Método de Bradford (1976

)
Quantificação de proteínas totais

Prof. Luiz Edson Mota de Oliveira
Fernanda Nery; Fernanda Soares; Francyane Braga; Samantha Dignart

Setembro - 2004

Introdução
As proteínas são os maiores constituintes de toda célula viva, e cada uma delas, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma função biológica associada às atividades vitais.

Práticas de laboratório para purificação de proteínas requerem um método rápido e sensível para a quantificação destas.

Métodos mais utilizados  Reação de Biureto  Método de Lowry  Método de Bradford  Método micro-Kjeldahl .

Reação de Biureto O método por biureto foi proposto por Riegler em 1914. A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de proteína. e a medida é feita num colorímetro. Interferências: • Tris • Amônia • Glicerol . baseado na observação de que substâncias que contêm duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas.

O C NH RC H Cu2+ HN C H CR C HN H CR O O C NH RCH O .

Procedimento de Lowry (1951) Aumenta a sensibilidade da reação de Biureto: composto de proteína-Cu2+ reage com Folin-Ciocalteus = coloração azul (650 nm). Complejo Proteína-Cu 2+ AA oxid. íon magnésio. AMARILLO Reactivo Folin red. Complejo Proteína-Cu 2+ AA red. . EDTA. Reagentes de Thiol. Carboidratos. Tris. Reactivo Folin oxid. AZUL Interferências: íon potássio.

 É considerado mais simples e sensível do que o método de Lowry.  Clorofila e outros pigmentos podem afetar os valores de absorbância. Apesar dessas limitações. . 1982).Método de Bradford  O corante que se liga à proteína é o Comassie Blue G–250. os métodos colorimétricos são efetivos e justificam sua utilização (Passos. mas estas diferenças não foram significativas (Pinto. 1996). tampões e mudanças no pH ou na temperatura.  Métodos colorimétricos: são sensíveis a íons.  Lowry indicou menos proteínas do que os resultados obtidos com o de Bradford.

Comassie Blue G-250 azul vermelho Ligação com proteína .

Materiais e Métodos Reagentes: Coomassie Brilliant Blue G-250 2-Mercaptoethanol Triton X-100 Dodecil Sulfato de Sódio outros .

15 M NaCl  Albumina de soro Bovino (2x cristalizada)  Quimiotripsinogênio A  Citocromo C (Coração de cavalo) Espectrofotômetro 200 uv  Albumina de Soro Humano Hemoglobina Método Gravimétrico .Preparação da solução de proteína 0.

8. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L.5% de ácido fosfórico e 4. Dessa forma.01% de Comassie. as concentrações finais serão: 0. .Preparação do reagente Comassie-blue G-250 Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%.7% de etanol.

1 mL com solução tampão  Adicionou 5 mL do reagente protéico e agitou em vórtex  Leitura de absorbância: 595 nm (depois de 2 minutos e antes de 1 hora)  Obtenção da Curva Padrão: Concentração vs Absorbância .Ensaio Protéico  10 a 100 µg de proteína  Pipetou em tubos volumes que foram ajustado para 0.

sensibilidade e linearidade  BSA = alta reprodutibilidade  Sensibilidade de 5 µg de proteína/mL no volume final  Linearidade = Lei Lambert-Beer .Resultados Reprodutibilidade.

Precisão do método Bradford Lowry .

Interferências de Componentes Não Protéicos .

Marcha analítica seguida no Laboratório 1) Reagentes  Comassie Blue G-250.1 mL) . H3PO4 e etanol  Soro Albumina Bovina (BSA) (1 mg/mL ou 10 µg/0.

01% de Comassie.7% de etanol Obs. 8. .2) Metodologia Preparação do reagente Comassie-blue G-250 Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95% Adicionar 100 mL de H3PO4 85% Completar para 1 L Deixar overnight com agitação constante e filtrar Concentrações finais: 0.5% de ácido fosfórico e 4.: Ácido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrário.

0 5. Tubos BSA (1 mg/mL) (mL) 0.0 5.00 5.10 0.02 Água (mL) 0.06 0.06 0.08 Comassie Blue G250 (mL) 5.04 0.0 40 60 80 100 *Volume reacional = 5.0 5.0 5.Procedimento para obtenção da curva padrão Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão BSA (1 mg/mL).10 0.04 0.08 0.02 0.1 mL .0 µg Protéina 0 20 1 2 3 4 5 6 0.00 0.

1 Comassie Blue G-250 (mL) 5.0 5.1 mL. Tubos BSA (X µg / 0.0 60 80 100 *Volume reacional = 5.1 de H2O 0.1 0. 60.1 0.0 5.1 mL retiradas de soluções de 20.0 µg Proteína 1 2 3 0 20 40 4 5 6 0.1 mL . Se assim for.1 mL) (mL) 0.Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alíquotas de 0.1 5.0 5.1 0. 40. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão soluções diluídas de BSA. 80 e 100 µg de BSA / 0. a curva seguirá o padrão mostrado na Tabela 2. Tabela 2.0 5.

. agitar os tubos em vortex Leitura no espectrofotômetro U.V.Após. = 595 nm.

.

6 0.0076x .4 0.0043 R2 = 0.0.Curva Padrão Método de Bradford 1 0.2 0 0 Abs 595 nm y = 0.8 0.9888 20 40 60 80 100 Concentração (ug/mL) .

OBRIGADO!! .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful