TCNICAS DE HIBRIDACIN CON SONDAS TCNICAS DE IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR DETECCIN DE GENES ESPECFICOS MEDIANTE HIBRIDACIN, IDENTIFICACIN DE ESPCIES

NO PATGENAS DEL GNERO MYCOBACTERIUM POR HIBRIDACIN REVERSA INNO-LIPA. 1. Introduccin La identificacin de las bacterias se realiza generalmente mediante una batera de pruebas bioqumicas. Pero en algunas bacterias como en el caso de las micobacterias o en bacterias poco frecuentes de difcil crecimiento o con pocos indicadores fenotpicos, se requieren tcnicas de biologa molecular para su correcta identificacin. La hibridacin es la unin complementaria de cidos nucleicos (ADN o ARN). Las tcnicas de hibridacin se utilizan a menudo para detectar una molcula diana partiendo de una sonda complementaria a ella. La hibridacin es la base de muchas tcnicas moleculares, como en la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa), Northern Blot, Southern Blot, microarrays de ADN, hibridacin in situ o screening de genotecas. Su uso extendido en diagnstico molecular abarca el diagnstico de enfermedades, la identificacin de microorganismos patgenos, el anlisis de perfiles de expresin gnica, la localizacin de genes en cromosomas, la deteccin de ARNm en tejidos in situ o la comparacin de especies de patgenos. En las tcnicas de hibridacin se parte de dos poblaciones de cidos nucleicos: un conjunto homogneo de cidos nucleicos de secuencia conocida que acta como sonda y otro conjunto heterogneo de cidos nucleicos de secuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana. Una de ellas debe estar marcada. Si lo est la sonda, la hibridacin es estndar. Si lo est la diana, la hibridacin es reversa. Los cidos nucleicos de partida son de cadena sencilla, bien procedentes de ADN clonado y fragmentado por enzimas de restriccin, bien oligonucletidos sintticos. La hibridacin puede producirse en medio lquido o sobre un soporte slido, como nitrocelulosa, al que se encuentra unida una de las dos poblaciones de cidos nucleicos. En la hibridacin estndar sera el ADN diana el que ira unido al soporte slido, mientras que en la hibridacin reversa sera la sonda. Durante la hibridacin se produce la unin de las molculas diana con las molculas sonda. Esta unin depende de la complementariedad de bases. Se pueden adaptar las condiciones para conseguir la especificidad de secuencia requerida para que se produzca la hibridacin. As, aumentando la fuerza inica (por ejemplo, la concentracin de cloruro sdico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridacin aunque existan algunas bases no complementarias. Por el contrario un aumento de la temperatura o una disminucin de la fuerza inica producen una hibridacin ms especfica que tolera menos fallos en la complementariedad de las secuencias a hibridar. Estas condiciones varan segn el objetivo de la prueba: As, por ejemplo, comparar ADN de especies diferentes necesita condiciones relajadas, pero identificar mutaciones puntuales en un gen necesita condiciones que fuercen una hibridacin muy especfica.

El marcaje se usa para visualizar la unin. Puede ser radiactivo o no radiactivo (fluorforos o marcaje enzimtico). A mayor complementariedad entre sondas y dianas, ms molculas hibridan y ms seal vemos. Principio de Hibridacin Reversa o LiPA (INNOGENETICS): Esquema de las tcnicas de hibridacin reversa: El ADN del bacilo est marcado con una molcula de biotina. Este ADN, si es complementario, se une por hibridacin al ADN que est fijado en la tira de nitrocelulosa. Al aadir estreptavidina-fosfatasa alcalina, la estreptavidina se une a la biotina. Finalmente se aade un sustrato que al ser degradado por la fosfatasa alcalina produce un compuesto de color prpura formando una lnea visible all donde ha habido hibridacin. Los ensayos de identificacin de tipo de INNO-LiPA de INNOGENETICS emplea una tcnica de hibridacin inversa, basada en la amplificacin de una zona genmica concreta (regin intergnica espaciadora 16S23S del ARN ribosomal). El material de ADN biotinilado amplificado se desnaturaliza qumicamente, y las hebras separadas se hibridan con sondas de oligonucletidos especficos inmovilizadas en bandas paralelas sobre tiras de nitrocelulosa. Esto va seguido de una fase de lavado astringente a fin de eliminar cualquier material amplificado incorrectamente emparejado. Tras el lavado astringente, se aade estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, que queda ligada a cualquier hbrido biotinilado que se haya formado con anterioridad. La incubacin con una solucin de sustrato que contiene un cromgeno produce un precipitado de color prpura/marrn. La reaccin se interrumpe mediante una fase de lavado, tras la que se registra el patrn de reactividad de las sondas. Este mtodo permite la deteccin e identificacin simultnea del gnero Mycobacterium y de 16 especies distintas a partir de cultivo, incluyendo M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae, M. genavense, M. simiae, Mycobacterium marinum + ulcerans, M. celatum, el complejo MAIS (M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum), M. malmoense, M. haemophilum, M. chelonae, el complejo M. fortuitum y M. smegmatis.

2. Material y Reactivos Material Asas bacteriolgicas. Agitador magntico Balanzas Bao termosttico Base y peine para la formacin de geles de agarosa Cmara de vdeo, impresora y software para digitalizacin de geles Cinta de autoclave Congelador Cubeta de electroforesis Fuente de electroforesis Gradillas Guantes Material de vidrio (probetas, botellas, etc.) Pipetas de volumen variable Puntas de pipeta estriles con/sin filtro Tubos estriles tipo eppendorf de 0.2 y 1,5 mL Microondas Nevera Termociclador Agitador orbital Cronmetro Reactivos INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 (Innogenetics) Ref. 80346 Nota: con una nica referencia envan dos cajas: una con el kit de PCR (congelado, ref. 803247) y otra con las tiras y los reactivos de hibridacin, guardar en nevera, ref. 80346) Taq Expand polimerasa 100U Ref. 11732641001 (Roche). Guardar en congelador. SafeView Nucleic Acid Stain (NSB Biologicals- ACEFESA) Ref. NBS-SV1 Guardar en nevera. Marcador de peso molecular, Marker VIII Ref. 11336045001 (Roche). Guardar en congelador. Tampn TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH8]), guardar a T ambiente. Tampn de electroforesis TBE 5X (Tris-cido brico-EDTA) a T ambiente. Tampn de carga PCR 5X, guardar en nevera. Agua destilada Agarosa, guardar a T ambiente

3. Procedimiento - Mantener el kit a T ambiente (20-25C) unos 30 min antes de su utilizacin. - Se recomienda alicuotar los reactivos del kit al usarlos por primera vez. OBTENCIN DEL DNA: - Resuspender una o dos colonias de la micobacteria en 200 l de tampn TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA [pH 8]), hervir 10 min, y centrifugar (5 min a 13,000 rpm). Pasar el sobrenadante a un eppendorff de 1,5 ml limpio, de aqu se utilizaran 2 L para la amplificacin. PCR: Determinar el volumen de mezcla de amplificacin segn el n de reacciones a preparar, que sern el nmero de muestras ms un control negativo (nos servir para detectar la posible contaminacin de los reactivos). Estos reactivos se guardan congelados en una zona libre de amplificados o DNA. - En un eppendorf estril de 1,5 ml aadir en este orden: Agua destilada estril...........................................................27,6 l x n reacciones Amplification buffer (kit-tapon transparente).................... 10 l x n reacciones MYC Primer Solution (kit- tapn verde)............................. 10 l x n reacciones Taq Expand polymerasa (Roche) no suministrada ..............0,4 l x n reacciones (corresponde 1,5 U por reaccin para una Taq polimerasa a 5U/ l). Durante la manipulacin mantener los reactivos en hielo. Reactivos para un volumen final de PCR de 50 l. - Rotular un tubo eppendorf estril de 0,2 ml para cada muestra y uno para el control negativo y repartir a cada uno 48 l de la mezcla de amplificacin. - Aadir a cada tubito 2 l del DNA problema y al control negativo aadir 2 destilada estril usada en la preparacin de la mezcla de amplificacin. l del agua

- Precalentar el termociclador a 95 y colocar las muestras con las siguientes condiciones de amplificacin (duracin 1 hora):
Desnaturalizacin Desnaturalizacin Annealing Extensin Mantener a

95C 95C 62C 72C 4C

1 min 30 seg 30 seg 30 seg

1 ciclo 40 ciclos

- Despus de la amplificacin seguir con el procedimiento o bien guardar los amplificados a una temperatura de -20C

COMPROBACIN DE LOS AMPLIFICADOS EN UN GEL DE AGAROSA : Tras el proceso de amplificacin, se proceder a la visualizacin de los productos de amplificacin, para ello prepararemos un gel de agarosa al 1%. - Mezclar en una botella de pirex 200 ml de tampn TBE diluido a 0,5X y 2 gr de agarosa. Calentar en el microondas hasta su disolucin. - Dejar enfriar la agarosa a T ambiente y mientras tanto montar el molde del gel sellando los extremos con cinta de autoclave y colocando el peine que formar los pocillos. - Con la agarosa atemperada aadir a la botella 15 l de SafeView mezclar bien evitando la formacin de burbujas y verter la mezcla en el molde del gel. - Una vez el gel haya solidificado retirar los elementos de sellado y el peine. - Colocar el gel en la cubeta de electroforesis y aadir TBE 0,5X hasta cubrirlo. - Para cargar los amplificados de PCR en el gel mezclar en un eppendorf de 1,5 ml: 6 l del amplificado + 3 l tampn de carga 5X + 6 l H2O destilada estril. - Para cargar el marcador de peso molecular en el gel mezclar en un eppendorf de 1,5 ml: 75 l H2O destilada estril + 10 l tampn de carga 5X + 15 l del Marker VIII (Roche). - Cargar el gel colocando en el primer pocillo 10 l del marcador de peso molecular preparado anteriormente (se puede guardar la solucin sobrante en la nevera, durante unos meses) y en los pocillos siguientes 15 l de cada uno de los amplificados. - Conectar los electrodos y iniciar la electroforesis a 100 V los primeros 5 minutos y despus pasar a un voltaje de 70-80 V. - Controlar la migracin del ADN por medio de la luz ultravioleta y comparar el tamao del producto amplificado con el marcador de peso molecular. En los amplificados hemos de obtener un fragmento de unos 400-550 pb. El control negativo no ha de presentar ninguna banda. HIBRIDACIN: Mantener los reactivos a T ambiente unos 30 minutos antes de su uso. Ajustar el nivel de agua del bao. - Calentar un bao de agua en agitacin a 62C 0,5C. Compruebe la temperatura utilizando un termmetro calibrado y ajuste la temperatura si es necesario. Este es uno de los pasos ms crticos ya que una temperatura demasiado baja podr dar lugar hibridaciones inespecficas (falsos positivos), mientras que temperaturas demasiado altas podrn dar lugar seales muy dbiles o falsos negativos.

- Precalentar Solucin de hibridacin (Hybridation Solution) y la Solucin de lavado (Stringent Wash Solution) mnimo a 37C y mximo a 62C. Mezclar las soluciones antes de su uso. Todos los cristales deben estar disueltos. - Con unas pinzas retirar del tubo el nmero de tiras Inno-Lipa a utilizar, una por muestra y incluir una tira para la muestra del control negativo (sin ADN). No tocar las tiras con las manos!. En cada tira rotular con lpiz la identificacin de la muestra por encima de la lnea azul del marcador. - Tomar el nmero de canales necesarios, uno por tira, y colocarlos en la bandeja. - Con el canal vaco (sin la tira), pipetear 10 l de Solucin desnaturalizante (Denaturation Solution) en la esquina superior de cada canal, cerrar inmediatamente el vial despus de su uso. - Aadir 10 l del amplificado o del control negativo a la Solucin desnaturalizante y mezclar cuidadosamente pipeteando y expulsando el lquido. Dejar desnaturalizar durante 5 minutos a T ambiente (20-25C). - Agitar la Solucin de hibridacin (Hybridation Solution) precalentada y aadir con cuidado 2 ml de la misma al amplificado desnaturalizado de cada canal. Evitar contaminar los canales vecinos durante el pipeteo. - Con unas pinzas colocar inmediatamente una tira en cada uno de los canales con el lado marcado de la membrana (lnea azul del marcador) hacia arriba. Las tiras deben quedar totalmente sumergidas. - Colocar la bandeja en el bao de agitacin a 62C0,5C (ajustar el nivel del agua del bao entre 1/3 y 1/2 de la altura de la bandeja, asegurndose que no flote). Ajustar el movimiento de agitacin que debe ser el que permita que las tiras y el lquido se muevan adelante y atrs en la cubeta, sin que se derrame el lquido por el borde de la cubeta. La agitacin es fundamental para conseguir la mxima sensibilidad y una tincin homognea. Cerrar la tapa del bao, para evitar variaciones de temperatura, e incubar en agitacin 30 min 3 min. LAVADOS: - Despus de la hibridacin retirar la bandeja del bao. - Mantener la bandeja inclinada y retirar el lquido de cada canal con una pipeta preferentemente conectada a un aspirador por vaco. Aspirar el lquido por la parte superior de la tira por encima de la lnea marcadora. - Aadir a cada canal 2 ml de Solucin de lavado precalentada (Stringent Wash Solution) y enjuagar las tiras por balanceando con la mano la bandeja de 60 30 segundos a temperatura ambiente. - Aspirar la solucin de lavado de cada canal y repetir de nuevo el lavado.

- Por ltimo, aspirar la solucin de lavado y incubar cada tira con 2 ml de Solucin de lavado precalentada. Colocar la bandeja en el bao de agitacin a 62C 0,5C cerrar la tapa (para evitar las variaciones de temperatura). Incubar 10 min 2 min. Durante la incubacin preparar la soluciones de trabajo Rinse working solution y Conjugate working solution. Rinse working solution (=solucin de aclarado 5x): Diluir por cada tira 2 ml de Rinse solution en 8 ml agua destilada estril. Solucin estable durante 2 semanas a 2-8C. Conjugate working solution: Diluir por cada tira 20 l de Conjugate 100X en 1980 l de Conjugate Diluient, se recomienda preparar una muestra de ms. La solucin es estable durante 24 h a T ambiente (20-25C) y en la oscuridad. DETECCIN: A partir de este punto todas las incubaciones se llevaran a cabo en un agitador orbital a 2025C. Durante la incubacin las tiras y el lquido deben moverse hacia delante y hacia atrs para conseguir un revelado homogneo. - Eliminar por aspiracin la solucin de lavado anterior. - Lavar cada tira utilizando 2 ml de Rinse working Solution, agitar durante 60-90 segundos eliminar la solucin por aspiracin y repetir el lavado con 2ml de Rinse working Solution. Aspirar la solucin. - Aadir 2 ml de Conjugate working solution a cada canal y incubar a 20-25C en agitacin durante 30 min 3 min. Aspirar la solucin. Preparar la solucin de sustrato de trabajo (Substrate Working solution) diez minutos antes de finalizar la incubacin con el conjugado. Substrate working solution: Diluir por cada tira 20 l de Substrate 100X en 1980 l de SubstrateBuffer, se recomienda preparar una muestra de ms. La solucin es estable durante 24 h a T ambiente (20-25C) y en la oscuridad. - Lavar cada tira dos veces con 2 ml de Rinse working Solution, agitar durante 60-90 segundos eliminar la solucin por aspiracin y repetir lavado. Aspirar la solucin. - Realizar otro lavado con 2 ml de Substrate Buffer agitar durante 60-90 segundos y eliminar la solucin por aspiracin. - Aadir 2 ml de Substrate Working solution a cada canal y incubar el agitacin durante 30 min 3 min. Aspirar la solucin. - Parar la reaccin colorimtrica lavando las tiras en agitacin durante al menos 3 min con 2 ml. de agua destilada estril. Repetir dos veces.

- Quitar las tiras de los canales con unas pinzas y colocarlas en papel absorbente. Dejar que se sequen completamente antes de leer los resultados. Guarde las tiras reveladas, secas y en la oscuridad. LECTURA DEL RESULTADO: - La lnea azul en el extremo superior corresponde al marcador nos servir para orientar la tira para la lectura. - La primera lnea positiva 1: es el control de conjugado y sustrato, ser positiva si se han aadido estos dos reactivos durante el proceso. Deber tener una intensidad similar en todas las tiras procesadas en una misma vez. - La segunda lnea 2: es la sonda correspondiente al gnero Mycobacterium sp. Detecta la presencia de DNA de este gnero en la muestra, e indica si haba una cantidad de amplificado suficiente para su hibridacin, para determinar una sonda como positiva se deber comparar su intensidad con ella. La tira correspondiente al control negativo deber estar en blanco excepto para la lnea de control de conjugado. Para la lectura de las bandas positivas utilizar la tarjeta del kit siguiendo este esquema de lectura: Lnea
2 3* 4* 5* 6* 7 8* 9 10 11 * 12 13 * 14 15 * 16 * 17 18 19 20 * 21 * 22 * 23 * 24

Sonda
MYC genus MTB MKA-1 MKA-2 MKA-3 MXE MGO MGV MSI MMU MCE MAIS MAV MIN-1 MIN-2 MSC MML MHP MCH-1 MCH-2 MCH-3 MFO MSM

Taxones que reaccionan con la sonda

Presencia de Mycobacterium en la muestra M tuberculosis complex: M. tuberculosis,M. bovis, M. microti, M. africanum M. kansasii (group I) M. kansasii (group II) M. kansasii (group III, V) M. kansasii (group IV), M. gastri M. xenopi M. gordonae M. genavense M. simiae M. marinum + M. ulcerans M. celatum M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum,MAC, M. malmoense M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum M. intracellulare (sequevars Min-A, -B, -C and -D) M. intracellulare (sequevar Mac-A) M. scrofulaceum M. malmoense M. haemophilum M. chelonae complex (group I, II, III, IV, M. abscessus) M. chelonae complex (group III, M. abscessus) M. chelonae (group I) M. fortuitum - M. peregrinum complex M. smegmatis

* Comentarios:

-Lnea 3: Sonda lnea 3 (MTB) muestra una reaccin positiva frente a M. tuberculosis,M. bovis, M. microti, M. africanum. -Lnea 4-6: Discriminacin de 5 grupos de M.kansasii. segn los datos derivados de la secuenciacin de la regin 16S-23S rRNA. -Lnea 8: Sonda MGO reacciona positivamente a M. gordonae, aunque puede darse una hibridacin dbil de esta sonda en los aislados de M. simiae (falso positivo). -Lnea 11: Sonda (MMU) positiva para las especies M.marinum i M.ulcerans las dos especies comparten la misma regin espaciadora. -Lnea 13: Sonda (MAIS) presenta reaccin positiva frente a todos los aislados de M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, y MAC complex. Tambin M.malmoense reacciona frente a esta sonda y M. haemophilum puede dar lugar a una hibridacin dbil, estas dos especies sern identificadas si presentan una hibridacin sus sondas especficas (18-MML y 19-MHP). -Lnea 15 y 16: Sondas (MIN-1 y MIN-2) para las distintas sequevars de M.intracellulare. -Lnea 20-22: Sondas (MCH-1, MCH-2 y MCH-3). Los aislados pertenecientes a M. chelonae complex e dividen en cuatro grupos genotpicos (I, II, III y IV) segn su secuencia de la regin 16S-23S rRNA. M. abscessus se encuentra en el grupo III. La sonda MHC-1 es una sonda de carcter general e hibridar con los cuatro grupos genotpicos. La sonda MHC-2 reacciona especficamente con el grupo III que incluye a M. abscessus. La sonda MHC-3 reacciona especficamente con el grupo I que son aislados recuperados frecuentemente de muestras humanas. Los aislados M.xenopi pueden presentar una hibridacin dbil (falso positivo) para la sonda MCH-1 (lnea 20). -Lnea 23: Sonda (MFO) presentar una reaccin positiva frente a las especies pertenecientes al complejo de M.fortuitum-M.peregrinum. M. smegmatis tambin reacciona positivamente a esta sonda pero se distingue claramente por presentar una hibridacin positiva para la sonda MSM (lnea 24).

 PLANTILLA PCR INNOLIPA N muestras: Volumen final:

Agua destilada estril..................................................27,6 l x Amplification buffer (kit-tapon transparente)............ 10 l x MYC Primer Solution (kit- tapn verde)................ .... 10 l x Taq Expand polymerasa (Roche) no suministrada .....0,4 l x

= = = =

Repartir a cada uno 48 l de la mezcla de amplificacin. DNA muestra o C negativo agua dest. estril ............ 2 l x =

Condiciones de la PCR:
Desnaturalizacin Desnaturalizacin Annealing Extensin Mantener a

95C 95C 62C 72C 4C

1 min 30 seg 30 seg 30 seg

1 ciclo 40 ciclos