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Rompimento no-Mecnico

1) Choque Osmtico
No ocorre rompimento total das clulas; Pode propiciar a permeabilizao seletiva; As clulas so mantidas por 30 minutos em meio com

concentrao de sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugao e ressuspensas em gua destilada a 4C.
Mais indicado para bactrias Gram-negativas, pois possuem

parede celular mais sensvel que as Gram-positivas.

Rompimento total e permeabilizao seletiva

Congelamento-descongelamento
As clulas passam por repetidos ciclos de congelamento

e descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a clula e provocar seu total rompimento ou lesion-la formando poros permeveis biomolcula-alvo.
Fatores que mais influenciam: tipo e idade da clula; Temperatura Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;

Congelamento-descongelamento
Mtodo de difcil implantao em grande escala Enzimas sensveis ao congelamento podem ser

inativadas

Termlise
Consiste no aquecimento da suspenso celular em banho

termostatizado, com injeo direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier.

Sos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido

sua simplicidade;

Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos,

leveduras e bactrias destinadas produo de protena microbiana;

Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores

dimenses e, portanto, de mais fcil remoo por filtrao ou centrifugao.

Termlise
Exemplos:
Rompimento total de clulas de uma suspenso de E.

coli (bactria Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 C por 15 minutos com liberao de enzimas intracelulares
Uma suspenso de Bacilus megaterium nas mesmas

condies proporciona o rompimento de menos da metade das clulas (bactria Gram-positiva- camada mais espessa de peptideoglicano)

Rompimento Qumico
lcalis:
Adequado quando a molcula-alvo estvel em pH

maior que 11 Mtodo simples e de baixo custo; Ocasiona gerao de poluentes;

Rompimento Qumico
Detergentes:
So capazes de dissociar protenas e lipoprotenas das

paredes celulares, provocando a formao de poros e liberar a molcula-alvo; A clula pode ser totalmente rompida; Ex.: lauril sulfato de sdio, Triton, etc. Formao de espuma e desnaturao e/ou precipitao de protenas

Rompimento Qumico
Solventes:
Consiste na desidratao das clulas, sendo os

solventes mais utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona;


Adequado para biomolculas que no sejam

desnaturadas na presena do solvente empregado;

Rompimento Qumico
Lise enzimtica:

Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmtica

rompida pela presso osmtica interna, aps a parede celular, ou parte dela, ser removida por ao das enzimas, permitindo que o contedo intracelular seja liberado. rompimento mecnico, temperatura, tenso de cisalhamento e elevadas presses. possibilidade de reciclo da enzima.

Adequado para recuperao de biomolculas sensveis ao

Fatores a ser considerados: presena de inibidores,

Rompimento Qumico
Sistema enzimtico deve ser adequado para cada tipo

de microrganismo:
Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais

hidrolisam componentes especficos da parede, como glucanas, protenas e mananas.


Bactrias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as

ligaes covalentes da estrutura do peptideoglicano

Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano

Ex.: lisozima, catalisa a hidrlise das ligaes glicosdicas do

peptideoglicano, mais eficiente no rompimentos de bactrias Grampositivas.

Preservao da Biomolcula-alvo
Adio de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da

degradao de protenas);
Adio de agentes redutores (para evitar a oxidao dos

stios ativos das enzimas aps o rompimento);


Adio de nucleases ou proteases podem melhorar as

caractersticas do meio, desde que no destruam a molcula de interesse;


Alterao de pH pode melhorar a viscosidade do meio.

Etapas de um Processo de Purificao

Baixa resoluo Alta resoluo

Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo


Precipitao

Separao por membranas


Extrao em sistemas de duas fases lquidas

Precipitao

Precipitao
Um dos mtodos mais tradicionais de concentrao e

purificao;

um mtodo moderado de purificao j que no

apresenta elevada capacidade de separao de diferentes protenas;

Mtodos agressivo para recuperao de protenas, pois sua

funo tridimensional modificada, e a funo bioqumica de uma protena depende de sua estrutura; precipitao

vivel quando a funo bioqumica recuperada aps a

Precipitao
Precipitante
Sais neutros (Salting-out) Polmeros no-inicos

Princpio

Vantagens
- Corrosivo

Desvantagens

Interaes hidrofbicas pela - Uso universal reduo da camada de hidratao da protena - Baixo custo Excluso da protena da fase - Uso de pequenas aquosa reduzindo a quantidade de quantidades de precipitante gua disponvel para a solvatao da protena interaes hidrofbicas e - Baixo custo interferncia das molculas de gua - Simples nas ligaes de hidrognio, Ligao com a molcula de protena - Uso de pequenas atuando como agente floculante quantidades de precipitante Neutralizao da carga global da protena pela alterao do pH do meio Formao de complexos - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Uso de pequenas quantidades de precipitante

- Liberao de amnia em pH alcalino - Aumento da viscosidade

Calor

- Risco de desnaturao

Polieletr-litos Precipitao isoeltrica

- Risco de desnaturao - Risco de desnaturao

Sais metlicos Solventes orgnicos

- Risco de desnaturao - Risco de desnaturao de protenas - Inflamvel e explosivo

Reduo da constante dieltrica do - Facilidade de reciclagem meio aumentando as interaes eletrostticas intermoleculares - Facilidade na remoo do precipitado

Estrutura das Protenas


Aminocidos (aa) com

Constituio

elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as protenas.
diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o carter cido ou bsico do aa em soluo.

Os 20 aa das protenas se

Estrutura das Protenas


Estrutura primria: refere-se seqncia dos aminocidos na cadeia linear peptdica.
Estrutura

secundria: refere-se ao grau de ordenao espacial da cadeia polipeptdica. So estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

Estrutura das Protenas


Estrutura terciria: refere-se ao arranjo espacial

obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundria. Envolve a otimizao de vrias interaes (hidrofbicas, eletrostticas e de van der Waals) e pontes de hidrognio entre vrios grupos na estrutura da protena.

As estruturas secundria e terciria conferem protena a sua estrutura tridimensional.

Estrutura das Protenas


Estrutura quaternria: envolve a associao de subunidades tercirias de protenas. Para sua estabilizao concorrem ligaes inicas, pontes de hidrognio, foras de van der Waals, pontes bissulfeto e interaes hidrofbicas.

Solubilidade de Protenas
Determina sua solubilidade Regio Hidrofbica (Apolar)

Regies Hidroflicas (Polares)

Alm dos aa, ons ferro e cobre, oligossacardeos e lipdeos conferem diferentes solubilidades s protenas.

Solubilidade: resultado global das interaes atrativas e

repulsivas entre molculas do solvente e soluto;


favorecida quando h interaes repulsivas entre

molculas de soluto e atrativas entre molculas do soluto e solvente;


Interaes entre soluto e solvente so no covalentes =>

interaes eletrostticas e foras de Van der Waals;

pH: grande influncia => altera o grau de dissociao dos grupamentos;


Carga total zero leva ao da agregao devido

repulso => perfis de solubilidade em diferentes valores de pH

O ponto de solubilidade mnima igual ou prximo ao

ponto isoeltrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a protena possui carga global igual a zero.

pH e distribuio de cargas:
+ + pI - -

De modo geral, o solvente aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanas na fora inica e no pH, por adio de solventes orgnicos miscveis e polmeros orgnicos, altera-se a solubilidade das protenas.

Desnaturao X Precipitao
A desnaturao compreende a destruio da estrutura terciria de uma molcula de protena e a formao de cadeias polipeptdicas ao acaso. - as variveis pH, temperatura e solventes orgnicos, dependendo dos valores, causam desnaturao das protenas.

A precipitao compreende a modificao da estrutura tridimensional da molcula de protena. - as mesmas variveis, dependendo dos valores, causam precipitao das protenas.

A precipitao deve permitir que a

conformao adequada da protena seja recuperada, para que a mesma possa exercer sua funo bioqumica aps o processo.

Precipitao por sais


Neutralizao das cargas superficiais com reduo da

camada de hidratao

Salting-out:

adio de sais que promovem o aprisionamento de molculas de gua que tornam-se escassas e o consequente consumo das molculas de gua nas regies hidrofbicas, que expostas interagem e se agregam.
elevada solubilidade, ex.: citrato de sdio, sulfato de sdio e sulfato de amnio.

Os sais mais adequados so aqueles que apresentam

Salting-in: reduo na concentrao de sais

induz interaes inicas e agregao entre molculas de protena. Globulinas se precipitam sob fora inica baixa

Mtodo mais comumente usado para separao de protenas o da adio de sais neutros (salting out)

Precipitao por solventes


A solubilidade das protenas varia com a distribuio dos

resduos hidroflicos e hidrofbicos na superfcie da molcula;


lcoois de cadeia inferior, acetona, teres e outros:

precipitantes;
Deve ser miscvel em gua, no reagir diretamente com as

molculas e ser bom precipitante;

Mais usados: metanol, etanol e acetona;

Mecanismo
Agregao de protenas por interaes eletrostticas entre superfcies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgnico.

Variveis que afetam o processo


Temperatura:

20 30 C estimulam a desnaturao < 0 C podem garantir que no haja desnaturao


adio do solvente temperatura deve ser lenta e sob refrigerao =>

pH: prximo ao pI favorece a precipitao

Precipitao por polmeros


PEG (polietilenoglicol), polmero de alta massa molar,

neutro e miscvel em gua, disponvel em diversos graus de polimerizao;


Em geral, propores de polmero (15 a 30%); 4000 g/mol ou mais so os mais eficientes Mecanismo: excluso da protena do meio aquoso; Concentrao depende do tamanho da molcula a ser

precipitada e da massa molar do polmero, sendo inversamente proporcional concentrao da protena; Remoo do polmero: ultrafiltrao, adio de etanol, separao pela formao de duas fases aquosas pela adio de sais.

Polieletrlitos:

polmeros inicos solveis em gua; usados devido ao baixo custo e pouca concentrao residual; Poliction polietilenoimina e polinion cido poliacrlico, utilizados para precipitar cidos nuclicos e protenas. Mecanismo: Ocorre a agregao protena (floculao) ou eletrosttico (neutralizao de cargas); a protena e o polieletrlito devem ter cargas opostas , por isso, deve-se operar longe do ponto isoeltrico da protena.

Precipitao pela temperatura


Mecanismo:1) diminuio: reduo na solubilidade; 2) aumento: desnaturao => exposio de grupos hidrofbicos que interagem e formam complexos insolveis;

Precipitao isoeltrica
Resulta da atrao eletrosttica das protenas quando estas esto prximas a seu pI; Mtodo bastante simples: ajuste do pH Prximo ao pI a repulso eletrosttica mnima => precipitao isoeltrica, por interao entre as zonas hidrofbicas; Vantagem: baixo custo Desvantagem: possibilidade desnaturao Obs.: Mtodo til para precipitar protenas indesejveis e otimizar outros tipos de precipitao;