Facultad de Ingeniera y Tecnologa Ingeniera Civil en Biotecnologa

Proyecto de investigacin Bioqumica Experimental 9 de Mayo 2012. Avance de Proyecto N1

Extraccin y Purificacin de Beta galactosidasa a partir de Aspergillus nger.

Braulio Contreras; Juan Domnguez. Contreras . F; Fuentes. R. Resumen

En el presente trabajo se describe el avance que se a logrado de acuerdo a la planificacin presentada , en esta etapa se logro cumplir con el primer objetivo especifico del trabajo el cual es cultivar el microrganismo Aspergillus Niger, el stock donde se obtiene el hongo para cultivarlo es un cultivo en placa proporcionada por el laboratorio de biotecnologa de la universidad San Sebastin , para cultivo liquido se utilizo las condiciones del medio liquido presentadas en el anteproyecto, se inoculo el hongo en 2 matraces de 500 ml y con 250 ml de medio de cultivo en este caso se utilizo Difco TM Malt Extract Broth el tiene todo las caractersticas optimas para el crecimiento del cultivo despus se llevo al shacker por 2 dias a 32 C y 200 rpm, el otro punto obtenido en este avance es la enzima comercial de - Galactosidasa ( EC 3.2.1.23 ) desde Aspergillus Oryzae ( Sigma G 5160) se obtuvo desde el proveedor de la enzima todas su caracterizacin se obtuvo su ph 4,5 , temperatura 30 C tambin se obtuvo en forma bibliogrfica la cintica de la enzima la cuales son Km 11,0 mM, Vmax 0.29min-1 estos datos van hacer corroborados despus experimentalmente cuando se caracterice la enzima purificada desde nuestro hongo y y cuando se caracterice la enzima comercial.

Abstract
This paper describes the progress that has accomplished according to plan submittedat this stage was achieved the first objective to meet specific work which is to cultivate the microorganism Aspergillus Niger, the stock where you get the fungus to cultivate plating is provided by the biotechnology laboratory of the University of San Sebastian ,was used for liquid culture liquid medium conditions presented in the draft, the fungus was inoculated into 2 flasks of 500 ml and 250 ml of culture medium in this case was used DifcoTM Malt Extract Broth has all the optimal characteristics for growth of the culture after the shacker took for 2 days at 32 C and 200 rpm, the other point obtained in this advance is the enzyme -commercial galactosidase (EC 3.2.1.23) from Aspergillus oryzae (Sigma G - 5160) was obtained from the supplier of the enzyme all gave their characterization pH 4.5, temperature 30 C was also obtained in bibliographic form of the enzyme kinetics which are the Km 11.0 mM, Vmax 0.29min1data will make later corroborated experimentally when the purified enzyme was characterized from our mushroom and and when it characterizes the commercial enzyme.

Introduccin El fin que persigue la biotecnologa y los mtodos de seleccin utilizados dentro de la misma, consiste en desarrollar procedimientos prcticos que permiten purificar la enzima (galactosidasa) u otro elemento puro de inters desde un microorganismos el cual tiene importancia a nivel industrial (2) (Doran, 1998). La produccin de una enzima por los mtodos de la biotecnologa clsica o bioqumica experimental incluye dos etapas principales: la fermentacin, en la que se multiplica el microorganismo productor de la enzima, y la de recuperacin, separacin y purificacin, en la donde esta se asla y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso. La -galactosidasa (EC 3.2.1.23) es una enzima que hidroliza la lactosa en sus monmeros glucosa y galactosa, al escindir el enlace 1-4. Se conoce que la leche, por su alto contenido en lactosa, no puede ser asimilada por cierto grupo de personas, pues les ocasiona trastornos digestivos a causa de que no sintetizan beta-galactosidasa (1) (Bayless et al., 1971). .Es un enzima esencial en el cuerpo humano, las deficiencias en la protena puede resultar en Galactosialidosis o sndrome de Morquio B. En E. coli, el gen de -galactosidasa, el gen lacZ, est presente como parte del sistema inducible opern lac que se activa en presencia de lactosa cuando el nivel de glucosa es bajo. Los objetivos de este primer avance consistieron en estudiar las condiciones ptimas para preparar los cultivos, preparar las soluciones, determinar el ph y temperaturas que influiran en la propagacin de Aspergillius Niger en el medio de cultivo, adems de un estudio para determinar los parmetros cinticos de la enzima comercial.

Materiales y Mtodos

Medio de cultivo. Se prepararo el medio cultivo acorde a las necesidades fisiolgicas del microorganismo para obtener un cultivo de Aspergillus Niger. Para cada medio se utilizo DifcoTM Malt Extract Broth el cual esta tiene el pH optimo para el cultivo (pH a 4,5), para tener un cultivo solo con organismo en estudio se autoclavaron 2 matraces de 250 ml con el medio a 15 psi por 15 minutos. a) DifcoTM Malt Extract Broth (tabla 1)

componente Malt extract Maltose Technical Dextrose Yeast Extract

g/1000ml 6 1.8 6 1,2

g/250ml 1,5 0,45 1,5 0,3

que la temperatura en que reacciona la enzima (3). Los parmetros cinticos para la enzima comercial igual se obtuvieron por medio de bibliografa (4).

b) Medio de cultivo autoclavado (imagen 1)

Para la preparacin de medio de culitvo se utilizaron la balanza analtica para pesar 3,75 g de DifcoTM Malt Extract Broth para preparar los 250 ml de medio para el cultivo del hongo, para sacar el medio de cultivo se utilizo la esptula. Cuando esta el medio de cultivo preparado se autoclava a 15 psi por 15 minutos para esterilizar el medio, depues se deja enfriar por 2 horas para depues inocular con el stock de Aspergillus Niger el cual fue proporcionado por el laboratorio de biotecnologa de la universidad San Sebastian para este proceso se esterilizo el rea con alcohol 70% y con 2 mecheros la inoculacin fue con una haza curva la cual fue calentada hasta dejar el metal al rojo vivo para esterilizarla al estar el haza esterilizada se procede a extrarer de la placa una muestra de hongo la cual se introduce en el cultivo y se lleva a el shaker a 32 C y 200 rpm por 48 horas. Resultados. a) Informacion enzima comercial (Tabla 2) Enzima EC PH Temperatura Km Vmax Beta galactosidasa 3.2.1.23 4.5 30C 11.0 mM 0.29min-1

c) Medio de cultivo con hongo despus de 36 horas (imagen 2)

Los resultados para la determinacin de pH ptimo se obtuvieron por bibliografa, al igual

Discusin. Al principio de nuestro proyecto se realizo toda la bsqueda bibliogrficas para la extraccin y purificacin de - Galactosidasa desde Aspergillus Oryzae lo cual tuvo una modificacin el hongo para la purificacin se cambio por Aspergillus Nger por lo cual se tuvo que revaluar lo buscado por bibliografa si exista alguan cambio en los protocolos utilizados o cambios en el medio de cultivo , los resultados del cambio no fueron interferentes con el proyecto por que al ser las dos hongos de la misma especie no cambiaron nuestra formulacin de proyecto. Los datos obtenidos por bibliografa de temperatura y ph de la enzima comercial son parmetros estudiados por varios papers por cual no se caracterizo la enzima comercial para obtener esos datos. Los parmetros cinticos se realizo una buscada bibliogrfica con paper que utilicen el mismo mtodo para obtener estos datos esto se realizo para obtener este dato de forma teorica y despus comparados con la enzima purificada desde el hongo y desde la enzima comercial Conclusin. Al obtener estos resultados se pude visualizar fcilmente que el cultivo se propago de buena manera, es importante determinar los factores ambientales ptimos (pH y temperatura). Debido a que bajo estas condiciones la -galactosidasa cataliza la reaccin con mayor velocidad. Como el hongo creci en perfectas condiciones esto da paso a las siguientes actividades que salen indicadas en la planificacin de nuestro proyecto las cuales corresponderan a la purificacin de nuestra enzima -galactosidasa

(2) Doran, P. 1998. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, California, USA. 439p.

(3) Robert E Lenga; Kristine L Votoupal galactosidasa http://www.sigmaaldrich.com 25-04-2012

(4) Seiichi Takasaki And Akira Kobata.

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF AN ENDO -GALACTOSIDASE PRODUCED BY DIPLOCOCCUS PNEUMONIAE. The Journal Of Biological Chemistry . Vol. 251, No. 12, Issue of June 25, pp. 36033609, 1976.

(5) Whiteburst, R. Enzyme in food Technology. Editorial Sheffield Academic Press. New York, USA,2002.

Bibliografa (1) BAYLESS, T.M.; D.M. PAIGE and G.D. FERRY . Lactose intolerance and milk drinking habits. Gastroenterology, 1971