17 Congresso de Iniciao Cientfica AO DO EXTRATO DE PIPER REGNELLI SOBRE HEMLISE INDUZIDA POR INDUTORES DE PEROXIDAO LIPDICA

Autor(es)

CNTIA MARIA BERTGLIA LUIZETTO

Orientador(es)

ANA CLIA RUGGIERO

Apoio Financeiro

FAPIC/UNIMEP 1. Introduo

O estresse oxidativo uma situao de desequilbrio entre sistemas protetores e sistemas geradores de espcies reativas que podem atacar o organismo, principalmente lipdios, protenas e cidos graxos. (SIES, 1987). Artrite, catarata, Doena de Parkinson, diabete aloxnica, leso isqumica e o prprio processo de envelhecimento so exemplos de desequilbrio favorvel produo de espcies radicais. (MENENGHINI, 1987), No organismo, durante o processo de respirao celular pode haver a liberao de espcies ativas de oxignio (EAO ou EROS), cujo principal produto o radical hidroxila (MENENGHINI, 1987). Radicais livres ao atacarem o citosol e a membrana eritrocitria, podem gerar radicais peroxil lipdicos (ou lipoperxidos) agravando todo processo de manuteno da vida eritrocitria e aumentando a destruio da membrana, que acarreta na m seletividade da membrana e conseqente morte celular (HALLIWELL E GUTTERIDGE, 1999). Por possuir uma alta presena de cidos graxos poliinsaturados e por ser exposto uma alta concentrao de O2, o eritrcito uma das clulas mais susceptveis ao dano oxidativo (CLEMENS et al, 1987) O sistema de defesa de nosso organismo que equilibra a produo de EROS se d em dois nveis. Primariamente, ocorre a ao de enzimas como a catalase, o superxido desmutase e a glutationa peroxidase. As defesas secundrias de nosso organismo surgem a partir de produtos originados na dieta, que impedem a disseminao da reao em cadeia criada pela liberao de radicais hidroxila, originados de perxidos, geralmente doando um ncleo de hidrognio para radicais lipdicos. Antioxidantes fenlicos utilizam muito este procedimento (LARSON, 1988). Os eritrcitos (clulas vermelhas do sangue) so particularmente suscetveis ao dano oxidativo como resultado do alto contedo de cidos graxos poliinsaturados das suas membranas e da alta concentrao celular de oxignio e hemoglobina (Hb), sendo a Hb um poderoso promotor de processos oxidativos (SATO et al., 1999). Os radicais livres so responsveis pela peroxidao lipdica e pela oxidao de protenas que levam formao de poros hemolticos que resultam na perda de potssio e seqencialmente, em hemlise (CARAMELO et al. 1994, BUREAU et al. 2005). A utilizao de plantas medicinais vem cada vez ganhando mais destaque no mundo, e especialmente na Amrica Latina, na qual vem contribuindo significativamente com o cuidado primrio sade. No Brasil, vrias plantas utilizadas na medicina popular tem sido alvo de pesquisas e algumas tm demonstrado atividade farmacolgica. Entre vrios exemplos, poderamos citar algumas plantas da famlia Piperaceae, as pariparobas (Pothomorphe umbellata L. Miq. e Piper regnelli) que so amplamente utilizadas na medicina popular (SCOTT et al., 2005). Tambm conhecido que extratos pertencentes ao gnero Piper e Photomorphe demonstram reduzir o estresse oxidativo em modelos

de peroxidao lipdica quando testados in vitro. Muitas funes biolgicas, inclusive proteo contra mutao gentica, carcinognese e outras so atribudas aos efeitos antioxidantes (PIETTA, 2000), portanto, devido alta concentrao de antioxidantes presentes no gnero Piper esta espcie foi escolhida.

2. Objetivos

O objetivo desse projeto foi avaliar o efeito de extrato hidroalcolico de Piper regnellii (pariparoba) no estresse oxidativo induzido em eritrcitos, avaliando especificamente a hemlise oxidativa e a oxidao da hemoglobina. 3. Desenvolvimento

Os eritrcitos foram isolados do sangue de ratos, lavados trs vezes com salina tamponada (PBS, pH 7,4) e ressuspensos em hematcrito de 4%. Para a determinao da hemlise oxidativa, as suspenses de eritrcitos a 4% foram tratadas com os oxidantes: perxido de hidrognio (0,5mM), hidroperxido de cumeno (0,5mM) e azoiniciador (0,5M). Para o perxido de hidrognio, as suspenses foram tratadas com azida sdica, para inibio da catalase. As suspenses foram incubadas com os oxidantes temperatura ambiente, com o hidroperxido de cumeno (CumOOH) e o perxido de hidrognio, e a 37oC com o azoiniciador (AAPH), e em intervalos de tempo especficos, alquotas foram retiradas e ressupensas em PBS, para avaliao da hemlise e em gua destilada, que hemolisa totalmente as clulas, para avaliao da oxidao da hemoglobina. A seguir os espectros pticos foram obtidos na regio de 400 a 700nm de comprimento. Em seguida as amostras foram tratadas com ferricianeto de potssio a 20% e os espectros determinados novamente. Para avaliao do efeito do extrato na da hemlise as suspenses de eritrcitos (Ht 4%) foram tratadas inicialmente com o extrato nas concentraes 0,10mg/mL, 0,25mg/mL e 1,0mg/mL (37 C, 20 min.) e a seguir submetidas a ao dos oxidantes, como j descrito. A porcentagem de hemlise foi calculada considerando-se 100% de hemlise a absorbncia da alquota ressuspensa em gua e relacionado-se a absorbncia da amostra, ao valor de 100% de hemlise. (SHARMA & SHARMA, 2001). Cada experimento foi repetido 3 vezes, para que os resultados sejam reproduzveis na margem de 10% de erro experimental. (LIU et al, 2002). O efeito do extrato na concentrao de metahemoglobina (metaHb) foi analisado atravs da absorbncia das alquotas tratadas com extrato antes e aps a adio do ferricioaneto de potssio, que oxida completamente a hemoglobina. O comprimento de onda utilizado aqui foi 630 nm, caracterstico da metaHb. A avaliao da porcentagem de metaHb foi realizada para as suspenses ressuspensas em gua destilada. A porcentagem de hemoglobina oxidada, nas suspenses de eritrcitos, foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinso molar das diferentes espcies de hemoglobina (oxihemoglobina, metahemoglobina e hemicromos) no pH 7,4 (WINTERBOURN, 1990). A partir dos valores das absorbncias ou densidade tica nos comprimentos de onda 560, 577, 630 e 700nm as concentraes (mmol/L) das diferentes espcies de hemoglobina foram calculadas, utilizando as equaes: A avaliao das quantidades relativas das espcies oxidadas de hemoglobina foi realizada para os eritrcitos ressuspensos em gua destilada. A porcentagem de cada espcie foi determinada em relao ao total de Hb. Todos os valores foram determinado como a mdia +/- desvio padro. Os valores obtidos que estiveram fora do desvio de 10% da mdia foram desconsiderados. Todos os experimentos foram realizados pelo menos 3 vezes com amostras diferentes. As diferenas estatsticas foram determinadas pelo teste t de Student para os dados no pareados e para a anlise de varincia foi utilizado o teste ANOVA. Os valores foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05.

4. Resultado e Discusso

O efeito do extrato sobre os eritrcitos no causou hemlise significativa. Os valores obtidos em todos os tempos de incubao e para as trs concentraes de extrato utilizadas se mantiveram menores do que 10%, comparveis aos controles, sem extrato. Na anlise do efeito do extrato sobre a hemlise induzida pelo perxido de hidrognio os resultados obtidos so relativos hemlise total, alquotas ressuspensas em gua destilada. O H2O2 induz a hemlise significativa, a partir dos 30 minutos de incubao e essa hemlise, aps 60 minutos de incubao, aproxima-se da hemlise total. O extrato hidroalcolico de pariparoba no apresentou efeito contra a hemlise induzida pelo oxidante; para todas as concentraes testadas, as porcentagens de hemlise ficaram muito prximas do controle, indicando que o extrato no foi capaz de proteger as clulas do ataque oxidativo do perxido de hidrognio, levando as clulas ruptura, hemlise. O efeito do extrato sobre a oxidao da hemoglobina metahemoglobina (FeII a FeIII) foi avaliado com o objetivo de se avaliar a

capacidade do extrato em proteger a hemeprotena do dano oxidativo induzido pelo perxido de hidrognio. O extrato no exerceu proteo efetiva, no protegeu os eritrcitos da produo de metahemoglobina. Na oxidao da hemoglobina induzida por oxidantes vrias espcies oxidadas podem ser formadas, a partir da oxiHb, alm da metaHb, entre elas a ferrilhemoglobina (heme-Fe IV) e os hemicromos, alm de espcies intermedirias difceis de serem determinadas (JIA & AKAYASH, 2008). Dessa forma, avaliou-se a decomposio da oxiHB e o efeito do extrato sobre esse decaimento. O extrato apresentou efeito, concentraes menores de 010 e 0,25 mg/mL, na proteo oxiHb e sua transformao em espcies oxidadas. O efeito do extrato sobre o estresse induzido por cumOOH, um indutor lipoflico, ele preferencialmente se liga membrana e essa regula a liberao das molculas do oxidante, no sendo a hemeproteina o alvo inicial do ataque dos radicais formados pelo cumOOH (VAN DEN BERG et al., 1992). O extrato de pariparoba apresentou um pequeno efeito protetor, na concentrao de 0,25 mg/mL, quanto a hemlise induzida pelo cumOOH. O extrato no protegeu os eritrcitos da oxidao da hemoglobina, para todas as concentraes de extrato a porcentagem de metaHb formada foi semelhante do controle, onde as suspenses foram tratadas apenas com o oxidante. No se observou efeito do extrato na transformao da oxiHb induzida pelo cumOOH, o decaimento da concentrao de oxiHB foi semelhante ao controle. O indutor AAPH (azoniciador) se decompe a 37C em soluo aquosa e gera radicais alquila que na presena do oxignio so convertidos no radical peroxila correspondente. Esses radicais peroxila induzem a peroxidao lipdica dos cidos graxos poliinsaturados das membranas dos eritrcitos levando a peroxidao lipdica (BANERJEE et al., 2008). O extrato hidroalcolico de folhas de Piper regnelli apresentou efeito protetor significativo contra a hemlise induzida pelo azoiniciador, nos tempos de incubao mais altos, 90 a 180 min, os valores obtidos so significativamente diferentes em relao ao controle (p <0.05). O extrato tambm apresentou efeito significativo em relao oxidao da hemoglobina, h uma diminuio significativa da concentrao de oxiHb no controle, ausncia do extrato, que quase totalmente decomposta no tempo de 180 min. Na presena do extrato, quantidades significativas de oxiHb esto presentes: 14%, para concentrao de 0,10 mg/mL, cerca de 38% para 0,25 mg/mL e cerca de 85%, na concentrao mais alta 1,0 mg/mL.

5. Consideraes Finais

Os resultados obtidos nesse projeto demonstraram que o extrato hidroalcolico de folhas de Piper regnelli pode inibir a hemlise oxidativa induzida pelo azoiniciador hidroflico AAPH e a oxidao da hemoglobina induzida por ele, diminuindo a produo de metahemoglobina e inibindo a decomposio da oxihemoglobina. Alm desse efeito significativo no estresse oxidativo induzido pelo azoiniciador, observou-se tambm efeito protetor contra a decomposio da oxihemoglobina dos eritrcitos submetidos ao do perxido de hidrognio, tambm um indutor hidroflico. Por outro, quando se utilizou o indutor lipoflico, o hidroperxido de cumeno, o extrato no foi capaz de proteger os eritrcitos do dano oxidativo, no exerceu efeito protetor contra a hemlise induzida, nem contra a oxidao da hemoglobina. Esses resultados podem indicar que, os componentes presentes no extrato hidroalclico das folhas de pariparoba, tm caractersticas hidroflicas e podem proteger o dano oxidativo induzido nesse ambiente celular, no conseguindo, devido s suas caractersticas de solubilidade, proteger os ambientes celulares hidrofbicos, onde o hidroperxido de cumeno inicia o ataque aos lipdios. Referncias Bibliogrficas

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