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Mtodo de Bradford (1976)

Quantificao de protenas totais

Prof. Luiz Edson Mota de Oliveira


Fernanda Nery; Fernanda Soares; Francyane Braga; Samantha Dignart

Setembro - 2004

Introduo
As protenas so os maiores constituintes de toda clula viva, e cada uma delas, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma funo biolgica associada s atividades vitais.

Prticas de laboratrio para purificao de protenas requerem um mtodo rpido e sensvel para a quantificao destas.

Mtodos mais utilizados


Reao de Biureto
Mtodo de Lowry Mtodo de Bradford Mtodo micro-Kjeldahl

Reao de Biureto

O mtodo por biureto foi proposto por Riegler em 1914, baseado na observao de que substncias que contm duas ou mais ligaes peptdicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em solues alcalinas. A intensidade da cor formada proporcional quantidade de protena, e a medida feita num colormetro.

Interferncias: Tris Amnia Glicerol

C NH RC H Cu2+ HN

C H CR C HN H CR

C NH RCH

Procedimento de Lowry (1951) Aumenta a sensibilidade da reao de Biureto: composto de protena-Cu2+ reage com Folin-Ciocalteus = colorao azul (650 nm).
Complejo Protena-Cu 2+ AA red. Complejo Protena-Cu 2+ AA oxid.

Reactivo Folin oxid. AMARILLO

Reactivo Folin red. AZUL

Interferncias: on potssio; on magnsio; EDTA; Tris; Reagentes de Thiol; Carboidratos.

Mtodo de Bradford
O corante que se liga protena o Comassie Blue G250; considerado mais simples e sensvel do que o mtodo de Lowry;

Lowry indicou menos protenas do que os resultados obtidos com o de Bradford, mas estas diferenas no foram significativas (Pinto, 1982);
Mtodos colorimtricos: so sensveis a ons, tampes e mudanas no pH ou na temperatura; Clorofila e outros pigmentos podem afetar os valores de absorbncia;

Apesar dessas limitaes, os mtodos colorimtricos so efetivos e justificam sua utilizao (Passos, 1996).

Comassie Blue G-250

azul

vermelho

Ligao com protena

Materiais e Mtodos

Reagentes:
Coomassie Brilliant Blue G-250

2-Mercaptoethanol
Triton X-100 Dodecil Sulfato de Sdio

outros

Preparao da soluo de protena

0,15 M NaCl

Albumina de soro Bovino (2x cristalizada)


Quimiotripsinognio A Citocromo C (Corao de cavalo) Espectrofotmetro 200 uv

Albumina de Soro Humano


Hemoglobina Mtodo Gravimtrico

Preparao do reagente Comassie-blue G-250

Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L. Dessa forma, as concentraes finais sero: 0,01% de Comassie, 8,5% de cido fosfrico e 4,7% de etanol.

Ensaio Protico 10 a 100 g de protena Pipetou em tubos volumes que foram ajustado para 0,1 mL com soluo tampo

Adicionou 5 mL do reagente protico e agitou em vrtex


Leitura de absorbncia: 595 nm (depois de 2 minutos e antes de 1 hora)

Obteno da Curva Padro:


Concentrao vs Absorbncia

Resultados Reprodutibilidade, sensibilidade e linearidade

BSA = alta reprodutibilidade

Sensibilidade de 5 g de protena/mL no volume final


Linearidade = Lei Lambert-Beer

Preciso do mtodo

Bradford

Lowry

Interferncias de Componentes No Proticos

Marcha analtica seguida no Laboratrio

1) Reagentes Comassie Blue G-250, H3PO4 e etanol Soro Albumina Bovina (BSA) (1 mg/mL ou 10 g/0,1 mL)

2) Metodologia

Preparao do reagente Comassie-blue G-250


Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%

Adicionar 100 mL de H3PO4 85%


Completar para 1 L Deixar overnight com agitao constante e filtrar

Concentraes finais: 0,01% de Comassie, 8,5% de cido fosfrico e 4,7% de etanol

Obs.: cido fosfrico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrrio.

Procedimento para obteno da curva padro


Tabela 1. Procedimento para obteno da curva padro de protenas utilizando-se como padro BSA (1 mg/mL).
Tubos BSA (1 mg/mL) (mL) 0,00 0,02 gua (mL) 0,10 0,08 Comassie Blue G250 (mL) 5,0 5,0 g Protina 0 20

1 2

3
4 5 6

0,04
0,06 0,08 0,10

0,06
0,04 0,02 0,00

5,0
5,0 5,0 5,0

40
60 80 100

*Volume reacional = 5,1 mL

Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alquotas de 0,1 mL retiradas de solues de 20, 40, 60, 80 e 100 g de BSA / 0,1 mL. Se assim for, a curva seguir o padro mostrado na Tabela 2.
Tabela 2. Procedimento para obteno da curva padro de protenas utilizando-se como padro solues diludas de BSA. Tubos BSA (X g / 0,1 mL) (mL) 0,1 de H2O 0,1 0,1 Comassie Blue G-250 (mL) 5,0 5,0 5,0 g Protena

1 2 3

0 20 40

4
5 6

0,1
0,1 0,1

5,0
5,0 5,0

60
80 100

*Volume reacional = 5,1 mL

Aps, agitar os tubos em vortex

Leitura no espectrofotmetro U.V. = 595 nm.

Curva Padro

Mtodo de Bradford
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

Abs 595 nm

y = 0,0076x - 0,0043 R2 = 0,9888

20

40

60

80

100

Concentrao (ug/mL)

OBRIGADO!!