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Universidade Federal de Pelotas Disciplina de Genmica II Prof. Dra.

Fabiana Seixas

RNA de interferncia
Delva Leo Emily Nunes Gabriela Debom Jessica Plaa Lucas Goedert 01/05/2011

Descoberta
Prmio Nobel de 2006

- 1990: Petnias;

- 1993: C. elegans.

Andrew Z. Fire

Craig C. Mello

O que o RNA de interferncia?


Fita que se pareia ao mRNA

Ligao impede a traduo Inibio da sntese proteica

RNA de interferncia

Mecanismo regulador da expresso gnica;

Existe em muitos organismos;


Classificao: microRNA (miRNA) SiRNA

miRNA

MicroRNA
Molculas de RNA com aproximadamente 22 nucleotdeos; Incapazes de codificar protenas; Funo na regulao ps-transcricional;

Degradao ou bloqueio na traduo de RNAs mensageiros.

Biognese

- Transcrio por RNA Polimerase II ou III; - Pri-miRNA (vrias nt), ao Drosha (RNase endonuclease III), cofator DGCR8/Pasha; - Pre-miRNA (60 a 80 nt), auxlio da Exportin 5, cofator Ram-GTP;

Biognese

- Pre-miRNA, sofre ao da Dicer (RNase III); - MicroRNA (18-26 nt), associao ao Complexo de Induo de Silenciamento do Rna (RISC) / Argonauta.

Biognese

Caractersticas
Ligam-se a regio 3 UTR do mRNA;

Degradao ou inibio?

- Quanto melhor o pareamento, maior a possibilidade de degradao do mRNA. - Quando o microRNA aciona o mecanismo de clivagem do mRNA, aps a clivagem, o microRNA permacene intacto, podendo reconhecer e degradar outros mRNAs.

Localizao Genmica
Regies intergnicas (42%)

- Possuem promotores e outros fatores de transcrio prprios.

Localizao Genmica
Regies intragnicas (58%)

- Podem ser intrnicos ou exnicos; - Compartilham o promotor do gene; - So processados em uma rota metablica diferente da exciso dos ntrons.

Caractersticas
Cerca de 500 genes de microRNA (1-5%);
Na espcie humana

Estimativa de 1000 genes;


Predio de genes. Avaliao de sequncias conservadas. Anlise de potencial estrutura loop.

Caractersticas
Cada microRNA age em ,aproximadamente, 300 mRNA diferentes.

Caractersticas
Cada mRNA pode sofrer interveno de diferentes microRNAs.

Caractersticas
.

- Grande parte dos miRNA so encontrados em genes parlogos - 50% dos genes so encontrados prximos, sendo transcritos por nica unidade de transcrio. - Em casos excepcionais, podem ocorrer por promotores isolados.

Caractersticas
Cerca de 20-30% dos genes codificantes podem ser alvo de microRNA;
So regies altamente conservadas; Podem ser exportados para outras clulas;

siRNA
Small interfering RNA

Short interfering RNA


de RNA fita dupla de aproximadamente 22 nucleotdeos

Incapazes de codificar protenas;


Funo na regulao ps-transcricional; Degradao ou bloqueio na traduo de mRNAs mensageiros.

Extremidade 3 com 2 nucleotdeos livres


siRNA assimtrico

Biognese

Biognese

Pareamento
Ligam-se a regio 3 UTR do mRNA

Caractersticas
siRNA so produzidos a partir de dsRNA; dsRNA provm da sntese por vrus ou sequncias repetitivas introduzidas; Podem funcionar como:
Defesa antiviral Silenciamento de mRNA

miRNA

siRNA

Origens Diferentes
Molcula endgena (miRNA)

Molcula exgena (siRNA)

RNAi

Diferenciao Espacial

Principais diferenas
Caractersticas Principal modo de interao Origem Sintetizante Conservao filogentica Estrutura Grampo Estgio precursor no ncleo Associao com heterocromatina Comprimento Funo em homeostase siRNA Clivagem do mRNA Exgena No Sim Sim Sim 18-26 nt Sim miRNA Inibio da transcrio Endgena ou Sinttica Sim Sim Sim Sim 18-26 nt Sim

Impacto na sntese de protenas


Potencial de utilizao em doenas

Indireto
Desconhecido

Indireto
Sim

RNAi nos Organismos

RNAi em clulas animais


Envolvidos em quase todos os processos celulares: Tempo de desenvolvimento Silenciamento Defesa antiviral Transposon Apoptose Diferenciao celular

Proliferao celular

Controle metablico

RNAi em clulas animais


O papel biolgico de cada RNAi ainda incerto.
Organismo Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans Caenorhabditis elegans miRNA lin- 4 let-7 miR-48, miR-84, miR-241 lsy-6 lsy-6, miR-273 miR-84 miR-2a, miR-2b, miR-6, miR-7 bantam miR-14 miR-430 miR-196 miR-375 miR-32 Alvo de ao regulao ps- transcricional negativo de lin-14 e lin-28 lin-41, hbl-1 e o fator de transcrio daf-12, pha-4 Funo Destino das clulas epidrmicas de L1 para L2 (passagem de fases larvais) Passagem do quarto estgio larval para adulto

hbl-1 regulador negativo do cog-1 regulador de die-1 let-60

Passagem entre os estgios larvais L2 e L3 Assimetria esquerda- direita Assimetria esquerda- direita Desenvolvimento da vulva

Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster Drosophila melanogaster Danio rerio Mamferos Mus musculus Homo sapiens

E(spl)/bHLH e famlia Bearded hid desconhecido desconhecido cliva HOXB8 mtpn pfv-1

Sinalizao Notch Controle do crescimento Morte celular programada Neurognese Desenvolvimento embrionrio Secreo de insulina Defesa viral

RNAi em clulas animais


As sequncias de miRNAs em animais geralmente so filogeneticamente conservadas: cerca de 55% dos miRNAs de C. elegans tem homlogos com humanos.
Pasquinelli et al., 2000

Isso auxilia na prova da evoluo animal.

RNAi em clulas animais x vegetais


Os miRNAs de plantas e animais exercerem seu controle de formas fundamentalmente diferentes sugerindo que os dois sistemas originaram-se de forma independente.
Millar e Waterhouse, 2005 Organismo Tamanho miRNA Ligao Principal forma de ao Local de ao da Dicer Presena do complexo Drosha Presena de Hen-1 Grau de complexidade da atuao do miRNA Animal miRNA mais curtos (20-22nt) Complementares ao site UTR 3 Represso de traduo Citoplasma Planta miRNA mais longos (21-24 nt) Complementares as regies codificadoras de mRNAs Degradao do mRNA Ncleo

Presente Ausente

Ausente Presente

Complexo - miRNAs tem muitos alvos Fcil - miRNAs tem pouco alvos TargetScan, TargetScanS, miRanda, Programas utilizados MovingTargets, PicTar e RNAhybrid MIRcheck, findMiRNA, Miru e PatScan

RNAi em clulas vegetais


Envolvidos nos seguintes processos celulares:

Desenvolvimento de estruturas

Mudana de fase

Estresse ambiental

Transduo

RNAi em clulas vegetais


O nmero de miRNA identificados em plantas menor do que em animais.
Zhang et al., 2007 Organismo Arabidopsis thaliana miRNA miR 172 Alvo de ao Reprime traduo do AP2 Funo Desenvolvimento da flor e tempo de cultura Desenvolvimento padro radical da raiz, sinalizao de giberelina e sinalizao luminosa Diferenciao e diviso celular; e alongamento das clulas

Arabidopsis thaliana

miR 170, miR 171

Liga-se ao mRNA que codifica domnio GRAS ou protena SCARECROW

Arabidopsis thaliana

miR 160, miR 167a

Liga-se ao mRNA que codifica ARFs

Arabidopsis thaliana Zea mays

miR 164a miR 172

Liga-se ao mRNA que codifica o domnio NAC e CUC2 Reprime traduo do gossy15

Formao de broto meristemtico apical Desenvolvimento da flor e tempo de cultura

RNAi em clulas vegetais


As sequncias de miRNAs em vegetais tambm apresentam segmentos filogeneticamente conservados.
Axtell e Bartel, 2005; Zhang et al, 2006

http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2164-10-558.pdf

RNAi em fungos?
A maioria dos fungos pode passar por dois tipos de silenciamento: Quelling e MSUD. Quelling parecido com o mecanismo de formao de RNAi em plantas ou animais (dependente de Argonauta e Dicer), entretando se d pelo processo de co- supresso.
Maquinaria celular percebe a possibilidade de superexpresso de um gene (por mRNA) e gera o desligamento desse (por RNAi) evitando caos celular.

Silenciamento Meitico por DNA No Pareado (MSUD) Durante o processo de meiose fngica, pode ocorrer a supresso de um gene em um dos oito cromossomos. Uma vez que h um gene no pareado, aquele que deveria com ele parear ser suprimido tambm. O curioso desse processo que todas as cpias desse gene em todo material gentico disposto sero silenciadas podendo gerar proles extremamente distinta das originrias.
Cromossomos separam-se na metfase da meiose para formar clulas haploides e em seguida passam por um processo de mitose ps- meitica gerando 8 cromossomos haplides.

RNAi em fungos?
Fungos Neurospora crassa em diferentes estgios de desenvolvimentos expressando o gene de interesse, histona H1 (hH1GFP, em verde)

Ao passar pelo processo meitico seguido da mitose ps meitica, ocorre a supresso dos genes por MSUD (indicados pela seta).
Fotos: Namboori B. Raju, Stanford University.

RNAi em bactrias e arqueas?


Descobrimos que existem um homlogo de Hen1 em bactrias, porm estas no produzem RNA de interferncia. Portanto, ns estamos muito curiosos para descobrir no que o Hen1 bacteriano atua.
Raven H. Huang, 2009

crRNA Curtas Repeties Palindrmicas Intercaladas Regularmente em Cluster (CRISP) que possuem entre 24 a 48 pb.

Streptococcus pyogenes, tambm chamada de Streptococcus GrupoA (the flesh eating bacterium) cultivada em meio slido (picture by Krzysztof Chylinski, Laboratory of Emmanuelle Charpentier)

RNAi e Doenas

RNAi e Doenas
Desordens genticas dominantes;

Baixa especificidade de terapias atuais;


SNPs geram falta de seletividade; Novas abordagens teraputica clssica; Promessa em resposta ao resfriamento da industria farmacutica; Alta especificidade e potncia atrai grande interesse ao RNAi:

RNAi-based therapeutic strategies for metabolic disease.

Lipdeos transportadores de siRNA; Self delivery; Inflamao do tecido adiposo; Microesferas de glucano;

MicroRNA-like antivirals

Sequncias antivirais expressas em miRNA; Preocupao com miRNA antiviral mimtico; Desafio no delivery; Lentivrus recombinantes; Implicaes do uso teraputico;

Design of functional small interfering RNAs targeting amyotrophic lateral sclerosis-associated mutant alleles.

RNAi e esclerose amiotrfica lateral; Design de siRNA e estratgia de assimetria; Mismatch da fita antisenso de siRNA; Silenciamento eficaz dos alelos mutantes SOD1.

Discrimination of Parkinson-associated LRRK2 alleles by introduction of a single nucleotide mismatch into siRNA.

Protena rica em leucina quinase2 (LRRK2) e doena de Parkinson (DP); Padro de mutao G2019S; siRNAs artificiais com mismatch; ASP-RNAi e alelos associados com DP.

RNAi em cncer
Cerca de 50% dos genes miRNA localizam- se em regies genmicas frgeis ou associadas ao cncer, atuando em oncogenes ou genes supressores tumoral.
Calin et al., 2004

miRNA let-7 miR-15a, miR-16 mir-17, mir-18, mir-19a, mir-92-1 miR-17-92 cluster

Alvo de ao Regula negativamente oncogene RAS Regula negativamente oncogene BCLl-2 Desconhecido Regula negativamente E2F1 e Rb

Funo Inibe o crescimento e diferenciao de clulas pulmonares tumoral Inibe a apoptose Tumorognese Inibe a proliferao celular

miR-21
miR- 372, miR-373

Regula negativamente PTEN


Regula negativamente LATS2

Ativa a apoptose
Ativa proliferao celular

RNAi em cncer
Cada tecido canceroso apresenta expresso alterada de miRNAs podendose utilizar isso como uma assinatura especfica de cada cncer.
Lu et al., 2005

Ryazansky e Gvozdev, 2008

RNAi em cncer

Uso teraputico- Frmacos


Ativao/Inativao do RNA de interferncia:
Cncer: Esquistossomose; AIDS; Febre amarela; Inativao de genes

Hepatite C e B;
Doenas neurodegenerativas;

Senescncia...

Uso teraputico- Novas tecnologias


Empecilho: ausncia nas bactrias mais utilizadas; Fragilidade dos fragmentos;

Criao de molculas hbridas DNA-RNA; Nanopartculas transportadoras; Partculas lipdicas transportadoras.

Uso teraputico- Empresas


Escasso resultado nas pesquisas:

Empresas que continuam fazendo investimentos em iRNA

Uso teraputico- Transgnese em plantas

Outras aplicaes
Bioinformtica:
Auxlio na escolha das sequencias de mRNA especficas;
Bancos de dados;

http://www.mirbase.org/

http://www.microrna.org/microrna/home.do

Outras apliacaes
Prospeco de novos microRNAs
Genes homlogos de conhecidos miRNA;
Loops prximos a regies de miRNA ou no;

http://genes.mit.edu/mirscan/

Outras aplicaes
Genmica funcional:

Outras aplicaes
Produo de modelos animais (knock-down)

Referncias

http://www.microrna.ic.cz/mirna4.html#MicroRNA Genes and Their Transcription http://www.nature.com/nrd/journal/v6/n6/fig_tab/nrd2310_F1.html http://www.microrna.ic.cz/ http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-84782011000100014 http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0004-27302006000600018&script=sci_arttext Ihttp://www.nature.com/nrg/journal/v5/n8/pdf/nrg1415.pdf Ittp://www.nature.com/nrm/journal/v6/n5/pdf/nrm1644.pdf http://www.sabiosciences.com/pathway7.php ttp://www.sciencenews.org/view/feature/id/62051/title/Cancer%E2%80%99s_little_helpers http://www.news-medical.net/health/MicroRNA-Cellular-Functions-%28Portuguese%29.aspx http://www.sabiosciences.com/pathway7.php http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2164-10-558.pdf http://protein.bio.msu.su/biokhimiya/contents/v73/full/73050640.html http://www.wikigenes.org/e/gene/e/827839.html http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio17/17_docg.pdf http://www.mims.umu.se/en/news/1379-when-bacteria-get-the-flu-and-sharpen-their-knivesscientists-identify-a-novel-pathway-to-activate-the-bacterial-immune-system-.html http://www.sciencedaily.com/releases/2009/10/091012225811.htm http://www.microrna.ic.cz/mirna4.html