CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA CLAE (HPLC)

LAS BASTOS DA FONSECA

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia Cromatografia uma tcnica utilizada na separao dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em 2 fases, uma estacionria e a outra mvel. A fase estacionria pode ser um slido, um lquido retido sobre um slido, ou um gel. A fase mvel pode ser lquida ou gasosa. (IUPAC)

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

Cromatografia Lquida
Planar Coluna Alta eficincia Convecional

CDD

CP

Adsoro

Partio

Inica

Excluso

Cromatografia Lquido-slido ou por adsoro (CLS)

O mecanismo de separao: competio entre molculas da amostra e da fase mvel em ocupar os stios ativos da fase estacionria, slido. Adsorventes mais utilizado: slica. importante que as partculas da fase estacionria apresentem um grande nmero de stios ativos ( grande rea de superfcie). Fase estacionria (polar) afetada com frequncia pela reteno de molculas de alta polaridade como lcoois, gua. Acarreta mudana nas propriedades da coluna. Pode dar origem a pobre eficincia. Assimetria dos picos compostos bsicos Diminuindo inclusive a vida til.

Cromatografia Lquido-lquido ou por partio (CLL)

O mecanismo de separao: baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase mvel e na fase estacionria. Fase estacionria: lquido adsorvido sobre um suporte slido formando um leito no miscvel com a fase mvel. Os componentes mais solveis na fase estacionria so seletivamente retidos, enquanto os menos solveis so transportados mais rapidamente pela fase mvel. Suporte slido: slica purificada. O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase estacionria na fase mvel.

Cromatografia Lquida com fase ligada (CLFL)

Surgiu como conseqncia de problemas associados a CLL. A fase estacionria (FE) est quimicamente ligada superfcie de um suporte, elimina-se o problema da solubilidade FE na FM. Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionria, possvel diferentes tipos de seletividade. Grupo funcional de natureza polar, como o grupo amino (- NH2 ) e o grupo Ciano (-CN), que funcionando similarmente s fases polares da CLS (SiOH), so chamadas de FASE NORMAL. Grupo funcional de natureza apolar, como os grupos octil (- C8H17) octadecil (- C18H37), fenil (- C6H5), so chamados de FASE REVERSA.

Cromatografia Lquida com fase ligada (CLFL)

FASE NORMAL: fase estacionria polar e fase mvel apolar. FASE REVERSA: fase estacionria apolar e fase mvel polar. Segundo o CDER, a maioria dos mtodos de anlises submetidos ao mesmo, so por cromatografia em fase reversa , deteco UV. Cromatografia lquida por par inico, uma forma especial de CLFL. A molcula da amostra inica ou ionizvel, forma um par de ons por associao com um contra on orgnico, da fase mvel. O par de ons ento distribudo entre a fase estacionria, normalmente uma de fase reversa, e a fase mvel, normalmente aquosa-orgnica, que solubiliza as espcies ionizadas.

Cromatografia por troca inica

A fase estacionria , normalmente, uma resina de poliestireno e divinilbenzeno, a qual so ligados grupos inicos, como por exemplo, - SO-3 - CO-2 - NR+3 - NH2R+ trocadores fortes de ction trocadores fracos de ction trocadores fortes de nions trocadores fracos de nions

As colunas catinicas so adquiridas comercialmente na forma de sais de Na+ ou de on hidroxnio (H+) as aninicas na forma de cloreto (Cl-).

Cromatografia por troca inica

Os grupos inicos tm um contra-on (com carga oposta) que pode ser deslocado pelos ons da fase mvel de carga similar a ele. Para uma resina trocadora de ctions, tem-se o equilbrio entre o contra on Na+ e o ction da amostra, M+ M+ + R-SO-3Na+ Na+ + R-SO-3M+

Cromatografia por excluso

A separao efetuada de acordo com o tamanho efetivo das molculas. A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho controlado. As molculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros da fase estacionria enquanto as maiores so excludas. Assim, molculas grandes movem-se rapidamente atravs da coluna e as molculas pequenas so eludas lentamente pela fase mvel. A CLAE necessita que a coluna seja de materiais com estruturas mais rgidas, normalmente de slica mas tambm de resina.

Cromatografia por por excluso.

A separao efetuada de acordo com o tamanho efetivo das molculas. A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho controlado. As molculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros da fase estacionria enquanto as maiores so excludas. Assim, molculas grandes movem-se rapidamente atravs da coluna e as molculas pequenas so eludas lentamente pela fase mvel. A CLAE necessita que a coluna seja de materiais com estruturas mais rgidas, normalmente de slica mas tambm de resina.

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

Sistema de CLAE

Fase Mvel Injetor

Coluna
Detector Registrador

Sistema de bombeamento

Sistema de CLAE
Reservatrio da Fase Mvel
Recipientes de vidro, ao inox ou plsticos inertes 1 a 3 L. Filtro de ao sinterizado para reter as partculas sem produzir uma queda excessiva de presso. A Fase Mvel deve ser filtrada, antes de ser colocada no reservatrio. Sistema de filtrao por membrana de 0,45 m de porosidade.

Sistema de CLAE
Caractersticas bsicas Bomba para CLAE
Quimicamente inerte (resistentes a fase mveis agressivas). Trabalha a altas presses. Fluxo contnuo, livre de pulsao. Reprodutibilidade do fluxo. Fluxo constante a curto e longo prazo. Fluxos - 0,1 a 10 mL/min analticas e at 100 mL/min preparativas Pequeno volume interno.

Sistema de CLAE
Tipo de Bomba.
Reciprocantes. So bombas que escoam volumes constantes de forma no contnua, isto pulsante. Vazo pulsando pode causar perda na eficincia da coluna e instabilidade no detector. Duplo pisto quando um pisto succiona a fase mvel o outro expulsa o lquido para fora da bomba. A vazo (fluxo) de ambos os pistes, j quase livre de pulsaes, encaminhada coluna. Amortizadores de fluxo. A principal vantagem vazo de volume constante.

Sistema de CLAE
Sistema de bombeamento.
Isocrtico: Composio da fase mvel permanece constante. Capaz de separar um nmero limitado de picos. Gradiente: Composio da fase mvel varia durante a anlise. Sistema aplicvel quando a polaridade dos compostos muito diferente. Separao de amostras complexas. A determinao de impurezas relacionadas em uma matria-prima um exemplo.

Sistema de CLAE
Injetores.
No atacado por solvente. reprodutvel e preciso. Opera a altas presses. Manual. Automtico (auto-sampler). Otimizao do tempo de anlise. Melhor reprodutibilidade analtica.

Sistema de CLAE
Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo

CUIDADO ! limpeza do injetor.

Sistema de CLAE
Detectores.
Caractersticas de um detector ideal. Alta sensibilidade. Baixo rudo (quanto maior o rudo pior ser o LD). Resposta rpida a todos os solutos. Ter uma larga faixa de linearidade. Insensibilidade mudanas na temperatura e vazo da FM. No provocar alargamento do pico. No destruio do soluto. Tipos de Detectores usados em CLAE. UV/VIS. Condutividade Eltrica. ndice de Refrao. Eletroqumico. Fluorescncia.

Sistema de CLAE
Detectores.
Caractersticas de alguns detectores de CLAE
Detector por Detector por eletroqumico condutividade (eletrodo Hg eltrica. gotejante). absorbncia excitao com mudanas no oxidao ou condutividade de luz na faixa luz produz ndice de reduo em eltrica do UV uma emisso refrao da potencial fixo devido a fluorescente fase mvel presena de ons. seletivo altamente universal seletivo seletivo depende prop. seletivo depende prop. depende prop. depende prop do composto do composto depende prop. fase mvel do composto do composto 10-9 10-9 e 10-12 10-7 10-12 10-8 Detector por espectrofotometria UV. Detector por fluorescncia. Detector por ndice de refrao.

Princpio de operao

Tipo

Quantidade mnima de deteco (g/mL) Volume de cela (L)

1-20

10-25

3-15

5-10

1,5-2,5

Sistema de CLAE
Detectores.
Caractersticas de alguns detectores de CLAE
Detector por espectrofotometria UV. Detector por fluorescncia. Detector por ndice de refrao. Detector por eletroqumico (eletrodo Hg gotejante). mdia sim Detector por condutividade eltrica.

Sensibilidade temperatura Sensvel vazo da fase mvel til com gradientes Aplicaes

baixa no

baixa no

alta no

Mdia sim

sim

sim

no

no

no

composto que absorvem no comprimento de onda selecionado

Composto ou derivados que fluorescem

geral

Espcies que oxidam ou reduzem

Solues aquosas com compostos inicos

Sistema de CLAE
Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAE
Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAE
Detector UV/VIS.
Lei de Lambert-Beer. Requer: Luz monocromtica Concentraes baixas Soluo sem turbidez (A) (B)

A = BC
Absorbncia Absortividade molar Concentrao molar Comprimento de percurso da clula Substituindo (A) em (B)

Aa = BCa
Aa = Absorbncia da amostra
Ca = Conc. da amostra

Ap = BC p
Ap = Absorbncia do padro

Aa Ap = Ca C p
Aa Ca = C p Ap

Cp =

Conc. do padro

Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Ser de alto grau de pureza. Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes. No decompor ou dissolver a fase estacionria. Ter baixa viscosidade. Ser compatvel com o tipo do detector utilizado. Ter polaridade adequada para permitir conveniente dos componentes da amostra. uma separao

Sistema de CLAE
O papel da Fase Mvel.

Coluna Interao Qumica Fase Mvel Amostra

A fase mvel interage com amostra e a coluna, atravs de sua polaridade e caractersticas qumicas, assim exercendo uma grande influncia na separao.

Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Fase Reversa. Tipicamente a fase mvel uma mistura de um componente aquoso, freqentemente contendo um tampo para controle de pH, e um solvente orgnico polar miscvel em gua. Solventes orgnicos. Metanol e Acetonitrila, so os mais utilizados. Tetrahidrofurano (THF) - usualmente na proporo de 5 20% junto com acetonitrila ou metanol para melhorar a seletividade. Fosfato um tampo muito utilizado.

Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Fase Reversa. Ordenando em uma srie decrescente de polaridade e crescente de poder de eluo. A principal desvantagem para o uso de sais inorgnicos, que podem precipitar nas tubulaes, bomba, injetor... do sistema cromatogrfico, principalmente se a proporo do solvente orgnico for alta. Especial ateno de ser data a limpeza do equipamento.

Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Fase Normal. Utiliza solventes apolares. O problema mais freqente neste tipo de cromatografia desativao da coluna de slica ou alumina por adsoro de gua. A gua adsorvida responsvel por mecanismos mistos de reteno (partio e adsoro) e produz grandes variaes na reteno e seletividade. Os solventes devem apresentar baixo teor de gua. Hexano, n-Heptano, Diclorometano e n-Propanol.

Sistema de CLAE
Fase Mvel
Caractersticas Polaridade da Fase Estacionria Polaridade da Fase Mvel Ordem de eluo da amostra - polar FASE NORMAL alta baixa + polar + polar FASE REVERSA baixa alta - polar

Efeito do aumento da Reduz os tempos de Aumento dos tempos polaridade da FM reteno de reteno

Sistema de CLAE
FASE NORMAL

Polaridade FM Reteno

Sistema de CLAE
FASE REVERSA

Polaridade FM Reteno

Sistema de CLAE
Fase Mvel.
O ar dissolvido na fase mvel pode: Formar bolhas na cabea da bomba presso, interrompendo o fluxo, prejudicando a integridade do pisto de safira e selo da bomba. A presena de bolhas no detector pode causar rudos muito alto. Em ambos os casos, h oscilao da linha de base, influncia sobre os tempos de reteno ou aparecimento de picos adicionais.

Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Mtodos de desgaseificao. Ultra-som (lento, pouco eficiente) Vcuo (lento, requer agitao) Vcuo + Ultra-som (mais eficiente) Purga de Hlio (contnua) Degasser (contnuo remove o ar logo antes de entrar na bomba)

Sistema de CLAE
Fase Estacionria.
Slica ou Resina de Poliestireno-divinilbenzeno

Partculas de Slica esfricas e irregulares.

Irregulares so menos eficientes.

Sistema de CLAE
Fase Estacionria.
Macroporoso Forma irregular ou esfrica 15 100 Alta capacidade Baixa Eficincia Baixo custo Separaes preparativas Limpeza da mostra Presso baixa Partcula macroporosa esfrica de Slica

Sistema de CLAE
Fase Estacionria.
Microporoso Forma irregular ou esfrica 3 10 Alta capacidade Alta Eficincia Alto custo Separaes analticas Separaes semi-preparativas Presso alta

Partcula microporosa esfrica de Slica.

Sistema de CLAE
FASE NORMAL Slica: superfcie polar e cida. Muito higroscpica. Adsoro de gua. Pode dar origem: A pobre eficincia originada dos mecanismos mistos de reteno. A pico com muita cauda para compostos bsicos, causada pela interao com os stios cidos.

Superfcie Silanol

Grupos funcionais: SiOH, (CH2OH)2 (Diol), NH2, NO2 e CN (Ciano).

Sistema de CLAE
FASE REVERSA Ligao do tipo siloxano a reao chamada de silanizao.

Si-OH Si-OH Si-OH +

R1 Cl Si R2 R3

Si-OH Si-O Si-OH

R1 Si R2 + HCl R3

R1 e R3 = CH3 ou O- CH3 R2 = C18, C8, C4, C2, fenil e ciano (CN).

Sistema de CLAE
FASE REVERSA Os grupos silanos (Si-OH) que no chegaram a silanizar- se podem: Promover mecanismos duplos de reteno. Forte reteno de compostos polares. Picos assimtricos em compostos bsicos. Adsores indesejadas, diminuindo inclusive a vida til da coluna. Para eliminar este feito, usa-se o processo conhecido como end-capping. Que consiste complementar a primeira silanizao (C8, C18,...) com molculas menores como trimetilsilano (TMS). Desativao da slica.

Sistema de CLAE
FASE REVERSA Os grupos silanos ( C18 Si-O-Si Si-OH Si-O-Si Slica no desativada. NH2- C-C-C-C-C-CH3 C18 Distoro do pico (cauda) pela formao de ponte de hidrognio com compostos bsicos. ) livres.

Sistema de CLAE
FASE REVERSA Os grupos silanos ( C18 Si-O-Si Si-OH Si-O-Si Slica no desativada. NH2- C-C-C-C-C-CH3 C18 Distoro do pico (cauda) pela formao de ponte de hidrognio com compostos bsicos. ) livres.

Sistema de CLAE
Limpeza da coluna aps anlise. Fase Reversa H2O ACN:H2O (10:90) n-Heptano ACN:H2O (90:10)

Fase Normal n-Propanol Colunas

100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30 cada etapa, fluxo de 1 ml/min 250 e 300x4/4,6 mm = 60 cada etapa, fluxo de 1 ml/min

Procedimento de regenerao. Fase Reversa: H2O Metanol Clorofrmio Metanol Fase Normal: Heptano Clorofmio Acetato de etila

H2SO4 0,05M Acetona Etanol H2O

Sistema de CLAE
Ativao de colunas novas Fase Reversa ACN ou Metanol 100% Fase Normal n-Heptano 100% Estocagem de colunas Fase Reversa ACN:H2O (90:10) Fase Normal n-Heptano Colunas
Utilizar H2O antes de solvente tamponado. Antes de introduzir a FM verificar a miscibilidade com o solvente de ativao.

Utilizar Etanol ou n-Propranol antes de solvente aquoso.

100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30 cada etapa, fluxo de 1 ml/min 250 e 300x4/4,6 mm = 60 cada etapa, fluxo de 1 ml/min

Sistema de CLAE

Sistema de CLAE

Sistema de CLAE

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