Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia Escuela de Qumica Biolgica Departamento de Citohistologa Lab.

Inmunologa 2012

PRACTICA 1
DETECCIN DE LA REACCIN ANTGENO ANTICUERPO IN VITRO

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

MATERIALES Bata (por persona) Guantes (por persona) Marcador permanente Cuaderno. Mayordomo y jabn (por grupo)

Al finalizar el laboratorio, el estudiante Al finalizar el laboratorio, estars en estar en capacidad de: capacidad de: Describir la naturaleza de las Describir la naturaleza de las reacciones antgeno-anticuerpo. reacciones antgeno-anticuerpo. Discutir los principios de los test de aglutinacin utilizados para Discutir los principios de los test de deteccin de reaccin antgenoaglutinacin la y hemaglutinacin anticuerpo. utilizados para deteccin de la reaccin antgeno-anticuerpo.

ACTIVIDADES:
Tens que: Leer el presente documento de apoyo. Observar las animaciones virtuales incluidas por hipervnculos en el presente documento de apoyo. Leer el procedimiento de la prctica. Responder el cuestionario adjunto. Resolver un examen corto respecto al presente documento de apoyo. Realiza la parte prctica.

DOCUMENTO DE APOYO I: REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO IN VITRO, AGLUTINACIN CON PARTCULAS DE LTEX.

EL ANTGENO:

El principio bsico de cualquier tcnica inmunoqumica es que un anticuerpo especfico se combinar con su antgeno especfico para formar un exclusivo complejo antgeno-anticuerpo.

Un antgeno es definido como cualquier sustancia extraa que provoca una respuesta inmune (p.ej., la produccin de anticuerpos especficos) cuando es introducida a los tejidos de un animal susceptible, y es capaz de combinarse con anticuerpos especficos sintetizados. Los antgenos, por lo general, tienen elevado peso molecular y comnmente son protenas o polisacridos. Los polipptidos, lpidos, cidos nucleicos y muchas otras sustancias pueden funcionar como antgenos. La respuesta inmune tambin puede ser generada contra sustancias ms pequeas, conocidas como haptenos, si estas se encuentran ancladas qumicamente a una protena de transporte, como la albmina de suero bovino, KLH u otras matrices sintticas. Una variedad de molculas como las drogas, azcares simples, aminocidos, pptidos pequeos, fosfolpidos o triacilglicridos pueden funcionar como haptenos. Por tanto, con suficiente tiempo, cualquier sustancia extraa puede ser identificada por el sistema inmune y producir anticuerpos especficos. De cualquier manera, esta respuesta inmune especfica es altamente variable y depende del tamao, la estructura y la composicin de los antgenos. Los antgenos que producen una elevada respuesta inmune se dice que son altamente inmunognicos.

La parte pequea en un antgeno que se logra unir complementariamente a un anticuerpo se conoce como epitopo. Esto usualmente corresponde de uno a cinco monosacridos o de 5-8 residuos aminoacdicos en la superficie del antgeno. Dado que las molculas antignicas existen en el espacio, el epitopo reconocido por un anticuerpo debe de ser dependiente de la presencia de una conformacin tridimensional antignica (p.ej. un nico sitio formado por la interaccin de dos bucles protecos nativos o subunidades), o bien, el eptopo puede corresponder a una regin simple de una secuencia primaria. Tales eptopos son descritos como conformacionales o lineales, respectivamente. El rango de sitios de unin posibles es enorme, con cualquier sitio de unin potencial teniendo sus propias propiedades estructurales derivadas de enlaces covalentes, enlaces inicos e interacciones hidroflicas e hidrofbicas. Para que ocurra una interaccin eficiente entre el antgeno y en anticuerpo, el epitopo debe de encontrarse disponible para la unin. Si la molcula objetivo es desnaturalizada, p.ej, a travs de fijacin, reduccin, cambios de pH o durante la preparacin para electroforesis en gel, el eptopo puede estar alterado y esto puede afectar su habilidad para interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos son inefectivos en Western blot, pero son muy buenos en inmunoqumica porque durante el ltimo, un sitio antignico puede permanecer en el tejido, mientras que con una mayor manipulacin se altera la conformacin proteica lo suficiente para destruir el sitio antignico y eliminar la unin al anticuerpo. Por tanto, el epitopo debe

estar presente o en el antgeno nativo, o en el ambiente celular, o solamente expuesto cuando sea desnaturalizado. El nmero, localizacin y tamao de los epitopos depende de cuanto del antgeno se encuentra presente durante el proceso de sntesis del anticuerpo. Si un producto gnico de inters se encuentra presente en concentraciones extremadamente bajas, uno puede escoger utilizar la informacin contenida en una secuencia de nucletidos para sintetizar un pptido y que este nos genere una secuencia especfica de anticuerpos. En algunos casos, los antgenos peptdicos tienen ventaja sobre todos los antgenos de una protena, en los cuales los anticuerpos generados pueden tener como objetivo una nica secuencia aminoacdica. Esto es especialmente til cuando se investigan protenas que pertenecen a familias con una alta secuencia homloga Las caractersticas de un buen antgeno incluyen: reas de estabilidad estructural y complejidad qumica dentro de la molcula. Extensiones significativas que carezcan de unidades que se repitan. Un peso molecular de 8,000-10,000 daltons, a pesar de que los aptenos con pesos moleculares tan bajos como 200 Da se han utilizado en la presencia de una protena transportadora. La habilidad de ser procesado por el sistema inmune. Regiones inmunognicas accesibles para el mecanismo de formacin de anticuerpos. Elementos estructurales que sean suficientemente distintos de los del hospedero. Para antgenos peptdicos, regiones que contengan al menos 30% de amninocidos inmunognicos: K, R, E, D, Q, N. Para antgenos peptdicos, residuos significativamente hidroflicos o cargados.

EL ANTICUERPO

El anticuerpo se encuentra definido como una inmunoglobulina capaz de unirse especficamente con el antgeno que ha ocasionado su produccin en un animal especfico. Son producidos en respuesta a la invasin de molculas extraas en el organismo. La mayora de anticuerpos existen como una o ms copias de una unidad en forma de Y, compuesta de cuatro cadenas polipeptdicas. Cada Y contiene dos copias iguales de una cadena pesada, y dos copias idnticas de una cadena ligera, nombradas as por sus pesos moleculares relativos. Los anticuerpos de vertebrados no mamferos son similares en estructura a los anticuerpos

mamferos IgG y son conocidos como IgY (yolk-derived). Los anticuerpos de mamferos pueden dividirse en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en el nmero de unidades Y y en el tipo de cadena pesada. Las cadenas pesadas de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE son conocidas como g, u, a, d, y e respectivamente. Las cadenas livianas de un anticuerpo pueden clasificarse como kappa o lamda (basado en diferencias estructurales polipeptdicas); de cualquier manera, la cadena pesada determina la subclase de cada anticuerpo. Las subclases de anticuerpos difieren en el nmero de enlaces disulfuro y la longitud de la regin bisagra. El anticuerpo ms utilizado en los procedimientos inmunoqumicos es de clase IgG porque es la inmunoglobulina en mayor concentracin srica. La forma clsica de Y de la IgG se encuentra compuesta de dos variables, especficas para el antgeno F(ab), las cuales son crticas para el enlace al antgeno, y la cola constante Fc que se une al receptor Fc en las clulas inmunes y tambin sirve como un til mango para manipular el anticuerpo durante la mayora de procedimientos inmunoqumicos. El nmero de regiones F(ab) en un anticuerpo, corresponde con sus subclases, y determina la valencia de un anticuerpo (en pocas palabras, el nmero de brazos con los que cuenta un anticuerpo para unirse a su antgeno). Los anticuerpos conjugados se encuentran marcados con un enzima o un fluorforo en la regin Fc. La regin Fc ancla el anticuerpo en la placa utilizada para ELISA y tambin se utiliza en anticuerpos secundarios en inmunoprecipitacin, inmunoblots e inmunohistoqumica. Estas tres regiones pueden romperse en dos F(ab) y un fragmento Fc por enzimas proteolticas como la pepsina. Fragmentar anticuerpos IgG es algunas veces fcil porque los fragmentos F(ab) (1) no precipitan el antgeno; y (2) no se unir a clulas inmunes en estudios in vivo porque carece de la regin Fc. A menudo, por su pequeo tamao y la falta de reactividad cruzada (por la prdida de la regin Fc), los fragmentos Fab radiomarcados para su uso en estudios funcionales. Otro dato interesante, es sque los fragmentos Fc se utilizan a menudo como agentes bloqueadores en tinciones histoqumicas.

INTERACCIN ANTGENO-ANTICUERPO

La asociacin especfica entre antgenos y anticuerpos es dependiente de puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas, fuerzas electrostticas y fuerzas de van der Waals. Todos estos tipos de enlace son dbiles, de naturaleza no covalente, y sin embargo algunas de las asociaciones entre un antgeno y un anticuerpo pueden llegar a ser bastante fuertes. Al igual que los anticuerpos, los antgenos pueden ser multivalentes, ya sea por mltiples copias del mismo epitomo, o a travs de la presencia de mltiples epitopos que son reconocidos por mltiples anticuerpos. Las interacciones que involucran multivalencia pueden producir complejos ms estables, de cualquier manera, la multivalencia puede presentar tambin impedimento estrico, disminuyendo as la posibilidad de unin. Todas las uniones antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) son reversibles y siguen los principios bsicos de termodinmica de cualquier interaccin biomolecular:

donde Ka es la constante de afinidad, Ab y Ag son las concentraciones de sitios no ocupados en el anticuerpo o el antgeno respectivamente, y Ab-Ag es la concentracin del complejo antgenoanticuerpo. El tiempo que toma llegar al equilibrio es dependiente de la tasa de difusin y de la afinidad del anticuerpo por el antgeno, y puede variar ampliamente. La constante de afinidad para un enlace Ag-Ac puede variar en un amplio rango, extendindose por debajo de 10 5/mol hasta 1012/mol. Las constantes de afinidad pueden verse afectadas por la temperatura, el pH y los solventes.

NATURALEZA DE LAS REACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO

LLAVE Y CERRADURA El sitio de unin de un anticuerpo se localiza en la porcin Fab de la molcula y se encuentra construido por regiones hipervariables de la cadena pesada y ligera. Estudios en cristalografa de rayos X respecto a las interacciones entre el antgeno y el anticuerpo muestran que el determinante antignico se ubica en una hendidura formada por el sitio de unin del anticuerpo como se muestra en la Fig. por tanto, el concepto de la reaccin antgeno-anticuerpo es uno de llave (el antgeno) que se ajusta a una cerradura (el anticuerpo).

ENLACES NO COVALENTES Los enlaces que mantienen unido el antgeno al sitio de unin del anticuerpo son en naturaleza no covalentes. Estos incluyen puentes de hidrgeno, enlaces electrostticos, fuerzas de van der Waals y enlaces hidrofbicos. Los mltiples enlaces que se forman entre en antgeno y el anticuerpo aseguran que el antgeno se unir fuertemente al anticuerpo. REVERSIBILIDAD Dado que las reacciones ocurren por enlaces no covalentes, son por naturaleza reversibles.

AFINIDAD Y AVIDEZ

AFINIDAD La afinidad de un anticuerpo es la fuerza de la reaccin entre un nico determinante antignico y un nico sitio de unin en un anticuerpo. Es la suma de las fuerzas de atraccin y repulsin que operan entre el determinante antignico y el sitio de unin. Como se observa en la figura.

AVIDEZ La avidez es antignicos y anticuerpo y individuales. una medida de la fuerza de unin de un antgeno con mltiples determinantes anticuerpos multivalentes. La avidez se ve influenciada tanto por la valencia de un la valencia de un antgeno. La avidez es ms que la suma de las afinidades Ve la figura.

Para repetir, la afinidad se refiere a la fuerza de unin entre un solo determinante antignico y un solo sitio de unin, mientras que, la avidez se refiere al total de las fuerzas de unin entre antgenos y anticuerpos multivalentes.

ESPECIFICIDAD Y REACTIVIDAD CRUZADA

ESPECIFICIDAD La especificidad se refiere a la habilidad de un sitio de unin en un anticuerpo de solamente reaccionar con un nico determinante antignico o, a la habilidad de una poblacin de anticuerpos de reaccionar solamente con un antgeno. Generalmente, existe un alto grado de especificidad en las reacciones antgeno-anticuerpo. Los anticuerpos pueden diferenciar en:

La estructura primaria de un antgeno. Las formas isomricas de un antgeno. La estructura secundaria y terciaria de un antgeno.

REACTIVIDAD CRUZADA La reactividad cruzada se refiere a la habilidad del sitio de unin de un anticuerpo para reaccionar con ms de un determinante antignico o a la habilidad de una poblacin de anticuerpos para reaccionar con ms de un antgeno. La figura te ilustra como se da la reactividad cruzada. La reactividad cruzada ocurre porque el antgeno que reacciona comparte un epitopo en comn con el antgeno que produjo la inmunizacin o bien, porque posee un epitopo que es estructuralmente similar al del antgeno inmungeno (miltiespecificidad).

TEST PARA LAS REACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO

FACTORES QUE AFECTAN LA DETERMINACIN DE REACCIONES ANTGENO-ANTICUERPO La nica manera en la que podemos conocer si la reaccin Ag-Ac ha ocurrido es mediante la deteccin directa o indirecta de los complejos Ag-Ac. La facilidad con la que podemos detectar estos complejos depende de: AFINIDAD A mayor afinidad tenga el anticuerpo por el antgeno, mayor ser la estabilidad de las interacciones. Y por tanto, se mejora la facilidad con la que se puede detectar la interaccin. AVIDEZ Las reacciones entre antgenos multivalentes y anticuerpos multivalentes son ms estables y por tanto es ms fcil detectarlas.

CONCENTRACIN La relacin entre la concentracin del antgeno y el anticuerpo influencia la deteccin de los complejos Ag-Ac porque l concentracin determina el tamao de los complejos que se forman. Figura. FORMA FSICA DEL ANTGENO La forma fsica de un antgeno influencia el cmo se puede detectar su reaccin con un anticuerpo. Si el antgeno es una partcula, generalmente se busca la aglutinacin de un antgeno por el anticuerpo. Si el antgeno es soluble, generalmente se busca la precipitacin del antgeno luego de la produccin de grandes complejos Ag-Ac insolubles.

PARTE PRCTICA

TEST DE AGLUTINACIN: FUNDAMENTO TERICO

AGLUTINACIN Y HEMAGLUTINACIN Cuando el antgeno es una partcula, la reaccin de un anticuerpo con el antgeno puede ser detectado por aglutinacin (clumping) del antgeno. El trmino general de aglutinacin se utiliza para describir anticuerpos que aglutinan partculas de antgeno. Cuando el antgeno es un eritrocito se utiliza el trmino hemaglutinacin. Todos los anticuerpos pueden tericamente aglutinar partculas de antgeno pero IgM, dado su elevada valencia, es particularmente una buena aglutinina y algunas veces se puede inferir que un anticuerpo es de clase IgM si es un anticuerpo que aglutina bien. TEST DE AGLUTINACIN CUALITATIVO Los test de aglutinacin se pueden utilizar de una manera cualitativa para determinar la presencia de un antgeno o un anticuerpo. El anticuerpo se mezcla con el antgeno y un resultado positivo se indica por la aglutinacin de la partcula a la cual el antgeno este adherido.

Por ejemplo, las clulas rojas de un paciente se pueden mezclar con un anticuerpo hacia un antgeno eritrocitario especfico para determinar el grupo sanguneo de una persona. Como segundo ejemplo, si se mezcla el suero de un paciente con clulas rojas de un grupo sanguneo conocido se puede determinar la presencia de anticuerpos contra este tipo sanguneo presentes en el suero del paciente.

TEST DE AGLUTINACIN CUANTITATIVO Los test de aglutinacin pueden ser utilizados para determinar el nivel de anticuerpos contra partculas de antgeno. En este test, se realizan diluciones seriadas de la muestra, que se prueban para determinar la presencia de anticuerpos y luego se aaden clulas rojas o bacterias u otro antgeno. Luego la dilucin mxima que te da aglutinacin se determina. La dilucin mxima que te da aglutinacin visible se llama ttulo. Los resultados se reportan como recprocos de la dilucin mxima que da aglutinacin visible. La Fig. te ilustra un test cuantitativo de hemaglutinacin.

Figura: placa de hemaglutinacin. Molecularmente esto es lo que ocurre:

EFECTO PROZONA: Ocasionalmente, cuando la concentracin del anticuerpo es alta (p.ej. diluciones bajas), existe aglutinacin y entonces, mientras la muestra es diluida, la aglutinacin ocurre. La falta aglutinacin a una alta concentracin de anticuerpos se conoce como efecto prozona. La falta aglutinacin en la prozona se debe al exceso de anticuerpo que resulta en la formacin complejos muy pequeos que no se agrupan para formar aglutinacin visible. no de de de

APLICACIONES DE LOS TEST DE AGLUTINACIN Determinacin de grupos sanguneos o de anticuerpos contra antgenos de grupo. Evaluar infecciones bacterianas.

p.ej. Una elevacin en el ttulo de un anticuerpo hacia una bacteria en particular indica una infeccin con ese tipo de bacteria. Not que, un aumento de cuatro veces en el ttulo significa que hay un incremento significativo en el ttulo del anticuerpo. CONSIDERACIONES PRCTICAS. A pesar de que este test es fcil de realizar, es solamente semi-cuantitativo. HEMAGLUTINACIN PASIVA Los test de aglutinacin solamente trabajan con antgenos que son partculas. Sin embargo, es posible cubrir eritrocitos con un antgeno soluble (p.ej. Antgenos virales, un polisacrido o un hapteno) y utilizar el eritrocito cubierto en test de aglutinacin para un anticuerpo hacia un antgeno soluble. Esto se conoce como hemaglutinacin pasiva. El test se realiza igual que un test de aglutinacin. Las aplicaciones incluyen la deteccin de anticuerpos contra antgenos solubles y la deteccin de anticuerpos contra antgenos virales.

PROCEDIMIENTO: AGLUTINACIN PASIVA DE LTEX: DETECCIN DE FACTOR REUMATOIDEO, ANTIESTREPTOLISINA O. Lleve los reactivos, sueros control y muestras de suero de pacientes a temperatura ambiente. Agregue sobre el rea de reaccin 50 l de suero o control. Agite el reactivo de ltex, asegurndose que est en homogneo antes de usarlo. Agregue una gota de la suspensin de partculas antignicas sobre la gota de suero. Con la ayuda de un aplicador, distribuya la mezcla en el rea de reaccin, homogneamente. Agitar por 2-5 minutos sobre un agitador mecnico o con un movimiento rotatorio y gentil entre sus manos. Realice la lectura de resultados despus del tiempo de agitacin, teniendo cuidado que la mezcla no se seque. http://www.youtube.com/watch?v=oXL1rH11MTg http://www.youtube.com/watch?v=aV8NPSiPh_4 HEMAGLUTINACIN: Con microgotero de 25 ul, colocar una gota de Diluyente de Sueros HAI en todos los pocillos a usar de la policubeta. Tomar una alcuota de cada suero a ensayar con microdilutores de 25 ul (uno para cada muestra). Colocar cada microdilutor en el primer pocillo y rotarlo por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin de la muestra. Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilucin 1/2), pasando los microdilutores al pocillo siguiente (dilucin 1/4) y as sucesivamente hasta la dilucin que se desea investigar (por ejemplo: 1/8, 1/16, 1/32), rotando en cada paso el microdilutor por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilucin de la muestra. Si se emplea una micropipeta automtica de 25 ul para la toma y/o dilucin de la muestra, homogeneizar por carga y descarga. Transferir 25 ul de pocillo a pocillo hasta la dilucin que se desee investigar. Descartar los ltimos 25 ul. Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones y 1/4, una gota (25 ul) de GR no sensibilizados para control de heterofilia. En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul) de Antgeno HAI. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta. Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones, durante 90 minutos. Leer a partir de los 90 minutos. Se puede aumentar la nitidez de la apreciacin, leyendo sobre un espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un papel blanco y traslcido entre la policubeta y la fuente de luz.

MATERIALES: Alcohol al 70% Algodn Beaker Bolsas blancas y rojas Cloro al 5% Descartadores de punzo cortantes Frasco vaco de 10 mL Goteros de 25 uL Guantes, S, M y L Kit de Chagatest Pipetas automaticas de 25 uL Pizetas cloro 5% Pizetas etanol 70% Placas de fondo en U Puntas amarillas Torundas de algodn Sueros control

http://www.fbs.leeds.ac.uk/institutes/ilse/movies/microbiology/view.php?flv=HA_HAI

INTERPRETACIN No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botn. Reactivo: formacin de una pelcula o manto en el fondo de los pocillos. En caso de observar la presencia de un pequeo anillo de bordes regulares, la muestra se considerar dudosa y deber ser ensayada por otro mtodo

CUESTIONARIO:
1. 2. 3. 4. 5. Qu es un antgeno? Qu es un anticuerpo? Que es la reaccin antgeno anticuerpo? (in vitro) De qu depende la reaccin antgeno anticuerpo. Realice un diagrama de flujo de los dos procedimientos de la prctica (aglutinacin y hemaglutinacin).