk kompleks ungu yaitu
antara Cu
2+
dengan NH dari rantai peptida dalam suasana basa.

5. Senyawa kompleks yang terbentuk :
O O
- C N CH C N CH - + Cu
2+ OH
O = C C = O
H R H R HN NH
RCH HCR
Cu
2+

O = C

C = O
HN NH
RCH HCR

6. Peptida juga memberi reaksi biuret karena adanya NH pada ikatan
pepetida sehingga dapat membentuk ion kompleks seperti di atas. Dengan
menambahkan reagen Biuret pada larutan protein dan pengukuran
adsorbansi larutan tersebut dan dibandingkan dengan sampel, dicari yang
sama adsorbansinya maka akan diketahui berapa kadar proteinnya.